JP2020509744A - 糖タンパク質製造プロセス - Google Patents
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Abstract
Description
Wは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Xは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Yは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Zは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Fcは、結晶化可能領域断片であり、
Dnは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、n=10又は16であり、及び
前記sALPは、可溶性アルカリホスファターゼである)
の構造を含む組換えアルカリホスファターゼを提供する。
「約」、「およそ」:用語「約」及び「およそ」は、本明細書で用いられるとき、1つ以上の特定の細胞培養条件に適用される場合、その1つ以上の培養条件において定められた参照値に類似する種々の値を指す。特定の実施形態では、用語「約」は、その1つ以上の培養条件において定められた参照値の25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1パーセント又はそれを下回る範囲に含まれる種々の値を指す。
本開示は、組換え細胞培養におけるアルカリホスファターゼタンパク質(例えば、アスホターゼアルファ)の生産に関する。アルカリホスファターゼタンパク質は、少なくともいくらかのアルカリホスファターゼ活性を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドを含む分子を含む。様々な実施形態では、本明細書で開示されるアルカリホスファターゼは、当該技術分野で公知のアルカリホスファターゼの任意の機能、例えばホスホエタノールアミン(PEA)、無機ピロリン酸(PPi)及びピリドキサール5’−リン酸(PLP)を含む天然基質に対する酵素活性を含み得る、アルカリホスファターゼ機能を有する任意のポリペプチドを含む。
上に示される通り、TNALPは、糖脂質を通じてそのC末端に固定される膜結合タンパク質である(ヒトTNALPについては、UniProtKB/Swiss−Prot受入番号P05186を参照されたい)。この糖脂質アンカー(GPI)は、翻訳後、一時的な膜アンカーとGPIの付加に対するシグナルとの両方として役立つ疎水性C末端の除去後に付加される。したがって、一実施形態では、可溶性ヒトTNALPは、疎水性C末端配列の1番目のアミノ酸、すなわちアラニンが停止コドンで置換されるTNALPを含む。そのように形成された可溶性TNALP(本明細書中でsTNALPと称される)は、GPI膜アンカーを欠如する触媒部位の形成に必要である、TNALPの天然アンカー型のすべてのアミノ酸を含有する。公知のTNALPとして、例えばヒトTNALP[ジェンバンク受入番号NP−000469、AAI10910、AAH90861、AAH66116、AAH21289及びAAI26166];アカゲザルTNALP[ジェンバンク受入番号XP−001109717];ラットTNALP[ジェンバンク受入番号NP_037191];イヌTNALP[ジェンバンク受入番号AAF64516];ブタTNALP[ジェンバンク受入番号AAN64273]、マウスTNALP[ジェンバンク受入番号NP_031457]、ウシTNALP[ジェンバンク受入番号NP_789828、NP_776412、AAM8209及びAAC33858]並びにネコTNALP[ジェンバンク受入番号NP_001036028]が挙げられる。
本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、所定の細胞型、組織又は臓器に対してアルカリホスファターゼタンパク質を特異的に標的にすることがある標的部分を含み得る。いくつかの実施形態では、かかる所定の細胞型、組織又は臓器は、骨組織である。かかる骨標的部分は、任意の公知のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は当該技術分野で公知の小分子化合物を含み得る。例えば、負に荷電したペプチドは、骨標的部分として用いられ得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせ(例えば、少なくとも1つのアスパラギン酸と少なくとも1つのグルタミン酸とを含むポリペプチド、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸残基の組み合わせを含む負に荷電したペプチド)であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13、D14、D15、D16、D17、D18、D19、D20又は20を超えるアスパラギン酸を有するポリアスパラギン酸であり得る。いくつかの実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20又は20を超えるグルタミン酸を有するポリグルタミン酸であり得る。一実施形態では、かかる負に荷電したペプチドは、D10〜D16又はE10〜E16からなる群から選択される少なくとも1つを含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のアルカリホスファターゼタンパク質は、ALP部分と標的部分との間にスペーサー配列を含む。一実施形態では、かかるアルカリホスファターゼタンパク質は、ALP(例えば、TNALP)部分と負に荷電したペプチド標的部分との間にスペーサー配列を含む。かかるスペーサーは、任意のポリペプチド、ポリヌクレオチド又は小分子化合物であり得る。いくつかの実施形態では、かかるスペーサーは、結晶化可能領域断片(Fc)の断片を含み得る。有用なFc断片は、ヒンジ並びにCH2及びCH3ドメインを含むIgGのFc断片を含む。かかるIgGは、IgG−1、IgG−2、IgG−3、IgG−3及びIgG−4又はそれらの任煮の組み合わせのいずれかであり得る。
具体的な実施形態では、本開示の骨標的化sALP融合タンパク質は、二量体又は四量体を形成するように会合される。
アスホターゼアルファは、2つのTNALP−Fc−D10ポリペプチド(それぞれ配列番号1に示されるような726アミノ酸を有する)からなる可溶性Fc融合タンパク質である。各々のポリペプチド又は単量体は、5つの部分から構成される。アミノ酸L1−S485を有する第1の部分(sALP)は、触媒機能を有する、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ酵素の可溶性部分である。第2の部分は、リンカーとしてアミノ酸L486−K487を有する。アミノ酸D488−K714を有する第3の部分(Fc)は、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインを有するヒト免疫グロブリンγ1(IgG1)のFc部分である。第4の部分は、リンカーとしてD715−I716を有する。第5の部分は、アスホターゼアルファが骨の鉱物相に結合することを可能にする骨標的部分であるアミノ酸D717−D726(D10)を有する。さらに、各ポリペプチド鎖は、6つの予想されるグリコシル化部位及び11のシステイン(Cys)残基を有する。Cys102は、遊離システインとして存在する。各ポリペプチド鎖は、4つの鎖内ジスルフィド結合をCys122とCys184、Cys472とCys480、Cys528とCys588及びCys634とCys692との間に有する。2つのポリペプチド鎖は、両方の鎖上のCys493間及び両方の鎖上のCys496間での2つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される。これらの共有結合構造的特徴に加えて、哺乳類アルカリホスファターゼは、各ポリペプチド鎖上において、亜鉛に対する2つの部位、マグネシウムに対する1つの部位及びカルシウムに対する1つの部位を含む4つの金属結合部位を有すると考えられる。
本明細書に記載のアルカリホスファターゼタンパク質(例えば、アスホターゼアルファ)は、当該技術分野で公知の方法を用いて、哺乳類又は他の細胞、特にCHO細胞によって生産され得る。かかる細胞は、培養ディッシュ、フラスコガラス又はバイオリアクター内で増殖され得る。細胞培養及び組換えタンパク質生産のための特定のプロセスは、当該技術分野で公知であり、例えばNelson and Geyer,1991 Bioprocess Technol.13:112−143及びRea et al.,Supplement to BioPharm International March 2008,20−25に記載されている。例示的なバイオリアクターは、バッチ、流加及び連続反応器を含む。いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼタンパク質は、流加バイオリアクター内で生産される。
任意の哺乳動物細胞型又は非哺乳動物細胞型がポリペプチドを生産するために培養され得るが、本開示に従って利用され得る。用いられ得る哺乳動物細胞の非限定例として、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞+/−DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,1980 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216);BALB/cマウス骨髄腫株(NSO/1、ECACC受入番号:85110503);ヒト網膜芽細胞腫(PER.C6(CruCell,Leiden,The Netherlands));SV40(COS−7,ATCC CRL 1651)によって形質転換されたサル腎臓CV1株;ヒト胚性腎臓株(懸濁培養下での増殖のためにサブクローニングされた293又は293細胞、Graham et al.,1977 J.Gen Virol.,36:59);ベビーハムスター腎細胞(BHK,ATCC CCL 10);マウスセルトリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243−251(1980));サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76,ATCC CRL−I 587);ヒト頸部がん細胞(HeLa,ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞(BRL3A,ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2,HB8065);マウス乳腺腫瘍(MMT060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44−68);MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝腫瘍株(Hep G2)が挙げられる。特定の実施形態では、ポリペプチド及びタンパク質の培養及び発現は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株から行われる。
本開示では、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が培地に接種、すなわち播種される。様々な播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、1.0×104細胞/mL〜1.0×107細胞/mLの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、1.0×105細胞/mL〜1.0×106細胞/mLの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、4.0×105細胞/mL〜8.0×105細胞/mLの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、5.0×105細胞/mL〜6.0×105細胞/mLの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、5.5×105細胞/mLの播種密度を用いることができる。いくつかの実施形態では、播種密度の増加は、SECによって測定されるとき、アスホターゼアルファ品質の断片化に影響し得る。いくつかの実施形態では、播種密度は、断片生成のリスクを低減するために接種時に制御される。
以前の結果によると、温度は、増殖速度、凝集、断片化及びTSACを含むいくつかのパラメータに対する影響を有する可能性があることが示された。いくつかの実施形態では、温度は、CHO細胞を培地で培養するとき、一定のままである。いくつかの実施形態では、温度は、CHO細胞を培地で培養するとき、約30℃〜約40℃、又は約35℃〜約40℃、又は約37℃〜約39℃、又は約37.5℃である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の40〜200時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の50〜150時間、又は60〜140時間、又は70〜130時間、又は80〜120時間、又は90〜110時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の80〜120時間にわたって一定である。いくつかの実施形態では、温度は、接種後の90時間、92時間、94時間、96時間、98時間、100時間、102時間、104時間、106時間、108時間又は110時間にわたって一定である。
細胞培養プロセス、特に非連続プロセス(例えば、バイオリアクターにおける流加プロセス)の実行時間は、通常、典型的には実行期間にわたって減少する細胞の残存生存度によって制限される。したがって、細胞生存度における時間を延長することは、組換えタンパク質の生産を改善するために所望される。生成物品質への関心はまた、細胞死が培養上清にシアリダーゼを放出し得、発現されるタンパク質のシアル酸含量を減少させる可能性があることから、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するという動機付けをもたらす。タンパク質精製への関心は、生細胞密度における減少を最小化し、高い細胞生存度を維持するというさらに別の動機付けをもたらす。培養物中の細胞片及び死細胞の内容物は、培養実行の終了時にタンパク質生成物を単離及び/又は精製する能力に対して負の影響を与え得る。したがって、細胞を培養下でより長期間にわたり生存可能に維持することにより、細胞によって生産される所望の糖タンパク質の品質における劣化及び究極的低下を引き起こすことがある、細胞性タンパク質及び酵素(例えば、細胞性プロテアーゼ及びシアリダーゼ)による培地の汚染において低下が認められる。
細胞培養下の増殖培地のpHの変更は、細胞タンパク質の分解活性、分泌及びタンパク質生産レベルに影響する可能性がある。細胞株の大部分は、約pH7〜8で十分に増殖する。細胞増殖における最適pHの変動は、様々な細胞株の中で比較的小さいが、いくつかの正常な線維芽細胞株の挙動は、pH7.0〜7.7で最高であり、形質転換細胞の挙動は、典型的には7.0〜7.4のpHで最高である(Eagle,1973 The effect of environmental pH on the growth of normal and malignant cells.J Cell Physiol 82:1−8)。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のpHは、約pH6.5〜7.7(例えば、6.50、6.55、6.60、6.65、6.70、6.75、6.80、6.85、6.90、6.95、7.00、7.05、7.10、7.15、7.20、7.25、7.30、7.35、7.39、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65及び7.70)である。いくつかの実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のpHは、約pH7.20〜7.60である。他の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のpHは、約pH6.9〜7.1である。特定の一実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のpHは、約pH6.9である。別の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のpHは、約pH7.30である。さらに別の実施形態では、アスホターゼアルファを生産するための培地のpHは、約pH7.39である。
いくつかの実施形態では、バッチ培養が用いられ、ここでは追加的な培地が接種後に添加されない。いくつかの実施形態では、流加培養が用いられ、ここでは1回以上のボーラス投与で培地が接種後に添加される。いくつかの実施形態では、2、3、4、5又は6回のボーラス投与で培地が接種後に添加される。
様々な栄養補助剤は、「フィード培地」とも称され、市販され、当業者に公知である。栄養補助剤は、接種が行われてから細胞培養物に添加される(培養培地と異なる)培地を含む。場合により、栄養補助剤は、培養下で増殖する細胞によって消費される栄養分を代替するために用いることができる。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、所望のタンパク質の生産を最適化するか又は所望のタンパク質の活性を最適化するために添加される。極めて多数の栄養補助剤が開発されており、市販されている。栄養補助剤の明示的な目的がプロセス開発の局面を高めることである一方、すべての細胞及び/又は生産されるすべてのタンパク質のために機能する普遍的な栄養補助剤は存在しない。所望の力価及び増殖特性を達成するため、所望の細胞株、生産タンパク質及び所与の基本培地と組み合わせて機能し得る、スケーラブルであり且つ適切な細胞培養栄養補助剤の選択は、ルーチン的でない。特定の細胞株、特定の生産タンパク質及び基本培地の組み合わせを用いて複数の市販の栄養補助剤をスクリーニングし、最適な補助剤を同定する典型的手法は、細胞培養プロセス中に存在する無数の変数に起因し、成功しない可能性がある。いくつかの実施形態では、栄養補助剤は、Efficient Feed C+AGT(商標)Supplement(Thermo Gisher Scientific,Waltham,MA)、Cell Boost(商標)2+Cell Boost(商標)4の組み合わせ(GE Healthcare,Sweden)、Cell Boost(商標)2+Cell Boost(商標)5の組み合わせ(GE Healthcare,Sweden)、Cell Boost(商標)6(GE Healthcare,Sweden)及びCell Boost(商標)7a+Cell Boost(商標)7b(GE Healthcare,Sweden)又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
亜鉛イオンは、アルカリホスファターゼ(例えば、アスホターゼアルファ)の安定性に対して、その構造及び活性を維持することに役立つことから重要であることが知られている。例えば、2個の亜鉛原子は、1個の胎盤アルカリホスファターゼ分子と会合する(Helene Le Du et al.2001 J.Biol.Chem.276:9158−9165)。この比に基づき、小規模モデルで開発された例示的な生産プロセスによって生産される1g/Lのアスホターゼアルファの力価について、約20μMの亜鉛がアスホターゼアルファ活性にとって必要である。20μMの亜鉛は、機能的なアスホターゼアルファを生産するのに理論的に十分である(すなわち亜鉛イオン2個/活性酵素)が、実際の亜鉛補給では、アルカリホスファターゼ(例えば、アスホターゼアルファ、TNALP、PALP、GCALP、IAP又はその融合/変異タンパク質)の生産プロセスにおいて、有意により高い亜鉛濃度(例えば、150μM)が要求されることがある。
先行試験により、収集タイミングの遅延が生存度及びTSAC低下に関連したため、収集タイミングが他のCQAに対する潜在的影響を有し得ることが示唆された。様々な実施形態では、アルカリホスファターゼ(例えば、アスホターゼアルファ)は、約200時間、210時間、220時間、230時間、240時間、250時間、260時間、264時間、270時間、280時間、288時間(すなわち12日)又は12日以降の時点で収集される。特定の実施形態では、アルカリホスファターゼ(例えば、アスホターゼアルファ)は、約10日又は約14日の時点で収集される。
用語「下流プロセス」は、本明細書で用いられるとき、一般に、再利用可能な成分の再利用並びに廃棄物の適切な処理及び処分を含む、培養細胞又は発酵培養液などの供給源から生産されるアルカリホスファターゼ(例えば、アスホターゼアルファ)の回収及び精製のためのプロセスの全部又は一部を指す。
標準的な増殖プロセス「コントロールプロセス」を、先行プロセスにおいて用いられるCHO供給量を0.5%(w/v)から2.0%(w/v)に増加させることにより開発した。コントロールプロセスは、0.12g/Lの平均活性力価を有した。コントロールプロセスは、他の市販のCHOに基づく上流プロセスと比べて著しく低い積分生細胞濃度(IVCC)及び体積力価を有した。複合栄養分の補充及び既存の供給量の増加を含む先行努力は、ほとんど又は全く成功していなかった。加えて、コントロールプロセスにおける温度変化は、標的のシアリル化を達成し、且つ活性レベルを最大化するのに重要であった。
本明細書に記載の通り、アルカリホスファターゼ(例えば、アスホターゼアルファ(sTNALP−Fc−D10))を生産するための改善された生産プロセスを開発した。アスホターゼアルファを発現する安定なCHO細胞株を、遺伝子発現系、例えばGS又はDHFR遺伝子発現系を用いて発現させた。二次クローンを単回の限界希釈クローニングにおいて高生産性の一次クローンから誘導し、最終細胞株を選択した。
最終アルカリホスファターゼ生成物の完全性を破壊することなく収率を最大化するため、様々な化学的に規定された市販の栄養供給サプリメントをコントロールプロセスに対して評価した(表3)。この試験におけるバイオリアクターコントロールのための細胞培養プロセスパラメータを表2に提示する。
SEC−HPLCデータを表3及び図7に提示する。(温度変化を伴う)代替的なフィード条件における総IVCC及び生産性の増加は、収集時、プロセス不純物を有意に改変しなかった。しかし、条件から温度変化を除くことにより、コントロールの2.6倍程度高い不純物レベルがもたらされ、コントロールプロセスの不純物レベルに対する温度変化の重要性が強調された。一般に、すべての試験条件において、10日目〜14日目により高い凝集物が認められた。96時間後の温度変化を伴う、Cell Boost 7a/7bが添加されたバイオリアクターは、コントロールプロセスバイオリアクター(10日目に4.1及び4.2%)に類似した凝集物レベル(4.2%)を示したが、14日目にそのほぼ2倍の生産性を示した。同じフィード方法の場合、温度変化を欠如した条件では、その対応する温度変化条件よりも高い凝集物がもたらされた。
タンパク質シアリル化は、重要なタンパク質生成物の属性であり、生理的条件下でタンパク質半減期に影響する。生産プロセスは、シアリル化レベルを許容できる制限内で厳密に制御するように選択される必要がある。
接種から少なくとも1日後、硫酸亜鉛を、実施例1〜5における条件に従い、20μM〜200μMの範囲の濃度のZn2+でアスホターゼアルファ培地に添加する。10日目及び14日目に増殖、活性、比活性、生産性、凝集物及びシアリル化を評価する。限定されないが、硫化物、臭化物、塩化物、フッ化物、ヨウ化物、リン酸塩、セレン化物、硝酸塩などを含む、他の生理学的に許容できる市販の亜鉛塩についても評価する。
温度変化の特定のタイミングを、栄養補助と併せて、CHO細胞におけるアスホターゼアルファ生産について、実施例1〜6における条件に従ってさらに評価する。10日目及び14日目に増殖、活性、比活性、生産性、凝集物及びシアリル化を評価する。結果によると、最高活性の生成物レベルが得られる一方、生成物品質及び許容できる放出パラメータが保持される。
Claims (106)
- 組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、
(i)組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を培地に接種することと、
(ii)前記培地中で前記CHO細胞を約36℃〜約38℃、約36.5℃〜約37.5℃、特に約37℃の温度で培養することと、
(iii)接種から少なくとも1日後、栄養補助剤の組み合わせであって、
(a)1つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む、第1の動物由来成分を含まない(ADCF)栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、L−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び2−メルカプトエタノールを含まない、第1の動物由来成分を含まない(ADCF)栄養補助剤、及び
(b)1つ以上のアミノ酸を含む第2のADCF栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、L−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、2−メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する、第2のADCF栄養補助剤
を含む組み合わせを(ii)の細胞培養物に添加することと、
(iv)前記接種から約80時間〜120時間後、(iii)の前記細胞培養物の温度を約30℃まで低下させることと、
(v)(iv)の前記細胞培養物から前記組換えアルカリホスファターゼを少なくとも1つのクロマトグラフィーステップによって単離することと
を含む方法。 - 前記培地は、EX−CELL(登録商標)302無血清培地、CD DG44培地、BD Select(商標)培地、SFM4CHO培地又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記培地は、SFM4CHO培地及びBD Select(商標)培地の組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培地は、SFM4CHO培地及びBD Select(商標)培地の組み合わせを、90/10、80/20、75/25、70/30、60/40又は50/50から選択される比、特に75/25の比で含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、ボーラス投与で添加される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、1分〜2時間の範囲の期間にわたって添加される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から1〜3日後に添加される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、3つ以上の異なる時点で添加される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、2〜6つの異なる時点で添加される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、4又は5つの異なる時点で添加される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から1〜3日後及び接種から3〜5日後に添加される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から1〜3日後、接種から3〜5日後、接種から5〜7日後、接種から7〜9日後及び接種から9〜11日後に添加される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から約2日後、及び接種から約4日後、接種から約6日後、及び接種から約8日後、及び接種から約10日後に添加される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の約0.5%〜約4%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の2%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の0.05%〜0.8%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の0.2%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の5%〜20%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の12%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の0.5%〜2%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の1.2%(w/v)の濃度で添加される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤は、CELL BOOST(商標)7aであり、且つ前記第2の栄養補助剤は、CELL BOOST(商標)7b(GE Healthcare)である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- (iv)の前記温度低下は、前記接種から約80時間〜150時間後である、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- (iv)の前記温度低下は、前記接種から約90時間〜100時間後である、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- (iv)の前記温度低下は、前記接種から約96時間後である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも約20μM〜約200μMのZn2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 約30、50、60、90、150又は200μMのZn2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 約90μMのZn2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- (v)は、接種から14日後に行われる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- (v)は、接種から10日後に行われる、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも1つを含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記活性は、pNPPに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸(PPi)加水分解アッセイの少なくとも1つから選択される方法から選択される、請求項32に記載の方法。
- 組換えアルカリホスファターゼKcat及びKm値の少なくとも1つは、無機ピロリン酸(PPi)加水分解アッセイにおいて増加する、請求項33に記載の方法。
- 積分生細胞濃度(IVCC)を決定することをさらに含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IVCCは、ステップ(iii)及び(iv)の不在下での前記方法と比べて約3.0倍〜約6.5倍だけ増加される、請求項35に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、W−sALP−X−Fc−Y−Dn−Z(式中、
Wは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Xは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Yは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Zは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Fcは、結晶化可能領域断片であり、
Dnは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、n=10又は16であり、及び
前記sALPは、可溶性アルカリホスファターゼである)
の構造を含む、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。 - 前記sALPは、C末端の糖脂質アンカー(GPI)を有しないアルカリホスファターゼ(ALP)の活性のあるアンカー型を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記アルカリホスファターゼ(ALP)は、組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)である、請求項37又は38に記載の方法。
- 前記sALPは、配列番号1のL1−S485に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記sALPは、配列番号1のL1−S485に示される配列を含む、請求項37〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記sALPは、無機ピロリン酸(PPi)の切断を触媒する能力がある、請求項37〜41のいずれか一項に記載の方法。
- n=10である、請求項37〜42のいずれか一項に記載の方法。
- W及びZは、前記ポリペプチドに不在である、請求項37〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fcは、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びヒンジ領域を含む、請求項37〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fcは、IgG−1、IgG−2、IgG−3、IgG−3及びIgG−4からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、請求項37〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fcは、免疫グロブリンIgG−1の定常ドメインである、請求項37〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Fcは、配列番号1のD488−K714に示される配列を含む、請求項37〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項37〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含み、且つその二量体である、請求項37〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含むポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第2のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第1のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×デンハート試薬、0.5%SDS及び100mg/mlの変性断片化されたサケ精子DNAにおける68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で10分間の2×SSC及び0.5%SDSでの洗浄、室温で10分間の2×SSC及び0.1%SDSでの洗浄、及び65℃で5分間、3回の0.1×SSC及び0.5%SDSでの洗浄を含む、請求項37〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に対する少なくとも90%の配列同一性を含む、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含む、請求項1〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、
(i)組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を培地に接種することと、
(ii)前記培地中で前記CHO細胞を約36℃〜約38℃、約36.5℃〜約37.5℃、特に約37℃の温度で培養することと、
(iii)少なくとも1つの栄養補助剤を細胞培養物に添加し、且つ約20μM〜約200μMのZn2+、特に約30μMのZn2+〜100μMのZn2+、特に約90μMのZn2+を添加することと、
(iv)前記接種から約80時間〜約120時間後、(iii)の前記細胞培養物の温度を約30℃まで低下させることと、
(v)(iv)の前記細胞培養物から前記組換えアルカリホスファターゼを少なくとも1つのクロマトグラフィーステップによって単離することと
を含む方法。 - 前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、ボーラス投与で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、1分〜2時間の範囲の期間にわたって添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から1〜3日後に添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、3つ以上の異なる時点で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、2〜6つの異なる時点で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、4又は5つの異なる時点で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から1〜3日後及び接種から3〜5日後に添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から1〜3日後、接種から3〜5日後、接種から5〜7日後、接種から7〜9日後及び接種から9〜11日後に添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から約2日後、及び接種から約4日後、接種から約6日後、及び接種から約8日後、及び接種から約10日後に添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の約0.5%〜約4%(w/v)の濃度で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の2%(w/v)の濃度で添加される、請求項65に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の0.05%〜0.8%(w/v)の濃度で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の0.2%(w/v)の濃度で添加される、請求項67に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の5%〜20%(w/v)の濃度で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の12%(w/v)の濃度で添加される、請求項69に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の0.5%〜2%(w/v)の濃度で添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の1.2%(w/v)の濃度で添加される、請求項71に記載の方法。
- 前記第1の栄養補助剤は、CELL BOOST(商標)7aであり、且つ前記第2の栄養補助剤は、CELL BOOST(商標)7b(GE Healthcare)である、請求項1に記載の方法。
- (iv)の前記温度低下は、前記接種から約80時間〜150時間後である、請求項1に記載の方法。
- (iv)の前記温度低下は、前記接種から約90時間〜100時間後である、請求項74に記載の方法。
- (iv)の前記温度低下は、前記接種から約96時間後である、請求項75に記載の方法。
- 少なくとも約20μM〜約200μMのZn2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 約30、50、60、90、150又は200μMのZn2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項77に記載の方法。
- 約90μMのZn2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、請求項78に記載の方法。
- (v)は、接種から14日後に行われる、請求項1に記載の方法。
- (v)は、接種から10日後に行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記活性は、pNPPに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸(PPi)加水分解アッセイの少なくとも1つから選択される方法から選択される、請求項83に記載の方法。
- 組換えアルカリホスファターゼKcat及びKm値の少なくとも1つは、無機ピロリン酸(PPi)加水分解アッセイにおいて増加する、請求項84に記載の方法。
- 積分生細胞濃度(IVCC)を決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記IVCCは、ステップ(iii)及び(iv)の不在下での前記方法と比べて約3.0倍〜約6.5倍だけ増加される、請求項86に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、W−sALP−X−Fc−Y−Dn−Z(式中、
Wは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Xは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Yは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Zは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Fcは、結晶化可能領域断片であり、
Dnは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、n=10又は16であり、及び
前記sALPは、可溶性アルカリホスファターゼである)
の構造を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記sALPは、C末端の糖脂質アンカー(GPI)を有しないアルカリホスファターゼ(ALP)の活性のあるアンカー型を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記アルカリホスファターゼ(ALP)は、組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)である、請求項88に記載の方法。
- 前記sALPは、配列番号1のL1−S485に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項88に記載の方法。
- 前記sALPは、配列番号1のL1−S485に示される配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記sALPは、無機ピロリン酸(PPi)の切断を触媒する能力がある、請求項88に記載の方法。
- n=10である、請求項88に記載の方法。
- W及びZは、前記ポリペプチドに不在である、請求項88に記載の方法。
- 前記Fcは、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びヒンジ領域を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記Fcは、IgG−1、IgG−2、IgG−3、IgG−3及びIgG−4からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、請求項88に記載の方法。
- 前記Fcは、免疫グロブリンIgG−1の定常ドメインである、請求項88に記載の方法。
- 前記Fcは、配列番号1のD488−K714に示される配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項88に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含み、且つその二量体である、請求項88に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含むポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第2のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第1のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×デンハート試薬、0.5%SDS及び100mg/mlの変性断片化されたサケ精子DNAにおける68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で10分間の2×SSC及び0.5%SDSでの洗浄、室温で10分間の2×SSC及び0.1%SDSでの洗浄、及び65℃で5分間、3回の0.1×SSC及び0.5%SDSでの洗浄を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に対する少なくとも90%の配列同一性を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1に示される配列を含む、請求項103に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、請求項54に記載の方法。
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