JP5936232B2 - Adamtsタンパク質発現のための細胞培養培地 - Google Patents
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Description
本出願は、2009年7月31日に出願された、米国仮出願第61/230,477号の利益を主張し、全ての目的において、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
適用なし
適用なし
Feb;7(1):25−31)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)(Moake
JL,Semin Hematol.2004 Jan;41(1):4−14)、結合組織障害、癌、炎症(Nicholson et al.)、および重度の熱帯熱マラリア(Larkin et al.,PLoS Pathog.2009 Mar;5(3):e1000349)を含む、いくつかの疾患および状態と関連付けられている分泌酵素である。これらの関連性のため、ADAMTS酵素は、いくつかの病態の可能性のある治療標的として認識されている(Jones GC,Curr Pharm Biotechnol.2006 Feb;7(1):25−31)。したがって、ウイルス、BSE、およびマイコプラズマ菌のような病原体等の汚染物を含まない、高比活性を有する高収率のADAMTSタンパク質を産生する方法が必要とされる。
purpura.N Engl J Med.1982;307:1432−1435)。UL−vWFとTTPとの間の関連は、TTPを患う大半の患者が、現在ADAMTS13として知られる、vWFを切断する血漿メタロプロテアーゼを欠損しているという、FurlanらならびにTsaiおよびLianによる独立した所見によって支持を得た(Furlan M,Robles R,Solenthaler M,Wassmer M,Sandoz P,Laemmle B.Deficient activity of von Willebrand factor−cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura.Blood.1997;89:3097−3103、Tsai H M,Sussman,I I,Ginsburg D,Lankhof H,Sixma J J,Nagel R L.Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factor mutants R834W and R834Q:inhibition by doxycycline and by monoclonal antibody VP−1. Blood.1997;89:1954−1962、Tsai H M,Lian E C.Antibodies to von Willebrand factor−cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura.N Engl J Med.1998;339:1585−1594)。
A Y,Siemieniak D R,Stark K R,Gruppo R,Sarode R,Shurin S B,Chandrasekaran V,Stabler S P,Sabio H,Bouhassira E E,Upshaw J D,Jr.,Ginsburg D,Tsai H M.Mutations in a
member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura.Nature.2001;413:488−494、Fujikawa K,Suzuki H,McMullen B,Chung D.Purification of human
von Willebrand factor−cleaving protease
and its identification as a new member of the metalloproteinase family.Blood.2001;98:1662−1666、Zheng X,Chung D,Takayama
T K,Majerus E M,Sadler J E,Fujikawa K.Structure of von Willebrand factor−cleaving protease(ADAMTS13),a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura.J Biol Chem.2001;276:41059−41063、Soejima K,Mimura N,Hirashima M,Maeda H,Hamamoto T,Nakagaki T,Nozaki C.A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood:possibly,the von Willebrand factor−cleaving protease;J Biochem(Tokyo). 2001;130:475−480、Gerritsen H E,Robles R,Lammle B,Furlan
M.Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor−cleaving protease. Blood.2001;98:1654−1661)。
D R,Stark K R,Gruppo R,Sarode R,Shurin S B,Chandrasekaran V,Stabler S P,Sabio H,Bouhassira E E,Upshaw J D,Jr.,Ginsburg D,Tsai H M. Mutations in a member of the
ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura.Nature.2001;413:488−494)。ADAMTS−13活性を阻害する自己抗体により生じることが多い特発性TTPは、成人および年長の小児に生じるより一般的な障害であり、11%〜36%の患者に一定の間隔で再発する可能性がある(Tsai H M,Lian E C.Antibodies to von Willebrand factor−cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura.N Engl J Med.1998;339:1585−1594、Furlan M,Lammle B.Deficiency of
von Willebrand factor−cleaving protease
in familial and acquired thrombotic thrombocytopenic purpura.Baillieres Clin Haematol.1998;11:509−514)。
B,Plaimauer B,Mohr G,Dockal M,Dorner F,Rieger M.Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor−cleaving protease(ADAMTS−13)in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura.Blood.2003;102:3241−3243)。健康な成人の血漿ADAMTS13活性は、50%〜178%の範囲である(Moake J L.Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome.Arch Pathol Lab Med.2002;126:1430−1433)。家族性または後天性のTTPを伴う大半の患者において、血漿ADAMTS13活性は欠損しているか、または正常な活性は5%未満である。治療を受けなければ、TTPの死亡率は90%を超えるが、血漿療法は、死亡率を約20%減少させている(Moake J L.Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome.Arch Pathol Lab Med.2002;126:1430−1433)。
in Weibel−Palade bodies of human endothelial cells.J Cell Biol.1982; 95:355−360、Wagner D D,Bonfanti R. von Willebrand factor and the endothelium.Mayo Clin Proc.1991;66:621−627、Sporn L A,Marder V J,Wagner D D.von Willebrand factor released from Weibel−Palade bodies binds more avidly to extracellular matrix than that secreted constitutively.Blood.1987;69:1531−1534、Tsai H M,Nagel R L,Hatcher V B,Sussman,I I.Endothelial cell−derived high molecular weight von Willebrand factor is
converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases.Biochem Biophys Res Commun.1989;158:980−985、Tsai H M,Nagel R L,Hatcher V B,Sussman,I I.Multimeric composition of endothelial cell−derived von Willebrand factor.Blood.1989;73:2074−2076)。内皮細胞から分泌されると、これらのUL−vWF多量体は、循環において、ADAMTS13によってvWF分子内の特定の切断部位で、一連のより小さい多量体に切断される(Tsai H M,Nagel R L,Hatcher V B,Sussman,I I.Endothelial cell−derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases.Biochem Biophys Res Commun.1989;158:980−985、Dent J A,Galbusera M,Ruggeri Z M.Heterogeneity of plasma von Willebrand factor
multimers resulting from proteolysis of
the constituent subunit.J Clin Invest.1991;88:774−782、Furlan M,Robles R,Affolter D,Meyer D,Baillod P,Lammle B.Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers.Proc Natl Acad Sci
USA.1993;90:7503−7507)。
in the three−dimensional structure of human von Willebrand factor.Blood.1996;88:2939−2950)。これは、vWF繊維の一端が表面に固定される時、生体内でも生じ得る。
thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to factor VIII related antigen.Thromb Res.1985;38:469−479)。TTPの再発を伴う患者は、血漿中に超大型多量体を有する。抑制物質(抗ADAMTS13 Ab)の持続がADAMTS13活性を減少させるため、UL−vWF多量体は、時間とともに蓄積する。UL−vWF多量体は、機能亢進性であり、せん断応力を受けてほどかれ、血小板の凝集を生じ、血管内血栓症をもたらす(Tsai H M.Von Willebrand factor,ADAMTS13,and thrombotic thrombocytopenic purpura.J Mol Med.2002;80:639−647、Tsai H M.Deficiency of ADAMTS−13 in thrombotic and thrombocytopenic
purpura.J Thromb Haemost.2003;1:2038−2040、discussion 2040−2035)。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも約2μMの濃度の亜鉛、または少なくとも約0.5mMの濃度のカルシウムのうちの少なくとも1つを含む培養培地中で、ADAMTSタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、方法。
(項目2)
前記培養培地は、少なくとも約2μMの亜鉛を含有する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記培養培地は、約2μM〜約12μMの間の亜鉛を含有する、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記培養培地は、少なくとも約5μMの亜鉛を含有する、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記培養培地は、約5μM〜約12μMの間の亜鉛を含有する、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記培養培地は、少なくとも約0.5mMのカルシウムを含有する、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記培養培地は、約0.5mM〜約1.5mMの間のカルシウムを含有する、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記培養培地は、少なくとも2μMの亜鉛と、少なくとも約0.5mMのカルシウムと、を含有する、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記培養培地は、少なくとも約2mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)をさらに含む、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記培養培地は、少なくとも約7mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)をさらに含む、項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記培養培地は、約2mg/L〜約10mg/Lの間のニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する、項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記培養培地は、少なくとも約0.5mg/Lのポリアミンをさらに含む、項目1〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記ポリアミンは、プトレシンである、項目12に記載の応法。
(項目14)
前記培養培地は、約2mg/L〜約8mg/Lの間のプトレシンを含有する、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記培養培地は、既知組成培地である、項目1〜15のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、項目1〜16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記細胞系は、CHO細胞系、BHK細胞系、およびHEK細胞系から成る群より選択される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記細胞系は、CHO細胞系である、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ADAMTSタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、項目1〜20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記方法は、回分細胞培養法を含む、項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、項目22に記載の方法。
(項目25)
前記方法は、連続細胞培養を含む、項目1〜21および23のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記培養は、ケモスタット様式で実施される、項目26に記載の方法。
(項目29)
前記培養は、灌流様式で実施される、項目26または27に記載の方法。
(項目30)
前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、項目27または29に記載の方法。
(項目31)
前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記培養は、少なくとも7日間維持される、項目23および25〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記培養は、少なくとも1ヶ月間維持される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記培養は、少なくとも2ヶ月間維持される、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記培養は、約35℃〜約37℃の間の温度で維持される、項目1〜34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記培養は、約6.9〜約7.3の間のpHで維持される、項目1〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記培養は、約7.05〜約7.15の間のpHで維持される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記ADAMTSタンパク質はADAMTS13である、項目1〜37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記培養培地中の前記ADAMTS13タンパク質の比活性は、1mgのADAMTS13タンパク質当り少なくとも約600Uである、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記培養培地中の前記ADAMTS13タンパク質の比活性は、1mgのADAMTS13タンパク質当り少なくとも約800Uである、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記培養は、1日につき1Lの培養物当り少なくとも約400UのADAMTS13活性(U/L/D)をもたらす、項目38〜40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
前記培養は、1日につき1Lの培養物当り少なくとも約800UのADAMTS13活性(U/L/D)をもたらす、項目41に記載の方法。
(項目43)
ADAMTS組成物を産生するための方法であって、
(a)動物性タンパク質を含まない培養培地中で、ADAMTSタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、
(b)前記培養物から上清の分画を除去するステップと、
(c)あらゆる残留細胞を除去するために、濾過または遠心分離のステップを実施するステップと、
(d)前記ADAMTSタンパク質を濃縮するために、限外濾過ステップを実施するステップと、
(e)少なくとも約0.5μMnの亜鉛と、少なくとも約0.1mMのカルシウムとを含む緩衝液を用いて、透析濾過を実施し、それによってADAMTS組成物を調製するステップと、を含む、方法。
(項目44)
細胞を培養する前記ステップは、回分細胞培養を含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
細胞を培養する前記ステップは、連続細胞培養を含む、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記培養培地は、カルシウムを含有する、項目43〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記培養培地は、少なくとも0.5mMのカルシウムを含有する、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記培養培地は、亜鉛を含有する、項目43〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記培養培地は、少なくとも2μMの亜鉛を含有する、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記培養培地は、ニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する、項目43〜49のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記培養培地は、少なくとも2mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記透析緩衝液は、少なくとも約5μMの亜鉛と、少なくとも約2mMのカルシウムと、を含有する、項目43〜51のいずれか1項に記載の方法。
(項目53)
前記ADAMTSタンパク質はADAMTS13である、項目43〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目54)
前記ADAMTS13の比活性の約20%未満が、前記ステップ(c)の終わりと前記ステップ(e)の終わりの間に失われる、項目43〜53のいずれか1項に記載の方法。
(項目55)
前記ADAMTS13の比活性の約10%未満が、前記ステップ(c)の終わりと前記ステップ(e)の終わりの間に失われる、項目54に記載の方法。
(項目56)
前記ADAMTS13組成物は、少なくとも約1000U/mgの比活性を有する、項目43〜55のいずれか1項に記載の方法。
(項目57)
前記ADAMTS13組成物は、少なくとも約1500U/mgの比活性を有する、項目56に記載の方法。
(項目58)
項目1〜42のいずれか1項に記載の方法に従って、細胞培養物中にADAMTSタンパク質を発現させることを含む方法により調製される、ADAMTSタンパク質組成物。
(項目59)
項目43〜57のいずれか1項に記載の方法に従う方法により調製される、ADAMTSタンパク質組成物。
本願発明は、さらに以下の項目を提供する。
(項目A1)
トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも3μMの亜鉛を含む培養培地中で、ADAMTSタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、ここで、該方法に従って発現されたADAMTSタンパク質は、1.5μMの亜鉛を含む培養培地中で発現されたADAMTSタンパク質と比較して、より高い比活性を有する、方法。
(項目A2)
前記培養培地は、3μM〜12μMの間の亜鉛を含有する、項目A1に記載の方法。
(項目A3)
前記培養培地は、少なくとも5μMの亜鉛を含有する、項目A1または2に記載の方法。
(項目A4)
前記培養培地は、5μM〜12μMの間の亜鉛を含有する、項目A1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目A5)
前記培養培地は、少なくとも0.5mMのカルシウムを含有する、項目A1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目A6)
前記培養培地は、0.5mM〜1.5mMの間のカルシウムを含有する、項目A5に記載の方法。
(項目A7)
前記培養培地は、少なくとも2mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)をさらに含む、項目A1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目A8)
前記培養培地は、少なくとも7mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)をさらに含む、項目A1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目A9)
前記培養培地は、2mg/L〜10mg/Lの間のニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する、項目A1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目A10)
前記培養培地は、少なくとも0.5mg/Lのポリアミンをさらに含む、項目A1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目A11)
前記ポリアミンは、プトレシンである、項目A10に記載の方法。
(項目A12)
前記培養培地は、2mg/L〜8mg/Lの間のプトレシンを含有する、項目A11に記載の方法。
(項目A13)
前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、項目A1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目A14)
前記培養培地は、既知組成培地である、項目A1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目A15)
前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、項目A1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目A16)
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、項目A15に記載の方法。
(項目A17)
前記細胞系は、CHO細胞系、BHK細胞系、およびHEK細胞系から成る群より選択される、項目A16に記載の方法。
(項目A18)
前記細胞系は、CHO細胞系である、項目A17に記載の方法。
(項目A19)
前記ADAMTSタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、項目A1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目A20)
前記方法は、回分細胞培養を含む、項目A1〜19のいずれか1項に記載の方法。
(項目A21)
前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、項目A20に記載の方法。
(項目A22)
前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、項目A20に記載の方法。
(項目A23)
前記方法は、連続細胞培養を含む、項目A1〜19および21のいずれか1項に記載の方法。
(項目A24)
前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、項目A23に記載の方法。
(項目A25)
前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、項目A23に記載の方法。
(項目A26)
前記培養は、ケモスタット様式で実施される、項目A24に記載の方法。
(項目A27)
前記培養は、灌流様式で実施される、項目A24または25に記載の方法。
(項目A28)
前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、項目A25または26に記載の方法。
(項目A29)
前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、項目A28に記載の方法。
(項目A30)
前記培養は、少なくとも7日間維持される、項目A21および23〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目A31)
前記培養は、少なくとも1ヶ月間維持される、項目A30に記載の方法。
(項目A32)
前記培養は、少なくとも2ヶ月間維持される、項目A31に記載の方法。
(項目A33)
前記培養は、35℃〜37℃の間の温度で維持される、項目A1〜32のいずれか1項に記載の方法。
(項目A34)
前記培養は、6.9〜7.3の間のpHで維持される、項目A1〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目A35)
前記培養は、7.05〜7.15の間のpHで維持される、項目A34に記載の方法。
(項目A36)
前記ADAMTSタンパク質はADAMTS13である、項目A1〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目A37)
前記培養培地中の前記ADAMTS13タンパク質の比活性は、1mgのADAMTS13タンパク質当り少なくとも600Uである、項目A36に記載の方法。
(項目A38)
前記培養培地中の前記ADAMTS13タンパク質の比活性は、1mgのADAMTS13タンパク質当り少なくとも800Uである、項目A37に記載の方法。
(項目A39)
前記培養は、1日につき1Lの培養物当り少なくとも400UのADAMTS13活性(U/L/D)をもたらす、項目A36〜38のいずれか1項に記載の方法。
(項目A40)
前記培養は、1日につき1Lの培養物当り少なくとも800UのADAMTS13活性(U/L/D)をもたらす、項目A39に記載の方法。
ADAMTSタンパク質(すなわち、ADAMTS−1〜ADAMTS−20)は、共通のモジュラードメイン構成を共有する分泌亜鉛メタロプロテイナーゼのファミリーである(概説については、Flannery C.R.,Front Biosci.2006 Jan 1;11:544−69を参照)。ADAMTSタンパク質は全て、共通のコアドメイン構造を共有し、シグナルペプチド、次いで、プロドメイン、亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジンI型反復、高システインドメイン、およびスペーサードメインから成る(Apte S.S.,J Biol Chem.2009 Nov 13;284(46):31493−7)。加えて、ADAMTS−4を除く全ては、少なくとももう1つのトロンボスポンジンI型反復ドメインを含有し、ADAMTSタンパク質の多くは、1つ以上のさらなる補助的なドメインを含有する。特に、全てのADAMTSタンパク質は、メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン内に位置する少なくとも1つのカルシウム結合部位と、少なくとも1つの亜鉛結合部位とを含有するように思われることが報告されている(Andreini et al.,J.Proteome Res.,2005,4(3),pp881−888)。
本明細書に使用される、「ビタミンB3」、「ニコチンアミド」、「ナイアシンアミド」、「ナイアシン」、および「ニコチン酸」という用語は、ビタミンのB3ファミリーのいずれの成員を指すために、交換可能に使用され得る。したがって、本ファミリーのいずれの成員も、本発明の方法に使用される培地を補充するために使用され得る。
一態様において、本発明は、高比活性を有するトロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(ADAMTS)タンパク質を発現させる方法を提供する。一実施形態において、方法は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド(ビタミンB3)から選択される少なくとも1つの成分で補充された培養培地中で、ADAMTSタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、ADAMTSタンパク質は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド(ビタミンB3)から選択される少なくとも2つの成分で補充された培地中に発現する。また別の実施形態において、培養培地は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド(ビタミンB3)で補充される。特定の実施形態において、ADAMTSタンパク質の発現に使用される培養培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成培地を含む場合がある。
N InnoLet SubQの詳細な論文から計算して、約1mg/L〜約10mg/Lの間のインスリンでの培地補充は、約0.03μM〜約1.5μMの亜鉛の補充ももたらすであろう濃度で亜鉛を含有する。したがって、一実施形態において、ADAMTSタンパク質の発現に使用される培養培地は、亜鉛含有インスリン調製物で補充され得る。
一態様において、本発明は、増加した全活性および/または比活性を有するADAMTS13タンパク質を発現させるための方法を提供する。有利に、カルシウム、亜鉛、および/またはニコチンアミド(ビタミンB3)で増殖培地を補充することにより、高比活性を有するADAMTS13ポリペプチドは、細胞培養物から組み換えにより発現し、回収され得ることが分かった。
有利に、増加したADAMTS13酵素活性および比活性は、亜鉛で補充された培地で増殖させた細胞培養物から回収され得ることが分かった。例えば、実施例1は、1.432mg/LのZnSO4・7H2O(5μMの亜鉛)を含有する培養培地中に発現したADAMTS13タンパク質が、0.432mg/LのみのZnSO4・7H2O(1.5μMの亜鉛)を含有する培養培地中に発現したADAMTS13タンパク質より40%〜100%高い比活性を有することを示す(表10および表11を比較)。さらに、この効果は、実施例2(表13および表14を比較)、実施例4(表16〜表19)、および実施例5(表20および表21)に示されるように、再現可能である。
有利に、増加したADAMTS13酵素活性および比活性は、カルシウムで補充された培地で増殖させた細胞培養物から回収され得ることが分かった。従来の細胞培養培地、例えば、DMEM/F12は、通常、約1mMのカルシウムを含有した。歴史的に、これらの高カルシウムレベルは、付着細胞培養物を補助するために、培地中に導入された。しかしながら、今日、浮遊培養用に設計された市販の培地は、非常に低いカルシウムレベル、例えば、約0.1mMのカルシウムを含有する。浮遊法を介して培養される細胞の凝集を防止するために、そのような低カルシウムレベルに依存する。低カルシウムレベルは、浮遊液中で細胞を繁殖させ、組み換えタンパク質を発現させるために十分であることが知られているが、本発明は、これらの低カルシウムレベルがADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)の発現に不十分であることを発見した。
有利に、増加したADAMTS13酵素活性および比活性は、ニコチンアミド(ビタミンB3)で補充された培地で増殖させた細胞培養物から回収され得ることが分かった。例えば、実施例2は、7mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する培養培地中に発現したADAMTS13タンパク質が、2mg/Lのみのニコチンアミドを含有する培養培地中に発現したADAMTS13タンパク質より60%高い得的活性を有することを示す(表13、4日目および7日目を11日目と比較)。意外にも、本作用は、7mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)と5μMの亜鉛を含有する培地中におけるADAMTS13の発現が、ADAMTS13タンパク質の比活性において200%〜300%の増加をもたらすので、亜鉛補充と相乗的である(表14の11日目と表13の4日目および7日目とを比較)。
組み換えADAMTSタンパク質は、適切な原核または真核宿主系における発現により産生され得る。真核細胞の例としては、CHO、COS、HEK293、BHK、SK−Hep、およびHepG2等の哺乳類細胞、昆虫細胞(例えば、SF9細胞、SF21細胞、S2細胞、およびHigh Five細胞)、ならびに酵母細胞(例えば、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス細胞)が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ADAMTSタンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞等において発現され得る。例えば、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、またはマウス細胞系においてである。特定の一実施形態において、細胞株は、CHO、BHK、またはHEK細胞系である。好ましい実施形態において、細胞系は、CHO細胞系である。
CRL1651)により形質転換されたサルの腎臓CV1系、ヒト胚腎臓系(浮遊培養物中での増殖のためにサブクローン化された293または293細胞、Graham et al.,J.Gen Virol.,36:59(1977))、仔ハムスター腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)、DUKX−B11サブクローン等のチャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO,Uriaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、マウスセルトリ細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod,23:243−251(1980))、サルの腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、アフリカ緑ザルの腎細胞(VERO−76,ATCC CRL−1587)、ヒトの頚部癌細胞(HeLa,ATCC CCL 2)、イヌの腎細胞(MDCK,ATCC CCL34)、バッファロラット肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL1442)、ヒトの肺細胞(W138,ATCC CCL75)、ヒトの肝細胞(Hep G2,HB8065)、マウスの乳房腫瘍(MMT 060562,ATCC CCL51)、TRI細胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44−68(1982))、MRC5細胞、FS4細胞、およびヒトの肝細胞腫系(Hep G2)が挙げられる。好ましくは、細胞系は、ゲッ齒類細胞系、特に、CHOまたはBHK等のハムスター細胞系である。
特定の実施形態において、本発明の方法は、回分または連続様式操作下で操作される細胞培養系の使用を含むことができる。例えば、回分細胞培養が利用される時、それらは、単一回分、流加、または反復回分様式下で操作され得る。同様に、連続細胞培養は、例えば、灌流、タービドスタット、またはケモスタット様式下で操作され得る。回分および連続細胞培養は、浮遊または付着条件のいずれかの下で実施され得る。浮遊条件下で操作される時、細胞は、自由に培養培地内に浮遊し、混合される。代替的に、付着条件下で、細胞は、固体相、例えば、マイクロキャリア、多孔質マイクロキャリア、ディスクキャリア、セラミックカートリッジ、中空ファイバ、フィラットシート、ゲルマトリクス等に結合される。
有利に、本発明は、連続培養において高比活性を有するADAMTSタンパク質、例えば、ADAMTS13を発現させる方法を提供する。これらの方法は、長期間にわたり単一培養からのADAMTSタンパク質の発現および精製を可能にする。具体的に、高レベルのADAMTS13タンパク質の発現および比活性は、本発明により提供される条件下の10Lのケモスタット生物反応器中で、少なくとも53日間維持され得ることが分かった(実施例3、表15を参照)。好ましい実施形態において、ADAMTSタンパク質は、ADAMTS13である。
別の態様において、本発明は、回分培養において高比活性を有するADAMTSタンパク質、例えば、ADAMTS13を発現させる方法を提供する。一部の実施形態において、培養培地は、例えば、変形形態1〜変形形態149(表2〜表9)のうちのいずれか1つに従う濃度で、カルシウム、亜鉛、またはニコチンアミド(ビタミンB3)のうちの少なくとも1つで補充され得る。特定の一実施形態において、方法は、単一回分細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、流加細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、反復回分細胞培養の使用を含む。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ADAMTSタンパク質は、ADAMTS13である。
意外にも、細胞生存率およびADAMTS13活性は、細胞培養物のpHおよび温度のわずかな変動により増加され得ることも分かった。図2に見られるように、発現したADAMTS13の比活性は、ADAMTS13タンパク質をコードするヌクレオチドを持つ細胞が約7.30未満で培養される時に非常に強化される。程度は低いが、これらの試験において、温度もADAMTS13の比活性に寄与する要因である。同様に、約6.80〜約7.3の間のpHで増殖させた培養物の上清におけるA13の容量生産能(FRETS−VWF73により測定される)は、その範囲の上下のpHレベルと比較して非常に増加したことが分かった。ADAMTS13生産能は、培養物の温度によっても影響を受けた。最大活性は、約34℃〜約37℃の間の温度で増殖させた培養物で認められた。
一態様において、本発明は、高比活性を有するADAMTSタンパク質の発現に有用である培養培地を提供する。有利に、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド(ビタミンB3)の組み合わせ等の、種々の成分で培養培地を補充することにより、培地で培養される細胞中で発現するADAMTS(例えば、ADAMTS13)酵素の活性は、非常に強化され、それと同時に、酵素は、補充されない培地で培養された細胞と、より高くはないとしても同等のレベルで発現することが分かった。
特定の態様において、本発明は、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加されたタンパク質を含まない。「タンパク質を含まない培養培地」および関連する用語は、培養物中の細胞に外因性である、またはその細胞以外の供給源からのタンパク質を欠損する培養培地を指し、これは、増殖中にタンパク質を自然に排出する。一実施形態において、外因的に追加されたタンパク質を含まない(すなわち、タンパク質を含まない)ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、亜鉛、カルシウム、および/またはニコチンアミド(ビタミンB3)で補充される。ある実施形態において、タンパク質を含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも2mg/L、または2mg/L〜30mg/Lもしくは約その間、または2mg/L〜8mg/Lもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。タンパク質を含まない培養培地の例は、米国特許第6,171,825号および同第6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許出願公開第2008/0009040号および同第2007/0212770号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の態様において、本発明は、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加されたオリゴペプチドを含まない。一実施形態において、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に添加されたオリゴペプチドを含まず(すなわち、ポリペプチドを含まない)、亜鉛、カルシウム、および/またはニコチンアミド(ビタミンB3)で補充される。ある実施形態において、オリゴペプチドを含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも2mg/L、または2mg/L〜30mg/Lもしくは約その間、または2mg/L〜8mg/Lもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。オリゴペプチドを含まない培養培地の例は、米国特許第6,171,825号および同第6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許出願公開第2008/0009040号および同第2007/0212770号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の態様において、本発明は、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、これは、血清を含まない。一実施形態において、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加された血清を含まず(すなわち、血清を含まない)、亜鉛、カルシウム、および/またはニコチンアミド(ビタミンB3)で補充される。ある実施形態において、血清を含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも2mg/L、または2mg/L〜30mg/Lもしくは約その間、または2mg/L〜8mg/Lもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。血清を含まない培養培地の例は、米国特許第6,171,825号および同第6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許出願公開第2008/0009040号および同第2007/0212770号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の態様において、本発明は、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、これは、動物性タンパク質を含まない。一実施形態において、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加された動物性タンパク質またはポリペプチドを含まず(すなわち、動物性タンパク質を含まない)、亜鉛、カルシウム、および/またはニコチンアミド(ビタミンB3)で補充される。特定の実施形態において、動物性タンパク質を含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも2mg/L、または2mg/L〜30mg/Lもしくは約その間、または2mg/L〜8mg/Lもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。動物性タンパク質を含まない培養培地の例は、米国特許第6,171,825号および同第6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許出願公開第2008/0009040号および同第2007/0212770号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ADAMTS13は、生体内の血漿中に分泌され、そこでは、大きなvWFの多量体を切断することにより、凝固活性を調節するように機能する。発現後、哺乳類細胞のADAMTS13を分泌する能力は、細胞培養物中のADAMTS13組成物の産生および精製中に利用され得る。例えば、哺乳類細胞培養物中で組み換えADAMTS13を発現させることにより、ADAMTS13組成物は、細胞を採取し、溶解する必要なく、直接培養物の上清から容易に回収され得る。これは、複数の培養遅延および回収期間なく、大量のタンパク質を産生するための、連続細胞培養(例えば、灌流またはケモスタット細胞培養)等の技法の使用を可能にする。本発明の一態様において、高比活性を有するADAMTSタンパク質を細胞培養物から精製するための方法を提供する。
通常、培養物の上清から分泌タンパク質を精製する場合、精製プロセスの第1ステップは、培養培地を緩衝溶液と交換することを含み、これは、関心のタンパク質のさらなる精製を促進する。培養培地を緩衝液と交換するためのいくつかの選択肢が存在し、透析濾過、透析、緩衝液交換法、ゲル濾過、クロマトグラフィ等が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)組成物は、1つ以上のクロマトグラフィステップによりさらに富化される。一実施形態において、富化されたADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)組成物を提供するための方法を提供し、本方法は、(a)培養培地中でADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、(b)ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)を含有する培養培地の上清の一部を回収するステップと、(c)培養培地の上清を亜鉛およびカルシウムを含有する緩衝溶液と交換し、第1のADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)組成物を形成するステップと、(d)ADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)をクロマトグラフィステップを用いてさらに富化し、これによって富化されたADAMTS(例えば、ADAMTS13)組成物を提供するステップとを含む。一実施形態において、培養培地は、亜鉛、カルシウム、および任意にニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する。好ましい実施形態において、細胞を培養するステップは、連続培養(例えば、灌流またはケモスタット培養)を含む。別の好ましい実施形態において、培養物は、34℃〜37℃の間の温度で維持される。また別の好ましい実施形態において、培養物は、6.9〜7.2の間のpHで維持される。
特定の実施形態において、ADAMTS(例えば、ADAMTS13)組成物を調製するために本明細書に提供される方法は、少なくとも1つのウイルスの不活性化または除去ステップをさらに含む。ある実施形態において、本明細書に提供される方法は、少なくとも2つ、または少なくとも3つのウイルスの不活性化または除去ステップを含む。本明細書に提供される方法により利用され得るウイルスの不活性化または除去ステップの例としては、溶媒界面活性剤処理(Horowitz et al.,Blood Coagul Fibrinolysis1994(5 Suppl 3)、S21−S28 and Kreil et al.,Transfusion2003(43):1023−1028、これらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる)、ナノ濾過(Hamamoto et al.,Vox Sang1989(56)230−236およびYuasa et al.,J Gen Virol.1991(72(pt8)):2021−2024、これらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明は、ADAMTS(例えば、ADAMTS13)組成物を調製するための方法を提供し、溶媒界面活性剤処理およびナノ濾過を含む。
ADAMTS培養物中に存在し得る種々のウイルス汚染物質を不活性化するために、1つ以上のADAMTS(例えば、ADAMTS13)中間溶体は、溶媒界面活性剤(S/D)処理を受けることができる。溶液を界面活性剤処理するための方法は、当該分野において周知である(概説については、Pelletier JP et al.,Best
Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205−42を参照し、その開示は、全ての目的において、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる)。一般に、いかなる標準的なS/D処理も、本明細書に提供される方法と併用して使用され得る。例えば、S/D処理のための例示的なプロトコルは、以下に提供される。
本明細書に提供されるADAMTSタンパク質(例えば、ADAMTS13)組成物のウイルス量を低減するために、組成物は、適切なナノ濾過デバイスを使用してナノ濾過され得る。ある実施形態において、ナノ濾過デバイスは、15nm〜200nmもしくは約その間の平均孔径を有する。この使用に適切なナノフィルタの例としては、DVD、DV50、DV20(Pall)、Viresolve NFP(登録商標)、Viresolve NFR(登録商標)(Millipore)、Planova(登録商標)15N、20N、35N、および75N(Planova)が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、ナノフィルタは、15〜72nmもしくは約その間、または19〜35nmもしくはその間、または15nm、19nm、20nm、35nm、もしくは72nm、または約それらの平均孔径を有し得る。好ましい実施形態において、ナノフィルタは、Asahi PLANOVA(登録商標)20NもしくはPLANOVA(登録商標)35Nフィルタ、またはそれらの等価物等の、19nm、20nm、もしくは35nm、または約それらの平均孔径を有する。
また他の実施形態において、ナノ濾過等の他のウイルスの不活性化または除去ステップ
に前に曝された、凍結乾燥されたADAMTS13タンパク質(例えば、ADAMTS13)組成物のウイルス活性は、凍結乾燥された組成物の加熱処理によりさらに低減され得る。血液因子中のウイルス量を不活性化するための加熱処理は、当該分野において周知である(例えば、Piszkiewicz et al.,Thromb Res.1987 Jul 15;47(2):235−41、Piszkiewicz et al.,Curr Stud Hematol Blood Transfus.1989;(56):44−54、Epstein and Fricke,Arch Pathol
Lab Med.1990 Mar;114(3):335−40を参照)。
有利に、亜鉛、カルシウム、および/またはニコチンアミド(ビタミンB3)で補充された細胞培養物中で発現させたADAMTS13等のADAMTSタンパク質は、予想外に、高比活性を有することが分かった。本明細書に提供されるように、本方法は、高比活性を有するそのようなADAMTSタンパク質の連続発現および回収のために開発された。例えば、本明細書に提供される連続細胞培養法は、1週間を超える間、1000U/mg超の比活性を有する、1日につき1リットル当り1mgのADAMTS13超の発現を可能にする。同様に、ADAMTS13タンパク質の精製中に通常遭遇する、活性の損失を低減させるための方法も、本明細書において提供される。
実施例1
既知組成BACD−A13培地中にヒトADAMTS13を発現する組み換えHEK293細胞系1020/1 013−2の生物反応器培養物を使用して、流加実験を実施した。培養培地をさらなる亜鉛で補充することの効果を調べた。
既知組成BACD−A13培地中にヒトADAMTS13を発現する組み換えCHO細胞系#938の生物反応器培養物を使用して、流加実験を実施した。培養培地をさらなる亜鉛および/またはビタミンB3で補充することの効果を調べた。
ヒトADAMTS13を発現する組み換えCHO細胞系#640−2のケモスタット細胞培養物を、さらなる亜鉛およびビタミンB13で補充した既知組成BACD−A13培地中で増殖させた。10Lの培養物を53日間維持し、A13タンパク質および活性の産生を経時的に監視した。
既知組成BACD−A13培地中にヒトADAMTS13を発現する組み換えCHO細胞系#640−2の生物反応器培養物を使用して、流加およびケモスタット細胞培養実験を実施した。異なるレベルの亜鉛で培養培地を補充することの効果を調べた。
既知組成BACD−A13培地中にヒトADAMTS13を発現する組み換えCHO細胞系#F6の生物反応器培養物を使用して、流加およびケモスタット細胞培養実験を実施した。より高レベルの亜鉛で培養培地を補充することの効果を調べた。
50Lの生物反応器で、さらなる亜鉛およびニコチンアミドで補充した既知組成BACD−A13培地中の組み換えCHO細胞系#640−2において、ヒトA13タンパク質を発現させた。培養物の上清を採取した後、亜鉛およびカルシウムを含む、および含まない緩衝液を使用して、限外/透析濾過(50kD)ステップの比較を実施した。
ケモスタットおよび灌流連続細胞培養法を、いくつかの組み換えCHO細胞系で発現するA13の相対的産生および比活性を決定するために比較した。
既知組成の動物性タンパク質を含まない培養培地を使用して、真核細胞培養物中で増殖させた組み換えヒトADAMTS13タンパク質の産生に対する温度およびpHの作用を決定するために、7.05〜7.30の間のpHで、35.0℃〜38.0℃の間の温度で、培養物を増殖させた。
Claims (14)
- 細胞培養上清からのADAMTS活性の回収を増加させるための方法であって、該方法は、以下:
(a)培養培地中でADAMTSタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップ;
(b)該培養物から該上清の分画を取り出すステップ;
(c)該培養物から取り出した該上清の該分画から残留細胞を除去するために濾過または遠心分離のステップを行い、それによって、清澄な上清を形成するステップ;
(d)該清澄な上清中のADAMTSタンパク質を限外濾過により濃縮し、それによって、濃縮された上清を形成するステップ;および
(e)少なくとも5μMの亜鉛および少なくとも2mMのカルシウムを含有する緩衝液に対して該濃縮された上清を透析濾過し、それによって、ADAMTS活性の回収が増加したADAMTS組成物を調製するステップ
を包含する、方法。 - 前記培養培地が少なくとも3μMの亜鉛および少なくとも0.5mMのカルシウムを含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記培養培地が少なくとも5μMの亜鉛を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記培養培地が5μM〜12μMの亜鉛を含有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養培地が少なくとも2mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養培地が少なくとも7mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養培地が2mg/L〜10mg/Lのニコチンアミド(ビタミンB3)を含有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ADAMTSタンパク質がADAMTS13である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ADAMTS13がヒトADAMTS13である、請求項8に記載の方法。
- ステップ(e)において形成された前記組成物のADAMTS13比活性が、ステップ(c)において形成された前記清澄な上清のADAMTS13比活性の少なくとも80%である、請求項9に記載の方法。
- ステップ(e)において形成された前記組成物のADAMTS13比活性が、ステップ(c)において形成された前記清澄な上清のADAMTS13比活性の少なくとも85%である、請求項9に記載の方法。
- ステップ(e)において形成された前記組成物のADAMTS13比活性が、ステップ(c)において形成された前記清澄な上清のADAMTS13比活性の少なくとも90%である、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞を培養するステップが、回分細胞培養を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞を培養するステップが、連続細胞培養を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
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