JP2018093881A

JP2018093881A - Ａｄａｍｔｓタンパク質発現のための細胞培養培地

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Publication number: JP2018093881A
Application number: JP2018011373A
Authority: JP
Inventors: グリルベルガーレオポルト; Leopold Grillberger; スペンガーアレクサンドラ; Spenger Alexandra; ハッスラッカーマインハルト; Hasslacher Meinhard; グリルベルガーラナ; Grillberger Rana; ライターマンフレート; Manfred Leiter
Original assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2018-06-21
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: HUE029110T2; BR112012002151A2; KR20150044981A; US8313926B2; JP2016144471A; HK1171790A1; EA023193B1; JP7083059B2; US8759026B2; US20200308566A1; US20130071906A1; EP2459702B1; KR101573972B1; KR20170140411A; BR122021005965B1; JP2014061005A; KR20150138425A; WO2011014838A1; US20190071660A1; JP2021112210A

Abstract

【課題】ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させる方法を提供する。【解決手段】トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法であって、該方法は、連続培養により、少なくとも３μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養するステップを含み、該連続培養は、１×１０６細胞／ｍＬ〜４×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で少なくとも７日間維持することを含む、方法。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年７月３１日に出願された、米国仮出願第６１／２３０，４７７号の利益を主張し、全ての目的において、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

政府支援による研究または開発の下で行われた発明に対する権利に関する記述
適用なし

コンパクトディスクにより提出された、「配列リスト」、表、またはコンピュータプログラムリスト付録への言及
適用なし

ＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）タンパク質は、亜鉛依存性触媒ドメイン、高システインドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、および少なくとも１つの、そして多くの場合複数のトロンボスポンジンＩ型反復を含む、いくつかの保存ドメインを含有するメタロプロテイナーゼのファミリーである（概説は、非特許文献１（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎｅｔａｌ．，ＢＭＣＥｖｏｌＢｉｏｌ．２００５Ｆｅｂ４；５（１）：１１）を参照）。これらのタンパク質は、進化的に、メタロプロテイナーゼのＡＤＡＭおよびＭＭＰのファミリーに関連し（ＪｏｎｅｓＧＣ，ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６
Ｆｅｂ；７（１）：２５−３１）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）（Ｍｏａｋｅ
ＪＬ，ＳｅｍｉｎＨｅｍａｔｏｌ．２００４Ｊａｎ；４１（１）：４−１４）、結合組織障害、癌、炎症（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎｅｔａｌ．）、および重度の熱帯熱マラリア（Ｌａｒｋｉｎｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ．２００９Ｍａｒ；５（３）：ｅ１０００３４９）を含む、いくつかの疾患および状態と関連付けられている分泌酵素である。これらの関連性のため、ＡＤＡＭＴＳ酵素は、いくつかの病態の可能性のある治療標的として認識されている（ＪｏｎｅｓＧＣ，ＣｕｒｒＰｈａｒｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６Ｆｅｂ；７（１）：２５−３１）。したがって、ウイルス、ＢＳＥ、およびマイコプラズマ菌のような病原体等の汚染物を含まない、高比活性を有する高収率のＡＤＡＭＴＳタンパク質を産生する方法が必要とされる。

細胞、特に真核細胞、より具体的には哺乳類細胞の培養のために、細胞の効率的な増殖、ならびに生物学的産物、特に、例えば組み換えタンパク質、抗体、ウイルス、ウイルス抗原、およびウイルス様粒子等の生物製剤の産生に必要な栄養物質を提供する、特別な培養培地を使用する必要性が常に存在する。前記生物学的産物の効率的な産生には、最大限の産生収率を得るために、最適な細胞密度ならびにタンパク質発現自体の増加を達成することが重要である。

細胞培養培地の配合物は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、いくつかの動物に由来するタンパク質、および／またはウシ由来のタンパク質加水分解物、ならびに植物もしくは酵母由来のタンパク質加水分解物のような不定の成分を含む、様々な添加物で補充されている。

一般に、例えば、アルブミン、トランスフェリン、インスリン等の血清または血清由来物質は、その得られた細胞培養物およびその生物学的産物を汚染し得る不要な作用物質を含む場合がある。さらに、ヒト血清由来添加物は、血清を介して感染する可能性がある肝炎ウイルスおよびＨＩＶを含む、全ての既知のウイルスについて試験されなければならない。また、ウシ血清およびその由来産物は、ＢＳＥ汚染のリスクがある。加えて、全ての血清由来産物は、未知の物質によって汚染される可能性がある。細胞培養にヒトまたは動物源に由来する血清またはタンパク質添加物を使用する時、特に、細胞がヒト投与用の薬物またはワクチンの製造に使用される場合、多くの問題（例えば、異なる回分の組成物における質の差、およびマイコプラズマ、ウイルス、またはＢＳＥで汚染されるリスク）が存在する。

したがって、血清または他の動物性タンパク質化合物を必要としない、効率的な宿主系および培養条件を提供するための多くの試みが行われている。

そのような血清を含まない培地は、植物または酵母に由来するタンパク質抽出物に基づいて開発されている。例えば、大豆加水分解物は、発酵プロセスに有用であることが知られており、多くの選好性生物、酵母、および真菌の増殖を強化することができる。国際公開第９６／２６２６６号は、大豆ミールのパパイン消化物が炭水化物および窒素の源であり、成分の多くが組織培養で使用され得ることを説明している。Ｆｒａｎｅｋら（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒｅｓｓ（２０００）１６，６８８−６９２）は、定義される大豆および小麦の加水分解物ペプチド分画の増殖および産生能の促進作用を説明している。

国際公開第９６／１５２３１号は、脊椎動物細胞の繁殖およびウイルス産生プロセス用の合成最小必須培地と酵母抽出物とから成る無血清培地を開示している。動物細胞増殖用の米ペプチド、および酵母抽出物とその酵素消化物、ならびに／または植物脂質を含む基礎細胞培養培地から成る培地配合物が、国際公開第９８／１５６１４号に開示されている。組み換え細胞の培養用の精製された大豆加水分解物を含む培地が、国際公開第０１／２３５２７号に開示されている。国際公開第００／０３０００号は、大豆加水分解物および酵母抽出物を含むが、増殖因子等の動物タンパク質の組み換え形態の存在も必要とする培地を開示している。

第ＥＰ−Ａ−０４８１７９１号は、動物源から単離されたタンパク質、脂質、および炭水化物を含まず、さらに組み換えインスリンまたはインスリン類似体、１％〜０．０２５％ｗ／ｖパパイン消化大豆ペプトン、およびプトレシンを含む、操作されたＣＨＯ細胞を培養するための、生化学的に定義された培養培地を説明している。国際公開第９８／０８９３４号は、加水分解された大豆ペプチド（１〜１０００ｍｇ／Ｌ）、０．０１〜１ｍｇ／Ｌのプトレシン、ならびにアルブミン、フェチュイン、種々のホルモン、および他のタンパク質を含む、種々の動物由来成分を含む、無血清真核細胞培養物を説明している。この内容において、プトレシンは、０．０８ｍｇ／Ｌの濃度で、ＤＭＥＭ／ＨａｍのＦ１２のような標準培地に含まれていることも知られていることに留意するべきである。

しかしながら、植物および／または酵母加水分解物は、オリゴペプチドならびに他の未知の成分および汚染物の未定義の混合物である。また、市販の加水分解物のロットの質は、非常に変動する。結果として、使用される加水分解物のロットのに関連して、組み換えタンパク質またはウイルス産物の産生において、多くの変動（ロット間の変動）が存在する（最大３倍の変動）。この欠点は、細胞の増殖ならびに各細胞のタンパク質発現に影響を及ぼす。ＵＳ第２００７／０２１２７７０号は、組み換えタンパク質生物製剤の大規模な産生に有用である、種々の動物性タンパク質を含まず、オリゴペプチドを含まない、既知組成培養培地を説明している。

ＡＤＡＭＴＳファミリーの１つの成員であるＡＤＡＭＴＳ１３は、残基Ｔｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６との間のフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）を切断し、これは生体内における大型ｖＷＦ多量体の分解に関与する機能である。ＡＤＡＭＴＳ１３活性の欠損は、ＴＴＰ（ＭｏａｋｅＪＬ，ＳｅｍｉｎＨｅｍａｔｏｌ．２００４Ｊａｎ；４１（１）：４−１４）、急性および慢性炎症（Ｃｈａｕｈａｎｅｔａｌ．，ＪＥｘｐＭｅｄ．２００８Ｓｅｐ１；２０５（９）：２０６５−７４）、および最近では重度の熱帯熱マラリア（Ｌａｒｋｉｎｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ．２００９Ｍａｒ；５（３）：ｅ１０００３４９）等の、いくつかの状態と関連付けられている。

血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）は、種々の程度の組織虚血および梗塞をもたらす可能性がある、血栓性微小血管障害、血小板減少症、および微小血管血栓症を特徴とする疾患である。臨床的に、ＴＴＰ患者は、血小板減少、分裂赤血球（赤血球の断片化）、および乳酸デヒドロゲナーゼのレベル上昇等の症状によって診断される（ＭｏａｋｅＪＬ．Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｍｉｃｒｏａｎｇｉｏｐａｔｈｉｅｓ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．２００２；３４７：５８９−６００、ＭｏａｋｅＪＬ．ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ，ＡＤＡＭＴＳ１３，ａｎｄｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＳｅｍｉｎＨｅｍａｔｏｌ．２００４；４１：４−１４、ＳａｄｌｅｒＪＥ，ＭｏａｋｅＪＬ，ＭｉｙａｔａＴ，ＧｅｏｒｇｅＪＮ．Ｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（ＡｍＳｏｃＨｅｍａｔｏｌＥｄｕｃＰｒｏｇｒａｍ）．２００４：４０７−４２３、ＳａｄｌｅｒＪＥ．ＮｅｗｃｏｎｃｅｐｔｓｉｎｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｄｉｓｅａｓｅ．ＡｎｎｕＲｅｖＭｅｄ．２００５；５６：１７３−１９１）。

１９８２年に、Ｍｏａｋｅらは、慢性の再発ＴＴＰを有する患者の血漿において、異常に大型のフォンビルブランド因子（ＵＬ−ｖＷＦ）多量体を認めた（ＭｏａｋｅＪＬ，ＲｕｄｙＣＫ，ＴｒｏｌｌＪＨ，ＷｅｉｎｓｔｅｉｎＭＪ，ＣｏｌａｎｎｉｎｏＮＭ，ＡｚｏｃａｒＪ，ＳｅｄｅｒＲＨ，ＨｏｎｇＳＬ，ＤｅｙｋｉｎＤ．ＵｎｕｓｕａｌｌｙｌａｒｇｅｐｌａｓｍａｆａｃｔｏｒＶＩＩＩ：ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｍｕｌｔｉｍｅｒｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｒｅｌａｐｓｉｎｇｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．１９８２；３０７：１４３２−１４３５）。ＵＬ−ｖＷＦとＴＴＰとの間の関連は、ＴＴＰを患う大半の患者が、現在ＡＤＡＭＴＳ１３として知られる、ｖＷＦを切断する血漿メタロプロテアーゼを欠損しているという、ＦｕｒｌａｎらならびにＴｓａｉおよびＬｉａｎによる独立した所見によって支持を得た（ＦｕｒｌａｎＭ，ＲｏｂｌｅｓＲ，ＳｏｌｅｎｔｈａｌｅｒＭ，ＷａｓｓｍｅｒＭ，ＳａｎｄｏｚＰ，ＬａｅｍｍｌｅＢ．ＤｅｆｉｃｉｅｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｃｈｒｏｎｉｃｒｅｌａｐｓｉｎｇｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：３０９７−３１０３、ＴｓａｉＨＭ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ，ＧｉｎｓｂｕｒｇＤ，ＬａｎｋｈｏｆＨ，ＳｉｘｍａＪＪ，ＮａｇｅｌＲＬ．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｃｌｅａｖａｇｅｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｙｐｅ２ＡｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｍｕｔａｎｔｓＲ８３４ＷａｎｄＲ８３４Ｑ：ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅａｎｄｂｙｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙＶＰ−１．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１９５４−１９６２、ＴｓａｉＨＭ，ＬｉａｎＥＣ．ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｉｎａｃｕｔｅｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．１９９８；３３９：１５８５−１５９４）。

ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼは、肝臓によって主に産生される１９０ｋＤａのグリコシル化タンパク質である（ＬｅｖｙＧＧ，ＮｉｃｈｏｌｓＷＣ，ＬｉａｎＥＣ，ＦｏｒｏｕｄＴ，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋＪＮ，ＭｃＧｅｅＢＭ，ＹａｎｇＡＹ，ＳｉｅｍｉｅｎｉａｋＤＲ，ＳｔａｒｋＫＲ，ＧｒｕｐｐｏＲ，ＳａｒｏｄｅＲ，ＳｈｕｒｉｎＳＢ，ＣｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎＶ，ＳｔａｂｌｅｒＳＰ，ＳａｂｉｏＨ，ＢｏｕｈａｓｓｉｒａＥＥ，ＵｐｓｈａｗＪＤ，Ｊｒ．，ＧｉｎｓｂｕｒｇＤ，ＴｓａｉＨＭ．ＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅＡＤＡＭＴＳｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｃａｕｓｅｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１３：４８８−４９４、ＦｕｊｉｋａｗａＫ，ＳｕｚｕｋｉＨ，ＭｃＭｕｌｌｅｎＢ，ＣｈｕｎｇＤ．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅａｎｄｉｔｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｆａｍｉｌｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１６６２−１６６６、ＺｈｅｎｇＸ，ＣｈｕｎｇＤ，ＴａｋａｙａｍａＴＫ，ＭａｊｅｒｕｓＥＭ，ＳａｄｌｅｒＪＥ，ＦｕｊｉｋａｗａＫ．ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＤＡＭＴＳ１３），ａｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００１；２７６：４１０５９−４１０６３、ＳｏｅｊｉｍａＫ，ＭｉｍｕｒａＮ，ＨｉｒａｓｈｉｍａＭ，ＭａｅｄａＨ，ＨａｍａｍｏｔｏＴ，ＮａｋａｇａｋｉＴ，ＮｏｚａｋｉＣ．Ａｎｏｖｅｌｈｕｍａｎｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒａｎｄｓｅｃｒｅｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｂｌｏｏｄ：ｐｏｓｓｉｂｌｙ，ｔｈｅｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅ；ＪＢｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．２００１；１３０：４７５−４８０、ＧｅｒｒｉｔｓｅｎＨＥ，ＲｏｂｌｅｓＲ，ＬａｍｍｌｅＢ，ＦｕｒｌａｎＭ．ＰａｒｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１６５４−１６６１）。

ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子における変異は、ＴＴＰを生じることが示されている（ＬｅｖｙＧＧ，ＮｉｃｈｏｌｓＷＣ，ＬｉａｎＥＣ，ＦｏｒｏｕｄＴ，ＭｃＣｌｉｎｔｉｃｋＪＮ，ＭｃＧｅｅＢＭ，ＹａｎｇＡＹ，ＳｉｅｍｉｅｎｉａｋＤＲ，ＳｔａｒｋＫＲ，ＧｒｕｐｐｏＲ，ＳａｒｏｄｅＲ，ＳｈｕｒｉｎＳＢ，ＣｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎＶ，ＳｔａｂｌｅｒＳＰ，ＳａｂｉｏＨ，ＢｏｕｈａｓｓｉｒａＥＥ，ＵｐｓｈａｗＪＤ，Ｊｒ．，ＧｉｎｓｂｕｒｇＤ，ＴｓａｉＨＭ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅ
ＡＤＡＭＴＳｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｃａｕｓｅｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１３：４８８−４９４）。ＡＤＡＭＴＳ−１３活性を阻害する自己抗体により生じることが多い特発性ＴＴＰは、成人および年長の小児に生じるより一般的な障害であり、１１％〜３６％の患者に一定の間隔で再発する可能性がある（ＴｓａｉＨＭ，ＬｉａｎＥＣ．ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｉｎａｃｕｔｅｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．１９９８；３３９：１５８５−１５９４、ＦｕｒｌａｎＭ，ＬａｍｍｌｅＢ．ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｆａｍｉｌｉａｌａｎｄａｃｑｕｉｒｅｄｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＢａｉｌｌｉｅｒｅｓＣｌｉｎＨａｅｍａｔｏｌ．１９９８；１１：５０９−５１４）。

非中和自己抗体も、循環からのクリアランスを誘発することにより、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を阻害し得る（ＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒＦ，ＫｎｏｂｌＰ，ＴｒａｔｔｎｅｒＢ，ＰｌａｉｍａｕｅｒＢ，ＭｏｈｒＧ，ＤｏｃｋａｌＭ，ＤｏｒｎｅｒＦ，ＲｉｅｇｅｒＭ．ＮｏｎｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＩｇＭａｎｄＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＤＡＭＴＳ−１３）ｉｎａｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：３２４１−３２４３）。健康な成人の血漿ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、５０％〜１７８％の範囲である（ＭｏａｋｅＪＬ．Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａａｎｄｔｈｅｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｒｅｍｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＡｒｃｈＰａｔｈｏｌＬａｂＭｅｄ．２００２；１２６：１４３０−１４３３）。家族性または後天性のＴＴＰを伴う大半の患者において、血漿ＡＤＡＭＴＳ１３活性は欠損しているか、または正常な活性は５％未満である。治療を受けなければ、ＴＴＰの死亡率は９０％を超えるが、血漿療法は、死亡率を約２０％減少させている（ＭｏａｋｅＪＬ．Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａａｎｄｔｈｅｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｒｅｍｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＡｒｃｈＰａｔｈｏｌＬａｂＭｅｄ．２００２；１２６：１４３０−１４３３）。

巨核球および内皮細胞で合成されたｖＷＦは、超大型ｖＷＦ（ＵＬ−ｖＷＦ）として、それぞれ、血小板α−顆粒およびバイベルパラーデ小体に貯蔵される（ＭｏａｋｅＪＬ，ＲｕｄｙＣＫ，ＴｒｏｌｌＪＨ，ＷｅｉｎｓｔｅｉｎＭＪ，ＣｏｌａｎｎｉｎｏＮＭ，ＡｚｏｃａｒＪ，ＳｅｄｅｒＲＨ，ＨｏｎｇＳＬ，ＤｅｙｋｉｎＤ．ＵｎｕｓｕａｌｌｙｌａｒｇｅｐｌａｓｍａｆａｃｔｏｒＶＩＩＩ：ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｍｕｌｔｉｍｅｒｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｒｅｌａｐｓｉｎｇｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．１９８２；３０７：１４３２−１４３５、ＷａｇｎｅｒＤＤ，ＯｌｍｓｔｅｄＪＢ，ＭａｒｄｅｒＶＪ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅｂｏｄｉｅｓｏｆｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９８２；９５：３５５−３６０、ＷａｇｎｅｒＤＤ，ＢｏｎｆａｎｔｉＲ．ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒａｎｄｔｈｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．ＭａｙｏＣｌｉｎＰｒｏｃ．１９９１；６６：６２１−６２７、ＳｐｏｒｎＬＡ，ＭａｒｄｅｒＶＪ，ＷａｇｎｅｒＤＤ．ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｒｅｌｅａｓｅｄｆｒｏｍＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅｂｏｄｉｅｓｂｉｎｄｓｍｏｒｅａｖｉｄｌｙｔｏｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｔｈａｎｔｈａｔｓｅｃｒｅｔｅｄｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ．Ｂｌｏｏｄ．１９８７；６９：１５３１−１５３４、ＴｓａｉＨＭ，ＮａｇｅｌＲＬ，ＨａｔｃｈｅｒＶＢ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｉｓｃｏｎｖｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｓｍａｍｕｌｔｉｍｅｒｐａｔｔｅｒｎｂｙｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｐｒｏｔｅａｓｅｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．１９８９；１５８：９８０−９８５、ＴｓａｉＨＭ，ＮａｇｅｌＲＬ，ＨａｔｃｈｅｒＶＢ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．１９８９；７３：２０７４−２０７６）。内皮細胞から分泌されると、これらのＵＬ−ｖＷＦ多量体は、循環において、ＡＤＡＭＴＳ１３によってｖＷＦ分子内の特定の切断部位で、一連のより小さい多量体に切断される（ＴｓａｉＨＭ，ＮａｇｅｌＲＬ，ＨａｔｃｈｅｒＶＢ，Ｓｕｓｓｍａｎ，ＩＩ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｉｓｃｏｎｖｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｌａｓｍａｍｕｌｔｉｍｅｒｐａｔｔｅｒｎｂｙｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｐｒｏｔｅａｓｅｓ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．１９８９；１５８：９８０−９８５、ＤｅｎｔＪＡ，ＧａｌｂｕｓｅｒａＭ，ＲｕｇｇｅｒｉＺＭ．ＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｏｆｐｌａｓｍａｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｍｕｌｔｉｍｅｒｓｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｕｂｕｎｉｔ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ．１９９１；８８：７７４−７８２、ＦｕｒｌａｎＭ，ＲｏｂｌｅｓＲ，ＡｆｆｏｌｔｅｒＤ，ＭｅｙｅｒＤ，ＢａｉｌｌｏｄＰ，ＬａｍｍｌｅＢ．ＴｒｉｐｌｅｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒｒｅｆｌｅｃｔｓｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍｕｌｔｉｍｅｒｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９３；９０：７５０３−７５０７）。

ＡＤＡＭＴＳ１３は、Ｔｙｒ８４２−Ｍｅｔ８４３で、成熟ｖＷＦサブユニットの中央Ａ２ドメインの結合を切断し、活性のために、亜鉛またはカルシウムを必要とする（ＤｅｎｔＪＡ，ＢｅｒｋｏｗｉｔｚＳＤ，ＷａｒｅＪ，ＫａｓｐｅｒＣＫ，ＲｕｇｇｅｒｉＺＭ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇｔｈｅｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｉｎｔｙｐｅＩＩＡｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９０；８７：６３０６−６３１０）。ｖＷＦは、電子顕微鏡によって見られるように、「毛糸の玉」および繊維状形態で存在する（ＳｌａｙｔｅｒＨ，ＬｏｓｃａｌｚｏＪ，ＢｏｃｋｅｎｓｔｅｄｔＰ，ＨａｎｄｉｎＲＩ．ＮａｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙａｎｄｑｕａｓｉ−ｅｌａｓｔｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５；２６０：８５５９−８５６３）。さらに、原子間力顕微鏡により、ｖＷＦが、静状態下で球状構造、およびせん断応力に曝された後、ほどかれた繊維状態で存在することが確認されている（ＳｉｅｄｌｅｃｋｉＣＡ，ＬｅｓｔｉｎｉＢＪ，Ｋｏｔｔｋｅ−ＭａｒｃｈａｎｔＫＫ，ＥｐｐｅｌｌＳＪ，ＷｉｌｓｏｎＤＬ，ＭａｒｃｈａｎｔＲＥ．Ｓｈｅａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８８：２９３９−２９５０）。これは、ｖＷＦ繊維の一端が表面に固定される時、生体内でも生じ得る。

ＴＴＰ患者の血栓は、ほとんどフィブリンを含まず、主にｖＷＦおよび血小板を含み、血栓症の原因としてｖＷＦ媒介血小板の凝集を示唆する（ＡｓａｄａＹ，ＳｕｍｉｙｏｓｈｉＡ，ＨａｙａｓｈｉＴ，ＳｕｚｕｍｉｙａＪ，ＫａｋｅｔａｎｉＫ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｖａｓｃｕｌａｒｌｅｓｉｏｎｉｎｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ，ｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｔｏｆａｃｔｏｒＶＩＩＩｒｅｌａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ．１９８５；３８：４６９−４７９）。ＴＴＰの再発を伴う患者は、血漿中に超大型多量体を有する。抑制物質（抗ＡＤＡＭＴＳ１３Ａｂ）の持続がＡＤＡＭＴＳ１３活性を減少させるため、ＵＬ−ｖＷＦ多量体は、時間とともに蓄積する。ＵＬ−ｖＷＦ多量体は、機能亢進性であり、せん断応力を受けてほどかれ、血小板の凝集を生じ、血管内血栓症をもたらす（ＴｓａｉＨＭ．ＶｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ，ＡＤＡＭＴＳ１３，ａｎｄｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＪＭｏｌＭｅｄ．２００２；８０：６３９−６４７、ＴｓａｉＨＭ．ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＡＤＡＭＴＳ−１３ｉｎｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃａｎｄｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．２００３；１：２０３８−２０４０、ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ２０４０−２０３５）。

ＡＤＡＭＴＳ１３欠損による血漿中の反応性亢進ＵＬ−ｖＷＦ多量体の存在は、冠動脈心疾患と関連付けられている動脈血栓症のリスク増加に関連している可能性があると考えられている。

ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、いくつかの疾患および病態と関連付けられているため、薬学的配合物および投与に適した、高比活性を有する組み換えＡＤＡＭＴＳタンパク質の大規模な産生方法が、本技術分野において必要とされている。本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の産生および精製の技術における、これらの必要性および他の必要性を満たす方法を提供する。

Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎｅｔａｌ．，ＢＭＣＥｖｏｌＢｉｏｌ．２００５Ｆｅｂ４；５（１）：１１

一態様において、本発明は、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させる方法を提供する。特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、有利に、発現レベルの増加、および実質的に改善された活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の産生をもたらす。これらの改善された性質は、一例において、カルシウム、亜鉛、またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）等の、レベルを増加した種々の成分でＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に使用される培養培地を補うことにより達成され得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質である。

別の態様において、本発明は、回分、流加、または連続細胞培養条件下で、動物性タンパク質を含まない、および既知組成培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ組み換え細胞を培養することにより、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現および／またはその活性レベルを増加させる方法に関する。一部の実施形態において、これらの方法は、細胞浮遊様式または細胞付着様式のいずれかで実施され得る、回分、流加、灌流、またはケモスタット細胞培養の使用を含む。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質である。

別の態様において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の精製中の活性損失の量を減少させる方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、精製緩衝液をさらなるレベルのカルシウムおよび／または亜鉛で補充することを含む。具体的な実施形態において、本方法は、精製中に使用される限外濾過および／または透析濾過ステップ中のＡＤＡＭＴＳタンパク質の活性を安定させることに関する。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質である。

また別の態様において、本発明は、薬学的組成物の調製に使用するために、増加した活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質を産生する方法に関する。特定の実施形態において、これらの方法は、増加した活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現の増加に適した条件下で、動物性タンパク質を含まない、および／または既知組成の培養培地の使用を含む。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質である。

関連する態様において、本発明は、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に有用である動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、および既知組成の培地を提供する。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも約２μＭの濃度の亜鉛、または少なくとも約０．５ｍＭの濃度のカルシウムのうちの少なくとも１つを含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、方法。
（項目２）
前記培養培地は、少なくとも約２μＭの亜鉛を含有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記培養培地は、約２μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記培養培地は、少なくとも約５μＭの亜鉛を含有する、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
前記培養培地は、約５μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムを含有する、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記培養培地は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛と、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムと、を含有する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記培養培地は、少なくとも約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンをさらに含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリアミンは、プトレシンである、項目１２に記載の応法。
（項目１４）
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記培養培地は、既知組成培地である、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系、およびＨＥＫ細胞系から成る群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記方法は、回分細胞培養法を含む、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記方法は、連続細胞培養を含む、項目１〜２１および２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記培養は、ケモスタット様式で実施される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記培養は、灌流様式で実施される、項目２６または２７に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、項目２７または２９に記載の方法。
（項目３１）
前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記培養は、少なくとも７日間維持される、項目２３および２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記培養は、少なくとも１ヶ月間維持される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記培養は、少なくとも２ヶ月間維持される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記培養は、約３５℃〜約３７℃の間の温度で維持される、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記培養は、約６．９〜約７．３の間のｐＨで維持される、項目１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記培養は、約７．０５〜約７．１５の間のｐＨで維持される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、項目１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約６００Ｕである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約８００Ｕである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約４００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約８００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ＡＤＡＭＴＳ組成物を産生するための方法であって、
（ａ）動物性タンパク質を含まない培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記培養物から上清の分画を除去するステップと、
（ｃ）あらゆる残留細胞を除去するために、濾過または遠心分離のステップを実施するステップと、
（ｄ）前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質を濃縮するために、限外濾過ステップを実施するステップと、
（ｅ）少なくとも約０．５μＭｎの亜鉛と、少なくとも約０．１ｍＭのカルシウムとを含む緩衝液を用いて、透析濾過を実施し、それによってＡＤＡＭＴＳ組成物を調製するステップと、を含む、方法。
（項目４４）
細胞を培養する前記ステップは、回分細胞培養を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
細胞を培養する前記ステップは、連続細胞培養を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記培養培地は、カルシウムを含有する、項目４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記培養培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記培養培地は、亜鉛を含有する、項目４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛を含有する、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、項目４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記培養培地は、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記透析緩衝液は、少なくとも約５μＭの亜鉛と、少なくとも約２ｍＭのカルシウムと、を含有する、項目４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、項目４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約２０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、項目４３〜５３のいずれか１項に記載の方法。（項目５５）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約１０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、項目４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１５００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法に従って、細胞培養物中にＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させることを含む方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。（項目５９）
項目４３〜５７のいずれか１項に記載の方法に従う方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。
本願発明は、さらに以下の項目を提供する。
（項目A１）
トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも３μＭの亜鉛を含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、ここで、該方法に従って発現されたＡＤＡＭＴＳタンパク質は、１．５μＭの亜鉛を含む培養培地中で発現されたＡＤＡＭＴＳタンパク質と比較して、より高い比活性を有する、方法。
（項目A２）
前記培養培地は、３μＭ〜１２μＭの間の亜鉛を含有する、項目A１に記載の方法。
（項目A３）
前記培養培地は、少なくとも５μＭの亜鉛を含有する、項目A１または２に記載の方法
。
（項目A４）
前記培養培地は、５μＭ〜１２μＭの間の亜鉛を含有する、項目A１〜３のいずれか１
項に記載の方法。
（項目A５）
前記培養培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する、項目A１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目A６）
前記培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する、項目A５に記
載の方法。
（項目A７）
前記培養培地は、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、項目A１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目A８）
前記培養培地は、少なくとも７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、項目A１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目A９）
前記培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、項目A１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目A１０）
前記培養培地は、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンをさらに含む、項目A１〜９
のいずれか１項に記載の方法。
（項目A１１）
前記ポリアミンは、プトレシンである、項目A１０に記載の方法。
（項目A１２）
前記培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する、項目A１１に
記載の方法。
（項目A１３）
前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、項目A１〜１２のいずれか１項に記載
の方法。
（項目A１４）
前記培養培地は、既知組成培地である、項目A１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目A１５）
前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、項目A１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目A１６）
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、項目A１５に記載の方法。
（項目A１７）
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系、およびＨＥＫ細胞系から成る群より選択される、項目A１６に記載の方法。
（項目A１８）
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系である、項目A１７に記載の方法。
（項目A１９）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、項目A１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目A２０）
前記方法は、回分細胞培養を含む、項目A１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目A２１）
前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、項目A２０に記載の方法。
（項目A２２）
前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、項目A２０に記載の方法。
（項目A２３）
前記方法は、連続細胞培養を含む、項目A１〜１９および２１のいずれか１項に記載の
方法。
（項目A２４）
前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、項目A２３に記載の方法。
（項目A２５）
前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、項目A２３に記載の方法。
（項目A２６）
前記培養は、ケモスタット様式で実施される、項目A２４に記載の方法。
（項目A２７）
前記培養は、灌流様式で実施される、項目A２４または２５に記載の方法。
（項目A２８）
前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、項目A２５または２６に記
載の方法。
（項目A２９）
前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、項目A２８に記載の方法。
（項目A３０）
前記培養は、少なくとも７日間維持される、項目A２１および２３〜２９のいずれか１
項に記載の方法。
（項目A３１）
前記培養は、少なくとも１ヶ月間維持される、項目A３０に記載の方法。
（項目A３２）
前記培養は、少なくとも２ヶ月間維持される、項目A３１に記載の方法。
（項目A３３）
前記培養は、３５℃〜３７℃の間の温度で維持される、項目A１〜３２のいずれか１項
に記載の方法。
（項目A３４）
前記培養は、６．９〜７．３の間のｐＨで維持される、項目A１〜３３のいずれか１項
に記載の方法。
（項目A３５）
前記培養は、７．０５〜７．１５の間のｐＨで維持される、項目A３４に記載の方法。
（項目A３６）
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、項目A１〜３５のいずれか１
項に記載の方法。
（項目A３７）
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも６００Ｕである、項目A３６に記載の方法。
（項目A３８）
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも８００Ｕである、項目A３７に記載の方法。
（項目A３９）
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも４００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、項目A３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目A４０）
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも８００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、項目A３９に記載の方法。

種々の温度およびｐＨ条件下で、動物性タンパク質を含まない培地中で培養されたＣＨＯ細胞で発現した、組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３の容量ＦＲＥＴＳ−ｖＷＦ７３産生能。種々の細胞培養実験の結果は、培養温度およびｐＨの関数として、正規化した容量ＡＤＡＭＴＳ１３ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３産生能を表現する（Ａ）等高線図および（Ｂ）表面プロットとして示される。

種々の温度およびｐＨ条件下で、動物性タンパク質を含まない培地中で培養された、組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現するＣＨＯ細胞の比活性レベル（ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３／ＥＬＩＳＡによる抗原）。種々の細胞培養実験の結果は、培養温度およびｐＨの関数として、比活性を表現する（Ａ）等高線図および（Ｂ）表面プロットとして示される。

Ｉ．概要
ＡＤＡＭＴＳタンパク質（すなわち、ＡＤＡＭＴＳ−１〜ＡＤＡＭＴＳ−２０）は、共通のモジュラードメイン構成を共有する分泌亜鉛メタロプロテイナーゼのファミリーである（概説については、ＦｌａｎｎｅｒｙＣ．Ｒ．，ＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ．２００６Ｊａｎ１；１１：５４４−６９を参照）。ＡＤＡＭＴＳタンパク質は全て、共通のコアドメイン構造を共有し、シグナルペプチド、次いで、プロドメイン、亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンジンＩ型反復、高システインドメイン、およびスペーサードメインから成る（ＡｐｔｅＳ．Ｓ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００９Ｎｏｖ１３；２８４（４６）：３１４９３−７）。加えて、ＡＤＡＭＴＳ−４を除く全ては、少なくとももう１つのトロンボスポンジンＩ型反復ドメインを含有し、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の多くは、１つ以上のさらなる補助的なドメインを含有する。特に、全てのＡＤＡＭＴＳタンパク質は、メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン内に位置する少なくとも１つのカルシウム結合部位と、少なくとも１つの亜鉛結合部位とを含有するように思われることが報告されている（Ａｎｄｒｅｉｎｉｅｔａｌ．，Ｊ．ＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓ．，２００５，４（３），ｐｐ８８１−８８８）。

ＡＤＡＭＴＳタンパク質の生物学的役割は、血管新生抑制、間質性腎線維症、骨再形成、卵巣濾胞形成、粥状動脈硬化、泌尿生殖器発達、および腫瘍増殖／再造形（ＡＤＡＭＴＳ−１）；エーラースダンロス症候群７Ｃ型、およびウシ皮膚脆弱症（ＡＤＡＭＴＳ−２）；関節炎、粥状動脈硬化、および腱障害（ＡＤＡＭＴＳ−４）；関節炎および膠芽腫（ＡＤＡＭＴＳ−５）；関節炎（ＡＤＡＭＴＳ−７）；血管新生抑制、脳悪性病変、関節炎、および粥状動脈硬化（ＡＤＡＭＴＳ−８）；関節炎（ＡＤＡＭＴＳ−９，−１２）；血栓性血小板減少性紫斑病（ＡＤＡＭＴＳ−１３）；ならびに抗血栓症／脳卒中（ＡＤＡＭＴＳ１８）を含む、種々の疾患および状態について報告されている（概説については、ＬｉｎａｎｄＬｉｕ，ＯｐｅｎＡｃｃｅｓｓＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｖｉｅｗｓ２００９：１１２１−１３１を参照）。

組み換えＡＤＡＭＴＳ１３（Ａ１３）は、これまで哺乳類細胞中で発現されているが、比活性は、細胞培養条件により広範に変動する。多くの市販の培養培地は、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより測定される活性の、ＥＬＩＳＡによって決定した抗原含量に対する比率として表現される、高比活性を有するＡ１３の発現に十分ではないことが分かっている。一態様において、本明細書に提供される方法は、全活性および比活性の増加したレベルを有するＡ１３の細胞培養発現を可能にする、いくつかの有利な所見に基づく。

本明細書に記載される試験は、培養培地中に約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの特定の最低濃度のカルシウムが、活性Ａ１３の発現に必要とされることを示す。加えて、培養培地を増加したレベルの亜鉛で補充することにより、得られた発現したＡ１３タンパク質が高い全活性および比活性を有したことが分かった。例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地等の、標準的な既知組成培地に見られる濃度と比較して、通常の濃度の２〜３倍のさらなる亜鉛で補充された培養において、Ａ１３の比活性は有意に増加した。さらに、Ａ１３の比活性におけるさらなる増加は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度を標準的なＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地の約２ｍｇ／Ｌから約７ｍｇ／Ｌに増加することにより達成され得る。さらなるカルシウム、亜鉛、および／またはニコチンアミドで補充された培地中で、組み換えＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を培養することにより、少なくとも約５００ｍＵ／μｇ、１０００ｍＵ／μｇ、最大約２０００ｍＵ／μｇの比活性が、組み換えヒトＡ１３の大規模な発現培養において達成され得る。組み換えにより産生されたＡ１３タンパク質の比活性のこれらのレベルは、以前に報告されていない。有利に、Ａ１３活性の増加したレベルは、動物由来の成分を含まない既知組成培地において達成され、薬学的配合物のタンパク質の産生に適した大規模でのＡＤＡＭＴＳタンパク質の一貫した再現性のある発現を可能にする。さらに、これらの培地は、組み換えタンパク質、例えば、インスリンさえ含まず、薬学的投与用の配合物においてより安全に使用され得る産物をもたらす。

本開示は、標準的な限外／透析濾過および他の精製ステップ中の活性および比活性の損失を防止する方法も提供する。有利に、透析濾過に使用される緩衝液をさらなるカルシウムおよび亜鉛で補充することにより、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイによって測定して、Ａ１３活性の損失において、有意な減少が達成され得ることが分かった。

したがって、分泌メタロプロテイナーゼのＡＤＡＭＴＳファミリー間の共通した構造−機能関係により、本発明によって提供される方法は、細胞培養中の全てのＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現、および細胞培地からの回収を可能にする。

ＩＩ．定義
本明細書に使用される、「ビタミンＢ３」、「ニコチンアミド」、「ナイアシンアミド」、「ナイアシン」、および「ニコチン酸」という用語は、ビタミンのＢ３ファミリーのいずれの成員を指すために、交換可能に使用され得る。したがって、本ファミリーのいずれの成員も、本発明の方法に使用される培地を補充するために使用され得る。

本明細書に使用される、「ＡＤＡＭＴＳタンパク質」とは、メタロプロテイナーゼのトロンボスポンジンＩ型モチーフファミリーを伴うディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼのポリペプチドを指す。本ファミリーの成員は、ヒトタンパク質ＡＤＡＭＴＳ１（ＮＭ＿００６９８８）、ＡＤＡＭＴＳ２（ＮＭ＿０１４２４４；ＮＭ＿０２１５９９）、ＡＤＡＭＴＳ３（ＮＭ＿０１４２４３）、ＡＤＡＭＴＳ４（ＮＭ＿００５０９９）、ＡＤＡＭＴＳ５（ＮＭ＿００７０３８）、ＡＤＡＭＴＳ６（ＮＭ＿０１４２７３）、ＡＤＡＭＴＳ７（ＮＭ＿０１４２７２７）、ＡＤＡＭＴＳ８（ＮＭ＿００７０３７）、ＡＤＡＭＴＳ９（ＮＭ＿１８２９２０；ＮＭ＿１８２９２１；ＮＭ＿０２０２４９）、ＡＤＡＭＴＳ１０（ＮＭ＿０３０９５７）、ＡＤＡＭＴＳ１２（ＮＭ＿０３０９５５）、ＡＤＡＭＴＳ１３（ＮＭ＿１３９０２５；ＮＭ＿１３９０２６；ＮＭ＿１３９０２７；ＮＭ＿１３９０２８）、ＡＤＡＭＴＳ１４（ＮＭ＿１３９１５５；ＮＭ＿０８０７２２）、ＡＤＡＭＴＳ１５（ＮＭ＿１３９０５５）、ＡＤＡＭＴＳ１６（ＮＭ＿１３９０５６），ＡＤＡＭＴＳ１７（ＮＭ＿１３９０５７）、ＡＤＡＭＴＳ１８（ＮＭ＿１９９３５５；ＮＭ＿１３９０５４）、ＡＤＡＭＴＳ１９（ＮＭ＿１３３６３８）、およびＡＤＡＭＴＳ２０（ＮＭ＿０２５００３，ＮＭ＿１７５８５１）を含む。ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、完全長タンパク質、および少なくとも部分的な生物学的活性、例えば、完全長タンパク質により示される活性、特に、完全長タンパク質により示されるプロテアーゼ活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上を示す、部分ポリペプチドの双方を含む。特定の場合において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、例えば、酵素的手段もしくは化学的手段によって、生体内または生体外のいずれかにおいて翻訳後修飾される。本発明のＡＤＡＭＴＳタンパク質は、選択的にスプライスされたイソ型、保存的修飾されたタンパク質、実質的に同一のタンパク質、ホモログ等を含むことを理解する。

本発明の内容において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、ゲッ齒、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、およびそれらの生物学的に活性な誘導体等の、哺乳類からのＡＤＡＭＴＳファミリーのいずれ成員のをも包含する。活性を有する変異体および異型ＡＤＡＭＴＳタンパク質も包含され、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の機能的断片および融合タンパク質も同様である。さらに、本発明のＡＤＡＭＴＳタンパク質は、精製、検出、またはその双方を促進するタグをさらに含む場合がある。本明細書に記載されるＡＤＡＭＴＳタンパク質は、生体外または生体内における治療成分または撮像に適した成分でさらに修飾され得る。

本明細書に使用される、「ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質」とは、ＡＤＡＭＴＳ１３活性、特に、ＶＷＦの残基Ｔｙｒ−８４２とＭｅｔ−８４３との間のペプチド結合を切断する能力を有するあらゆるタンパク質またはポリペプチドを指す。例示的な実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ＿６２０５９４（ＡＤＡＭＴＳ１３イソ型１、プレプロタンパク質）、またはＮＰ＿６２０５９４（ＡＤＡＭＴＳ１３イソ型１、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５〜１４２７に高度に類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ＿６２０５９６（ＡＤＡＭＴＳ１３イソ型２、プレプロタンパク質）、またはＮＰ＿６２０５９４（ＡＤＡＭＴＳ１３イソ型２、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５〜１３７１に高度に類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。また別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ＮＰ＿６２０５９５（ＡＤＡＭＴＳ１３イソ型３、プレプロタンパク質）、またはＮＰ＿６２０５９５（ＡＤＡＭＴＳ１３イソ型１、成熟ポリペプチド）のアミノ酸７５〜１３４０に高度に類似するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本明細書に使用される、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ｖＷＦ切断活性を有する天然変異形、およびｖＷＦ切断活性を有する人工構築物を含む。本明細書に使用される、ＡＤＡＭＴＳ１３は、ある基礎活性を保持する、あらゆる天然変異形、代替配列、イソ型、または変異体タンパク質を包含する。ヒト集団に認められるＡＤＡＭＴＳ１３変異の例は、これらに限定されないが、Ｒ７Ｗ、Ｖ８８Ｍ、Ｈ９６Ｄ、Ｒ１０２Ｃ、Ｒ１９３Ｗ、Ｔ１９６Ｉ、Ｈ２３４Ｑ、Ａ２５０Ｖ、Ｒ２６８Ｐ、Ｗ３９０Ｃ、Ｒ３９８Ｈ、Ｑ４４８Ｅ、Ｑ４５６Ｈ、Ｐ４５７Ｌ、Ｃ５０８Ｙ、Ｒ５２８Ｇ、Ｐ６１８Ａ、Ｒ６２５Ｈ、Ｉ６７３Ｆ、Ｒ６９２Ｃ、Ａ７３２Ｖ、Ｓ９０３Ｌ、Ｃ９０８Ｙ、Ｃ９５１Ｇ、Ｇ９８２Ｒ、Ｃ１０２４Ｇ、Ａ１０３３Ｔ、Ｒ１０９５Ｗ、Ｒ１１２３Ｃ、Ｃ１２１３Ｙ、Ｔ１２２６Ｉ、Ｇ１２３９Ｖ、Ｒ１３３６Ｗを含み、それらの多くは、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）に関連して認められる。ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、翻訳後修飾を含有するポリペプチドも含む。例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３は、残基６１４、６６７、および１３５４で、Ｎ−アセチルグリコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）によって修飾されることが示され、残基１４２、１４６、５５２、５７９、７０７、８２８、および１２３５もこの様式で修飾され得ることが予測されている。

タンパク分解的に活性の組み換えＡＤＡＭＴＳ１３は、それらの開示が、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｌａｉｍａｕｅｒら（２００２，Ｂｌｏｏｄ．１５；１００（１０）：３６２６−３２）、および第ＵＳ２００５／０２６６５２８号に記載される、哺乳類細胞培養での発現によって調製され得る。細胞を発現するＡＤＡＭＴＳ１３の組み換え培養の方法は、ＰｌａｉｍａｕｅｒＢ，ＳｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒＦ．（ＳｅｍｉｎＨｅｍａｔｏｌ．２００４Ｊａｎ；４１（１）：２４−３３、その開示は、全ての目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。

本明細書に使用される、「１単位のＡＤＡＭＴＳ活性」は、使用されるアッセイに関わらず、１ｍＬの貯蔵された正常なヒト血漿中の活性量として定義される。例えば、ＡＤＡＭＴＳタンパク質がＡＤＡＭＴＳ１３である時、１単位のＡＤＡＭＴＳ１３ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性は、１ｍＬの貯蔵された正常なヒト血漿により切断されるのと同じ量のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基質を切断するのに必要な活性量である（Ｋｏｋａｍｅｅｔａｌ．，ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ．２００５Ａｐｒ；１２９（１）：９３−１００）。好都合に、ＡＤＡＭＴＳ１３活性は、ＡＤＡＭＴＳ１３の基質として、改変フォンビルブランド因子ペプチドを利用する機能アッセイ等の、機能アッセイにより決定され得る（Ｔｒｉｐｏｄｉｅｔａｌ．ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．２００８Ｓｅｐ；６（９）：１５３４−４１）。組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性を決定する好ましい方法は、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎら（ＡｓｓａｙｏｆｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）−ｃｌｅａｖｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｂａｓｅｄｏｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｃｏｌｌａｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙｏｆｄｅｇｒａｄｅｄｖＷＦ：ａｔｏｏｌｆｏｒｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ（ＴＴＰ）．ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ１９９９；８２：１３８６−１３８９）に開示されている。一実施形態において、上に定義されるＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質と見なされるためには、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然ＡＤＡＭＴＳ１３の少なくとも１％のｖＷＦ切断活性を有さなければならない。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、天然ＡＤＡＭＴＳ１３の少なくとも１０％の活性を含有する。また別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、天然ＡＤＡＭＴＳ１３の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、、または１００％の活性を含有する。ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の量は、例えば、Ｒｉｅｇｅｒら（２００６，ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．２００６９５（２）：２１２−２０）に開示されるＥＬＩＳＡ方法を使用して、ＡＤＡＭＴＳ１３抗原の測定によっても決定され得る。

本明細書に使用される、「μｇのＡＤＡＭＴＳ１３」または「μｇのＡＤＡＭＴＳ１３抗原」とは、１ｍＬの貯蔵された正常なヒト血漿と同じレベルの、ＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能なタンパク質を提供するＡＤＡＭＴＳ１３の量を意味する。これは、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３が１ｍＬの正常なヒト血漿に存在するという公表推定値に基づき、したがって、近似測定値である。

本明細書に使用される、「生物学的に活性な誘導体」という用語は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質に関連して使用される時、組み換えＤＮＡ技術を介して得られたポリペプチドも包含する。これは、（ｉ）例えば、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅を介した遺伝子組み換えによる組み換えＤＮＡの産生、（ｉｉ）形質移入により、すなわち、電気穿孔または微量注入法を介して、組み換えＤＮＡを原核細胞または真核細胞に導入する、（ｉｉｉ）例えば、連続または回分方式で、前記形質転換細胞を培養する、（ｉｖ）例えば、構成的に、または誘発により、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させる、および（ｖ）例えば、培養培地から、または形質転換された細胞を採取することにより、前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質を単離し、これは、（ｖｉ）例えば、イオン交換クロマトグラフィ、分子ふるいクロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ等を介して、実質的に精製された組み換えＡＤＡＭＴＳタンパク質を得るためである分野において公知のあらゆる方法を含み得る。「生物学的に活性な誘導体」という用語は、例えば、哺乳類、特にヒトの循環系中のＡＤＡＭＴＳタンパク質の半減期等の生物学的／薬学的性質を改善するために、第２のポリペプチド、例えば、免疫グロブリンＦｃドメインまたはアルブミンドメインと組み合わせた、例えば、ＡＤＡＭＴＳタンパク質またはその機能断片等のキメラ分子も含む。

本明細書に使用される、「限外濾過」という用語は、静水圧が半透膜に対して液体を通過させる、種々の膜濾過法を包含する。浮遊した固体および高分子量の溶質は、保持され、一方、水および低分子量の溶質は膜を通過する。この分離プロセスは、巨大分子（１０^３〜１０^６Ｄａ）溶液、特にタンパク質溶液を精製し、濃縮するために使用されることが多い。それらが保持する分子の大きさに応じて、いくつかの限外濾過膜が利用可能である。限外濾過は、通常、２ｎｍ〜０．０５μｍの間の膜孔経、および１〜１０バールの間の圧力で操作されることを特徴とし、コロイド様タンパク質を糖類および塩類等の小分子から分離するために特に有用である。逆に、ナノ濾過は、通常、０．５〜２ｎｍの間の膜孔経、および５〜４０バールの間の圧力で操作されることを特徴とする、別の圧力駆動濾過法である。ナノ濾過は、一方では、糖類、他の有機分子と多価塩との間、他方では、一価塩と水との間の分離を達成するために頻繁に使用される。一般に、限外濾過は、全量濾過様式または接線流濾過（ＴＦＦ）様式のいずれかで実施され得る。

本明細書に使用される、「透析濾過」という用語は、別の膜濾過法を指し、時折、接線流濾過（ＴＦＦ）とも呼ばれ、液体は、限外濾過膜の表面に沿って接線方向に送り込まれる。通常、保持液は、膜を通過した後透析濾過緩衝液で希釈され、その後、連続流動プロセスで膜に戻される。一般に、透析濾過は、全量濾過様式または接線流濾過（ＴＦＦ）様式のいずれかで実施され得る。そのため、単一系が、最初に限外濾過を使用して試料を濃縮し、次に透析濾過によって緩衝液の交換を実施するために、限外濾過および透析濾過操作の双方に使用され得る。

本明細書に使用される、「ポリアミン」という用語は、炭素、窒素、および水素から成る有機化合物の基のいずれかを指し、２つ以上のアミノ基を含有する。例えば、本用語は、カダベリン、プトレシン、アグマチン、オルニチン、スペルミン、およびスペルミジンから成る群より選択される分子を包含する。

ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に使用される既知組成培養培地の特定の実施形態において、ポリアミンの濃度は、培地中、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌ、または約０．５ｍｇ／Ｌ〜約２０ｍｇ／Ｌ、または約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌ、または約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌ、または約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌ、または約２ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌの範囲の濃度で存在する。具体的な実施形態の１つにおいて、ポリアミンは、約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの濃度のプトレシンである。

本明細書に使用される、「既知組成培地」という用語は、全ての成分が何であるか、およびその濃度が分かっている合成増殖培地を指す。既知組成培地は、個々の植物または動物由来の成分（例えば、タンパク質、ポリペプチド等）を含む場合も含まない場合もあるが、細菌、酵母、動物、または植物の抽出物を含有しない。市販の既知組成培地の例としては、種々のＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）培地（ＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）、種々のダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥ）培地（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ；ＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）、Ｈａｍ’ｓＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ；ＳＡＦＣＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）等が挙げられるが、これらに限定されない。既知組成培養培地を調製する方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号等、当該分野において公知であり、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に使用される、「オリゴペプチドを含まない培養培地」という用語は、タンパク質加水分解物に由来するオリゴペプチド等の、オリゴペプチドを含まない、タンパク質を含まない培地を指す。一実施形態において、培地は、２０以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の一実施形態において、培地は、１５以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の別の実施形態において、培地は、１０以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。一実施形態において、培地は、７つ以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。別の実施形態において、培地は、５つ以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらに別の実施形態において、培地は、３つ以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明のさらなる実施形態によると、培地は、２つ以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。オリゴペプチドを含まない培養培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号等、当該分野において公知であり、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に使用される、「無血清培養培地」という用語は、動物血清で補充されていない培養培地を指す。多くの場合、無血清培地は、既知組成培地であるが、無血清培地は、個別の動物もしくは植物タンパク質、またはタンパク質分画で補充され得る。無血清培養培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号等、当該分野において公知であり、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に使用される、「動物性タンパク質を含まない培養培地」という用語は、動物血清、タンパク質、またはタンパク質分画で補充されない培養培地を指す。多くの場合、動物性タンパク質を含まない培養培地は、既知組成培地であるが、動物性タンパク質を含まない培地は、植物または酵母の加水分解物を含有し得る。動物性タンパク質を含まない培養培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号等、当該分野において公知であり、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

「発現ベクター」とは、核酸構築物であり、宿主細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素とともに、組み換えにより、または合成により生成される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。通常、発現ベクターは、操作可能にプロモーターに連結される、転写される核酸を含む。

「異種性」という用語は、核酸の一部に関して使用される時、核酸が自然には相互に同じ関係で認められない２つ以上のサブ配列を含むことを意味する。例えば、核酸は、通常、組み換えにより産生され、新しい機能性核酸を作製するように配置される無関係の遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からのプロモーターと別の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が自然には相互に同じ関係で認められない２つ以上のサブ配列を含む（例えば、融合タンパク質）ことを意味する。

「プロモーター」は、核酸の転写を指示する一連の核酸制御配列として定義される。本明細書に使用される、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合のＴＡＴＡ要素等の、転写の開始部位の近くの必須核酸配列を含む。プロモーターは、任意に、遠位エンハンサーまたは抑制要素も含み、これは、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る。「構成」プロモーターは、大半の環境および発達条件下で活性であるプロモーターである。「誘発可能」プロモーターは、環境または発達調節下で活性であるプロモーターである。「操作可能に連結される」という用語は、核酸発現制御配列（プロモーターまたは一連の転写因子結合部位）と第２の核酸配列との間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。

本明細書に使用される、「約」という用語は、指定された値のプラスまたはマイナス１０％のおおよその範囲を表す。例えば、「約２０％」という用語は、１８〜２２％の範囲を包含する。

ＩＩＩ．ＡＤＡＭＴＳタンパク質発現
一態様において、本発明は、高比活性を有するトロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させる方法を提供する。一実施形態において、方法は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）から選択される少なくとも１つの成分で補充された培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）から選択される少なくとも２つの成分で補充された培地中に発現する。また別の実施形態において、培養培地は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に使用される培養培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成培地を含む場合がある。

一態様において、方法は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の産生のために提供される。一実施形態において、方法は、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミドのうちの少なくとも１つで補充された培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、培養物から上清の分画を除去するステップと、あらゆる残留細胞を除去するために遠心分離または濾過のステップを実施するステップと、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を濃縮するために、限外濾過ステップを実施するステップと、少なくともカルシウムまたは亜鉛を含む緩衝液を用いて透析濾過ステップを実施するステップと、を含む。一部の実施形態において、カルシウムの濃度は、少なくとも、約０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ、または５ｍＭカルシウム超であり得る。他の実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ、または１０μＭ亜鉛超であり得る。特定の実施形態において、採取物、細胞を含まない上清、または透析濾過緩衝液は、上述の濃度でカルシウムおよび亜鉛の組合物を含有する。特定の実施形態において、限外濾過および／または透析濾過膜のカットオフは、例えば、約１５０ｋＤ、または１２５ｋＤ、または１００ｋＤ、または７５ｋＤ、または５０ｋＤ、または３０ｋＤ、または１０ｋＤ、または１０ｋＤ未満であり得る。ある実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３またはその生物学的に活性な誘導体である。具体的な実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体である。特定の実施形態において、本方法に使用される培養培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成培地であり得る。

一実施形態において、方法は、イオン交換クロマトグラフィ、分子ふるいクロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、および疎水性相互作用クロマトグラフィから成る群から選択される精製ステップをさらに含む。

また別の実施形態において、亜鉛補充は、亜鉛を含有するタンパク質またはポリペプチド調製物を追加することにより提供され得る。例えば、通常のインスリンの調製物は、Ｍｅｄｓｃａｐｅサーバ上で見つけられる、組み換えヒトインスリンであるＮｏｖｏｌｉｎ
ＮＩｎｎｏＬｅｔＳｕｂＱの詳細な論文から計算して、約１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間のインスリンでの培地補充は、約０．０３μＭ〜約１．５μＭの亜鉛の補充ももたらすであろう濃度で亜鉛を含有する。したがって、一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に使用される培養培地は、亜鉛含有インスリン調製物で補充され得る。

本明細書に開示される亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される、宿主細胞系を培養するために選択される基礎培地は、本発明には重要ではなく、哺乳類細胞を培養するのに適した、当該分野において公知のもののうちのいずれか１つ、またはその組み合わせであり得る。ダルベッコ変法イーグル培地、ＨａｍのＦ−１２培地、イーグル最小必須培地、およびＲＰＭＩ−１６４０培地等の培地は、市販されている。組み換えインスリン等の増殖因子の追加は任意である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現する細胞を培養するために使用される基礎培地は、１つ以上の市販の既知組成培地、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＨａｍのＦ−１２の混合物を含む場合があり、これは、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）以外の１つ以上の成分で補充されている。市販の培地を補充するために使用され得る成分の例としては、必須アミノ酸（例えば、グルタミン）、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）、一級アミン（例えば、エタノールアミン）、ポリアミン（例えば、プトレシン）、微量金属（例えば、イオン）、および緩衝剤（例えば、重炭酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、培地は、表１に提供されるＢＣＳ培地である。別の具体的な実施形態において、培地は、ＢＡＣＤ培地、例えばＢＡＣＤ−Ａ１３培地である。

歴史的に、動物細胞は、動物血清を含有する培地で培養されてきた。しかしながら、そのような培地は、定義が不完全であり、感染のリスクがある。したがって、当業者は、いずれのタンパク質を完全に含まない、または少なくとも組み換えにより産生されないいかなるタンパク質も含まない、「タンパク質を含まない」培地を考案した。ヒト血清アルブミンは、組み換えタンパク質の産生のために、無血清培養補充物として一般に使用される。好ましい培地は、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号に開示されるものを含む。

任意に、ポリプロピレングリコール（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６１、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−７１、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１０８、またはＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標））等の非イオン性界面活性剤が、消泡剤として培地に追加され得る。この薬剤は、一般に、細胞を通気の負の作用（「散布」）から保護するために適用される。非イオン性界面活性剤の量は、０．０５〜１０ｇ／Ｌの間、好ましくは、０．１〜５ｇ／Ｌの間の範囲であり得る。

第ＵＳ６９３６４４１号の培地は、ＣＨＯ細胞の培養に特に良く適しているが、他の細胞にも使用され得る。さらに適した培地は、米国特許出願第２００７／０２１２７７０号（ＢａｘｔｅｒＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．，ＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅＳ．Ａ．）に開示されるオリゴペプチドを含まない培地である。

一実施形態において、本発明は、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも約２μＭの濃度の亜鉛、または少なくとも約０．５ｍＭの濃度のカルシウムのうちの少なくとも１つを含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ２である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ３である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ５である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ６である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ７である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ８である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ９である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１０である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１１である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１２である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１４である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１５である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１６である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１７である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１８である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１９である。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ２０である。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、培養培地は、少なくとも約２μＭの亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約２μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する。また別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約５μＭの亜鉛を含有する。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約５μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムを含有する。また別の実施形態において、培養培地は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する。一実施形態において、培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛と、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムとを含有する。

また他の実施形態において、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）の追加は、細胞培養中のＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現および比活性をさらに強化することが分かった。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む。また別の実施形態において、培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。

特定の実施形態において、培養培地は、動物性タンパク質を含まない培養培地である。別の実施形態において、培養培地は、既知組成培地である。特定の実施形態において、培養培地は、１つ以上のポリアミンを含む場合がある。特定の実施形態において、ポリアミンは、例えば、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌの濃度のプトレシンである。具体的な実施形態において、培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する。

特定の実施形態において、培養に使用される細胞または細胞系は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、または哺乳類細胞である。具体的な実施形態において、細胞系は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、またはマウス細胞系である。より具体的な実施形態において、細胞系は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞系である。好ましい実施形態において、細胞系は、ＣＨＯ細胞系である。

特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される制御配列を含む。一実施形態において、制御配列はプロモーターである。特定の実施形態において、プロモーターは、構成プロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは、誘導可能プロモーターである。

特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、連続細胞培養系（すなわち、連続細胞培養）の使用を含む。一実施形態において、連続培養系は、ケモスタット培養系（すなわち、ケモスタット細胞培養）である。別の実施形態において、連続培養系は、タービドスタット培養系（すなわち、タービドスタット細胞培養）である。また別の実施形態において、連続培養系は、灌流培養系（すなわち、灌流細胞培養）である。特定の実施形態において、連続培養系は、浮遊様式で操作され得る。他の実施形態において、連続培養系は、付着様式で操作され得る。特定の実施形態において、付着様式は、マイクロキャリア、例えば、多孔質マイクロキャリアの使用を含む。

特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、回分細胞培養系（すなわち、回分細胞培養）の使用を含む。一実施形態において、回分培養系は、単一回分培養系（すなわち、単一回分細胞培養）である。別の実施形態において、回分培養系は、流加培養系（すなわち、流加細胞培養）である。また別の実施形態において、回分培養系は、反復回分培養系（すなわち、反復回分細胞培養）である。特定の実施形態において、回分培養系は、浮遊様式で操作され得る。他の実施形態において、回分培養系は、付着様式で操作され得る。特定の実施形態において、付着様式は、マイクロキャリア、例えば、多孔質マイクロキャリアの使用を含む。

特定の実施形態において、培養は、約３５℃〜約３７℃の間の温度で維持される。他の実施形態において、培養は、約６．９〜約７．３の間のｐＨで維持される。具体的な実施形態において、培養は、約７．０５〜約７．１５の間のｐＨで維持される。

特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、培養培地中で、１ｍｇＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも６００Ｕの比活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をもたらす（すなわち、ＡＤＡＭＴＳ１３の発現）。他の実施形態において、比活性は、１ｍｇＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも８００Ｕである。他の実施形態において、比活性は、１ｍｇＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも１０００Ｕである。他の実施形態において、比活性は、１ｍｇＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも１５００Ｕである。他の実施形態において、比活性は、１ｍｇＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも２０００Ｕである。

他の実施形態において、本方法は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも４００Ｕ（Ｕ／Ｌ／Ｄ）のＡＤＡＭＴＳ１３活性をもたらす培養物を提供する。一実施形態において、本方法は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも８００Ｕ（Ｕ／Ｌ／Ｄ）のＡＤＡＭＴＳ１３活性をもたらす培養物を提供する。

Ａ．ＡＤＡＭＴＳ１３
一態様において、本発明は、増加した全活性および／または比活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を発現させるための方法を提供する。有利に、カルシウム、亜鉛、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）で増殖培地を補充することにより、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチドは、細胞培養物から組み換えにより発現し、回収され得ることが分かった。

ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、国際公開第２００９／０８６３０９号に提供されており、その開示は、全ての目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本参照文献は、適切な方法および培養条件を説明し、これは、培養の持続期間を通して維持され得る。本明細書に記載される、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現に使用される細胞培養物は、一般に、３４℃〜３７℃の間の温度で、または約その温度の間で、および６．８〜７．３のｐＨで、または約そのｐＨの間で維持される。

培養温度およびｐＨを監視する手段は、当該分野において周知であり、一般に、生物反応器の中に挿入されるか、培養培地が循環されるループに含まれるか、または抽出された培養培地の試料の中に挿入されるプローブに依存する。適切なインラインｐＨセンサは、ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏＩｎＰｒｏ３１００／１２５／Ｐｔ１００センサ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−ＴｏｌｅｄｏＩｎｇｏｌｄ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を含む。センサを所定のレベルで保つために、指定されたパラメータを変更する手段も周知である。例えば、温度を一定に保つことは、通常、生物反応器または供給培地（流加または連続プロセスの場合）を加熱する、または冷却することを含み、ｐＨを一定に保つことは、通常、適切な緩衝液（通常、重炭酸）を選択し、それを十分に供給し、塩酸等の酸、または水酸化ナトリウム、重炭酸ナトリウム等のアルカリ、もしくはそれらの混合物を必要に応じて供給培地に追加することを含む。インラインｐＨプローブの較正は、細胞が培養される数日または数週間にわたって等の、時間とともに変動し得ることもある。その場合には、最近較正されたオフラインプローブから得た測定値を使用することによって、インラインプローブをリセットすることが有益であり得る。

一実施形態において、方法は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）から選択される少なくとも１つの成分で補充された培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）から選択される少なくとも２つの成分で補充された培地中に発現する。また別の実施形態において、培養培地は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一部の実施形態において、培養培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成培養培地であり得る。

１．亜鉛の補充
有利に、増加したＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性および比活性は、亜鉛で補充された培地で増殖させた細胞培養物から回収され得ることが分かった。例えば、実施例１は、１．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（５μＭの亜鉛）を含有する培養培地中に発現したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が、０．４３２ｍｇ／ＬのみのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（１．５μＭの亜鉛）を含有する培養培地中に発現したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質より４０％〜１００％高い比活性を有することを示す（表１０および表１１を比較）。さらに、この効果は、実施例２（表１３および表１４を比較）、実施例４（表１６〜表１９）、および実施例５（表２０および表２１）に示されるように、再現可能である。

したがって、一態様において、本発明は、亜鉛で補充された、例えば、少なくとも２μＭの亜鉛を含有する培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより、増加した比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための方法を提供する。同様に、本発明は、亜鉛で補充された、例えば、少なくとも２μＭの亜鉛を含有する培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより、増加した全活性または比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を調製するための方法も提供する。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、培養培地は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。また他の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有し得る。適切な亜鉛の濃度範囲は、一般に、高濃度の亜鉛、例えば、２０μＭ超、２５μＭ超、３０μＭ超、４０μＭ超等の濃度の存在下で生じ得る細胞培養毒性により決定される。当業者に理解されるように、亜鉛濃度が特定の培養系に対してどの程度抑制的であるかは、他の要因の中でも、特に、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるために使用される細胞の種類、利用される培養培地の成分、および培養に利用される操作様式（例えば、回分対連続、浮遊対付着、ケモスタット対灌流等）に依存する。特定の場合において、高亜鉛濃度は、培養培地の成分が溶液から亜鉛を隔離する場合に、例えば、培養培地がアルブミンを含有する場合、必要とされ得る。したがって、適切な亜鉛の濃度範囲は、一般に、利用される培養された細胞、培地、および操作様式が何であるかによって決定される。当業者は、利用される個々の培養系に基づき、亜鉛補充の使用における適切な上限を容易に決定することができるであろう。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含有する動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。また別の実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有し得る。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含有する既知組成培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む既知組成培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、既知組成培養培地は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、既知組成培養培地は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。また別の実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有し得る。特定の実施形態において、既知組成培地は、動物由来タンパク質および／またはポリペプチドを含まない。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。一実施形態において、本方法は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。また他の実施形態において、本方法は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。また他の実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。一実施形態において、本方法は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。別の実施形態において、本方法は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。また別の実施形態において、本方法は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度は、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、またはその間で維持される。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、本方法は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。別の実施形態において、本方法は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。また別の実施形態において、本方法は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるために使用される培養培地は、少なくとも約２μＭ〜少なくとも約１２μＭの最終濃度で、亜鉛で補充され得る。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも約２μＭ、または少なくとも約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上のレベルの亜鉛の最終濃度で、亜鉛で補充され得る。一般に、いかなる亜鉛塩も本発明の培地を補充するために使用され得、許容される塩の例としては、ＺＮＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＺＮＳＯ_３・２Ｈ_２Ｏ、（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７）_２ＺＮ_３・２Ｈ_２Ｏ、ＺＮＢＲ_２、ＺＮＢＲ_２・２Ｈ_２Ｏ、ＺＮＣＬ_２、ＺＮ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ、ＺＮ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２・Ｈ_２Ｏ、（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２ＺＮ・２Ｈ_２Ｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、薬学的に許容される亜鉛の塩が、本発明の培養培地を補充するために使用される。

２．カルシウムの補充
有利に、増加したＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性および比活性は、カルシウムで補充された培地で増殖させた細胞培養物から回収され得ることが分かった。従来の細胞培養培地、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、通常、約１ｍＭのカルシウムを含有した。歴史的に、これらの高カルシウムレベルは、付着細胞培養物を補助するために、培地中に導入された。しかしながら、今日、浮遊培養用に設計された市販の培地は、非常に低いカルシウムレベル、例えば、約０．１ｍＭのカルシウムを含有する。浮遊法を介して培養される細胞の凝集を防止するために、そのような低カルシウムレベルに依存する。低カルシウムレベルは、浮遊液中で細胞を繁殖させ、組み換えタンパク質を発現させるために十分であることが知られているが、本発明は、これらの低カルシウムレベルがＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現に不十分であることを発見した。

したがって、一態様において、本発明は、カルシウムで補充された、例えば、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより、増加した比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための方法を提供する。同様に、本発明は、カルシウムで補充された、例えば、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより、増加した全活性または比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を調製するための方法も提供する。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含有する。また他の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有し得る。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含有する動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含有する。また別の実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有し得る。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含有する既知組成培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む既知組成培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、既知組成培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含有する。また別の実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有し得る。特定の実施形態において、既知組成培地は、動物由来タンパク質および／またはポリペプチドを含まない。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。一実施形態において、本方法は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。また他の実施形態において、本方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。また他の実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。一実施形態において、本方法は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。また他の実施形態において、本方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度は、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、またはその間で維持される。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、本方法は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。また他の実施形態において、本方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において培養培地は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、または約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムと、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムと、少なくともまたは約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムと、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムと、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムと、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一般に、いかなるカルシウム塩も本発明の培地を補充するために使用され得る。許容される塩の例としては、ＣａＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＣａＦＰＯ_３・２Ｈ_２Ｏ、ＣａＩ_２、ＣａＢｒ_２、（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２Ｃａ、（ＣＨＯ_２）_２Ｃａ、（Ｃ_６Ｈ_７Ｏ_６）_２Ｃａ、（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７）_２Ｃａ_３・２Ｈ_２Ｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、薬学的に許容されるカルシウムの塩は、本発明の培養培地を補充するために使用される。

３．ニコチンアミド（ビタミンＢ３）の補充
有利に、増加したＡＤＡＭＴＳ１３酵素活性および比活性は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された培地で増殖させた細胞培養物から回収され得ることが分かった。例えば、実施例２は、７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する培養培地中に発現したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が、２ｍｇ／Ｌのみのニコチンアミドを含有する培養培地中に発現したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質より６０％高い得的活性を有することを示す（表１３、４日目および７日目を１１日目と比較）。意外にも、本作用は、７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と５μＭの亜鉛を含有する培地中におけるＡＤＡＭＴＳ１３の発現が、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性において２００％〜３００％の増加をもたらすので、亜鉛補充と相乗的である（表１４の１１日目と表１３の４日目および７日目とを比較）。

したがって、一態様において、本発明は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された、例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより、増加した比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための方法を提供する。同様に、本発明は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された、例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより、増加した全活性または比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を調製するための方法も提供する

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。また他の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有し得る。適切なニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度範囲は、一般に、高濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）、例えば、１５ｍｇ／Ｌ超、２０ｍｇ／Ｌ超、３０ｍｇ／Ｌ超、４０ｍｇ／Ｌ超等の濃度の存在下で生じ得る細胞培養毒性により決定される。当業者に理解されるように、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）濃度が特定の培養系に対してどの程度抑制的であるかは、他の要因の中でも、特に、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるために使用される細胞の種類、利用される培養培地の成分、および培養に利用される操作様式（例えば、回分対連続、浮遊対付着、ケモスタット対灌流等）に依存する。ある場合において、高ニコチンアミド（ビタミンＢ３）濃度は、培養培地の成分が溶液からニコチンアミド（ビタミンＢ３）を隔離する場合に必要とされ得る。したがって、適切なニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度範囲は、一般に、利用される培養された細胞、培地、および操作様式の識別によって決定される。当業者は、利用される個々の培養系に基づき、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）補充の使用における適切な上限を容易に決定することができるであろう。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。また他の実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有し得る。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する既知組成培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む既知組成培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。一実施形態において、既知組成培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。また他の実施形態において、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有し得る。特定の実施形態において、既知組成培地は、動物由来タンパク質および／またはポリペプチドを含まない。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。一実施形態において、本方法は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。また他の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。また他の実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。一実施形態において、本方法は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミドを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。また他の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度は、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。別の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、本方法は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。また他の実施形態において、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することを含み、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛とを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上、または約それら以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛とを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上、または約それら以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。また別の関連する実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上、または約それら以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛とを含む。特定の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上、または約それら以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛とを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムとを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムとを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムとを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムとを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムとを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムとを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムとを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムとを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムとを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムとを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムとを含む。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムとを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

別の実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムとを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。関連する実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上、または約それら以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムとを含む。別の関連する実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上、または約それら以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、または約５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウムとを含む。特定の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上、または約それら以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）と、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムとを含む。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

一実施形態において、トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法を提供し、本方法は、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、亜鉛は、少なくとも、もしくは約２μＭ、５μＭ、２μＭ〜１２μＭの間、５μＭ〜１２μＭの間、または少なくとも３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の濃度で培養培地中に存在する。特定の実施形態において、カルシウムは、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、１．５ｍＭ、０．５〜１．５の間、または少なくとも０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上の濃度で培養培地中に存在する。特定の実施形態において、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）は、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ〜７ｍｇ／Ｌ、または少なくとも、もしくは約３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度で培養培地中に存在する。

本明細書に明示的に開示され、変形形態１４〜変形形態９３（表３〜表６）に提供されるように、３つの成分（すなわち、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３））の濃度のいずれの組み合わせも、本発明の方法に使用されることが意図される。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続または流加培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、連続培養条件は、ケモスタット培養条件である。別の具体的な実施形態において、連続培養条件は、灌流培養条件である。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。

Ｂ．宿主細胞およびベクター
組み換えＡＤＡＭＴＳタンパク質は、適切な原核または真核宿主系における発現により産生され得る。真核細胞の例としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ−Ｈｅｐ、およびＨｅｐＧ２等の哺乳類細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｓ２細胞、およびＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞）、ならびに酵母細胞（例えば、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞等において発現され得る。例えば、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、またはマウス細胞系においてである。特定の一実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、またはＨＥＫ細胞系である。好ましい実施形態において、細胞系は、ＣＨＯ細胞系である。

一実施形態において、細胞は、ＡＤＡＭＴＳ１３等の所望のＡＤＡＭＴＳタンパク質を産生するために、好ましくは、製造プロセス（すなわち、少なくとも１リットル）で培養され得るあらゆる哺乳類細胞であり得る。例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサルの腎臓ＣＶ１系、ヒト胚腎臓系（浮遊培養物中での増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ１０）、ＤＵＫＸ−Ｂ１１サブクローン等のチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，ＵｒｉａｕｂａｎｄＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ，２３：２４３−２５１（１９８０））、サルの腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、アフリカ緑ザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）、ヒトの頚部癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣＣＣＬ２）、イヌの腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、バッファロラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）、ヒトの肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ７５）、ヒトの肝細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）、マウスの乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒトの肝細胞腫系（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。好ましくは、細胞系は、ゲッ齒類細胞系、特に、ＣＨＯまたはＢＨＫ等のハムスター細胞系である。

ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現するために、広範なベクターが使用され得、真核および原核発現ベクターより選択され得る。特定の実施形態において、プラスミドベクターは、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、（ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現に使用することが意図される。一般に、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主との結合に使用される。ベクターは、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型の選択を提供することができるマーカー配列を保有することができる。プラスミドは、１つ以上の制御配列、例えば、プロモーターに操作可能に連結されるＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を含む。

組み換えＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現する安定したＣＨＯ細胞クローンを調製する好ましい方法は以下の通りである。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞系であるＤＵＫＸ−Ｂ１１が、基本的に、米国特許第５，２５０，４２１号（Ｋａｕｆｍａｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）に記載されるように、関連する組み換えタンパク質の発現を可能にするためにＤＨＦＲ発現ベクターを形質移入される。選択は、ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）を含まない培地中での増殖により行われ、組み換えＡＤＡＭＴＳタンパク質およびＤＨＦＲ遺伝子の発現をコードする関連する領域の増幅は、増加した濃度のメトトレキサート中で細胞を繁殖させることにより達成される。適切な場合、ＣＨＯ細胞系は、基本的に、第ＵＳ６，１００，０６１号（Ｒｅｉｔｅｒｅｔａｌ，ｌｍｍｕｎｏＡｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）に記載されるように、血清および／またはタンパク質を含まない培地中での増殖に適応され得る。

別の好ましい実施形態において、安定したＨＥＫ２９３細胞は、ハイグロマイシン選択マーカーを含有する構築物を形質移入され、抗生物質耐性により形質転換体を選択することにより調製される。

特定のウイルスが細胞を感染させる、またはレセプター媒介飲食作用を介して細胞に進入し、宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、安定かつ効率的にウイルス遺伝子を発現する能力は、外来性核酸の細胞（例えば、哺乳類細胞）内への移動においてウイルスを魅力的な候補物質にする。したがって、特定の実施形態において、ウイルスベクターが、発現のために、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入するために使用される。ウイルスベクターは、１つ以上の制御配列、例えば、プロモーターに操作可能に連結されるＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を含む。代替的に、ウイルスベクターは、制御配列を含有しなくてもよく、代わりに、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現を誘発するために、宿主細胞内の制御配列に依存する。核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、アデノウイルス発現ベクターは、構築物のパッケージを支持し、最終的にそれにクローン化されたＡＤＡＭＴＳ構築物を発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有するこれらの構築物を含む。アデノウイルスベクターは、最大７ｋｂの外来性配列の導入を可能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎａｒｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ，２００（２）：５３５−５４６，１９９２））。

別の実施形態において、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が、発現のために、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入するために使用され得る。ＡＡＶ系は、以前に記載されており、一般に、当該分野において周知である（ＫｅｌｌｅｈｅｒａｎｄＶｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０−７，１９９４、Ｃｏｔｔｅｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，８９（１３）：６０９４−６０９８，１９９２、Ｃｕｒｉｅｌ，ＮａｔＩｍｍｕｎ，１３（２−３）：１４１−６４，１９９４、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７−１２９，１９９２）。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号に記載されており、それぞれ、全ての目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、レトロウイルス発現ベクターが、発現のために、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入するために使用される。これらの系は、以前に記載されており、一般に、当該分野において周知である（Ｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３、ＮｉｃｏｌａｓａｎｄＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｓｕｒｖｅｙｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚａｎｄＤｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４−５１３，１９８８、Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８，１９８６）。具体的な実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３−２６７，１９９６、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（９）：８７１−８７５，１９９７、Ｂｌｏｍｅｒｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ．，７１（９）：６６４１−６６４９，１９９７、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照）。

原核生物発現のためのベクターの例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤ等のプラスミドが挙げられるが、これらに限定されず、原核生物発現ベクターに使用されるプロモーターは、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ等を含む。真核生物発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母における発現においては、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１等のプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴ等のベクター、（ｉｉ）昆虫細胞における発現においては、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈ等のプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣ等のベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳類細胞における発現においては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ−１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、およびβ−アクチン等のプロモーターを使用する、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶ等のベクター、およびワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス等のウイルス系由来のベクターを含む。

特定の実施形態において、本発明の細胞培養方法は、マイクロキャリアの使用を含み得る。本発明は、他の態様の中でも、大規模なＡＤＡＭＴＳタンパク質発現の方法を提供する。一部の実施形態において、実施形態の細胞培養は、高細胞密度およびタンパク質発現を達成するために、高容量の特定の培養表面積を提供するのに適した条件下で、大型の生物反応器中で実施され得る。そのような増殖条件を提供するための一手段は、攪拌タンク生物反応器において、細胞培養用のマイクロキャリアを使用することである。別の実施形態において、これらの増殖必要条件は、浮遊細胞培養の使用を介して満たされる。

Ｃ．培養方法
特定の実施形態において、本発明の方法は、回分または連続様式操作下で操作される細胞培養系の使用を含むことができる。例えば、回分細胞培養が利用される時、それらは、単一回分、流加、または反復回分様式下で操作され得る。同様に、連続細胞培養は、例えば、灌流、タービドスタット、またはケモスタット様式下で操作され得る。回分および連続細胞培養は、浮遊または付着条件のいずれかの下で実施され得る。浮遊条件下で操作される時、細胞は、自由に培養培地内に浮遊し、混合される。代替的に、付着条件下で、細胞は、固体相、例えば、マイクロキャリア、多孔質マイクロキャリア、ディスクキャリア、セラミックカートリッジ、中空ファイバ、フィラットシート、ゲルマトリクス等に結合される。

回分培養は、通常、細胞接種材料がタンクまたは発酵槽中で最大密度に培養され、単一回分として採取され、加工される、大規模な細胞培養である。流加培養は、通常、新たな栄養物質（例えば、増殖制限基質）、または添加物（例えば、産物に対する前駆体）のいずれかを供給される回分培養である。供給液は、通常、生物反応器の希釈を避けるために、高度に濃縮される。反復回分培養において、細胞は、培養培地中に設置され、所望の細胞密度に増殖される。衰退期および細胞死の開始を避けるために、培養物は、次いで、細胞が最大濃度に達する前に完全増殖培地で希釈される。希釈の量および頻度は、広範に変動し、細胞系の増殖特徴および培養プロセスの利便性による。プロセスは、必要に応じて何度も繰り返すことができ、細胞および培地が継代で廃棄されない限り、培養物の容量は、各希釈物が作製されるにつれて、段階的に増加する。容量の増加は、槽内に希釈物が入るのに十分な大きさの反応器を有することによって、またはいくつかの槽に希釈培養物を分配することによって取り扱うことができる。この種類の培養物の実施理由は、指数的な増殖状態で細胞を維持するためである。一連の継代は、培養物の容量が段階的に常に増加し、複数の採取物が存在し得、細胞が増殖し続け、プロセスが所望する限り継続できることを特徴とする。特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）は、回分培養物の上清を採取した後に回収され得る。

連続培養は、新たな培地の流入により栄養物質で持続的に供給される浮遊培養であり得、培養物の容量は、通常、使用済み培地を同時に除去することにより、一定に保たれる。ケモスタット法およびタービドスタット法において、抽出された培地は細胞を含有する。よて、細胞培養槽に残留する細胞は、定常状態を維持するように増殖しなければならない。ケモスタット法において、増殖速度は、通常、希釈速度、すなわち、新たな培地が添加される速度を制御することにより制御される。培養物中の細胞の増殖速度は、例えば、希釈速度を変更することにより、最大下増殖速度で制御され得る。逆に、タービドスタット法において、希釈速度は、細胞がｐＨおよび温度等の所与の操作条件で達成することができる最大増殖速度を可能にするように設定される。

灌流培養において、抽出された培地は、細胞が枯渇し、これは、例えば、細胞の培養物への再導入をもたらす濾過法により、または遠心分離法により、培養槽に保持される。しかしながら、通常濾過に使用される膜は、１００％の細胞を保持せず、よって、培地が抽出される時に、一部が除去される。細胞の大部分は培養槽に保持されるため、非常に高増殖速度で灌流培養物を操作することは重要ではないかもしれない。

攪拌タンク反応器システムは、浮遊または付着様式下で操作される回分および連続細胞培養に使用され得る。一般に、攪拌タンク反応器システムは、Ｒｕｓｈｔｏｎ、水中翼、ピッチブレード、またはマリーン等のあらゆる種類の攪拌器を備えた、あらゆる従来の攪拌タンク反応器として操作され得る。

本発明の方法は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現のために、灌流またはケモスタット細胞培養等の流加細胞培養または連続細胞培養の使用を含む場合がある。特定の実施形態において、最大少なくとも約１２μＭの濃度の亜鉛で補充される流加培養培地が、増加した比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現を提供することが分かった（表２０）。特に、１２μＭの最終濃度の亜鉛で補充された流加培養物において、特定の細胞増殖速度および全活性は、影響を受けず、一方、発現させたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は増加し続けた。これは、ケモスタット細胞培養を利用した実験で見られたものとは対照的である。これらの実験において、５μＭの最終濃度の亜鉛での培養培地の補充は、上清におけるＡＤＡＭＴＳ１３の比活性において増加をもたらした（表２１）。しかしながら、培養上清におけるＡＤＡＭＴＳ１３の比活性は高いままであったが、８．５μＭおよび１２μＭの高レベルの補充での比細胞増殖速度および全ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質収率は減少した。

したがって、一実施形態において、本発明の方法は、少なくとも、もしくは約２μＭ、少なくとも、もしくは約５μＭ、２μＭ〜１２μＭもしくは約その間、２μＭ〜５μＭもしくは約その間、５μＭ〜１２μＭもしくは約その間、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛の濃度で亜鉛を含む培地を用いた流加細胞培養の使用を含む。一部の実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約５μＭ〜少なくとも約１２μＭであり得る。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。

１．連続培養
有利に、本発明は、連続培養において高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法を提供する。これらの方法は、長期間にわたり単一培養からのＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現および精製を可能にする。具体的に、高レベルのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の発現および比活性は、本発明により提供される条件下の１０Ｌのケモスタット生物反応器中で、少なくとも５３日間維持され得ることが分かった（実施例３、表１５を参照）。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

したがって、一実施形態において、本発明は、長期間、高特異性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させる方法を提供する。特定の実施形態において、培養物は、少なくとも、もしくは約７日間、または少なくとも、もしくは約１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも、もしくは約５週間、６週間、７週間、または少なくとも、もしくは約２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。これらの実施形態の一部において、全ＡＤＡＭＴＳタンパク質発現、活性、または比活性のレベルは、長期間、培養物中で維持される。他の実施形態において、比増殖速度、細胞密度等は、長期間、培養物中で維持される。一部の実施形態において、培養培地は、例えば、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、カルシウム、亜鉛、またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）のうちの少なくとも１つで補充され得る。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、連続細胞培養技法は、少なくとも７日間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、連続細胞培養技法は、少なくとも１４日間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、連続細胞培養技法は、少なくとも２１日間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、連続細胞培養技法は、少なくとも１ヶ月間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、連続細胞培養技法は、少なくとも２ヶ月間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、連続細胞培養技法は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月以上、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させる方法は、少なくとも７日間、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛、少なくとも、もしくは約２μＭ〜１２μＭの間の亜鉛、または約２μＭ〜５μＭもしくは約その間の亜鉛、３μＭ〜５μＭもしくは約その間の亜鉛、５μＭ〜１２μＭもしくは約その間の亜鉛、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛の濃度で亜鉛を含む培地を用いた連続細胞培養の使用を含む場合がある。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、連続培養条件下で、少なくとも約７日間、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛を含有する培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。他の実施形態において、培養培地は、少なくとも約３μＭの亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約５μＭの亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、２μＭの亜鉛〜５μＭの亜鉛、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、３μＭの亜鉛〜５μＭの亜鉛、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、２μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、３μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、５μＭの亜鉛〜１２μＭの亜鉛、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有する。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、連続培養条件下で、少なくとも約７日間、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムを含有する培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。他の実施形態において、培養培地は、少なくとも約１．０ｍＭのカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約１．５ｍＭのカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム、または約その間のカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、１．０ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム、または約その間のカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有する。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、連続培養条件下で、少なくとも約７日間、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸をもつ細胞を培養することを含む。他の実施形態において、培養培地は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜７ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。別の実施形態において、培養培地は、５ｍｇ／Ｌ〜７ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、連続培養条件下で、少なくとも約７日間、亜鉛およびカルシウムの双方で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。ある実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、変形形態９４〜変形形態１１３（表７）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、連続培養条件下で、少なくとも約７日間、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。ある実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１１４〜変形形態１３３（表８）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、連続培養条件下で、少なくとも約７日間、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の双方で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。ある実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１３４〜変形形態１４９（表９）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、連続培養条件下で、少なくとも約７日間、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。ある実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１４〜変形形態９３（表３〜表６）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、培養物は、長期間、約０．５×１０^６〜４×１０^７細胞／ｍＬの間の細胞密度で維持される。他の実施形態において、細胞密度は、長期間、約１．０×１０^６〜約１．０×１０^７細胞／ｍＬの間の濃度で維持される。他の実施形態において、細胞密度は、長期間、約１．０×１０^６〜約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間の濃度で維持される。他の実施形態において、細胞密度は、長期間、約１．０×１０^６〜約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間の濃度で維持される。また別の実施形態において、細胞密度は、長期間、約２．０×１０^６〜約４．０×１０^６の間、または約１．０×１０^６〜約２．５×１０^６の間、または約１．５×１０^６〜約３．５×１０^６の間、またはあらゆる他の類似する範囲の濃度で維持され得る。組み換えＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の産生のために細胞培養物が維持される細胞密度は、タンパク質発現に使用される培養条件および培地に依存する。当業者は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を産生する細胞培養物の最適な細胞密度を容易に決定することができるだろう。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

他の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、例えば、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性単位等の、１日につき１リットル培養物当り少なくとも、もしくは約５００単位（５００Ｕ／Ｌ／Ｄ）のＡＤＡＭＴＳ１３活性の産生を可能にし、少なくとも、もしくは約５００Ｕ／ｍｇのＡ１３の比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約６００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約７００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約８００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約９００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１０００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１１００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１２００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１３００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１４００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１５００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約２０００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

別の実施形態において、方法は、長期間、高比活性、例えば、少なくとも約６００Ｕ／ｍｇのＡ１３タンパク質、または少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００以上のＵ／ｍｇのＡ１３タンパク質の比活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の延長された発現を可能にする。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。特定の一実施形態において、方法は、ケモスタット細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、タービドスタット細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、灌流細胞培養の使用を含む。特定の実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

２．回分培養
別の態様において、本発明は、回分培養において高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法を提供する。一部の実施形態において、培養培地は、例えば、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、カルシウム、亜鉛、またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）のうちの少なくとも１つで補充され得る。特定の一実施形態において、方法は、単一回分細胞培養の使用を含む。別の実施形態において、方法は、流加細胞培養の使用を含む。また別の実施形態において、方法は、反復回分細胞培養の使用を含む。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、流加または反復回分細胞培養技法は、少なくとも７日間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、流加または反復回分細胞培養技法は、少なくとも１４日間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、流加または反復回分細胞培養技法は、少なくとも２１日間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、流加または反復回分細胞培養技法は、少なくとも１ヶ月、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、流加または反復回分細胞培養技法は、少なくとも２ヶ月間、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。別の実施形態において、流加または反復回分細胞培養技法は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月以上、変形形態１〜変形形態１４９（表２〜表９）のうちのいずれか１つに従う濃度で、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する細胞培養物中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために使用され得る。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させる方法は、少なくとも７日間、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛、２μＭ〜１２μＭの間もしくは約その間の亜鉛、または２μＭ〜５μＭもしくは約その間の亜鉛、３μＭ〜５μＭもしくは約その間の亜鉛、５μＭ〜１２μＭもしくは約その間の亜鉛、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛の濃度で亜鉛を含む培地を用いた流加または反復回分細胞培養の使用を含み得る。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、流加または反復回分培養条件下で、少なくとも約７日間、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムを含有する培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。他の実施形態において、培養培地は、少なくとも約１．０ｍＭのカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約１．５ｍＭのカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム、または約その間のカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、１．０ｍＭ〜１．５ｍＭのカルシウム、または約その間のカルシウムを含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有する。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、流加または反復回分培養条件下で、少なくとも約７日間、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸をもつ細胞を培養することを含む。他の実施形態において、培養培地は、少なくとも約５ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜７ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。別の実施形態において、培養培地は、５ｍｇ／Ｌ〜７ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、流加または反復回分培養条件下で、少なくとも約７日間、亜鉛およびカルシウムの双方で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。ある実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、変形形態９４〜変形形態１１３（表７）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、流加または反復回分培養条件下で、少なくとも約７日間、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の双方で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。ある実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１１４〜変形形態１３３（表８）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、流加または反復回分培養条件下で、少なくとも約７日間、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１３４〜変形形態１４９（表９）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法は、流加または反復回分培養条件下で、少なくとも約７日間、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された培養倍中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む。ある実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１４〜変形形態９３（表３〜表６）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、培養物は、長期間、約０．５×１０^６〜４×１０^７細胞／ｍＬの間の細胞密度で維持される。他の実施形態において、細胞密度は、長期間、約１．０×１０^６〜約１．０×１０^７細胞／ｍＬの間の濃度で維持される。他の実施形態において、細胞密度は、長期間、約１．０×１０^６〜約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間の濃度で維持される。他の実施形態において、細胞密度は、長期間、約１．０×１０^６〜約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間の濃度で維持される。また別の実施形態において、細胞密度は、長期間、約２．０×１０^６〜約４．０×１０^６の間、または約１．０×１０^６〜約２．５×１０^６の間、または約１．５×１０^６〜約３．５×１０^６の間、またはあらゆる他の類似する範囲の濃度で維持され得る。組み換えＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の産生のために細胞培養物が維持される細胞密度は、タンパク質発現に使用される培養条件および培地に依存する。当業者は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を産生する細胞培養物の最適な細胞密度を容易に決定することができるだろう。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

他の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、例えば、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性単位等の、１日につき１リットル培養物当たり少なくとも、もしくは約５００単位（５００Ｕ／Ｌ／Ｄ）のＡＤＡＭＴＳ１３活性の産生を可能にし、少なくとも、もしくは約５００Ｕ／ｍｇのＡ１３の比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約６００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約７００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約８００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約９００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１０００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１１００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１２００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１３００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１４００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約１５００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３を発現させる方法は、少なくとも、または約２０００Ｕ／Ｌ／Ｄの産生を可能にする。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

別の実施形態において、方法は、長期間、高比活性、例えば、少なくとも約６００Ｕ／ｍｇのＡ１３タンパク質、または少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００以上のＵ／ｍｇのＡ１３タンパク質の比活性を有するＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の延長された発現を可能にする。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一部の実施形態において、培養は、浮遊回分培養として実施され得る。他の実施形態において、培養は、付着回分培養として実施され得る。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

３．培養条件
意外にも、細胞生存率およびＡＤＡＭＴＳ１３活性は、細胞培養物のｐＨおよび温度のわずかな変動により増加され得ることも分かった。図２に見られるように、発現したＡＤＡＭＴＳ１３の比活性は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードするヌクレオチドを持つ細胞が約７．３０未満で培養される時に非常に強化される。程度は低いが、これらの試験において、温度もＡＤＡＭＴＳ１３の比活性に寄与する要因である。同様に、約６．８０〜約７．３の間のｐＨで増殖させた培養物の上清におけるＡ１３の容量生産能（ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３により測定される）は、その範囲の上下のｐＨレベルと比較して非常に増加したことが分かった。ＡＤＡＭＴＳ１３生産能は、培養物の温度によっても影響を受けた。最大活性は、約３４℃〜約３７℃の間の温度で増殖させた培養物で認められた。

他の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させる方法は、培養培地の温度を約３４℃〜約３７℃の温度で維持するステップを含む。ある実施形態において、培養培地は、３６．５℃以下、３６．０℃以下、３５．５℃以下、または３５．０℃未満の温度で維持され得る。具体的な実施形態において、温度は、約３６℃の温度で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、上述の温度およびｐＨの範囲の組み合わせ、例えば、３６．５℃以下、かつ例えば、７．１５以下のｐＨで維持される。好ましい実施形態において、培養物は、３６．０℃の温度、かつ７．１０のｐＨで維持される。

したがって、一部の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させる方法は、培養培地のｐＨを約６．８〜７．３の間のｐＨで維持するステップを含む。ある実施形態において、ｐＨは、約７．０〜約７．２５の間、または約７．０５〜約７．１５の間であり得る。ある実施形態において、ｐＨは、７．２０以下、７．１５以下、７．１０、または７．０５以下のｐＨで維持され得る。具体的な一実施形態において、培養培地のｐＨは、約７．１のｐＨで維持される。

一実施形態において、本発明は、３４℃〜約３７℃もしくは約その間の温度、かつ６．８〜７．３もしくは約その間のｐＨで、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法を提供する。別の実施形態において、培養物の温度は、３５℃〜約３７℃もしくは約その間であり、ｐＨは、６．８〜７．３もしくは約その間である。別の実施形態において、培養物の温度は、３５．５℃〜約３６．５℃もしくは約その間であり、ｐＨは、６．８〜７．３もしくは約その間である。別の実施形態において、培養物の温度は、３６℃もしくは約３６℃であり、ｐＨは、６．８〜７．３もしくは約その間である。一実施形態において、培養培地は、亜鉛で補充される。別の具体的な実施形態において、培養培地は、カルシウムで補充される。別の具体的な実施形態において、培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、培養培地は、亜鉛およびカルシウムで補充される。一実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、変形形態９４〜変形形態１１３（表７）のうちの１つである。別の実施形態において、培養培地は、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１１４〜変形形態１３３（表８）のうちの１つである。別の実施形態において、培養培地は、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１３４〜変形形態１４９（表９）のうちの１つである。また別の実施形態において、培養培地は、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で濃縮される。一実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１４〜変形形態９３（表３〜表６）のうちの１つである。

別の実施形態において、本発明は、３４℃〜約３７℃もしくは約その間の温度、かつ６．９〜７．２５もしくは約その間のｐＨで、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法を提供する。別の実施形態において、培養物の温度は、３５℃〜約３７℃もしくは約その間であり、ｐＨは、６．９〜７．２５もしくは約その間である。別の実施形態において、培養物の温度は、３５．５℃〜約３６．５℃もしくは約その間であり、ｐＨは、６．９〜７．２５もしくは約その間である。別の実施形態において、培養物の温度は、３６℃もしくは約３６℃であり、ｐＨは、６．９〜７．２５もしくは約その間である。一実施形態において、培養培地は、亜鉛で補充される。別の具体的な実施形態において、培養培地は、カルシウムで補充される。別の具体的な実施形態において、培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、培養培地は、亜鉛およびカルシウムで補充される。一実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、変形形態９４〜変形形態１１３（表７）のうちの１つである。別の実施形態において、培養培地は、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１１４〜変形形態１３３（表８）のうちの１つである。別の実施形態において、培養培地は、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１３４〜変形形態１４９（表９）のうちの１つである。また別の実施形態において、培養培地は、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で濃縮される。一実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１４〜変形形態９３（表３〜表６）のうちの１つである。

別の実施形態において、本発明は、３４℃〜約３７℃もしくは約その間の温度、かつ７．０〜７．２０もしくは約その間のｐＨで、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させるための方法を提供する。別の実施形態において、培養物の温度は、３５℃〜約３７℃もしくは約その間であり、ｐＨは、７．０〜７．２０もしくは約その間である。別の実施形態において、培養物の温度は、３５．５℃〜約３６．５℃もしくは約その間であり、ｐＨは、７．０〜７．２０もしくは約その間である。別の実施形態において、培養物の温度は、３６℃もしくは約３６℃であり、ｐＨは、７．０〜７．２０もしくは約その間である。一実施形態において、培養培地は、亜鉛で補充される。別の具体的な実施形態において、培養培地は、カルシウムで補充される。別の具体的な実施形態において、培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、培養培地は、亜鉛およびカルシウムで補充される。一実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、変形形態９４〜変形形態１１３（表７）のうちの１つである。別の実施形態において、培養培地は、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１１４〜変形形態１３３（表８）のうちの１つである。別の実施形態において、培養培地は、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１３４〜変形形態１４９（表９）のうちの１つである。また別の実施形態において、培養培地は、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で濃縮される。一実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１４〜変形形態９３（表３〜表６）のうちの１つである。

マイクロキャリア上で細胞を増殖させる概念は、最初にｖａｎＷｅｚｅｌ（ｖａｎＷｅｚｅｌＡＬ．，Ｎａｔｕｒｅ１９６７Ｏｃｔ７；２１６（５１１０）：６４−５）によって説明され、増殖培地中に浮遊した小固形粒子の表面上への細胞の付着を可能にする。これらの方法は、高い表面対体積比を提供し、よって、効率的な栄養利用を可能にする。さらに、真核細胞系における分泌タンパク質の発現において、増加した表面対体積比は、高レベルの分泌、よって、培養物の上清におけるタンパク質の高収率を可能にする。最後に、これらの方法は、真核生物発現培養物の容易なスケールアップを可能にする。

ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現する細胞は、細胞培養増殖中、球形または多孔質マイクロキャリアに結合され得る。マイクロキャリアは、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチン、およびセルロース、ならびにＢｕｔｌｅｒ（１９８８．Ｉｎ：Ｓｐｉｅｒ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ＡｎｉｍａｌｃｅｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：２８３−３０３）に記載される他に基づくマイクロキャリアの群から選択されるマイクロキャリアであり得る。したがって、本発明の一実施形態によると、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現する細胞は、球形マイクロキャリア上で培養される。本発明の別の実施形態によると、ＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現する細胞は、多孔質マイクロキャリア上で培養される。球形マイクロキャリア上で細胞をバイオマスに増殖させ、それらが最終発酵バイオマスに達した時、かつ多孔質マイクロキャリア上で発現タンパク質を産生する前に細胞を継代する、またはその逆も可能である。球形マイクロキャリアは、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）１、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）２、およびＣｙｔｏｄｅｘ（商標）３（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の平滑表面、ならびにＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）１、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）２、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（商標）１、およびＣｙｔｏｌｉｎｅ（商標）２（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）等のマクロ多孔質マイクロキャリアの群から選択されるものである。

ＩＶ．培養培地
一態様において、本発明は、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に有用である培養培地を提供する。有利に、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の組み合わせ等の、種々の成分で培養培地を補充することにより、培地で培養される細胞中で発現するＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）酵素の活性は、非常に強化され、それと同時に、酵素は、補充されない培地で培養された細胞と、より高くはないとしても同等のレベルで発現することが分かった。

動物性タンパク質を含まない、および既知組成の培養培地の調製方法は、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号等、当該分野において公知であり、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態において、本明細書に記載される方法に使用される培養培地は、動物性タンパク質を含まない、またはオリゴペプチドを含まない培地である。ある実施形態において、培養培地は、既知組成であり得る。特定の実施形態において、培養培地は、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの濃度の少なくとも１つのポリアミンを含有し得る。

したがって、一実施形態において、さらなるカルシウム、亜鉛、および／またはビタミンＢ３で補充された培養培地を提供する。ある実施形態において、培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成の培地であり得る。ある実施形態において、動物性タンパク質を含まない、またはオリゴペプチドを含まない培地は、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号に教示されるように調製され（それらの開示は、全ての目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、それらの双方は、全ての目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、さらなるカルシウム、亜鉛、および／またはビタミンＢ３で補充される。具体的な実施形態において、既知組成培養培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に類似してもよく、これは、培地で培養される細胞中で発現するＡＤＡＭＴＳタンパク質の比活性を増加させるために、さらなるカルシウム、亜鉛、および／またはビタミンＢ３で補充された。また他の実施形態において、培養培地は動物の成分を含まない。別の実施形態において、培養培地は、タンパク質、例えば、胎児仔ウシ血清等の血清からの動物性タンパク質を含有する。別の実施形態において、培養物は、外因的に追加された組み換えタンパク質を有する。別の実施形態において、タンパク質は、認定された病原体未感染動物からである。

特定の実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間の濃度で、少なくとも１つのポリアミンを含有する。別の実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間で、少なくとも１つのポリアミンを含有する。一実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間で、少なくとも１つのポリアミンを含有する。ある実施形態において、ポリアミンは、オルニチン、プトレシン、スペルミン、またはスペルミジン等の群からである。好ましい実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。具体的な実施形態において、培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のプトレシンを含有する。

一実施形態において、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現のための培養培地を提供する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含有する。一実施形態において、培養培地は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含有する。また他の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有し得る。

一般に、いずれの亜鉛塩も本発明の培地を補充するために使用することができ、許容される塩の例としては、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ｎＳＯ_３・２Ｈ_２Ｏ、（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７）_２Ｚｎ_３・２Ｈ_２Ｏ、ＺｎＢｒ_２、ＺｎＢｒ_２・２Ｈ_２Ｏ、ＺｎＣｌ_２、Ｚｎ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ、Ｚｎ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２・Ｈ_２Ｏ、（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２Ｚｎ・２Ｈ_２Ｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、薬学的に許容される亜鉛の塩は、本発明の培養培地を補充するために使用される。他の実施形態において、ペプチドまたはタンパク質調製物、例えば、インスリンを含有する亜鉛は、本明細書に提供される培養物の補充に使用され得る。

別の実施形態において、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含有する。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含有する。また他の実施形態において、培養培地は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有し得る。

一般に、いかなるカルシウム塩も本発明の培地を補充するために使用することができ、許容される塩の例としては、ＣａＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＣａＦＰＯ_３・２Ｈ_２Ｏ、ＣａＩ_２、ＣａＢｒ_２、（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２Ｃａ、（ＣＨＯ_２）_２Ｃａ、（Ｃ_６Ｈ_７Ｏ_６）_２Ｃａ、（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７）_２Ｃａ_３・２Ｈ_２Ｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、薬学的に許容されるカルシウムの塩が、本発明の培養培地を補充するために使用される。

別の実施形態において、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。一実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。また他の実施形態において、培養培地は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有し得る。

有利に、亜鉛およびカルシウムの双方で補充することにより、培養培地中に発現したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性が、非常に増加することが分かった。したがって、一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために本明細書に提供される培養培地は、亜鉛およびカルシウムの双方で補充され得る。例えば、培養培地は、表７に提供されるレベル、すなわち、変形形態９４〜変形形態１１３のうちのいずれか１つに従うレベルで、亜鉛およびカルシウムで補充され得る。

同様に、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の双方で培養培地を補充することにより、培養培地で発現したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性が、相乗的に増加することが分かった。例えば、この効果は、実施例２に見ることができる（表１４の１１日目を表１３の４日目および７日目と比較）。したがって、一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるために本明細書に提供される培養培地は、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の双方で補充され得る。例えば、培養培地は、表８に提供されるレベル、すなわち、変形形態１１４〜変形形態１３３のうちのいずれか１つに従うレベルで、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充され得る。

有利に、ニコチンアミドおよびカルシウムの双方で補充することにより、培養培地中に発現したＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性が、非常に増加することが分かった。したがって、一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現のために本明細書に提供される培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）およびカルシウムの双方で補充され得る。例えば、培養培地は、表９に提供されるレベル、すなわち、変形形態１３４〜変形形態１４９のうちのいずれか１つに従うレベルで、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）およびカルシウムで補充され得る。

一部の実施形態において、本発明により提供される培養培地は、液体または乾燥もしくは粉末の形態で提供され得る。培地は、単回使用に適した量に予め小分けされるか、または２つ以上の細胞培養に使用され得るより大きな量で提供され得る。一般に、本発明の培地は、減菌様式で提供される。したがって、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質を発現させる、または産生するためのキットも提供し、本キットは、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に適した培養培地を含む。

一態様において、本発明は、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の発現に有用な培養培地を提供する。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約２μＭの亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約２μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する。また別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約５μＭの亜鉛を含有する。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約５〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムを含有する。また別の実施形態において、培養培地は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する。一実施形態において、培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛と、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムとを含有する。

また他の実施形態において、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）の追加は、細胞培養物におけるＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現および比活性をさらに強化することが分かった。一実施形態において、培養培地は、少なくとも約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む。また別の実施形態において、培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。

特定の実施形態において、培養培地は、動物性タンパク質を含まない培養培地である。別の実施形態において、培養培地は、既知組成培地である。ある実施形態において、培養培地は、１つ以上のポリアミンを含む場合がある。特定の実施形態において、ポリアミンは、例えば、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌの濃度のプトレシンである。具体的な実施形態において、培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する。

１．タンパク質を含まない培養培地
特定の態様において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加されたタンパク質を含まない。「タンパク質を含まない培養培地」および関連する用語は、培養物中の細胞に外因性である、またはその細胞以外の供給源からのタンパク質を欠損する培養培地を指し、これは、増殖中にタンパク質を自然に排出する。一実施形態において、外因的に追加されたタンパク質を含まない（すなわち、タンパク質を含まない）ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。ある実施形態において、タンパク質を含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌもしくは約その間、または２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。タンパク質を含まない培養培地の例は、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛、２μＭ〜１２μＭもしくは約その間の亜鉛、または５μＭ〜１２μＭもしくは約その間の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのタンパク質を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのタンパク質を含まない培養培地を提供する。

別の実施形態において、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウム、少なくとも、もしくは約１．５ｍＭのカルシウム、または０．５〜１．５ｍＭもしくは約その間のカルシウムを含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのタンパク質を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのタンパク質を含まない培養培地を提供する。

また別の実施形態において、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、または２ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのタンパク質を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのタンパク質を含まない培養培地を提供する。

２．オリゴペプチドを含まない培養培地
特定の態様において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加されたオリゴペプチドを含まない。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に添加されたオリゴペプチドを含まず（すなわち、ポリペプチドを含まない）、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。ある実施形態において、オリゴペプチドを含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌもしくは約その間、または２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。オリゴペプチドを含まない培養培地の例は、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛、２μＭ〜１２μＭもしくは約その間の亜鉛、または５μＭ〜１２μＭもしくは約その間の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのオリゴペプチドを含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのオリゴペプチドを含まない培養培地を提供する。

別の実施形態において、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウム、少なくとも、もしくは約１．５ｍＭのカルシウム、または０．５〜１．５ｍＭのカルシウムもしくは約その間のカルシウムを含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのオリゴペプチドを含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのオリゴペプチドを含まない培養培地を提供する。

また別の実施形態において、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、少なくとも、もしくは約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、または２ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのオリゴペプチドを含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるためのオリゴペプチドを含まない培養培地を提供する。

３．血清を含まない培養培地
特定の態様において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、これは、血清を含まない。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加された血清を含まず（すなわち、血清を含まない）、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。ある実施形態において、血清を含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌもしくは約その間、または２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。血清を含まない培養培地の例は、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛、２μＭ〜１２μＭもしくはその間の亜鉛、または５μＭ〜１２μＭもしくはその間の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための血清を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための血清を含まない培養培地を提供する。

別の実施形態において、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウム、少なくとも、もしくは約１．５ｍＭのカルシウム、または０．５〜１．５ｍＭもしくは約その間のカルシウムを含有するＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための血清を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための血清を含まない培養培地を提供する。

また別の実施形態において、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、または２ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための血清を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための血清を含まない培養培地を提供する。

４．動物性タンパク質を含まない培養培地
特定の態様において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、これは、動物性タンパク質を含まない。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための培養培地を提供し、これは、外因的に追加された動物性タンパク質またはポリペプチドを含まず（すなわち、動物性タンパク質を含まない）、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。特定の実施形態において、動物性タンパク質を含まない培養培地は、ポリアミンを含有する。例えば、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌもしくは約その間、または２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌもしくは約その間の濃度である。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。動物性タンパク質を含まない培養培地の例は、米国特許第６，１７１，８２５号および同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号および同第２００７／０２１２７７０号に教示され、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

一実施形態において、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛、２μＭ〜１２μＭもしくはその間の亜鉛、または５μＭ〜１２μＭもしくはその間の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための動物性タンパク質を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための動物性タンパク質を含まない培養培地を提供する。

別の実施形態において、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウム、少なくとも、もしくは約１．５ｍＭのカルシウム、または０．５〜１．５ｍＭもしくは約その間のカルシウムを含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための動物性タンパク質を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための動物性タンパク質を含まない培養培地を提供する。

また別の実施形態において、少なくとも、もしくは約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、少なくとも、もしくは約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）、または２ｍｇ／Ｌもしくはその間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための動物性タンパク質を含まない培養培地を提供する。また他の実施形態において、少なくとも、または約３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を発現させるための動物性タンパク質を含まない培養培地を提供する。

Ｖ．ＡＤＡＭＴＳタンパク質の精製
ＡＤＡＭＴＳ１３は、生体内の血漿中に分泌され、そこでは、大きなｖＷＦの多量体を切断することにより、凝固活性を調節するように機能する。発現後、哺乳類細胞のＡＤＡＭＴＳ１３を分泌する能力は、細胞培養物中のＡＤＡＭＴＳ１３組成物の産生および精製中に利用され得る。例えば、哺乳類細胞培養物中で組み換えＡＤＡＭＴＳ１３を発現させることにより、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、細胞を採取し、溶解する必要なく、直接培養物の上清から容易に回収され得る。これは、複数の培養遅延および回収期間なく、大量のタンパク質を産生するための、連続細胞培養（例えば、灌流またはケモスタット細胞培養）等の技法の使用を可能にする。本発明の一態様において、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質を細胞培養物から精製するための方法を提供する。

したがって、一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、培養物中で発現し、培養物の上清から直接回収される。本様式で、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質は、培養物の分画を除去し、上清の他の成分からＡＤＡＭＴＳ１３を精製することにより回収される。一般に、これは、濾過または遠心分離により上清とともに回収されるあらゆる細胞を分離し、上清を１つ以上の精製ステップに曝すことを含む。

米国特許出願公開第２００５／０２６６５２８号およびＺｈｅｎｇら（２００１，Ｂｌｏｏｄ，９８：１６６２−１６６６）、それらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）は、ＡＤＡＭＴＳ１３を精製するための例示的な方法を提供する。精製されたＡＤＡＭＴＳ１３は、従来の方法に従い製剤化され、例えば、ＴＴＰを処置するために治療的に使用される。

一態様において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を産生するための方法を提供する。第１の実施形態において、方法は、（ａ）動物性タンパク質を含まない培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、（ｂ）培養物から上清の分画を除去することと、（ｃ）あらゆる残留細胞を除去するために、濾過または遠心分離を実施するステップと、（ｄ）ＡＤＡＭＴＳタンパク質を濃縮するために、限外濾過ステップを実施するステップと、（ｅ）少なくとも約０．５μＭの亜鉛および少なくとも約０．１ｍＭのカルシウムを含む緩衝液を用いた透析濾過ステップを実施し、これによってＡＤＡＭＴＳ組成物を調製するステップとを含む。

特定の実施形態において、細胞を培養するステップは、回分細胞培養を含む。他の実施形態において、細胞を培養するステップは、連続細胞培養を含む。

特定の実施形態において、培養培地は、カルシウムを含有する。具体的な実施形態において、培養培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する。他の実施形態において、培養培地は、亜鉛を含有する。具体的な実施形態において、培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛を含有する。また他の実施形態において、培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。具体的な実施形態において、培養培地は、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。特定の実施形態において、透析濾過の緩衝液は、少なくとも約５μＭの亜鉛と、少なくとも約２ｍＭのカルシウムとを含有する。

特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約２０％未満が、ステップ（ｃ）の終わりからステップ（ｅ）の終わりの間に失われる。他の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約１０％未満が、ステップ（ｃ）の終わりからステップ（ｅ）の終わりの間に失われる。また他の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１５００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。

Ａ．緩衝液の交換
通常、培養物の上清から分泌タンパク質を精製する場合、精製プロセスの第１ステップは、培養培地を緩衝溶液と交換することを含み、これは、関心のタンパク質のさらなる精製を促進する。培養培地を緩衝液と交換するためのいくつかの選択肢が存在し、透析濾過、透析、緩衝液交換法、ゲル濾過、クロマトグラフィ等が挙げられるが、これらに限定されない。

ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質組成物は、培養物からの上清の採取と精製ステップとの間の時間の長さに関わらず、新しい緩衝液の導入、例えば、透析濾過、透析、緩衝液の交換、クロマトグラフィ、および同様のステップを必要とするそのような精製ステップ中に、それらの比活性の著しい分画が失われることが分かった。しかしながら、有利に、本発明は、透析濾過、透析、緩衝液の交換、ゲル濾過、およびクロマトグラフィのステップ等の系に導入される緩衝液中に亜鉛およびカルシウムを含むことにより、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物の高比活性が保持されることを発見した。その証拠に、実施例６は、カルシウムおよび亜鉛を欠損する緩衝液を用いたＡＤＡＭＴＳ１３組成物の透析濾過が、組成物の比活性のほぼ２５％の平均損失をもたらし、一方、カルシウムおよび亜鉛を含めることで、この損失をほぼ完全に防止することを示す（表２２）。したがって、本発明は、緩衝系に亜鉛およびカルシウムを含めることにより、透析濾過、または類似する方法、例えば、透析、緩衝液の交換、クロマトグラフィ後のＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物における活性の損失を減少させるための方法を提供する。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を精製するための方法を提供し、本方法は、（ａ）培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、（ｂ）ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を含有する培養培地の上清の一部を回収するステップと、（ｃ）培養培地の上清を亜鉛およびカルシウムを含有する緩衝溶液と交換し、これによって、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を調製するステップとを含む。一実施形態において、培養培地は、亜鉛、カルシウム、および任意にニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。好ましい実施形態において、細胞を培養するステップは、連続培養（例えば、灌流またはケモスタット培養）を含む。別の好ましい実施形態において、培養物は、３４℃〜３７℃の間の温度で維持される。また別の好ましい実施形態において、培養物は、６．９〜７．２の間のｐＨで維持される。

特定の一実施形態において、培養培地の上清を緩衝溶液と交換するステップは、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約０．５μＭの亜鉛とを含有する緩衝液の使用を含む。別の実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約２ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛とを含有する。特定の実施形態において、カルシウムの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０，７５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ以上のカルシウムであり得る。特定の実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ以上の亜鉛であり得る。一般に、上記のいかなる組み合わせの濃度も、本方法の使用に適している。

一実施形態において、カルシウムおよび亜鉛を含有する緩衝液を用いて、緩衝液の交換（例えば、透析濾過、透析、ゲル濾過等）を実施することにより、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の緩衝液を交換するための方法を提供する。特定の一実施形態において、方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約０．５μＭの亜鉛とを含有する緩衝液の使用を含む。別の実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約１ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約１μＭの亜鉛とを含有する。一実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約２ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約２μＭの亜鉛とを含有する。別の実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約２ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛とを含有する。また他の実施形態において、緩衝液は、０．５ｍＭ〜５ｍＭの間のカルシウムと、０．５μＭ〜５μＭの間の亜鉛とを含有する。ある実施形態において、カルシウムの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０，７５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ以上のカルシウムであり得る。ある実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ以上の亜鉛であり得る。ある実施形態において、採取物、細胞を含まない上清、または透析濾過緩衝液は、上述の濃度でカルシウムおよび亜鉛の組合物を含有する。

別の実施形態において、細胞培養物中で発現させた後にＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）の酵素活性を安定させるための方法を提供し、採取物、細胞を含まない上清、または濃縮するため、もしくはＡＤＡＭＴＳ溶液の緩衝液の交換のために使用される透析濾過緩衝液を含有する細胞をカルシウムおよび亜鉛で補充することを含む。ある一実施形態において、方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約０．５μＭの亜鉛とを含有する緩衝液の使用を含む。別の実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約２ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛とを含有する。特定の実施形態において、カルシウムの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０，７５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ以上のカルシウムであり得る。ある実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ以上の亜鉛であり得る。ある実施形態において、採取物、細胞を含まない上清、または透析濾過緩衝液は、上述の濃度でカルシウムおよび亜鉛の組合物を含有する。

他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、いずれの個別のステップ中にも存在する比活性の１５％未満の損失をもたらす。好ましい実施形態において、本明細書に提供される方法は、いずれの個別のステップ中にも存在した後の比活性の１０％未満の損失をもたらす。特定の実施形態において、回収された培養物の上清に存在する比活性の１５％未満が、最初の緩衝液の交換ステップ（例えば、透析濾過または透析）中に失われる。好ましい実施形態において、回収された培養物の上清に存在する比活性の１０％未満が、最初の緩衝液の交換ステップ（例えば、透析濾過または透析）中に失われる。

Ｂ．クロマトグラフィ
特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物は、１つ以上のクロマトグラフィステップによりさらに富化される。一実施形態において、富化されたＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を提供するための方法を提供し、本方法は、（ａ）培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、（ｂ）ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を含有する培養培地の上清の一部を回収するステップと、（ｃ）培養培地の上清を亜鉛およびカルシウムを含有する緩衝溶液と交換し、第１のＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を形成するステップと、（ｄ）ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をクロマトグラフィステップを用いてさらに富化し、これによって富化されたＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を提供するステップとを含む。一実施形態において、培養培地は、亜鉛、カルシウム、および任意にニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。好ましい実施形態において、細胞を培養するステップは、連続培養（例えば、灌流またはケモスタット培養）を含む。別の好ましい実施形態において、培養物は、３４℃〜３７℃の間の温度で維持される。また別の好ましい実施形態において、培養物は、６．９〜７．２の間のｐＨで維持される。

特定の一実施形態において、培養培地の上清を緩衝溶液と交換するステップ、および／またはクロマトグラフィステップは、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約０．５μＭの亜鉛とを含有する緩衝液の使用を含む。好ましい実施形態において、双方のステップは、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約０．５μＭの亜鉛とを含有する緩衝液の使用を含む。別の実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約２ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛とを含有する。実施形態において、カルシウムの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０，７５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ以上のカルシウムであり得る。ある実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ以上の亜鉛であり得る。一般に、上記のいかなる組み合わせの濃度も、本方法の使用に適している。

一実施形態において、クロマトグラフィステップに使用される緩衝液を亜鉛およびカルシウムで補充することにより、クロマトグラフィステップ中のＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物の比活性を維持するための方法を提供する。特定の一実施形態において、方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約０．５μＭの亜鉛とを含有する緩衝液の使用を含む。別の実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約２ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛とを含有する。ある実施形態において、カルシウムの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０，７５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ以上のカルシウムであり得る。ある実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ以上の亜鉛であり得る。一般に、上記のいかなる合わせの濃度も、本方法の使用に適している。

ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を精製するために使用され得るクロマトグラフィ法の例としては、陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣ）、疎水性交換クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ（ＨＡＰ）、免疫親和クロマトグラフィ、分子ふるいクロマトグラフィ（すなわち、ゲル濾過）、または他の適切なクロマトグラフィステップが挙げられるが、これらに限定されない。クロマトグラフィステップは、回分またはカラム様式のいずれかで実施され得る。特定の実施形態において、これらのクロマトグラフィ法のいずれかを実施するために使用される緩衝液は、亜鉛およびカルシウムを含む。特定の一実施形態において、方法は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約０．５μＭの亜鉛とを含有する緩衝液の使用を含む。別の実施形態において、緩衝液は、少なくとも、もしくは約２ｍＭのカルシウムと、少なくとも、もしくは約５μＭの亜鉛とを含有する。ある実施形態において、カルシウムの濃度は、少なくとも約０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭ、０，７５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ以上のカルシウムであり得る。ある実施形態において、亜鉛の濃度は、少なくとも約０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭ以上の亜鉛であり得る。一般に、上記のいかなる組み合わせの濃度も、本方法の使用に適している。

いかなる適切な陰イオン交換樹脂も、本明細書に提供される方法に使用され得る。使用に適した陰イオン交換樹脂の例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）、および四級アンモニウム（Ｑ）樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。

いかなる適切な陽イオン交換樹脂も、本明細書に提供される方法に使用され得る。使用に適した陽イオン交換樹脂の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネート（Ｓ）樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。

いかなる適切なヒドロキシアパタイトまたは他のカルシウム系樹脂も、本明細書に提供される方法に使用され得る。適切な樹脂の例としては、ヒドロキシアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、フルオロヒドロキシアパタイト樹脂等が挙げられるが、これらに限定されない。

いかなる適切な疎水性相互作用クロマトグラフィ樹脂も、本明細書に提供される方法に使用され得る。適切な樹脂の例としては、フェニル樹脂、メチル樹脂、ブチル樹脂、オクチル樹脂等が挙げられるが、これらに限定されない。

ある実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）は、例えば、抗体、アプタマー、またはＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）に高度に特異的な他の適切な結合分子と共役する樹脂を用いて、免疫親和クロマトグラフィによりさらに富化され得る。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ活性の損失を低減する方法は、緩衝液の交換、透析濾過、透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、ナノ濾過、限外濾過、無菌濾過等を含むが、これらに限定されないいかなる個別のステップ中にも、２０％未満の純損失をもたらす。他の実施形態において、本明細書に提供される方法は、いずれかの個別のステップ中に存在する比活性の１５％未満の損失をもたらす。好ましい実施形態において、本明細書に提供される方法は、いずれかの個別のステップ中に存在する比活性の１０％未満の損失をもたらす。特定の実施形態において、回収された培養物の上清に存在する比活性の１５％未満が、最初の緩衝液の交換ステップ（例えば、透析濾過または透析）中に失われる。好ましい実施形態において、回収された培養物の上清に存在する比活性の１０％未満は、最初の緩衝液の交換ステップ（例えば、透析濾過または透析）中に失われる。

Ｃ．ウイルスの不活性化および／または除去
特定の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を調製するために本明細書に提供される方法は、少なくとも１つのウイルスの不活性化または除去ステップをさらに含む。ある実施形態において、本明細書に提供される方法は、少なくとも２つ、または少なくとも３つのウイルスの不活性化または除去ステップを含む。本明細書に提供される方法により利用され得るウイルスの不活性化または除去ステップの例としては、溶媒界面活性剤処理（Ｈｏｒｏｗｉｔｚｅｔａｌ．，ＢｌｏｏｄＣｏａｇｕｌＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ１９９４（５Ｓｕｐｐｌ３）、Ｓ２１−Ｓ２８ａｎｄＫｒｅｉｌｅｔａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ２００３（４３）：１０２３−１０２８、これらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる）、ナノ濾過（Ｈａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．，ＶｏｘＳａｎｇ１９８９（５６）２３０−２３６およびＹｕａｓａｅｔａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．１９９１（７２（ｐｔ８））：２０２１−２０２４、これらの開示は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を調製するための方法を提供し、溶媒界面活性剤処理およびナノ濾過を含む。

一実施形態において、ウイルス的に安全なＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を提供するための方法を提供し、本方法は、（ａ）培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、（ｂ）ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を含有する培養培地の上清の一部を回収するステップと、（ｃ）培養培地の上清を亜鉛およびカルシウムを含有する緩衝溶液と交換し、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を形成するステップと、（ｄ）任意に、クロマトグラフィステップを用いて、ＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）を富化するステップと、（ｅ）少なくとも１つのウイルスの不活性化または除去ステップを実施し、これによって、ウイルス的に安全なＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物を提供するステップとを含む。一実施形態において、培養培地は、亜鉛、カルシウム、および任意にニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する。好ましい実施形態において、細胞を培養するステップは、連続培養（例えば、灌流またはケモスタット培養）を含む。別の好ましい実施形態において、培養物は、３４℃〜３７℃の間の温度で維持される。また別の好ましい実施形態において、培養物は、６．９〜７．２の間のｐＨで維持される。一実施形態において、ウイルス除去ステップは、ナノ濾過である。

１．溶媒および界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理
ＡＤＡＭＴＳ培養物中に存在し得る種々のウイルス汚染物質を不活性化するために、１つ以上のＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）中間溶体は、溶媒界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理を受けることができる。溶液を界面活性剤処理するための方法は、当該分野において周知である（概説については、ＰｅｌｌｅｔｉｅｒＪＰｅｔａｌ．，Ｂｅｓｔ
ＰｒａｃｔＲｅｓＣｌｉｎＨａｅｍａｔｏｌ．２００６；１９（１）：２０５−４２を参照し、その開示は、全ての目的において、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。一般に、いかなる標準的なＳ／Ｄ処理も、本明細書に提供される方法と併用して使用され得る。例えば、Ｓ／Ｄ処理のための例示的なプロトコルは、以下に提供される。

一実施形態において、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびトリ（ｎ−ブチル）リン酸（ＴＮＢＰ）が、それぞれ、１．０％、０．３％、および０．３％もしくは約それらの最終濃度で、ＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）中間溶液に追加される。次いで、混合物は、少なくとも約１時間、１８℃〜２５℃もしくは約その間の温度で攪拌される。

２．ナノ濾過および限外／透析濾過
本明細書に提供されるＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物のウイルス量を低減するために、組成物は、適切なナノ濾過デバイスを使用してナノ濾過され得る。ある実施形態において、ナノ濾過デバイスは、１５ｎｍ〜２００ｎｍもしくは約その間の平均孔径を有する。この使用に適切なナノフィルタの例としては、ＤＶＤ、ＤＶ５０、ＤＶ２０（Ｐａｌｌ）、ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＮＦＰ（登録商標）、ＶｉｒｅｓｏｌｖｅＮＦＲ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）１５Ｎ、２０Ｎ、３５Ｎ、および７５Ｎ（Ｐｌａｎｏｖａ）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態において、ナノフィルタは、１５〜７２ｎｍもしくは約その間、または１９〜３５ｎｍもしくはその間、または１５ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、３５ｎｍ、もしくは７２ｎｍ、または約それらの平均孔径を有し得る。好ましい実施形態において、ナノフィルタは、ＡｓａｈｉＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）２０ＮもしくはＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）３５Ｎフィルタ、またはそれらの等価物等の、１９ｎｍ、２０ｎｍ、もしくは３５ｎｍ、または約それらの平均孔径を有する。

ナノ濾過後、濾液は、任意に、限外濾過により濃縮され、かつ／または緩衝組成物は、透析濾過により調節され得る。ある実施形態において、限外濾過は、開口チャネルスクリーンを有するカセット中で行われ、限外濾過膜は、１７５ｋＤａ未満もしくは約１７５ｋＤａ、または１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０未満もしくは約それら以下のｋＤａの公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）を有する。好ましい実施形態において、限外濾過膜は、わずか３０ｋＤａのＮＭＷＣＯを有する。別の好ましい実施形態において、限外濾過膜は、わずか３０ｋＤａのＮＭＷＣＯを有する。

３．凍結乾燥および加熱処理
また他の実施形態において、ナノ濾過等の他のウイルスの不活性化または除去ステップに前に曝された、凍結乾燥されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）組成物のウイルス活性は、凍結乾燥された組成物の加熱処理によりさらに低減され得る。血液因子中のウイルス量を不活性化するための加熱処理は、当該分野において周知である（例えば、Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ．，ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ．１９８７Ｊｕｌ１５；４７（２）：２３５−４１、Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＳｔｕｄＨｅｍａｔｏｌＢｌｏｏｄＴｒａｎｓｆｕｓ．１９８９；（５６）：４４−５４、ＥｐｓｔｅｉｎａｎｄＦｒｉｃｋｅ，ＡｒｃｈＰａｔｈｏｌＬａｂＭｅｄ．１９９０Ｍａｒ；１１４（３）：３３５−４０を参照）。

ＶＩ．ＡＤＡＭＴＳ組成物
有利に、亜鉛、カルシウム、および／またはニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された細胞培養物中で発現させたＡＤＡＭＴＳ１３等のＡＤＡＭＴＳタンパク質は、予想外に、高比活性を有することが分かった。本明細書に提供されるように、本方法は、高比活性を有するそのようなＡＤＡＭＴＳタンパク質の連続発現および回収のために開発された。例えば、本明細書に提供される連続細胞培養法は、１週間を超える間、１０００Ｕ／ｍｇ超の比活性を有する、１日につき１リットル当り１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３超の発現を可能にする。同様に、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の精製中に通常遭遇する、活性の損失を低減させるための方法も、本明細書において提供される。

したがって、一態様において、本発明は、本明細書に提供される方法により細胞培養物中で発現させたＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を提供する。例えば、タンパク質がカルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）から選択される少なくとも１つの成分で補充される培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより発現する、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物を提供する。本明細書に提供される方法により精製されるＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）も提供する。例えば、交換緩衝液が亜鉛およびカルシウムを含む、緩衝液の交換ステップを含む方法により精製されたＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物を提供する。本発明の好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物は、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物である。

一態様において、本発明は、本明細書に提供されるいずれかの方法により細胞培養物中でＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させる方法を含む方法により調製されるＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を提供する。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

関連する態様において、本発明は、培養培地からＡＤＡＭＴＳタンパク質を精製する間、少なくとも１つの緩衝液に亜鉛およびカルシウムの双方を含むことを含む方法により調製されるＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を提供する。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

本発明は、本明細書に提供される方法により調製されるＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）を提供する。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）から選択される少なくとも１つの成分で補充された培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。具体的な実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）から選択される少なくとも２つの成分で補充された培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。また別の実施形態において、培養培地は、カルシウム、亜鉛、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充される。一部の実施形態において、培養培地は、動物性タンパク質を含まない、オリゴペプチドを含まない、または既知組成培養培地であり得る。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）は、少なくとも、または約２μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。別の実施形態において、組成物は、少なくとも、または約５μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。一実施形態において、組成物は、２μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。別の実施形態において、組成物は、５μＭ〜１２μＭ、または約その間の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。また他の実施形態において、組成物は、少なくとも、もしくは約２μＭ、または少なくとも、もしくは約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上の亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。別の実施形態において、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、本方法は、浮遊様式で操作される、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養条件下で実施される。他の具体的な実施形態において、方法は、付着様式で操作される、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養条件下で実施される。別の実施形態において、本方法は、回分培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、本方法は、浮遊様式で操作される、単一回分、反復回分、または流加培養条件下で実施される。他の具体的な実施形態において、方法は、付着様式で操作される、単一回分、反復回分、または流加培養条件下で実施される。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）の一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に使用される培養培地は、少なくとも約２μＭ〜少なくとも約１２μＭの最終濃度で、亜鉛で補充され得る。特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも約２μＭ、または少なくとも約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ以上のレベルの亜鉛の最終濃度で、亜鉛で補充され得る。一般に、あらゆる亜鉛塩が本発明の培地を補充するために使用することができ、許容される塩の例としては、ＺＮＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＺＮＳＯ_３・２Ｈ_２Ｏ、（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７）_２ＺＮ_３・２Ｈ_２Ｏ、ＺＮＢＲ_２、ＺＮＢＲ_２・２Ｈ_２Ｏ、ＺＮＣＬ_２、ＺＮ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ、ＺＮ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２・Ｈ_２Ｏ、（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２ＺＮ・２Ｈ_２Ｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、薬学的に許容される亜鉛の塩が、本発明の培養培地を補充するために使用される。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）は、少なくとも、または約０．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、少なくとも、または約１．５ｍＭのカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭ、または約その間のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。また他の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、少なくとも、もしくは約０．５ｍＭ、または少なくとも、もしくは約０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ以上のカルシウムを含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。別の実施形態において、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、方法は、浮遊様式で操作される、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養条件下で実施される。他の具体的な実施形態において、本方法は、付着様式で操作される、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養条件下で実施される。別の実施形態において、本方法は、回分培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、本方法は、浮遊様式で操作される、単一回分、反復回分、または流加培養条件下で実施される。他の具体的な実施形態において、本方法は、付着様式で操作される、単一回分、反復回分、または流加培養条件下で実施される。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一般に、あらゆるカルシウム塩が本発明の培地を補充するために使用され得る。許容される塩の例としては、ＣａＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＣａＦＰＯ_３・２Ｈ_２Ｏ、ＣａＩ_２、ＣａＢｒ_２、（Ｃ_２Ｈ_３Ｏ_２）_２Ｃａ、（ＣＨＯ_２）_２Ｃａ、（Ｃ_６Ｈ_７Ｏ_６）_２Ｃａ、（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７）_２Ｃａ_３・２Ｈ_２Ｏ等が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、薬学的に許容されるカルシウムの塩は、本発明の培養培地を補充するために使用される。

別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物）は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、少なくとも、または約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、または約その間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。また他の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、少なくとも、または約２ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、４ｍｇ／Ｌ、５ｍｇ／Ｌ、６ｍｇ／Ｌ、７ｍｇ／Ｌ、８ｍｇ／Ｌ、９ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ以上の濃度のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養することにより調製される。一実施形態において、培養物は、３５℃〜３７℃、または約その間で維持される。具体的な実施形態において、培養物は、３６℃、または約３６℃で維持される。別の実施形態において、培養物のｐＨは、６．９〜７．３、または約その間で維持される。一実施形態において、培養物の温度および／またはｐＨは、少なくとも７日間維持される。一実施形態において、本方法は、連続培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、本方法は、浮遊様式で操作される、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養条件下で実施される。他の具体的な実施形態において、本方法は、付着様式で操作される、ケモスタット、タービドスタット、または灌流培養条件下で実施される。別の実施形態において、本方法は、回分培養条件下で実施される。具体的な実施形態において、本方法は、浮遊様式で操作される、単一回分、反復回分、または流加培養条件下で実施される。他の具体的な実施形態において、本方法は、付着様式で操作される、単一回分、反復回分、または流加培養条件下で実施される。一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞は、哺乳類細胞である。特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ハムスター、ヒト、またはマウス細胞である。具体的な実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞系、ＨＥＫ２９３細胞系、またはＢＨＫ細胞系である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、動物性タンパク質および／またはポリペプチドを含まない培養培地中で培養される。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、合成培養培地中で培養され、これは、動物性タンパク質およびポリペプチドを含む場合も、含まない場合もある。一実施形態において、培養培地は、０．５ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。別の実施形態において、培養培地は、２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、または約その間のポリアミンをさらに含む。具体的な実施形態において、ポリアミンはプトレシンである。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、亜鉛およびカルシウムの双方で補充された培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸をもつ細胞を培養することにより調製される。実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛およびカルシウムの濃度は、変形形態９４〜変形形態１１３（表７）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一実施形態において、培養は、灌流培養である。別の実施形態において、培養は、ケモスタット培養である。他の実施形態において、培養は、流加または反復回分培養である。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の双方で補充された培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。ある実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１１４〜変形形態１３３（表８）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一実施形態において、培養は、灌流培養である。別の実施形態において、培養は、ケモスタット培養である。他の実施形態において、培養は、流加または反復回分培養である。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の双方で補充された培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。ある実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、カルシウムおよびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１３４〜変形形態１４９（表９）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一実施形態において、培養は、灌流培養である。別の実施形態において、培養は、ケモスタット培養である。他の実施形態において、培養は、流加または反復回分培養である。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

一実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ組成物は、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充された培養培地中でＡＤＡＭＴＳタンパク質（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３）をコードする核酸を持つ細胞を培養することにより調製される。ある実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、本明細書に記載されるもののうちのいずれかであり得る。ある実施形態において、亜鉛、カルシウム、およびニコチンアミド（ビタミンＢ３）の濃度は、変形形態１４〜変形形態９３（表３〜表６）のうちの１つである。ある実施形態において、培養物は、少なくとも７日間、または少なくとも１４日間、２１日間、２８日間、または少なくとも５週間、６週間、７週間、または少なくとも２ヶ月間、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８ヶ月間以上維持される。一実施形態において、培養は、灌流培養である。別の実施形態において、培養は、ケモスタット培養である。他の実施形態において、培養は、流加または反復回分培養である。好ましい実施形態において、ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ１３である。

別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、高比活性、例えば、少なくとも６００Ｕ／ｍｇのＡ１３タンパク質の比活性で提供される。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも７００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも８００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも９００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１１００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１２００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１３００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１４００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１５００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１６００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１７００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１８００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも１９００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも２０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも２１００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも２２００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも２３００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも２４００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。別の実施形態において、ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも２５００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。

ＶＩＩ．実施例
実施例１
既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中にヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＨＥＫ２９３細胞系１０２０／１０１３−２の生物反応器培養物を使用して、流加実験を実施した。培養培地をさらなる亜鉛で補充することの効果を調べた。

空気飽和２０％の溶解酸素濃度で、３７℃でインライン制御された７．２０のｐＨ下、ブレード羽根を備えた１．５Ｌの生物反応器中で、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＨＥＫ２９３細胞を流加細胞培養により培養した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２系の既知組成培養培地（ＢＡＣＤ−Ａ１３；表１２）を含有する２つの同一の生物反応器に細胞浮遊液を移動した。２つの培養物をＤＭＥＭ／Ｆ１２のように、０．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを用いるか、または１．４３２ｍｇ／Ｌの最終濃度のために１ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏでさらに補充するかのいずれかにより調製されたＢＡＣＤ−Ａ１３培地中で増殖させた。２つの流加培養物は、それ以外は同様に処理され、よって相互に直接比較され得る。

上清を遠心分離または濾過して残留細胞を除去した後、培養物の上清におけるＡ１３の活性をＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより測定した。Ａ１３の総量は、Ａ１３特異的抗体（表１０）を使用して、ＥＬＩＳＡにより測定した。標準的なＤＭＥＭ／Ｆ１２亜鉛濃度を有するＢＡＣＤ−Ａ１３培地を利用した培養物からの上清は、３日目および６日目にそれぞれ、７２８および８２６ｍＵ／ｍＬのＡ１３活性を有した。培養物の比活性は、それぞれ、４８２ｍＵ／μｇおよび５２６ｍＵ／μｇＡ１３であった。対照的に、亜鉛でさらに補充された培養物からの上清は、Ａ１３発現の収率はわずかに改善されたのみであったが（３日目および６日目に、それぞれ、７％および１９％超）、Ａ１３活性の全活性および比活性が大幅に改善されたことを示した（表１１）。表１０および表１１の結果を比較することによって見られるように、全Ａ１３ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性は、０．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏで増殖させた培養物と比較して、１．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏの存在下で増殖させた培養物において、３日目で１１８％高く（１５８９対７２８）、６日目で６１％高かった（１３８１対７２８）。同様に、補充された培養物中のＡ１３タンパク質の比活性は、３日目で１０４％高く（９８１対４８２ｍＵ／μｇ）、６日目で４２％高かった（７３９対５２６ｍＵ／μｇ）。

生物反応器から試料を取り、ＥＬＩＳＡによりＡ１３について分析し、Ａ１３活性をＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイにより測定した。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ技術により細胞数を決定した。希釈速度を測定し、増殖率および容量生産能の計算に使用した。

実施例２
既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中にヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞系＃９３８の生物反応器培養物を使用して、流加実験を実施した。培養培地をさらなる亜鉛および／またはビタミンＢ３で補充することの効果を調べた。

ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞を既知組成ＢＣＳ培地（ＢＣＳ培地）に適応させた。ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＷｏｒｋｉｎｇＣｅｌｌＢａｎｋ＃０１（ＤＷＣＢ＃０１）からのクローン＃９３８を解凍し、細胞接種材料をＢＣＳ培地中で調製した。ブレード羽根を備えた２つの１．５Ｌの生物反応器中に細胞を移し、空気飽和２０％の溶解酸素濃度で、３７℃でインライン制御された７．２０のｐＨの商標ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中で、流加細胞培養下で増殖させた。２つの培養物をＤＭＥＭ／Ｆ１２のように、０．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを用いるか、または１．４３２ｍｇ／Ｌの最終濃度のために１ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏでさらに補充するかのいずれかにより調製されたＢＡＣＤ−Ａ１３培地中で増殖させた。２つの流加培養物は、それ以外は同様に処理され、よって相互に直接比較され得る。上清を４日目および７日目に採取し、Ａ１３タンパク質および活性レベルについてアッセイした。７日目に採取した後、双方の培養物を７．０２ｍｇ／Ｌの最終濃度のために、さらなる５ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）で補充し、さらに４日間、同じ条件下で増殖させた。上清を１１日目に採取し、Ａ１３タンパク質および活性レベルをアッセイした。

亜鉛を補充せずに増殖させた最初の培養物において、採取した上清のＡ１３活性レベルは、４日目および７日目にそれぞれ、６４２および４８８ｍＵ／ｍＬであった（表１３）。これらの上清の比活性は、４日目および７日目にそれぞれ、３７１および２７３ｍＵ／μｇであった。前の実施例１に見られるように、さらなる亜鉛で補充された培養物の上清におけるＡ１３の全活性および比活性は、大幅に増加した（採取４日目および７日目の表１３および表１４を比較）。前と同様、双方の培養物で産生された総Ａ１３は、類似するが、さらなる亜鉛で補充された第２の培養物の上清からのＡ１３は、４日目および７日目にそれぞれ、４０％および１０４％を超える全活性、ならびに４日目よび７日目に７８％および７５％を超える比活性を有した（表１４対表１３）。全Ａ１３収率および細胞増殖率を含む他のパラメータは、さらなる亜鉛の補充により影響を受けないように見えた。

７日目に上清を採取した後、双方の培養物をさらなる５ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）でさらに補充し、さらに４日間、同じ条件下で増殖させた。前と同様に、上清を１１日目に採取した。ビタミンＢ３の補充は、双方の培養物の上清中で認められたＡ１３の全ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性および比活性の増加をもたらした（表１３および表１４、１１日目）。特に、これらの値は、双方の培養物においておよそ２倍であった。１１日目に、さらなる亜鉛およびビタミンＢ３で補充された培養物２からの上清は、培養物１から採取された上清よりほぼ２００％大きい（２３６６対７９１ｍＵ／ｍＬ）全活性、および１７４％大きい（１１８９対４３２ｍＵ／μｇ）比活性を示した。

ニコチンアミド単独での培地の補充は、Ａ１３の全活性（７９１ｍＵ／ｍＬ対４８８ｍＵ／ｍＬ、表１３の７日目と１１日目とを比較）および比活性（４３２ｍＵ／μｇ対２７３ｍＵ／μｇ、表１３の７日目と１１日目とを比較）において約６０％の増加をもたらした。同様に、亜鉛単独での培地の補充は、Ａ１３の全活性および比活性において約７０％〜８０％の間の増加をもたらした（表１３および表１４の４日目および７日目を比較）。意外にも、ニコチンアミドおよび亜鉛の双方での培地の補充は、Ａ１３の約３００％〜４００％の間の全活性（表１４の１１日目と表１３の４日目および７日目とを比較）、および約２００％〜３００％の間の比活性（表１４の１１日目と表１３の４日目および７日目とを比較）の相乗的増加をもたらし、亜鉛とニコチンアミドとの効果の間に予想外の相乗的相互作用を示した。

実施例３
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞系＃６４０−２のケモスタット細胞培養物を、さらなる亜鉛およびビタミンＢ１３で補充した既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中で増殖させた。１０Ｌの培養物を５３日間維持し、Ａ１３タンパク質および活性の産生を経時的に監視した。

ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞を既知組成商標培地（ＢＣＳ培地）に適応させた。細胞バンクウイルスを解凍し、細胞接種材料をＢＣＳ培地中で調製した。Ａ１３発現クローン＃６４０−２から繁殖させた細胞を、Ｒｕｓｈｔｏｎ型羽根を備えた１０Ｌの生物反応器に移し、空気飽和２０％の溶解酸素濃度で、３７℃でインライン制御された７．１５〜７．２０のｐＨ下、商標ＢＡＣＤ−Ａ１３培地を用いて反復回分培養物中で培養した。２つの回分培養物を１０Ｌの最終作業量に増殖させた後、５日目に生物反応器を連続培地供給に切り替え、ケモスタット様式でさらに４８時間操作した。

生物反応器からの上清の試料を毎週採取し、ＥＬＩＳＡによりＡ１３タンパク質の産生、およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイによりＡ１３活性について分析した。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ技術により細胞数を決定した。希釈速度を測定し、増殖率および容量生産能の計算に使用した。

１．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏの最終濃度および７．０２ｍｇ／Ｌのニコチンアミドで、亜鉛およびニコチンアミドで補充した既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地を使用した連続培養条件下において、０．９〜１．３ｍｇ／Ｌ／Ｄの間の高レベルのＡ１３タンパク質産生、および約８００〜１１００ｍＵ／μｇＡ１３の間の比活性が達成された（表１５）。これらの結果は、実施例２にあるように、ＣＨＯクローン＃９３８で達成された、タンパク質産生および比活性と一致した。特に、容量および細胞比産生能は、長期培養において経時的に増加し、経時的な増殖率および希釈速度の増加による可能性が高い。発現したＡ１３の高比活性は、培養物がケモスタット条件下で増殖された少なくともまる７週間にわたり、一定して高レベルで少なくとも維持され得る。事実、培養物中で産生されたＡ１３の比活性は、実際に２週目の約８００ｍＵ／μｇから７週目の約１１００ｍＵ／μｇＡ１３に増加した。

実施例４
既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中にヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞系＃６４０−２の生物反応器培養物を使用して、流加およびケモスタット細胞培養実験を実施した。異なるレベルの亜鉛で培養培地を補充することの効果を調べた。

流加様式で、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞を既知組成商標培地であるＢＣＳ培地に適応させた。つまり、ＤＷＣＢ＃０５を解凍し、細胞接種材料をＢＣＳ培地中で調製した。ブレード羽根を備えた１．５Ｌの生物反応器に細胞を移し、空気飽和２０％の溶解酸素濃度で、３７℃でインライン制御された７．２０のｐＨ下、７ｍｇ／Ｌの最終濃度のニコチンアミドで補充したが、亜鉛補充をしない商標ＢＡＣＤ−Ａ１３培地に入れた。次いで、異なるＺｎ補充（０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、および１．０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ〜０．４３２ｍｇ／Ｌ、０．９３２ｍｇ／Ｌ、および１．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏの最終濃度）を含む、７ｍｇ／Ｌの最終濃度のニコチンアミドで補充したＢＡＣＤ−Ａ１３培地を含有する３つの同じ生物反応器に回分細胞浮遊液を分けた。

ＢＡＣＤ−Ａ１３培地は、さらなる亜鉛で補充した、または補充しない０．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏを含んだ。培養物および培地は、それ以外は同じであり、よって、相互に直接比較することができる。培養物を約１週間、流加様式で増殖させ、Ａ１３タンパク質産生およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性について、上清をアッセイした。次いで、３つ全ての生物反応器をケモスタット様式に切り替え、上述のように、異なる亜鉛補充の培地を使用して、連続培養条件下で約２週間操作した。

流加培養条件下において、実施例１および２に見られる結果と一致し、０．５ｍｇ／Ｌまたは１．０ｍｇ／ＬのいずれかのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏでの培地の補充は、さらなる亜鉛（４３７ｍＵ／μｇ）で補充されなかった培地と比較して、上清におけるＡ１３タンパク質の比活性を大幅に増加した（それぞれ、７８５ｍＵ／μｇおよび８７６ｍＵ／μｇ）（表１６）。前と同じように、全Ａ１３タンパク質産生および比細胞増殖を含む他のパラメータは、さらなる亜鉛による補充により影響を受けなかった。

生物反応器をケモスタット様式に切り替えた後、上述の異なる亜鉛補充の培地を使用して、培養物を約１週間（２週目）、連続培養条件下で増殖させた。生物反応器からの上清の試料を毎週採取し、ＥＬＩＳＡによりＡ１３タンパク質産生、およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイによりＡ１３活性について分析した。流加様式下で増殖させた培養物に見られる結果と同様に、連続培養増殖に使用した増殖培地のさらなる亜鉛での補充は、補充なし（５５３ｍＵ／μｇ）と比較して、１週間後、Ａ１３比活性の実質的な改善をもたらした（０．５ｍｇ／Ｌおよび１．０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ補充において、それぞれ６９７ｍＵ／μｇおよび７２９ｍＵ／μｇ）（表１７、表１８、および表１９）。

以前に、連続細胞培養で発現させたＡ１３の比活性は、長期間にわたって実際に改善されたことが分かっていた（実施例３を参照）。この結果が繰り返され得るかどうかを調べるために、さらなる亜鉛で補充した培地中で増殖させた培養をさらに１週間続けた。表１８および表１９に見られるように、双方の培養物の上清におけるＡ１３の比活性は、経時的に再び増加した。０．５ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏで補充した培地の上清に認められたＡ１３の比活性は、２週目の６９７ｍＵ／ｍｇから３週目の７５９ｍＵ／ｍｇに増加した（表１８）。同様に、１．０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏで補充した培地の上清に認められたＡ１３の比活性は、２週目の７２９ｍＵ／ｍｇから３週目の８１２ｍＵ／ｍｇに増加した（表１９）。前と同様、比細胞増殖は、さらなる亜鉛で補充することにより影響を受けなかった。しかしながら、特に、Ａ１３タンパク質産生は、亜鉛で補充されなかった培養物中での産生と比較して、さらなる亜鉛で補充された双方の培養物において増加したようであった。

実施例５
既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中にヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞系＃Ｆ６の生物反応器培養物を使用して、流加およびケモスタット細胞培養実験を実施した。より高レベルの亜鉛で培養培地を補充することの効果を調べた。

流加様式で、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞を既知組成商標培地であるＢＣＳ培地に適応させた。適応させた集団をサブクローン化し、クローン＃Ｆ６をそれから誘導した。

つまり、ＤＷＣＢ＃１９を解凍し、細胞接種材料をＢＣＳ培地中で調製した。ブレード羽根を備えた３つの１．５Ｌの生物反応器に細胞を移し、１．４３２ｍｇ／Ｌ、２．４３２ｍｇ／Ｌ、および３．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏの最終濃度のために、それぞれ、１．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、および３．０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏで補充した商標ＢＡＣＤ−Ａ１３培地に入れた。空気飽和２０％の溶解酸素濃度で、３６℃でインライン制御した７．１５のｐＨ下、培養物を増殖させた。

培養物を約１週間、反復回分様式（３回分）で増殖させ、Ａ１３タンパク質産生およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性について、上清をアッセイした。次いで、３つ全ての生物反応器をケモスタット様式に切り替え、上述のように、異なる亜鉛補充の培地を使用して、連続培養条件下で約１０日間操作した。

流加培養条件下において、増加した亜鉛量での培養培地の補充は、培養物の上清中に分泌されたＡ１３の比活性をさらに増加させた。上に報告された前の結果と一致し、さらなる１．０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏでの培地の補充は、８０６ｍＵ／μｇの高比活性をもたらした。亜鉛濃度のさらなる増加、すなわち、２．０ｍｇ／Ｌおよび３．０ｍｇ／Ｌでの補充は、さらに高レベルのＡ１３比活性をもたらした（それぞれ、８８０ｍＵ／μｇおよび８８９ｍＵ／μｇ）（表２０）。前と同じように、全Ａ１３タンパク質産生および比細胞増殖を含む他のパラメータは、さらなる亜鉛による補充により影響を受けなかった。

生物反応器をケモスタット様式に切り替えた後、上述の異なる亜鉛補充の培地を使用して、培養物を１０日間、連続培養条件下で増殖させた。生物反応器からの上清の試料をＥＬＩＳＡによりＡ１３タンパク質産生、およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイによりＡ１３活性について分析した。流加様式下で増殖させた培養物に見られた結果と異なり、連続培養増殖に使用された増殖培地の高レベルの亜鉛での補充は、比増殖率および全体的な細胞生存率の減少をもたらした。さらなる１．０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏで補充した培地におけるケモスタット培養増殖は、上述の前の結果と一致する、高い細胞生存率（８８．６％）および比増殖率（１日につき０．２５６）を示し続けた（表２１）。

逆に、より高レベルのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏである２．０ｍｇ／Ｌ、および３．０ｍｇ／Ｌで補充された培地中で増殖させた培養物は、細胞生存率（それそれ、７２．１％および８０．４％）および比増殖率（それぞれ、１日につき０．０９１および０．１３４）の大幅な減少を示した。しかしながら、特記すべきは、２つの培養物の上清におけるＡ１３の比活性は、高いままであったことである（それぞれ、８６３ｍＵ／μｇおよび７７１ｍＵ／μｇ）（表２１）。

実施例６
５０Ｌの生物反応器で、さらなる亜鉛およびニコチンアミドで補充した既知組成ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中の組み換えＣＨＯ細胞系＃６４０−２において、ヒトＡ１３タンパク質を発現させた。培養物の上清を採取した後、亜鉛およびカルシウムを含む、および含まない緩衝液を使用して、限外／透析濾過（５０ｋＤ）ステップの比較を実施した。

ヒトＡＤＡＭＴＳ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞を既知組成商標培地であるＢＣＳ培地に適応させた。簡潔に述べると、ＤＷＣＢを解凍し、細胞接種材料をＢＣＳ培地中で調製した。１０Ｌの生物反応器を介して、Ｒｕｓｈｔｏｎ型羽根を備えた５０Ｌの生物反応器に細胞を移し、空気飽和２０％の溶解酸素濃度で、３７℃でインライン制御された７．１５〜７．２０のｐＨ下、商標ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中で、ケモスタット様式で培養した。

生物反応器からの上清を濾過し、細胞を含まない採取物を５０ｋＤのＰＥＳ膜（濃縮係数は約１：１０）を使用して限外濾過し、次いで、ｐＨ７．７の５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＴＲＩＳを含有する５容量の緩衝液で透析濾過した。２ｍＭのＣａおよび５μＭのＺｎを含む、または含まない透析濾過緩衝液を比較し、透析濾過とクロマトグラフィ精製との間の活性損失に対する作用を決定した。

ＥＬＩＳＡにより検出される１μｇＡ１３当りｍＵＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３として記録された比活性は、透析濾過の直後、およびさらなる精製のために試料を装填する直前に決定された。試料は、３日の最長時間の間（約８０時間未満）、約２〜８℃の間で保管された。試料を長期間保管した時、これらは、透析濾過の終わりとクロマトグラフィの始めとの間、−１５℃未満に保たれた。試料は、透析濾過の直後とクロマトグラフィカラムの装填直前に測定、および比較された。

限外／透析濾過ステップとさらなる精製ステップとの間の比較的短い保持時間にもかかわらず、Ａ１３比活性の大幅な損失（２３．３％）が、透析濾過緩衝液が亜鉛およびカルシウムを含まない場合に生じた。逆に、透析濾過緩衝液が２ｍＭのＣａおよび５μＭのＺｎを含有した時、Ａ１３比活性の損失（７．３％）は、大幅に減少した（表２２）。

実施例７
ケモスタットおよび灌流連続細胞培養法を、いくつかの組み換えＣＨＯ細胞系で発現するＡ１３の相対的産生および比活性を決定するために比較した。

簡潔に述べると、組み換えヒトＡ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞の異なるクローンが、既知組成商標培地（ＢＣＳ）に適応され、これは、接種材料の調製に使用された。細胞は、１．４３２ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏおよび７．０２ｍｇ／Ｌのニコチンアミドの最終濃度で亜鉛およびニコチンアミドで補充された商標ＢＡＣＤ−Ａ１３培地中で、生物反応器でさらに培養された。次いで、各細胞クローンからの接種材料は、２つの生物反応器に移され、表２３に示すように、そのうちの１つは、ケモスタット条件（ＣＳＴ）下で培養され、他方は、灌流下で培養された。Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商標）ＩＩマイクロキャリア（ＧＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、約２×１０^６〜４×１０^６細胞／ｍＬの間の密度で、細胞を培養した。

細胞を３〜４週間、連続培養条件下で増殖させ、ＥＬＩＳＡによりＡ１３タンパク質の産生、およびＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイによりＡ１３の活性について、生物反応器からの上清の試料を定期的に分析した。表２３に示す値は、３〜４週の期間の平均を表す。上の実施例１〜６で得られた結果と一致し、ケモスタット下で増殖させた培養物は、約７００ｍＵ／μｇ〜約１０００ｍＵ／μｇの高比活性を有する、約１ｍｇ／Ｌ／ｄ〜約２ｍｇ／Ｌ／ｄのＡ１３タンパク質を産生した（表２３）。際立って、灌流培養条件下で増殖させた培養物は、一貫して、ケモスタット条件下で増殖させた同一のクローンより、培養物の上清において高いＡ１３のタンパク質産生および活性レベルを示した。灌流培養において産生されたＡ１３の比活性は、非常に高く、４つのクローンのうちの３つは、少なくとも約１０００ｍＵ／μｇを示した。

実施例８
既知組成の動物性タンパク質を含まない培養培地を使用して、真核細胞培養物中で増殖させた組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の産生に対する温度およびｐＨの作用を決定するために、７．０５〜７．３０の間のｐＨで、３５．０℃〜３８．０℃の間の温度で、培養物を増殖させた。

簡潔に述べると、ブレード羽根を備えた１．５Ｌの生物反応器にヒトＡ１３を発現する組み換えＣＨＯ細胞を移し、商標ＢＡＣＤ−Ａ１３培地に入れた。空気飽和２０％の溶解酸素濃度で、３５．０℃〜３８．０℃の範囲の温度でインライン制御された７．０５〜７．３０の間のｐＨ下で、細胞を増殖させた。応答曲面アプローチを使用して実験を設計し、実施した。統計分析は、統計ソフトウェアパッケージＭｉｎｉｔａｂ（登録商標）１５．１．０．０を使用して行われた。

図１および２に見ることができるように、温度およびｐＨの双方は、容量Ａ１３生産能（ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３により測定、図１）、および比活性（ＥＬＩＳＡによりＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３活性／抗原、図２）に対してかなりの効果を有した。具体的に、最大容量ＦＲＥＴＳ産生能は、約７．０５〜７．２の間の範囲、特に、約７．１０の低ｐＨ、および約３５．０℃〜３７．０℃の間の温度、特に、約３６℃で増殖させた培養物において達成された。具体的に、最大比活性（ＥＬＩＳＡによる抗原に対するＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３）は、約７．０５〜７．２の間の範囲、特に７．１０以下の低ｐＨ、および約３５．０℃〜３７．０℃の間、特に３６℃以下の温度で増殖させた培養物において達成された。Ａ１３産生の具体的な最適条件は、最適収率および産生量に関して、約３６℃の温度、かつ約７．１０のｐＨの組合せで達成された。

本明細書に記載される実施例および実施形態は、単に例示目的であり、それらを考慮する種々の修正または変更は、当業者に提案され、本出願の趣旨および範囲ならびに付属の請求項の範囲内に含まれることを理解する。本明細書に引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的において、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims

トロンボスポンジンモチーフ１３を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ１３）タンパク質を発現させるための方法であって、該方法は、連続培養により、少なくとも３μＭの亜鉛を含む培養培地中でＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質をコードする核酸を持つ哺乳類細胞を培養するステップを含み、該連続培養は、１×１０ ^６細胞／ｍＬ〜４×１０ ^６細胞／ｍＬの細胞密度で少なくとも７日間維持することを含む、方法。
前記培養培地が３μＭ〜１２μＭの亜鉛を含有する、請求項１に記載の方法。
前記培養培地が少なくとも５μＭの亜鉛を含有する、請求項１に記載の方法。
前記培養培地が５μＭ〜１２μＭの亜鉛を含有する、請求項１に記載の方法。
前記培養培地が少なくとも４ｍｇ／Ｌのニコチンアミドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記培養培地が少なくとも７ｍｇ／Ｌのニコチンアミドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記培養培地が２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌのニコチンアミドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＨＥＫ細胞から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記連続培養がケモスタット様式で実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記連続培養が灌流様式で実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記培養が少なくとも１ヶ月間維持される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記培養が３５℃〜３７℃の温度で維持される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
前記培養が６．９〜７．３のｐＨで維持される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
前記培養が７．０５〜７．１５のｐＨで維持される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質がヒトＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記発現されたＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質が、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも８００Ｕの比活性を有する、請求項１６に記載の方法。
前記培養が、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも８００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、請求項１７に記載の方法。