KR102418824B1 - 포유동물의 고성능 유가식 배양을 위한 신규 배지 - Google Patents

포유동물의 고성능 유가식 배양을 위한 신규 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 무-혈청 및 무-단백질 배양 배지에 관한 것이다. 이러한 배지는 고성능 배양 배지고, 포유동물의 유가식 배양을 현저하게 개선시킨다. 본 발명은 또한 상기 배지를 제조 및/또는 고안하는 방법, 및 그들의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

포유동물의 고성능 유가식 배양을 위한 신규 배지{NEW MEDIUM FOR HIGH PERFORMANCE MAMMALIAN FED-BATCH CULTURES}
본 발명은 신규한 무-혈청 및 무-단백질 배양 배지에 관한 것이다. 이러한 배지는 고성능 배양 배지이고, 포유동물의 유가식 배양을 현저하게 향상시킨다. 본 발명은 또한 상기 배양 배지를 제조 및/또는 고안하는 방법, 및 그들의 사용 방법에 관한 것이다. 이러한 배양 배지 및 방법은 예를 들어, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 임의의 포유동물 세포의 배양에 적용될 수 있고, 모든 종류의 생물반응기에서 사용될 수 있다.
생명공학 업계는 최소한의 시간 프레임에서 고성능 공정들을 개발하여 증가하는 시장의 요구를 만족시키고 제조 비용을 감소시키도록 강하게 동기부여 된다. 잘-균형잡힌 배지 조성물은 유가식 공정의 주요한 두 개의 요소-최대 생균 밀도 및 생산성에 필수적이므로, 많은 노력들이 배지 최적화에 집중되었다. 문헌 [Jerums and Yang (2005) BioProcess International, 3:38-44; Zhang et al. (2008) BioPharm International, 21:60-8; Hodge (2005) BioPharm. International., 18:1-4; 및 Li F et al. (2010) Mabs, 2:455-477]를 참조한다.
단백질 치료법을 위한 공정 개발은 많은 조건들의 스크리닝 및 세포 배양 공정 생산량의 최적화를 가속화하는 고-처리량(HT) 기술에 점점 더 의존한다. 자동화된 HT 실험은 완전한 요인 실험적 고안(full factorial experimental design)을 사용하여 큰 고안 공간을 탐색하고 원료 물질, 배양 배지, 노동 및 시간을 감소시켜 비용을 줄이는 기회를 제공한다. 문헌 [Amanullah A et al. (2010) Biotechnol. Bioeng., 106:57-67; Bareither R and Pollard D. (2011) Biotechnol. Prog, 27:2-14; 및 Barrett TA et al. (2010) Biotechnol. Bioeng., 105:260-75]를 참조한다. 많은 이용가능한 HT 시스템들 중에서, 분석적 적용을 위해 처음으로 사용된 마이크로웰 플레이트는 지난 10년 동안 미생물 및 포유동물 세포 배양 적용을 위한 중요한 도구가 되었다. 산소 질량 이동 비율(oxygen mass transfer rates) 및 혼합 조건들의 특징을 규명하여, 이러한 장치들에서 현탁 배양 조건들을 이해하고, 세포 배양 필요를 뒷받침하는 데에서 그들의 효율을 확인하는데 엄청난 노력들이 이루어졌다. 동시에 세포의 로딩, 샘플링 및 피딩을 가능하게 하고, 웰 내로 형광 패치 센서를 혼입하여 pH, 용존 산소(DO), 및 광학 밀도(OD) 측정을 수행하는 것을 가능하게 하는 표준 랩 자동화 액체 핸들링 플랫폼 내로의 그들의 통합은 그들을 바이오공정 개발 연구들을 위한 효율적인 규모-축소 도구로서 만들었다. 문헌 [Baboo et al. (2012) Biotechnol. Prog., 28:392-405; Chen A et al. (2009) Biotechnol. Bioeng., 102:148-60; Duetz WA (2007) Trends Microbiol., 15:469-75; Funke M et al. (2009) Biotechnol. Bioeng, 103:1118-28; Micheletti M and Lye GJ. (2006) Curr. Opin. Biotechnol., 17:611-618; Wen Y et al. (2012) Process Biochem., 47:612-618]를 참조한다.
배지 성분들이 차선의 농도에서 세포 성장 또는 생산성을 제한할 수 있고, 따라서 바로 공정 성능에 영향을 줄지도 모르기 때문에 배지 최적화는 공정 개발에서 중요한 단계이다. 문헌 [Kim DY et al. (2005) Cytotechnol., 47:37-49]를 참조한다. 한편, 배지 성분들은 또한 분비되는 단백질에, 특히 그들의 생체 내에서 생물 활성 및 안전성에 필수적인 그들의 글리코실화에 영향을 미칠 수 있다. 문헌 [Gawlitzek M et al. (2009) Biotechnol. Bioeng., 103:1164-1175; 및 Hossler P et al. (2009) Glycobiology, 19:936-49]를 참조한다. 배양 배지 개발에 사용된 고전적인 전략은 다른 것들은 일정하게 유지하면서 한 번에 하나의 인자(OFAT)의 변동에 의존한다. 이는 수고롭고, 시간이 걸리며, 성분들의 상승적인 상호작용을 설명하지 못한다. 그러므로, 신규한 기술 및 방법으로 실험고안법(design of experiments)(DoE) 및 통계적 분석들을 수반하는 것이 수행되었다.
이러한 DoE 및 통계적 분석 기술들은 한번에 많은 성분들의 시험과 그들의 상호작용들의 확인을 가능하게 한다. 문헌 [Lee GM et al. (1999) J. Biotechnol., 69:85-93; Sandadi S et al. (2006) Biotechnol. Prog., 22:595-600; 및 Zhang H et al. (2012) Cytotechnol. published online 21 August 2012]을 참조한다. 배지 최적화를 위한 많은 전략들이 기재되어 있다. 문헌 [Jerums M and Yang X. (2005); Zhang M et al. (2008)]를 참조한다. 예를 들어, 최적화는 소진된 배지 분석(spent medium analysis)에 기초할 수 있으며, 문헌 [Xie L and Wang DI. (1994) Biotechnol Bioeng, 43:1164-74]를 참조한다. 최적화는 또한 대사산물 흐름 분석(metabolite flux analyses) 또는 대사체학에 기초할 수 있으며, 이는 차후 실험들에서 성분들의 재균형을 가능하게 하며, 문헌 [Dietmair S. et al. (2012) Biotechnol. Bioeng., 109:1404-14; Selvarasu S. et al. (2012) Biotechnol. Bioeng., 109:1415-1429; 및 Xing Z et al. (2011) Process Biochem., 46:1423-1429]를 참조한다. 한편, 통계적 DoE가 자동화 및 소 세포 배양 장치들과 관련되고, 수백가지의 배지 배합물을 시험할 수 있게 하는 고-처리량 접근법에서, 시험들은 보통 결정적 공정 산출(예를 들어, 세포 성장, 단백질 역가)을 모니터링하는 것에 의해 수행된다. 이는 수백가지의 배지 배합물을 시험할 수 있게 한다. 문헌 [Barrett et al. (2010); Didier C et al. (2007) Chemom. Intell. Lab. Syst., 86:1-9; Girard P et al. (2001) Biochem. Eng. J., 7:117-119; 및 Hodge G (2005) Biopharm International, 18 :1-4]를 참조한다.
재조합 포유동물 세포 배양과 같은 복합 생물학적 시스템으로 일을 할 때, 정의된 상이한 배합물들의 조합들을 평가하는 혼합 고안들은 배지 최적화에 중요한 도구일 수 있다. 문헌 [Jerums and Yang (2005); Didier et al. (2007); 및 Rispoli F and Shah V. (2009) Biotechnol. Prog., 25:980-985]를 참조한다. 이러한 접근법은 특히 요인 고안(factorial designs)을 사용하여 발생될 지 모르는 성분 용해성 문제들을 회피하기 때문에 많은 성분들을 시험할 때에 특히 흥미롭다. 다양한 배양 배지 성분들의 최적 농도 범위는 배지 블렌딩으로부터 수득된 다양한 신규 혼합물들의 성능을 평가하는 것에 의해 확인될 수 있다. 문헌 [Jordan et al.]에는 최근 한 회의 실험들에서 20개의 아미노산들을 리셔플(reshuffle)하는데 사용되었던 확장된 배지 블렌딩 전략에 기초한 신규 고-처리량 방법이 기재되었다. 문헌 [Jordan M et al. (2013) Cytotechnol., 65:31-40]를 참조한다. 단일클론 항체(mAb)를 생산하는 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 회분식 배양에서 현저하게 향상된 많은 생균 밀도 및 역가는 10 개의 배합물로부터의 배지 블렌딩에 의해 제조된 192 개의 혼합물로부터 기인하였다.
보통, 유가식 공정의 배지 및 피드 개발은 동시 최적화에 요구되는 다수의 실험 때문에 연속적으로 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Zhang et al. (2012)]은 재조합 항체를 발현하는 CHO 세포에 대한 유가식 공정을 위한 배지 및 피드를 연속적으로 개발하였다. 문헌 [Zhang et al.]은 플랙캣-버만 고안을 사용하여 세포 성장 및 항체 생산에 대한 활성 인자들을 스크리닝한 후, 중심 합성 고안법(central composite design)을 사용하여 그들의 농도를 최적화하고, 그 후 생산성을 향상시키는 서로 다른 영양소들의 화학량적 비율에 기초한 피딩 고안을 사용하였다. 그럼에도, 성공적인 최적화 전략의 결과는 기본 배지와 피드 배지가 밀접하게 연관되어 세포 배양 성능에 영향을 줄 수 있기 때문에 언제나 이상적이지는 않을 수 있다. 실제로, 향상된 기본 배지는 세포의 대사 및 성장을 변경할 수 있으며, 이는 그런 뒤 변형된 피드를 필요로 할 수 있다. 그러므로, 문헌 [Jiang Z et al. (2012) BioProcess. International, 10:40-45.]에서 제안된 바와 같이, 몇몇 요소들의 순차적인 최적화가 반복되어야 하며, 또는 순차적 배지 및 피드 최적화 후에는 피드 및 공정 설정에서 최종 회의 통합된 최적화가 뒤따라야 한다.
다른 그룹들은 보충 블렌드의 개발에 집중하였다. 예를 들어, WO12/078270은 강화된 성능 특성들을 가지는 세포 배양 배지 보충물 또는 보충 블렌드를 결정하는 스크리닝 방법을 개시한다. 이는 배양 배지에 첨가되는 하나, 둘 또는 그 이상의 성분들을 사안에 따라 포함하는 보충물 또는 보충물의 조합을 특히 기재한다.
많은 문헌들이 포유동물 세포 배양 배지를 기재하였다. 예를 들어, EP2154244 출원은 세포를 배양하기 위한 배지로서, 1 mM 이상의 세린, 1 mM 이상의 티로신 및 0.4 mM 이상의 시스테인을 가지는 배지를 개시한다. 이 출원은 최적화된 배양 배지를 수득하는데 필요한 다른 성분들의 특정한 농도에 대하여는 침묵하고 있다. EP481791 특허는 동물 공급원(animal source)으로부터 분리한 단백질, 지질 및 탄수화물이 없는 배양 배지에 관한 것이나, 대신 예를 들어 재조합 인슐린과 같은 재조합 단백질 공급원들을 사용한다. 게다가, 이 특허는 배양 배지에 포함되어야 할 아미노산들에 대한 특정 범위의 농도를 개시한다. 다른 예로서 US 6,048,728은 8 mM 이상의 농도인 글루타민, 글루타메이트 및 아스파라긴, 트립토판, 또 다른 아미노산, 및 적어도 콜린 및 에탄올아민을 포함하는 인지질 전구체 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지를 기재한다. 또 다른 추가 예로서 WO 98/45411은 특정한 아미노산 농도를 가지는 배양 배지를 개시한다.
그러나, 최소한의 시간 프레임에서 고성능 공정들을 개발하여 증가하는 시장의 요구를 만족시키고 제조 비용을 감소시키는 필요는 여전히 존재한다. 고성능 공정들을 개발하는 것은 내재적으로 오염의 위험이 없는(즉, 무-혈청 및 무-단백질) 고성능 배양 배지를 개발하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은 신규한 무-혈청 및 무-단백질 배양 배지이다. 이러한 배양 배지는 통적인 차이니스 햄스터 난소(CHO) 배지와 같은 전통적인 포유동물 배지의 성능을 향상시킬 수 있기 때문에 고성능으로 여겨진다. 예를 들어, 본 발명의 배지는 더 적은 시간에서 더 높은 수율로 생산 될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 것은 유가식 세포 배양을 위한 배지의 개발을 포함하는, 배지의 개발을 위한 신규한 블렌딩 고안이다. 이러한 고안은 단 한번의 실험으로 독점권이 부여된 또는 전통적인 배지의 모든 배지 성분들의 최적화를 가능하게 한다.
본 발명은 또한 상기 배지를 제조하는 방법, 및 그들의 사용 방법을 포함한다. 본 발명에 따른 상기 배양 배지 및 상기 방법은 임의의 포유동물 세포의 배양에 적용될 수 있고, 모든 종류의 생물반응기에 적용될 수 있다. 바람직하게 이들은 유가식 생물반응기에서 CHO 세포에 적용된다.
따라서 본 발명의 일 실시양태는 무-혈청 및 무-단백질이고 NaH2PO4, L-루이신, L-리신, L-메티오닌, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-트레오닌, L-트립토판, L-발린, 황산 마그네슘, 염화 칼슘, 미오-이노시톨, 피루브산 나트륨, D-비오틴, 염화 콜린, L-아스파라긴, 엽산, 나이아신아미드(B3), D-판토텐산 x ½칼슘, L-세린, 염화 칼륨, 피리독신, L-아스파르트산, 리보플라빈, 티아민, 구연산 제2철 암모늄, 비타민 B12, 히포크산틴, 티미딘, 푸트레신, 에탄올아민, 황산 아연, 황산 제2구리, 플루로닉, L-티로신, 아셀렌산 나트륨, L-알라닌, L-아르기닌, L-시스테인, L-히스티딘 및 L-이소루이신을 포함하는 포유동물 세포 배양을 위한 배지이다. 상기 배지는 글루코스, NaHCO3, 또는 그들의 조합뿐만 아니라 NaCl 및 NaOH를 더 포함할 수 있다. NaCl 및/또는 NaOH는 첨가될 때 몰삼투압농도 및 pH 조절을 위해 사용된다.
일 실시양태에 있어서, 상기 배지 성분의 농도는 하기범위와 같다:
NaH2PO4: 1.7 내지 10;
L-루이신: 2 내지 9 mM;
L-리신: 1 내지 6 mM;
글리신: 0 내지 3 mM;
L-메티오닌: 0.4 내지 2 mM;
L-글루탐산: 1 내지 4 mM;
L-페닐알라닌: 0.5 내지 3 mM;
L-프롤린: 0.7 내지 6 mM;
L-트레오닌: 0.7 내지 6 mM;
L-트립토판: 0.5 내지 2 mM;
L-발린: 1 내지 7 mM;
황산 마그네슘: 0.1 내지 1.5 mM;
염화 칼슘: 0.1 내지 1.05 mM;
미오-이노시톨: 0.07 내지 0.7 mM;
피루브산 나트륨: 0.8 내지 4 mM;
D-비오틴: 0.0008 내지 0.01 mM;
염화 콜린: 0.1 내지 1 mM;
L-아스파라긴: 3 내지 9 mM;
엽산: 0.006 내지 0.04 mM;
나이아신아미드(B3): 0.03 내지 0.15 mM;
D-판토텐산 x ½ 칼슘: 0.015 내지 0.15 mM;
L-세린: 1 내지 8 mM;
염화 칼륨: 1 내지 10 mM;
피리독신: 0.005 내지 0.05 mM;
L-아스파르트산: 0.8 내지 2.4 mM;
리보플라빈: 0.0003 내지 0.003 mM;
티아민: 0.008 내지 0.04 mM;
구연산 제2철 암모늄: 1 내지 10 mg/L;
비타민 B12: 0.0003 내지 0.004 mM;
히포크산틴: 0.008 내지 0.04 mM;
티미딘: 0.0015 내지 0.006 mM;
푸트레신: 0.006 내지 0.03 mM;
에탄올아민: 0.1 내지 0.5 mM;
황산 아연: 0.004 내지 0.02 mM;
황산 제2구리: 0.00004 내지 0.0008 mM;
플루로닉: 0.5 내지 2.0 g/L;
L-티로신: 0.7 내지 3 mM;
아셀렌산 나트륨: 0.00001 내지 0.00006 mM;
L-알라닌: 0 내지 3 mM;
L-아르기닌: 1 내지 3 mM;
L-시스테인: 1 내지 3 mM;
L-히스티딘: 0.4 내지 3 mM; 및
L-이소루이신: 1 내지 6 mM.
상기 배지가 글루코스, NaHCO3, 또는 그들의 조합을 더 포함하는 경우, 이러한 성분들은 바람직하게는 일정하게 유지된다. 일 실시양태에 있어서, 상기 글루코스는 대략 6 g/L (즉, 33 mM)의 농도로 유지되며 NaHCO3는 대략 2 g/L (즉, 23.8 mM)의 농도로 유지된다.
본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 본 발명에 따른 상기 배지의 몰삼투압농도는 300 내지 330 mOsm/kg, 바람직하게는 약 305 내지 320 mOsm/kg 또는 305 내지 320 mOsm/kg, 더욱 바람직하게는 약 315 mOsm/kg 또는 315 mOsm/kg 이다.
본 발명에 따른 상기 배지의 pH는 약 6 내지 약 8, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5의 범위이고, 더욱 바람직하게는 약 또는 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 또는 7.2이다.
도 1은 본 발명의 실시양태에 따른 고-처리량 배지 블렌딩 방법을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시양태에 따른 배지 및 피드 블렌딩을 기초로 한 고-처리 세포 배양 방법을 사용하는 향상된 개발 전략을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시양태에 따라 제조된 376개의 배지 블렌드 및 20개의 대조군에 대한 생균 밀도(VCD), 생존력(%), 적분 생균 밀도(integral viable cell density, IVC), 집단배가수(population doubling level, PDL) 및 역가를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 데이터 분석을 위한 3가지 가능한 접근법들을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시양태에 따른 통계 고안 분석 프로그램을 사용하는 데이터 처리를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시양태에 따른 다-변량 분석(MVA)의 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 실시양태에 따른 블렌딩 방법의 강건성(robustness)을 결정하기 위한 대한 데이터 분석을 나타낸다.
용어 "세포 배양 배지(medium)," "배양 배지," "배지," 및 "배지들"은 임의의 타입의 세포가 배양될 수 있는 임의의 배지를 지칭한다.
용어 "생물반응기"는 세포가 배양될 수 있는 임의의 시스템을 지칭한다. 이 용어는 플라스크, 정지 플라스크(stationary flasks), 스피너 플라스크(spinner flasks), 쉐이크 튜브(shake tubes), 쉐이크 보틀(shake bottles), 웨이브 백(wave bags), 섬유 생물반응기(fiber bioreactors), 유가식 생물반응기 또는 고 용량 생물반응기(high capacity bioreactors)를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.
"전통적인 배지" 또는 "기본 배지"는 세포 대사에 유용한 모든 필수적 구성성분을 함유하는 세포 배양 배지를 지칭한다. 이는 예를 들어 아미노산, 지질, 탄소원, 비타민 및 미네랄 염을 포함한다. DMEM(둘베코스 모디파이드 이글 미디엄), RPMI(로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 미디엄) 또는 미디엄 F12(햄스 F12 미디엄)이 전통적인 배지의 예이다.
"화학적으로 정의된 배지," "화학적으로 정의된 기본 배지," 및 "CDM"은 모든 성분들이 화학식의 측면에서 기재될 수 있고 알려진 농도로 존재하는 것을 지칭한다.
용어 "유가식 배양"은 볼루스(bolus) 또는 연속적인 배지 보충으로 소비되는 배지를 다시 채우는, 세포를 성장시키는 연속적인 방법을 지칭한다. 이러한 세포 배양 기술은 배지 배합물, 세포주, 및 다른 세포 성장 조건에 따라서 10x106 초과 내지 30x106 세포수/ml 정도의 고 세포 밀도를 달성하는 잠재력을 가지고 있다. 이상성(biphasic) 배양 조건이 다양한 공급 전략 및 배지 배합물에 의해서 생성되고 유지될 수 있다.
본 발명의 일측면은 신규한 무-혈청 및 무-단백질 배양 배지이다. 이러한 배지는 전통적인 차이니스 햄스터 난소(CHO) 배지와 같은 전통적인 포유동물 배지를 여러 가지 면에서 능가한다. 예를 들어, 본 발명의 배양 배지가 유가식 공정에서 사용될 때, 상기 공정은 더 적은 시간에 높은 수율로 단백질을 생산한다.
본 발명에 따른 배지는 화학적으로 잘-정의된 것이고, 무-혈청 및 무-단백질이다. 이러한 성질들은 본 발명에 따른 상기 배지가 재조합 단백질과 같은 단백질을 더 높은 수율로 생산할 수 있게 한다. 이러한 배지는 많은 것들 중에서 적게 변동하는 균일한 성질들을 가진다. 상기 배지를 사용하는 것은 재조합 단백질과 같은 단백질로서 균일한 성질들을 가지는 것이 수득될 수 있도록 보장한다. 상기 배지는 따라서 재조합 단백질(예를 들어, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체 또는 그들의 단편)과 같은 단백질의 산업적 제조에 적합하다. 본 발명에 따른 배지가 무-혈청 및 무-단백질이므로, 바이러스성 오염의 위험이 없다.
본 발명의 예시적인 실시양태는 상기 다양한 요소들을 액체에 함께 혼합하는 것에 의해 배지를 제조하는 방법을 더 제공한다. 상기 액체는 물 또는 전통적인 배지(기본 배지)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 기본 배지가 사용되면, 첨가되어야 하는 각 성분의 양이 표 2에 기재된 최종 농도들에 맞추기 위해, 기본 배지의 초기 농도에 따라 달라질 것이다.
본 발명은 단 한번의 실험으로 전통적인 또는 독점권이 부여된 배지의 모든 배지 성분들의 최적화를 가능하게 하고, 특히 유가식 세포 배양 공정을 위한 향상된 배양 배지의 개발을 위한 신규한 블렌딩 고안을 더 기재한다. 동시에 모든 배지의 성분들을 시험하는 능력은 잠재적으로 결정적인 인자들이 누락되지 않는다는 장점을 나타낸다.
또한, 본 명세서에 기재된 것은 (기본 또는 전통적인) 배양 배지를 개발 및/또는 최적화하기 위한 고-처리량 배지 블렌딩 방법으로서:
a) 배지 성분을 선택하거나 또는 최적화를 위한 기본 배지를 선택하는 단계로서, 상기 최적화 배지는 잘 특성화된 것인 단계;
b) 상기 각 성분에 대해 세 수준의 농도를 선택하는 단계;
c) 상기 선택된 성분을 상이한 농도로 가지는 배지 배합물의 세트를 제조하는 단계;
d) 상기 상이한 배지 배합물을 상이한 농도에서 혼합하여 상이한 배지 블렌드를 수득하는 단계;
e) 각 블렌드에 대해 세포 배양 성능을 평가하는 단계로서, 상기 세포 배양은 포유동물 세포 배양인 단계;
f) 세포 배양에 대한 각 블렌드의 상기 성능을 모니터링하는 단계;
g) f)단계에서 수득된 데이터를 분석하는 단계; 및
h) 하나 이상의 최종 배양 배지(배지들)을 결정하는 단계를 포함하는 (기본 또는 전통적인) 배양 배지를 개발 및/또는 최적화하기 위한 고-처리량 배지 블렌딩 방법이다.
예시적인 실시양태에서, 상기 (h)단계에서 수득된 상기 최종 배양 배지는 다른 배지와 비교하여 최적화되거나 또는 최적화되었던 상기 배지와 비교하여 최적화된다. 상기 최종 배양 배지는 예를 들어 세포 증대 및/또는 유가식 배양 배지로서 사용된다. (c)단계의 상기 배지 블렌드는 상기 세포 배양 조건들에 따라, 또는 배양되어야 할 상기 세포에 따라 첨가될 수 있는 다른 성분들 중에서 글루코스, NaHCO3, NaCl 및/또는 NaOH 또는 그들의 조합을 더 포함한다.
세포 배양 성능 (단계 e)에 대해 각 블렌드를 평가하기 위해, 각 상이한 배지 블렌드에 포유동물 세포를 접종해야 하고, 상기 포유동물 세포는 상기 배지 블렌드에서 배양되어야 한다.
또 다른 실시양태에 있어서, 본 발명은 배양 배지를 개발 및/또는 최적화하기 위한 고-처리량 배지 블렌딩 방법으로서:
a) 배지 성분을 선택하거나 또는 최적화를 위한 기본 배지를 선택하는 단계로서, 상기 최적화 배지는 잘 특성화된 것인 단계;
b) 상기 각 성분에 대해 세 수준의 농도를 선택하는 단계;
c) 상기 선택된 성분을 상이한 농도로 가지는 배지 배합물의 세트를 제조하는 단계;
d) 상기 상이한 배지 배합물을 상이한 농도에서 혼합하여 상이한 배지 블렌드를 수득하는 단계;
e) 각 블렌드에 대해 세포 배양 성능을 평가하는 단계로서, 상기 세포 배양은 포유동물 세포 배양인 단계;
f) 세포 배양에 대한 각 블렌드의 상기 성능을 모니터링하는 단계;
g) f)단계에서 수득된 데이터를 분석하는 단계;
h) 추가 최적화를 위한 핵심 성분들을 결정하는 단계;
i) h)단계에서 수득한 정보를 기초로 b) 내지 g) 단계를 반복하는 단계;
j) 임의로 h) 및 i) 단계를 반복하는 단계; 및
k) 하나 이상의 최종 배양 배지를 결정하는 단계를 포함하는 배양 배지를 개발 및/또는 최적화하기 위한 고-처리량 배지 블렌딩 방법이다.
예시적인 일 실시양태에서, 상기 (k)단계에서 수득된 상기 최종 배양 배지는 다른 배지와 비교하여 최적화되거나 또는 최적화되었던 상기 배지와 비교하여 최적화된다. 상기 최종 배양 배지는 예를 들어 세포 증대 및/또는 유가식 배양 배지로서 사용된다. 또한, (c)단계의 상기 배지 블렌드는 상기 세포 배양 조건들에 따라, 또는 배양 되어야 할 상기 세포에 따라 첨가될 수 있는 다른 성분들 중에서 글루코스, NaHCO3, NaCl 및/또는 NaOH 또는 그들의 조합을 더 포함한다.
세포 배양 성능 (단계 e)에 대해 각 블렌드를 평가하기 위해, 각 상이한 배지 블렌드에 포유동물 세포를 접종해야 하고, 상기 포유동물 세포는 상기 배지 블렌드에서 배양되어야 한다.
예시적인 실시양태에서, h)단계의 핵심 성분(들)은 구연산 제2철 암모늄, 판토텐산, 발린, 메티오닌, 아르기닌, 비오틴, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴, 황산 제2구리, 시스테인, 비타민 B12, 아셀렌산 나트륨, 또는 그들의 조합 중 하나 이상의 성분을 포함한다. 실제로, 구연산 제2철 암모늄, 판토텐산, 발린, 메티오닌, 아르기닌, 비오틴 및 세린은 역가에 대한 모델에서 영향을 가지는 것으로 알려져 왔고, 반면 아스파르트산, 아스파라긴, 황산 제2구리, 시스테인, 비타민 B12 및 아셀렌산 나트륨은 MVA에서 중요한 인자들과 연관된 것으로 나타났다(실시예, 데이터 분석 과정 참조).
본 발명에 따른 상기 고안 방법은 모든 종류의 생물반응기에서, 임의의 포유동물 세포를 위한 배양 배지의 고안 및/또는 최적화에 적용될 수 있다. 바람직하게 상기 포유동물 세포는 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체 또는 그들의 단편과 같은 단백질(재조합 단백질)을 발현하고 생산하기 위해 변형된다. 일 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 재조합 CHO 세포이다.
상기 세포 배양 성능의 평가는 생균 밀도(VCD), 역가, 적분 생균 밀도(IVC), 집단배가수(PDL) 및/또는 생존력을 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다. 이러한 측정들은 통상의 기술자에게 잘 알려진 임의의 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 상기 배양 배지는 임의의 포유동물 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 이들은 유가식 생물배양기를 위한, CHO 세포 또는 재조합 CHO 세포를 배양하는데 특히 적합하다. 일 실시양태에서, CHO 세포와 같은 상기 포유동물 세포는 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체 또는 그들의 단편과 같은 단백질(재조합 단백질)을 발현하고 생산하기 위해 변형된 재조합 세포이다.
예시적인 추가 실시양태에서, 본 발명은 포유동물 세포에서 제시된 단백질을 생산하는 공정을 기재하며, 상기 공정은 본 발명에 따른 배지에서 상기 세포를 성장시키는 단계 및 상기 포유동물 세포로부터 생산된 제시된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 또한 본 명세서에 기재된 것은 제시된 단백질을 생산하는 방법으로서, a) 재조합 단백질과 같은 제시된 단백질을 생산할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양은 본 발명에 따른 배지 중 하나에서 수행되는 단계; 및 b) 상기 포유동물 세포로부터 생산된 제시된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법이다. 일 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체 또는 그들의 단편과 같은 단백질(재조합 단백질)을 발현하고 생산하기 위해 변형된 것이다. 다른 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 재조합 CHO 세포이다.
다른 예시적인 실시양태에서, 포유동물 세포를 배양하여 생산물을 수득하는 방법이 기재된다. 상기 방법은 본 발명에 따른 배지 중 하나에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 더욱 기재된 것은 포유동물 세포를 배양하는 방법이며, 상기 방법은 a) 재조합 단백질과 같은 제시된 단백질을 생산할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 배양은 본 발명에 따른 배지 중 하나에서 상기 포유동물 세포를 충분하게 성장시키기에 충분한 기간 동안 또는 제시된 단백질의 적절한 생산을 가능케 하기에 충분한 기간 동안 수행되는 단계 및 b) 상기 포유동물 세포에 의해 생산된 제시된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 항체 또는 그들의 단편과 같은 단백질(재조합 단백질)을 발현하고 생산하기 위해 변형된다. 바람직하게 상기 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 재조합 CHO 세포이다.
47개의 성분들로 구성된 독점권이 부여된 배지로부터 시작하여, 16개의 배합물을 상기 43개의 성분들에 대해 세 개의 서로 다른 수준들로 변화시키면서 고안하였다. 상기 블렌딩 고안으로부터 제외된 유일한 인자들은 피드의 일부이고 배양 초기 3일 동안은 제한되지 않았던 글루코스, pH 조절을 위해 필요했던 NaOH, 주요한 pH 버퍼로서 NaHCO3, 그리고 몰삼투압농도 조절을 위한 NaCl이다. 2원성 블렌드(binary blends)를 고려한 맞춤-제작 혼합물 DoE에 기초하여, 배지 블렌딩은 CHO 유가식 배양의 공정 성능에 대한 96-DWP에서 시험된 376개의 블렌드들을 야기하였다. 증대기(expansion phase) 동안 상이한 블렌드를 시험하는 것은 최고로 확인된 생산 배지가 증대 배지로서 사용될 수 있다는 것을 보장한다. 실제로, 일부 블렌드는 세포 증대기 동안 세포 성장을 20%로 증가시키는 것이 이미 가능하였으며, 이러한 증가는 생산기(production phase) 동안 확인되었다. 역가에 관하여는, 특정한 블렌드에서 40%까지의 중요한 향상이 관찰되었다. 세계적으로, 최고의 조건들은 일반적으로 IVC, 역가 및 비생산성(specific productivity)을 향상시켰으나, 일부 조건들은 IVC 증가를 나타내지 않고 역가 및 비생산성에서의 증가만을 나타내었다.
데이터 분석을 위해 사용된 전략은 3 개의 수준을 포함했다. 첫 번째 수준은 상기 세포 배양 공정 성능에 대한 각 배지 블렌드의 효과의 실험적 분석이었다. 모든 블렌딩 조건들로서 공정 산출을 향상시키는 그들의 잠재력에 관한 것을 스코어링 및 등위매기기하는 것에 의해서, 최고의 조건들이 쉽게 이용 가능하게 되었고 확인을 위해서 더 큰 규모에서 더욱 시험될 수 있었다. 이러한 방법은 복잡한 통계학적 방법론의 사용 없이도 배지 최적화를 위한 단순하고 빠른 방법을 표시한다. 분석의 두 가지 다른 수준들은 더 심도 깊은 평가를 가능하게 하는 통계학적 도구들을 사용하였다. 수학적 모델들을 사용하는 것에 의해, 첫 번째 도구인 디자인 엑스퍼트 소프트웨어(Design Expert software)는 최종 PDL, IVC 및 역가를 극대화하는 최고의 혼합물의 예측을 가능하게 하였다. 이 방법의 대단한 장점은 여러 개의 기준이 함께 분석되어 기준 간의 상승적인 반응들을 확인할 수 있다는 점이다. 또한, 이는 초기 16개의 배합물의 등위매기기를 가능케 하여, 예를 들어, 불량한 성능 혼합들에서 시스템적으로 존재하였던 배합물들을 확인하고 신규한 DoE에서 시험되어야 할 다른 것들과 교체되는 것이 가능하였다. 상기 모델링 도구는 또한 시험되지 않은 신규한 혼합물들을 상이한 블렌딩 비율로서 시뮬레이션하는데 유용하나, 두 개의 배합물에 제한되지 않으며 가능한 최고의 블렌드의 예측을 가능하게 한다.
MVA에 기초한 분석의 궁극적인 수준은 SIMCA-P++ 소프트웨어를 사용하였다. 부분 최소 자승 회귀분석(partial least square regression)을 사용하는 역가를 위해 생성된 상기 모델은 역가에 대해 가장 큰 영향력을 가지는 요소들로서 구연산 제2철 암모늄, 판토텐산, 발린, 메티오닌, 아르기닌, 비오틴 및 세린의 확인을 가능케 하였고, 반면 아스파르트산, 아스파라긴, 황산 제2구리, 시스테인, 비타민 B12 및 아셀렌산 나트륨과 같은 다른 인자들이 MVA에서 중요한 인자들과 연관되어 있기 때문에 선택되었다. 우리가 이러한 연관으로 인하여 진짜 효과 또는 “거짓”효과 간의 차이를 실제로 구별하지 못할 수 있다는 점을 염두에 두어야 한다. 이러한 세 번째 방법의 이점은 더욱 평가 될 수 있고 잠재적으로 향상된 성능을 가지는 신규한 배지 배합물의 확인을 초래해야 하는 핵심 배지 성분들의 확인을 가능케 한다는 점이다.
결론적으로, 본 명세서에 기재된 상기 고-처리량 배지 블렌딩 접근법은 유가식 공정의 배지 최적화를 위한 강건하고 신속한 방법이다. 결정적인 공정 산출, 예를 들어, 세포 성장, 생존력, 역가에 기초한 단순 등위매기기에 의한 데이터 분석은 쉽고 빠른 도구를 제공하여 거의 400개의 상이한 블렌드 중에서 최고의 성능을 내는 배지 배합물을 결정하고, 이는 더 큰 규모들에서도 신속하게 확인될 수 있다. 한편, 통계학적 도구들은 최고의 성능을 내는 배지 배합물의 예측 및 추가 최적화를 위한 결정적인 배지 성분들의 확인을 가능케 하는 더 심도깊은 분석을 가능하게 한다. 고전적인 배지 개발 전략들과 비교하였을 때, 이러한 방법은 비용 및 개발 시간을 대단히 감소시키며 한 번의 실험 내에서 향상되고 더욱 일정한 성능을 달성하는 가능성을 강화시킨다. 데이터 분석을 포함하는 모든 배지 블렌딩 공정은 6주 이내에 수행되었다. 이러한 방법은 또한 피드 개발에 적용될 수 있으며 유가식 공정 개발 및 최적화를 위한 신규한 관점, 및 세포주 스크리닝 및 세포주 안정성 연구들과 같은 다른 활동들을 위한 신규한 관점을 여는 것이다.
실시예
재료 및 방법
배지 배합물 제조.
개별 성분들을 칭량하는 것으로 16개의 배합물을 제조하였다. 각 배합물에 대해, 배양 초기 3일 동안의 임의의 제한을 예방하기 위해 글루코스 농도를 33.3 mM로 고정하였고; NaOH 농도를 조절하여 NaHCO3 첨가 전에 pH 7.0을 수득하였고; NaHCO3 농도를 23.8 mM로 고정하여 완충 용량을 유지하였고; NaCl 농도를 조절하여 몰삼투압농도를 약 315 mOsm/kg에 도달하게 하였다.
자동화된 배지 블렌딩.
고-처리량 배지 블렌딩을 액체 핸들링 워크스테이션(liquid handling workstation)(바이오멕 FX(Biomek FX), 벡크만-코울터 인크.(Beckman-Coulter, Inc.), 미국 캘리포니아주 풀러튼) 상에서 수행하였다. 총 376개의 혼합물을 5 개의 사각-형상 96-DWP(그레이너 바이오-원(Greiner Bio-One) # 780271) 내에서 바로 블렌딩하였다. 각 플레이트 상에서, 역가 결정에 필요한 시약들을 위해 16개의 웰을 이용 가능하게 유지하였다. 상기 16개의 배합물을 2원성 블렌드를 가지는 맞춤-제작 혼합물 DoE에 따라서 블렌딩하였다. 상기 고안의 후보 지점들은 정점들(100%의 1개의 배합물), 에지(edges)의 중심(50%의 2개의 배합물), 및 세 번째 에지(하나는 33%, 다른 하나는 67%인 2개의 배합물)이었다. 376개의 혼합물에 더하여, 실험적 및 플레이트-투-플레이트(plate-to-plate) 변동성을 평가하기 위해 20개의 대조군을 수행하였다. 대조군은 독점권이 부여된 배지(대조군 1: 이 참조 배지는 상기 배지 블렌딩 고안의 부분이 아니며 그 정확한 조성은 공개되지 않는다) 또는 F2 배합물(대조군 2: 각 성분에 대한 중간 수준)이었다.
세포 배양
mAb를 생산하는 CHO-S 세포주를 사용하여 실험들을 수행하였다. 이러한 세포들을 먼저 쉐이크 튜브 또는 쉐이크 보틀 내의 독점권이 부여된 배지에 증대시켰다. 유가식 공정을 시작하기 7일 전에(7일 전), 상기 세포를 원심분리하고, F1 배합물(가장 낮은 수준의 각 성분; 아래의 표 1 참조)에서 5x106 세포수/mL의 농도로 재현탁하고 그런 뒤 이전에 376 개의 상이한 블렌드와 20 개의 대조군으로 채워진 5 개의 사각-형상 96-DWP 내에 0.75x106 세포수/mL로 시딩하였다(최종 웰 당 부피는 450 μL). 모든 작은 부피 액체 핸들링(500 μL 미만)을 로봇 플랫폼(robotic platform)으로 수행하였다. 그런 뒤 상기 플레이트들을 37℃, 5% CO2, 90% 습도 및 320 rpm 교반의 쉐이커 인큐베이터(ISF1-X, 퀴너 AG(Kuhner AG)) 내에서 배기 뚜껑(vented lids)으로 인큐베이션하여 증발을 최소화 하였다(문헌 [Duetz (2007) Trends Microbiol., 15:469-475]). 3 번의 계대배양(passages)을 각각의 상이한 배지 혼합물에 대해 동일한 조건들 하에서 5일 전, 3일 전 및 0일 전(유가식 배양의 시작일)에 수행하였다. 각각의 계대배양에서, 상기 세포들을 0.75x106 세포수/mL로 희석하였고 배지 블렌드 및 대조군을 함유하는 신규한 세트의 5 개의 96-DWP에서 재-인큐베이션하였다.
샘플들을 성장 및 생존력 평가(구아바 이지-사이트(Guava Easy-Cyte), 머크 밀리포레(Merck Millipore))를 위해 취하였다. 유가식 접종 이전에 3 번의 계대배양들을 MSX를 가지는 배지에서 수행하는 반면 유가식은 없이 수행하였다. 증대기 이후에, 상기 유가식 공정을 0.75x106 세포수/mL로 다양한 배지 블렌드 내에 시딩된 세포들로 개시하였으며, 피드를 2일, 4일, 7일 및 10일째에 첨가하였다. 피딩 시스템은 400 g/L의 글루코스 용액, 30 개가 넘는 성분을 함유하는 화학적으로 정의된 주 피드 및 고도로 농축된 알칼리성 아미노산 용액으로 구성되었다. 각 피딩에 앞서 그리고 상기 배양 말기(14일째)에, 샘플들(40 μL 미만)을 성장 및 생존력 평가와 역가 결정을 위하여 취하였다.
PDL, IVC, 역가 및 비생산성(PCD) 결정.
PDL을 증대기(7일 전 내지 0일째) 동안 계산하고 하기 식에 따라서 유가식 배양의 첫 번째 이틀 동안 계산하였다.
PDL = [1 / log10 (2)] × log10 (TCDt / VCDt-1) + PDLt-1
TCDt = 시간t 에서 총 세포 밀도이고 VCDt-1 = 시간t-1에서 생균 밀도이다.
IVC(106 세포수.일/mL)를 하기 식에 따라서 유가식 배양 동안 계산하였다:
IVCt = IVCt-1 + (VCDt + VCDt-1) / 2 × Δt,
여기서 IVCt = 시간t 에서 IVC, IVCt-1 = 이전의 세포 계수(counting)에서 IVC(IVC 0 = 초기 IVC = 유가식 접종의 세포 밀도), VCDt = 시간t에서 생균 밀도, VCDt-1 = 시간 t-1에서 생균 밀도이고, Δt = 시간 t와 t-1의 차이이다.
유가식 공정 동안 생산된 mAb의 역가 정량화를 단백질 A 센서(Protein A sensors)를 사용하는 옥텟 KQe(Octet KQe) (포르테바이오(ForteBio))로 수행하였다. 각 샘플을 희석 버퍼(PBS pH = 7.4, BSA 0.1 g/L, 1%의 트윈 20)에서 20x로 희석하였다. 재생 버퍼는 글리신 2M이었고 중화 버퍼는 상기 희석 버퍼이었다.
비생산성(pg/세포수.일 단위의 PCD)을 하기 식에 따라서 계산하였다:
PCDt = 역가t / IVCt.
데이터 분석
스프레드시트 분석
데이터를 스프레드시트로 컴파일링 하고 상이한 배지 블렌딩 조건들을 공정 성능을 향상시키는 그들의 잠재력에 따라서 스코어링 및 등위매기기를 하였다. 먼저, 향상 대 대조군의 백분율로서 정의된, 각 산출(IVC, 생존력, 역가, PDL)에 대해 향상 스코어를 결정하였다. 그런 뒤 최대 역가 스코어에 대하여 이전에 표준화된(역가가 다른 산출들에 비하여 더 높은 향상 백분율을 나타냈기 때문에 표준화를 최대 역가에 대하여 수행하였다) 개별 스코어들을 첨가하여 각 조건들에 대해 글로벌 스코어(global score)를 계산하였다. 모든 블렌딩 조건들의 등위 글로벌 스코어들은 최고의 배합물의 결정을 가능케 하였다. 글로벌 스코어 0을 가지는 이러한 조건들에 대해, 등위는 역가의 양에 기초하였다.
디자인 엑스퍼트에 의한 분석.
각 하나에 대해 각 시간 지점에서 감소된 2차 혼합 모델(reduced quadratic mixture models)을 발생시키는 각 산출(주로 PDL, IVC, 및 역가)을 분석하는데 디자인 엑스퍼트 소프트웨어(V8.1, StatEase)를 사용하였다. 각 모델의 분산 분석(ANOVA)은 PDL, IVC 및 역가에 대해 현저한 영향을 가지는 주 인자들(핵심 배합물)을 나타낸다. 제곱근 변환을 역가 및 IVC에 대해 적용하였으며 멱변환(power transformation)을 PDL에 적용하여 그들의 모델들을 향상시켰다. 그런 뒤 모델들을 사용하여 성장 및 생산 모두를 최대화시키는 16개의 배합물로부터 최고의 혼합물들을 예측하였다. “평균 최고” 혼합물을 고안하였다.
SIMCA-P++에 의한 분석.
분석은 MVA에 기초하고 SIMCA-P++ 소프트웨어(V12, U-메트릭스(U-Metrics))를 사용하였다. PLS 회귀를 각 산출에 대해 수행하여 핵심 성분들을 확인하기 위해 각 성분들의 효과를 연구하였다. MVA의 성분들간의 가능한 연관을 탐지하기 위해, 연관 매트릭스를 이끌서 냈고 연관 인자들을 결정하였다. 연관 인자가 0.8을 넘으면 연관이 강한 것으로, 0.6과 0.8 사이이면 연관이 중간인 것으로, 0.6 미만이면 연관이 무시할만한 것으로 고려하였다.
결과
일반론들
블렌드를 세포 증대기 및 유가식 생산기 모두에서 시험하였고, 확인된 최고의 생산 배지는 또한 증대 배지로서 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. 결과 데이터를 세 가지 접근법, 세포 성장 및 생산성을 향상시키는 그들의 잠재력에 기초한 배지 블렌드의 스코어링 및 등위매기기, 및 디자인 엑스퍼트 및 다변량 분석(MVA)를 사용하는 두 개의 통계학적 접근법에 의하여 분석하였다. 도 1은 유가식 세포 배양 공정의 배지 개발을 위한 고-처리량 배지 블렌딩 방법을 도시한다. 16 개의 배지 배합물을 47개의 성분들 중 43개로부터 고안하였다. 맞춤-제작 혼합물 DoE에 따른 배지 블렌딩은 376 개의 상이한 블렌드를 야기하였고 이를 유가식에서 세포 배양 성능에 대해 96-딥웰 플레이트(DWP)내에서 평가하였다. 데이터를 먼저 실험적으로 분석하였고, 그런 뒤 통계학적 방법론들로 분석하였다.
블렌딩 방법의 강건성을 유사한 조건들에서 전체 블렌딩 실험을 반복하는 것으로 확인하였다. 이러한 연구는 도 2에 나타난 바와 같이, 18 주 동안 유가식 공정의 개발 및 최적화를 가능케 하는 첫 번째 글로벌 세-단계 전략을 표시한다.
첫 단계에서는 피드를 일정하게 유지하면서 기본 배지가 최적화 된다. 그 다음 단계에서는, 첫 단계 동안 확인된 배지 후보들이 일정한 숫자의 피드 배합물로부터 발생된 피드 블렌드의 패널과 조합하여 실험의 2번째 라운드에서 시험된다. 세 번째 단계는 핵심 배지를 최적화하는 것으로 구성된다.
배지 배합물 고안 및 제조.
산업적 유가식 공정을 위해 고안된 제1-세대 독점권이 부여된 배지 배합물은 배지 블렌딩에 의해 더욱 향상되었다. 이러한 실험의 목표는 47개의 성분들 중 43 개의 농도를 최적화하는 것이었다. 4개의 남은 성분들 중에서, 글루코스 및 NaHCO3를 일정하게 유지하였고, 반면 NaCl 및 NaOH를 각각 몰삼투압농도 및 pH 조정을 위해 사용하였다. 43 개의 성분들로 16개의 배지 배합물을 고안하였다(하기 표 1 참조). 각 성분에 대해, 세 개의 수준을 선택하였다(저 = 0, 중 = 1 및 고 = 2). 상기 성분들 및 그들의 시험 범위를 표 1에 제시한다. 각 수준에 대한 성분 농도를 선택하기 위해, 농축된 독점권이 부여된 배지(0.25 내지 3X)로 예비적인 세포 배양 실험을 수행하였고, 세포 성장 및 역가를 측정하였다. 이러한 실험적 데이터뿐만 아니라 문헌으로부터의 과학적 지식 및 1x의 독점권이 부여된 배지 배합물에서 성분 농도에 기초하여 세 개의 수준에 대응하는 농도를 선택하였다. 수준 1을 대부분의 성분들에 대한 제1-세대 독점권이 부여된 배지(대조군 1)에서 발견되는 농도들에 근접하게 하였고, 수준 1의 모든 성분들을 가지는 F2를 제2 대조군(대조군 2)으로 고려하였다. 이러한 대조군들을 수행하여 실험 및 플레이트-투-플레이트 변동성을 평가하였다. 모든 성분들을 동일한 수준(각각 0, 1 및 2)으로 가지는 첫 번째 세 개의 배합물을 제외하고, 각 배합물을 각 성분 수준에 대하여 무작위하게 고안하였다.
16 개의 배합물 중 80개의 무작위 고안들을 발생시켰고, 성분들간의 연관들을 평가하였다. 실험의 고안 공간을 최대화 하기 위해 이러한 연관들을 최고로 최소화하는 고안을 선택하였다.
딥웰 플레이트들에서 공정 성능.
16개 배합물의 혼합 및 고안은 376개의 상이한 배지 블렌드를 야기하였고 이를 mAb를 생산하는 CHO 세포들을 함유하는 96-딥웰 플레이트들(DWP) 내로 로봇 플랫폼을 사용하여 첨가하였다. 396개의 웰(376개의 배지 블렌드 및 20개의 대조군) 중 일부에서 배지 블렌딩 혼합물의 예시는 표 3에 제공된다.
혼합물들을 세포 증대기 및 유가식 생산기 모두에서 시험하였다. 도 3은 집단배가수(PDL), 세포 성장, 생존력, 적분 생균 밀도(IVC), 및 역가의 측면에서 376개의 상이한 배지 블렌드 (회색 라인) 및 20 개의 대조군(검은색 파선 라인: 대조군 1, 검은색 실선 라인: 대조군 2)으로 수득된 공정 성능을 나타낸다. 생균 밀도 및 생존력에 대한 7일 전으로부터 14일째의 데이터, pDL에 대한 7일 전으로부터 2일째의 데이터 및 IVC 및 역가에 대한 0일째로부터 14일째의 데이터이다. 모든 산출들은 시험 조건들에 따라서 넓은 범위의 결과를 나타내었다. 증대기 동안, 일부 배지 블렌드는 PDL 데이터에 나타낸 바와 같이 세포 성장률을 20% 증가시키는 것이 가능하였고, 대조군들에서 24시간에서 20시간으로 배가시간이 감소하였다(데이터 나타내지 않음). 이를 생산기 동안, 20%까지의 IVC 향상, 156(대조군에 대해)으로부터 190x106 세포수.일/mL(최고 조건에 대해)까지로 확인하였다.
여러 조건들이 성장 또는 유도된 중요한 세포 응집(cell aggregation)을 가능케 하지 않았다. 성장 없음(no growth)에서부터 23.7 x 106 세포수/mL(대조군은 18.0 x 106 세포수/mL)까지 성장 프로파일에서 큰 변동이 관찰되었다. 약 50개의 조건들이 세포 성장을 향상시켰다면, 오직 10 개만이 수거시에 동등 또는 증가된 세포 생존력을 나타내었다. 이는 향상된 성장으로부터 야기되는 신규한 영양 제한, 및 모든 조건들에 적용된 동일한 피드 요법(feed regimen)에 기인한 것일지 모른다. 역가에 대하여, 대략 3.7 g/L의 최대 역가로 40%까지의 향상이 관찰되었다. 대조군 2(모든 성분들을 수준 1로 가지는 F2)는 대조군 1과 비교하여 현저하고 강건한 역가 향상(대략 13%)을 나타내었다.
데이터 분석 공정.
상기 배지 블렌딩 실험으로부터 수득한 거대한 데이터 세트에서 최고의 산출을 얻기 위해, 도 4에 나타낸 바와 같이 세 개의 옵션을 선택하였다. 각 산출 대 대조군에 대한 향상 스코어, 각 혼합물에 대한 글로벌 스코어 및 최고의 조건들을 선택하기 위한 등위를 결정하는 것으로 첫 번째 수준의 분석을 엑셀에서 수행하였다. 두 번째 수준의 분석을 디자인 엑스퍼트를 사용하여 수행하였고, 각 산출을 모델링하여 최고의 배합물을 예측하였다. 세 번째 수준의 분석을 SIMCA-p++를 사용하여 다중변량 분석으로 수행하고 핵심 성분들을 확인하였다.
스프레드시트 상의 각 조건에 대한 개별적인 산출(생균 밀도, 역가, IVC, PDL, 생존력)의 데이터를 분석하는 것인 첫 번째 접근법의 예시를 표 4에 제시하였다. 이러한 표는 몇몇 블렌딩 실험 조건들(표 3에 기재됨)에 대해 수득된 공정 성능 데이터, 및 각 산출에 대해 계산된 향상 스코어 및 글로벌 스코어 및 각 조건에 대한 등위를 나타낸다. 이러한 접근법은 가장 유망한 조건들을 선택하는 신속한 방법을 나타낸다.
다른 두 개의 접근법은 더 심도 깊은 데이터 분석을 가능하게 하는 통계학적 도구들을 사용하였다. 세포 성장 및 역가 모두를 최대화하는 최고의 혼합물들의 예측을 디자인 엑스퍼트 소프트웨어를 사용하여 수득하였다. 각 산출을 상이한 배합물 혼합물들에 대해 모델링하였다. 주 효과 및 첫 번째 수준의 상호작용을 ANOVA에 의해 평가하였다. 실험적 값들과 모델로부터의 예측들간의 좋은 연관이 2일째에서 PDL, 14일째에서 IVC(x106 세포수.일/mL) 및 역가(mg/L)에 대해 0.7 및 0.8 사이의 예측된-R2 및 대략 0.9의 R2(도 5A)로 수득되었고, 이는 최고의 혼합물 예측을 가능하게 하였다. 도 5B는 5 개의 예측된 최고의 배지의 평균을 대표하는 6번째 배지에 더하여, 16개의 배합물에 기초하고 최종 PDL, IVC 및 역가를 최대화하는 5 개의 예측된 최고의 배지의 조성물을 나타낸다. 도 5C는 5 개의 최고의 예측 및 이러한 5 개의 최고의 예측의 평균에 대한 PDL, IVC 및 역가에 대한 예측된 값들을 나타낸다.
MVA에 기초한 세 번째 수준의 분석은 SIMCA-P++ 소프트웨어를 사용하였다. 모델을 부분 최소 자승(PLS) 회귀분석을 사용하여 역가에 대해 생성하였다. 평가된 인자들의 개수와 비교하여 낮은 숫자의 시험된 조건들과 관련해서 상대적으로 좋은 모델을 생성하기 위해 세 개의 성분들을 사용하였다. 3 번째 성분에 대한 R2(모델이 실험적 데이터에 얼마나 잘 맞는지에 대한 지표) 및 Q2(모델 예측 능력의 추정치)은 각각 0.514 및 0.438이었다. 도 6A는 PLS 회귀분석에 의하여 결정된 14일째에서 역가에 대한 개별적인 성분들의 영향을 나타낸다. 구연산 제2철 암모늄, 판토텐산 및 발린은 역가에 대해 강한 긍정적인 효과를 가지는 성분들 중에서 나타났으며, 반면 세린, 비오틴 및 아르기닌은 부정적인 영향을 가지는 것들 중에 있었다. 역가에 대해 매우 긍정적인(구연산 제2철 암모늄; 그래프에서 "*"은 이상치를 표시한다), 매우 부정적인(비오틴) 또는 중간(이소루이신)의 효과를 가지는 3 개의 성분들의 산점도(Scatter plots)를 도 6B에 나타낸다. 구연산 제2철 암모늄은 낮은 농도(1 mg/L에서 1 g/L 미만의 역가)에서 불량한 성능을 나타내었으나, 역가가 증가하여 5 mg/L에서 대략 3 g/L로 안정되었다. 최고의 결과를 7.5와 10 mg/L 사이에서 수득하였다. 역가는 0.8 및 4μM 사이의 비오틴 농도에 의해 실질적으로 영향받지 않았으나, 더 높은 농도에서는 감소하였다. 한편, 이소루이신은 1 및 6 mM 사이에서 역가에 명확한 영향을 가지지 않았다. 잠재적으로, 현저하게 긍정적인 또는 부정적인 영향을 가지는 추가적인 성분들이 존재할 수 있을 것이다.
특정한 샘플들 사이에 존재하는 연관 때문에, PLS 분석은 단독으로 모든 성분들에 대해 확실히 효과가 있다고 생각할 수는 없을 것이다. 이를 평가하기 위해, 연관 매트릭스를 이끌어 냈다(데이터는 나타내지 않음). 두 쌍의 인자들로서, 메티오닌 대 아스파라긴 및 푸트레신 대 글루탐산에 대해서 높은 연관이 관찰되었다. 추가 최적화를 위한 후보 성분들을 두 개의 기준, 모델에 영향을 미치는 그들의 경향 및 시험에서 다른 중요한 인자들에 대한 그들의 연관을 기초로 선택하였다. 이러한 기준에 기초하여 총 13 개의 인자들이 제안될 수 있다. 모델에 영향을 미치는 인자들은 구연산 제2철 암모늄, 판토텐산, 발린, 메티오닌, 아르기닌, 비오틴 및 세린이고, 반면 MVA에서 중요한 인자와 연관된 인자들은 아스파르트산, 아스파라긴, 황산 제2구리, 시스테인, 비타민 B12 및 아셀렌산 나트륨(MVA에서 중요한 인자와 연관된 인자와 연관된다)이다. 예를 들어, DoE 접근법을 사용하는 이러한 인자들의 추가 최적화는 잠재적으로 향상된 성능을 가지는 배지 배합물들의 확인을 야기해야 한다.
배지 블렌딩 방법의 강건성.
상기 방법의 강건성을 평가하기 위해, 유사한 조건들 하에서 배지 블렌드로 실험을 반복하였다. 도 7A는 첫 번째 및 두 번째 블렌딩 실험에서 5 개의 플레이트 각각에 대한 14일째의 최종 역가 분포를 나타낸다. 전체적으로, 역가 분포는 두 실험의 모든 플레이트에 대해 필적하였고; 오직 첫 번째 실험의 플레이트 4만이 낮은 역가를 나타내었으며, 이는 잘못된 희석 또는 잘못된 피페팅(pipetting)과 같은 기술적 문제와 관계되었을 수 있다. 그럼에도, 도 7B에 나타난 바와 같이, 첫 번째 실험으로부터 얻어진 역가 및 IVC에 대해 수득된 최고의 20개 조건들을 고려하였을 때, 18개는 2 번째 실험에서 수득된 데이터와 근접하게 연관되어 있고, R2는 IVC 및 역가 모두에 대해 대략 0.7 이었다(빈 원들은 376개의 시험된 조건들을 표시하고 검정색 부호는 첫 번째 실험에서 역가에 대한 최고의 20개 조건들을 표시하고; 원들은 매우 재생산가능한 18개의 조건들을 표시하나 사각형 및 삼각형은 재생산성이 부족한 두 개의 조건을 표시한다). 이는 최고의 성능 조건들에 대한 블렌딩 방법의 강건성을 증명한다. 더 많은 변동들은 더 낮은 성능을 유도하는 조건들로서, 세포 군집(clumping), 대사 인자들 또는 물리적 파라미터들과 관련된 것에 대해 관찰되었다. 최고의 성능 배지 배합물의 확인 이후의 단계는 이들을 더 큰 규모에서 시험하여 예측가능성을 확인하는 것이다.
학술 논문 또는 초록, 특허 출원 또는 임의의 다른 문헌들을 포함하는 본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 인용된 문헌들에 존재하는 모든 데이터, 표, 도면 및 본문을 포함하는 그들의 전체가 참고로서 본 명세서에 도입된다. 더불어, 본 명세서에 인용된 문헌들 내에서 인용된 문헌들의 전체 내용은 또한 본 명세서에 전체적으로 참고로서 도입된다.
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표 1. 배지 배합물 고안: 이 매트릭스는 43 개의 성분들(C1-C43)으로 고안된 16 개의 배지 배합물(F1-F16)을 나타낸다. 값 0(저), 1(중), 및 2(고)는 각 성분의 상대적인 농도를 표시하며 모든 성분들을 동일한 수준으로 가지는 F1, F2 및 F3을 제외한 각 배합물을 각 성분 수준에 대하여 무작위로 고안하였다.
Figure 112020087943838-pat00001
표 2. 시험된 성분 농도 범위: 47개의 배지 성분들 중에서 43개를 세 개의 수준, 수준 0(저), 수준 1(중) 및 수준 2(고)에서 시험하였다. 수준 1은 나타나지 않았으나 각 성분에 대한 수준 0 및 수준 2 사이의 중간 농도를 표시한다. 글루코스(6 g/L) 및 NaHCO3 (2 g/L)를 일정하게 유지하였고, 반면 NaCl 및 NaOH를 각각 몰삼투압농도 및 pH 조정을 위해 사용하였다.
Figure 112020087943838-pat00002
표 3. 블렌딩 혼합물들의 예시 - 16개의 배합물로부터 얻은 12개의 블렌딩 혼합물 배합비를 예시로서 나타내었다. 하나의 대조군(대조군 1: 독점권이 부여된 배지)를 런 3(run 3)에 나타내고 다른 대조군(대조군 2: F2 배합물: 각 성분의 중간점)을 런 95에 나타낸다.
Figure 112020087943838-pat00003
표 4. 공정 성능 데이터 및 스코어 및 등위의 예시 - 표 왼쪽 부분은 몇몇 376개의 블렌딩 혼합물들(블렌딩 혼합물 배합비에 대한 표 3 참조)로 인큐베이션한 세포들에 대한 14일째의 IVC, 생존력 및 역가 그리고 2일째의 PDL 데이터를 나타낸다. 표 오른쪽 부분은 IVC, 생존력, 역가 및 pDL 대 대조군(%로 표현됨)에 대한 개별적인 향상 스코어들, 각 블렌딩 혼합물에 대한 글로벌 스코어 (최대 역가 스코어 대 표준화된 개별적인 스코어들의 덧셈에 상응함), 및 글로벌 스코어에 기초한 등위를 나타낸다. *글로벌 스코어가 0인 조건들에 대해서는 역가의 양을 기초로 등위를 매긴다.
Figure 112020087943838-pat00004

Claims (11)

1.7 내지 10 mM의 NaH2PO4, 2 내지 9 mM의 L-루이신, 1 내지 6 mM의 L-리신, 0 내지 3 mM의 글리신, 0.4 내지 2 mM의 L-메티오닌, 1 내지 4 mM의 L-글루탐산, 0.5 내지 3 mM의 L-페닐알라닌, 0.7 내지 6 mM의 L-프롤린, 0.7 내지 6 mM의 L-트레오닌, 0.5 내지 2 mM의 L-트립토판, 1 내지 7 mM의 L-발린, 0.1 내지 1.5 mM의 황산 마그네슘, 0.1 내지 1.05 mM의 염화 칼슘, 0.07 내지 0.7 mM의 미오-이노시톨, 0.8 내지 4 mM의 피루브산 나트륨, 0.0008 내지 0.01 mM의 D-비오틴, 0.1 내지 1 mM의 염화 콜린, 3 내지 9 mM의 L-아스파라긴, 0.006 내지 0.04 mM의 엽산, 0.03 내지 0.15 mM의 나이아신아미드(B3), 0.015 내지 0.15 mM의 D-판토텐산 x 1/2칼슘, 1 내지 8 mM의 L-세린, 1 내지 10 mM의 염화 칼륨, 0.005 내지 0.05 mM의 피리독신, 0.8 내지 2.4 mM의 L-아스파르트산, 0.0003 내지 0.003 mM의 리보플라빈, 0.008 내지 0.04 mM의 티아민, 1 내지 10 mg/L의 구연산 제2철 암모늄, 0.0003 내지 0.004 mM의 비타민 B12, 0.008 내지 0.04 mM의 히포크산틴, 0.0015 내지 0.006 mM의 티미딘, 0.006 내지 0.03 mM의 푸트레신, 0.1 내지 0.5 mM의 에탄올아민, 0.004 내지 0.02 mM의 황산 아연, 0.00004 내지 0.0008 mM의 황산 제2구리, 0.5 내지 2.0 g/L의 플루로닉, 0.7 내지 3 mM의 L-티로신, 0.00001 내지 0.00006 mM의 아셀렌산 나트륨, 0 내지 3 mM의 L-알라닌, 1 내지 3 mM의 L-아르기닌, 1 내지 3 mM의 L-시스테인, 0.4 내지 3 mM의 L-히스티딘, 및 1 내지 6 mM의 L-이소루이신을 포함하는, CHO 세포용 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 글루코스, NaHCO3, NaCl, NaOH, 또는 그들의 조합을 더 포함하는, CHO 세포용 세포 배양 배지.
제2항에 있어서, 글루코스가 6 g/L의 농도이고, NaHCO3가 2 g/L의 농도인, CHO 세포용 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 몰삼투압농도가 300 내지 330 mOsm/kg의 범위인, CHO 세포용 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, pH가 6.0 내지 8.0의 범위인, CHO 세포용 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 글리신 또는 L-알라닌 또는 둘 다를 더 포함하는, CHO 세포용 세포 배양 배지.
제1항에 따른 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 성장시키는 것을 포함하는, 포유동물 세포를 배양하여 생성물을 수득하는 방법이며, 여기서 포유동물 세포가 CHO 세포인, 방법.
제1항에 따른 세포 배양 배지에서 재조합 CHO 세포주를 성장시키는 단계, 및
상기 세포 배양 배지로부터 상기 세포주에 의해 발현된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는, 단백질을 생산하는 방법.
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