KR101573972B1 - Ａｄａｍｔｓ 단백질 발현을 위한 세포 배양 배지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현에 유용한 배양 배지를 제공한다. ADAMTS 단백질의 발현 및 정제 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 배지 및 방법은 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질의 발현에 유용하다. 또한, 본 명세서에 제공된 방법에 따라 발현되어 정제되는, 특이적 활성이 높은 ADAMTS, 예를 들면, ADAMTS13 단백질 조성물이 제공된다.

Description

ＡＤＡＭＴＳ 단백질 발현을 위한 세포 배양 배지{CELL CULTURE MEDIUM FOR ADAMTS PROTEIN EXPRESSION}
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2009년 7월 31일자로 출원된 미국 가출원 제61/230,477호를 우선권으로 주장하며, 이는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
연방 지원 연구 또는 개발하에 이루어진 발명에 대한 권리에 대한 진술서
적용되지 않음
콤팩트 디스크로 제출된 "서열 리스팅(SEQUENCE LISTING)", 테이블 또는 컴퓨터 프로그램 리스팅 부록에 대한 참조
적용되지 않음
ADAMTS(트롬보스폰딘 타입 I 모티프가 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제) 단백질은 아연-의존성 촉매 도메인, 시스테인-풍부 도메인, 디신테그린-유사 도메인을 포함한, 수많은 보존된 도메인, 및 적어도 하나, 및 대부분의 경우에는 다중, 트롬보스폰딘 타입 I 반복체를 포함하는, 메탈로프로테이나제 그룹이다(검토를 위해, 참조: Nicholson et al., BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). 메탈로프로테이나제의 ADAM 및 MMP 그룹과 진화적으로 관련된 이들 단백질(Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31)은 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP)(Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), 결합조직 이상, 암, 염증(Nicholson et al.), 및 심각한 열대열 말라리아(Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349)를 포함한 수많은 질병 및 상태와 관련된 분비 효소이다. 이들 관련성으로 인하여, ADAMTS 효소는 수많은 병리학에 대한 잠재적인 치료학적 목적으로서 인식되어 왔다(참조: Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31). 따라서, 오염물(예: 바이러스, BSE, 및 Mycoplasma bacteria와 같은 병원체)이 없는, 높은 특이적 활성을 갖는 ADAMTS 단백질을 큰 수율로 제조하는 방법이 필요하다.
세포, 특히 진핵 세포 및 보다 특히는, 포유동물 세포의 배양을 위해, 세포의 효율적인 성장에, 그리고 생물학적 생성물, 특히 바이오약제, 예를 들면, 재조합 단백질, 항체, 바이러스, 바이러스 항원 및 바이러스-형 입자의 제조에 필요한 영양 물질을 제공하는 특별한 배양 배지를 사용할 일정한 필요성이 존재한다. 상기 생물학적 생성물의 효율적인 제조를 위해, 최대 생성물 수율을 수득하기 위한 단백질 발현 자체의 증가뿐만 아니라, 최적의 세포 밀도를 성취하는 것이 중요하다.
세포 배양 배지 제형은 소 태아 혈청(FCS), 몇 개의 동물 유래 단백질 및/또는 식물 또는 효모로부터 유래된 단백질 가수분해물뿐만 아니라, 소 기원의 단백질 가수분해물과 같은 한정되지 않은 성분을 포함하는, 일정 범위의 부가제로 보충하였다.
일반적으로, 혈청 또는 혈청 유래 물질, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린 또는 인슐린은 세포 배양물 및 이로부터 수득되는 생물학적 생성물을 오염시킬 수 있는 원치않는 제제를 포함할 수 있다. 더욱이, 인간 혈청 유래 부가제는 혈청을 통해 전달될 수 있는 간염 바이러스 및 HIV를 포함하는, 모든 공지된 바이러스에 대해 시험해야 한다. 더욱이, 소 혈청 및 이로부터 유래된 생성물은 BSE 오염의 위험을 갖는다. 또한, 모든 혈청 유래된 생성물은 알려지지 않은 물질에 의해 오염될 수 있다. 세포 배양물 중 인간 또는 동물 공급원으로부터 유래된 혈청 또는 단백질 부가제를 사용하는 경우에, 특히 세포가 인간 투여를 위한 약제 또는 백신의 제조시 사용된다면, 수많은 문제점(예: 상이한 배치의 조성에 있어서 다양한 특성 및 마이코플라즈마, 바이러스 또는 BSE에 의한 오염의 위험)이 존재한다.
따라서, 혈청 또는 다른 동물 단백질 화합물이 필요치 않은, 효율적인 숙주 시스템 및 배양 조건을 제공하는 많은 시도가 있어왔다.
상기 혈청 부재 배지는 식물 또는 효모로부터 유래된 단백질 추출물을 기본으로 하여 개발되었다. 예를 들면, 대두 가수분해물은 발효 공정에 유용한 것으로 알려져 있으며, 많은 까다로운 유기체, 효모 및 진균의 성장을 개선할 수 있다. WO 96/26266은 대두 밀의 파파익 분해물(papaic digest)이 탄수화물 및 질소의 공급원이며, 많은 성분들은 조직 배양에 사용될 수 있다고 기술하고 있다. Franek 등(Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692)은 한정된 대두 및 밀 가수분해물 펩티드 분획의 효과를 촉진하는 성장 및 생산성을 기술하고 있다.
WO 96/15231은 척추동물 세포 및 바이러스 제조 과정의 유도를 위해 합성 최소 필수 배지 및 효모 추출물로 구성된 혈청 부재 배지를 기술하고 있다. 벼 펩티드 및 효모 추출물과 이의 효소 분해물을 포함하는 기본 세포 배양 배지, 및/또는 동물 세포의 성장을 위한 식물 지질로 구성된 배지 제형이 WO 98/15614에 기술되어 있다. 재조합 세포의 배양을 위한 정제된 대두 가수분해물을 포함하는 배지가 WO 01/23527에 기술되어 있다. WO 00/03000은 대두 가수분해물 및 효모 추출물을 포함할 뿐만 아니라, 동물 단백질의 재조합 형태(예: 성장 인자)의 존재를 필요로 하는 배지를 기술하고 있다.
EP-A-0 481 791은 동물 공급원으로부터 분리된 단백질, 지질 및 탄수화물을 포함하지 않고, 재조합 인슐린 또는 인슐린 유사체, 1 내지 0.025% w/v 파파인 분해 대두 펩톤 및 푸트레신을 추가로 포함하는, 조작된 CHO 세포를 배양하기 위한 생화학적으로 규명된 배양 배지를 기술하고 있다. WO 98/08934는 가수분해된 대두 펩티드(1 내지 1000㎎/L), 0.01 내지 1㎎/L의 푸트레신과, 알부민, 페투인, 다양한 호르몬 및 다른 단백질을 포함한, 다양한 동물 유래 성분을 포함하는 혈청 부재 진핵 세포 배양물을 기술하고 있다. 이와 관련하여, 푸트레신은 또한 0.08㎎/L의 농도로 DMEM/Ham's F12와 같은 표준 배지에 포함되는 것으로 알려져 있음을 주지해야 한다.
그러나, 식물 및/또는 효모 가수분해물은 올리고펩티드 및 다른 공지되지 않은 성분과 오염물의 비한정된 혼합물이다. 더욱이, 시판중인 가수분해물의 lot 특성은 상당히 변화한다. 그 결과, 사용된 가수분해물의 lot의 함수("로트 대 로트 변이")로서 재조합 단백질 또는 바이러스 생성물의 제조시 커다란 변이(3 인자 이하의 변이)가 존재한다. 이러한 단점은 각 세포의 단백질 발현뿐만 아니라, 세포의 증식에 영향을 준다. US 2007/0212770은 재조합 단백질 바이오약제의 대규모 제조에 유용한 다양한 동물 단백질 부재 및 올리고펩티드 부재의, 화학적으로 규명된 배양 배지를 기술하고 있다.
한 ADAMTS 그룹 일원, ADAMTS13은 생체 내에서 큰 vWF 다합체의 분해에 대해 책임있는 작용, 잔기 Tyr 1605와 Met 1606 사이에 von Willebrand factor(vWF)를 절단한다. ADAMTS13 활성의 손실은 수많은 상태, 예를 들면, TTP(Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), 급성 및 만성 염증(Chauhan et al., J Exp Med. 2008 Sep 1;205(9):2065-74), 및 가장 최근에, 심각한 열대열 말라리아(Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349)와 관련되어 왔다.
혈전성 혈소판 감소성 자반병(TPP)은 다양한 정도의 조직 허혈 및 경색을 유발할 수 있는 혈전성 미세혈관병증, 혈소판 감소증 및 미세혈관 혈전증을 특징으로 하는 질환이다. 임상적으로, TTP 환자는 혈소판 감소증, 분열 적혈구(적혈구 단편) 및 락테이트 데하이드로게나제의 증가된 수준과 같은 증상에 의해 진단된다(참조: Moake J L. Thrombotic microangiopathies. N Engl J Med. 2002; 347:589-600; Moake J L. von Willebrand factor, ADAMTS13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. Semin Hematol. 2004; 41:4-14; Sadler J E, Moake J L, Miyata T, George J N. Recent advances in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004: 407-423; Sadler J E. New concepts in von Willebrand disease. Annu Rev Med. 2005; 56:173-191).
1982년에, Moake 등은 만성 재발 TTP가 있는 환자의 혈장에서 특이하게 큰 von Willebrand factor(UL-vWF) 다합체를 발견하였다(참조: Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435). 수득된 UL-vWF와 TTP 사이에 관련은 TTP로 고생하는 대부분의 환자가 vWF를 절단하는, ADAMTS13으로 오늘날 공지된, 혈장 메탈로프로테아제가 결핍되어 있다는 Furlan 등 및 Tsai와 Lian에 의한 독립적인 발견에 의해 지지된다(참조: Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Laemmle B. Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 1997; 89:3097-3103; Tsai H M, Sussman, I I, Ginsburg D, Lankhof H, Sixma J J, Nagel R L. Proteolytic cleavage of recombinant type 2A von Willebrand factor mutants R834W and R834Q: inhibition by doxycycline and by monoclonal antibody VP-1. Blood. 1997; 89:1954-1962; Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594).
ADAMTS13 프로테아제는 간에 의해 주로 생성되는 190kDa 글리코실화 단백질이다(참조: Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa K, Suzuki H, McMullen B, Chung D. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family. Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng X, Chung D, Takayama T K, Majerus E M, Sadler J E, Fujikawa K. Structure of von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13), a metalloprotease involved in thrombotic thrombocytopenic purpura. J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima K, Mimura N, Hirashima M, Maeda H, Hamamoto T, Nakagaki T, Nozaki C. A novel human metalloprotease synthesized in the liver and secreted into the blood: possibly, the von Willebrand factor-cleaving protease; J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; Gerritsen H E, Robles R, Lammle B, Furlan M. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease. Blood. 2001; 98:1654-1661).
ADAMTS13 유전자에서 돌연변이는 TTP를 유발하는 것으로 나타났다(참조: Levy G G, Nichols W C, Lian E C, Foroud T, McClintick J N, McGee B M, Yang A Y, Siemieniak D R, Stark K R, Gruppo R, Sarode R, Shurin S B, Chandrasekaran V, Stabler S P, Sabio H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg D, Tsai H M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494). 종종 ADAMTS-13 활성을 억제하는 자가항체에 의해 유발되는 특발성 TTP는 성인 및 청소년에서 유발되고, 환자의 11 내지 36%에서 규칙적인 간격으로 재발될 수 있는 보다 통상적인 질환이다(참조: Tsai H M, Lian E C. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1998; 339:1585-1594; Furlan M, Lammle B. Deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease in familial and acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. Baillieres Clin Haematol. 1998; 11:509-514).
비 중화 자가항체는 순환으로부터 청소를 유도함으로써 ADAMTS13 활성을 또한 억제할 수 있다(참조: Scheiflinger F, Knobl P, Trattner B, Plaimauer B, Mohr G, Dockal M, Dorner F, Rieger M. Nonneutralizing IgM and IgG antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS-13) in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 2003; 102:3241-3243). 건강한 성인에서 혈장 ADAMTS13 활성은 50 내지 178%의 범위이다(참조: Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433). 가족성 또는 후천성 TTP가 있는 대부분의 환자에서, 혈장 ADAMTS13 활성은 존재하지 않거나, 정상 활성의 5% 미만이다. 치료 없이, TTP에 대한 사망율은 90%를 초과하지만, 혈장 치료법은 약 20%로 사망율을 감소시킨다(참조: Moake J L. Thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126:1430-1433).
거대 핵세포 및 내피 세포에서 합성된 vWF는 초대형 vWF(UL-vWF)로서, 각각 혈소판 α-입자 및 Weibel-Palade 바디에 저장된다(참조: Moake J L, Rudy C K, Troll J H, Weinstein M J, Colannino N M, Azocar J, Seder R H, Hong S L, Deykin D. Unusually large plasma factor VIII:von Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med. 1982; 307:1432-1435; Wagner D D, Olmsted J B, Marder V J. Immunolocalization of von Willebrand protein in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells. J Cell Biol. 1982; 95:355-360; Wagner D D, Bonfanti R. von Willebrand factor and the endothelium. Mayo Clin Proc. 1991; 66:621-627; Sporn L A, Marder V J, Wagner D D. von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies binds more avidly to extracellular matrix than that secreted constitutively. Blood. 1987; 69:1531-1534; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Multimeric composition of endothelial cell-derived von Willebrand factor. Blood. 1989; 73:2074-2076). 내피 세포로부터 분비되는 경우에, 이들 UL-vWF 다합체는 순환시 ADAMTS13에 의해 vWF 분자 내의 특정 절단 부위에서 일련의 보다 작은 다합체로 절단된다(참조: Tsai H M, Nagel R L, Hatcher V B, Sussman, I I. Endothelial cell-derived high molecular weight von Willebrand factor is converted into the plasma multimer pattern by granulocyte proteases. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 158:980-985; Dent J A, Galbusera M, Ruggeri Z M. Heterogeneity of plasma von Willebrand factor multimers resulting from proteolysis of the constituent subunit. J Clin Invest. 1991; 88:774-782; Furlan M, Robles R, Affolter D, Meyer D, Baillod P, Lammle B. Triplet structure of von Willebrand factor reflects proteolytic degradation of high molecular weight multimers. Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90:7503-7507).
ADAMTS13은 성숙 vWF 서브유닛의 중심 A2 도메인의 Tyr842-Met843 결합에서 절단되며, 활성을 위해 아연 또는 칼슘을 필요로 한다(참조: Dent J A, Berkowitz S D, Ware J, Kasper C K, Ruggeri Z M. Identification of a cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA von Willebrand factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1990; 87:6306-6310). vWF는 전자 현미경에 의해 알 수 있는 바와 같이 "실덩이(ball-of-yarn)" 및 필라멘트 형태로 존재한다(참조: Slayter H, Loscalzo J, Bockenstedt P, Handin R I. Native conformation of human von Willebrand protein. Analysis by electron microscopy and quasi-elastic light scattering. J Biol. Chem. 1985; 260:8559-8563). 더욱이, 원자력 현미경으로 전단 응력에 노출 후 vWF가 정상 상태 및 폴딩(folding)되지 않은 필라멘트 상태에서 공모양 형태로 존재함이 확인된다(참조: Siedlecki C A, Lestini B J, Kottke-Marchant K K, Eppell S J, Wilson D L, Marchant R E. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 1996; 88:2939-2950). 이는 vWF 필라멘트의 한 끝이 표면에 결합된 경우에 생체 내에서 또한 일어날 수 있다.
TTP 환자의 트롬빈은 혈전증의 원인으로서 vWF-매개된 혈소판 응집을 제시하는, 피브린은 거의 없고 주로 vWF 및 혈소판으로 이루어진다(참조: Asada Y, Sumiyoshi A, Hayashi T, Suzumiya J, Kaketani K. Immunohistochemistry of vascular lesion in thrombotic thrombocytopenic purpura, with special reference to factor VIII related antigen. Thromb Res. 1985; 38:469-479). 재발 TTP가 있는 환자는 혈장에 초거대 다합체를 갖는다. UL-vWF 다합체는 억제제(항-ADAMTS13 Ab)의 지속성이 ADAMTS13 활성을 감소시키기 때문에, 시간이 경과함에 따라 누적된다. UL-vWF 다합체는 혈소판 응집을 유발하는 전단 응력의 결과로서 과다활동성이고 폴딩되어 있지 않음으로써, 혈관 내 혈전을 유발한다(참조: Tsai H M. Von Willebrand factor, ADAMTS13, and thrombotic thrombocytopenic purpura. J Mol Med. 2002; 80:639-647; Tsai H M. Deficiency of ADAMTS-13 in thrombotic and thrombocytopenic purpura. J Thromb Haemost. 2003; 1:2038-2040; discussion 2040-2035).
ADAMTS13 결핍으로 인해 혈장 내 과다 활동성 UL-vWF 다합체의 존재는 관상 심장 질환과 관련된 동맥 혈전의 증가된 위험과 관련될 수 있는 것으로 여겨진다.
ADAMTS 단백질이 수많은 질환 및 상태에 관련되어 왔기 때문에, 약제학적 제형 및 투여에 적합한, 높은 특이적 활성을 갖는 재조합 ADAMTS 단백질의 대규모 제조 방법에 대한 필요성이 당해 분야에 존재한다. 본 발명은 ADAMTS 단백질의 제조 및 정제를 위해 당해 분야에서 이들 및 다른 요구를 만족하는 방법들을 제공한다.
발명의 간단한 요약
한 측면에 있어서, 본 발명은 트롬보스폰딘 모티프(ADAMTS)가 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS) 단백질의 발현 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 유용하게 증가된 발현 수준 및 실질적으로 개선된 활성을 갖는 ADAMTS 단백질의 제조를 유발한다. 이들 개선된 특성은 한 예로, ADAMTS 단백질의 발현을 위해 사용되는 배양 배지를 증가된 수준의 다양한 성분(예: 칼슘, 아연 또는 니코틴아미드(비타민 B3))으로 보충하여 성취할 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13 단백질이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 배치식(batch), 첨가식(fed-batch) 또는 연속식 세포-배양 조건하에 동물 단백질 부재 및 화학적으로 규명된 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 재조합 세포를 배양시킴으로써 ADAMTS 단백질의 발현 및/또는 활성 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이들 방법은 세포 현탁 또는 세포 부착 형태로 수행할 수 있는 배치식, 첨가식, 관류 또는 케모스태트(chemostat) 세포 배양의 사용을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13 단백질이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 ADAMTS 단백질의 정제 도중 활성 손실량을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 정제 완충액을 부가 수준의 칼슘 및/또는 아연으로 보충시킴을 포함한다. 특별한 구체예에서, 상기 방법은 정제 도중 사용된 한외여과 및/또는 정용여과(diafiltration) 단계 도중 ADAMTS 단백질의 활성의 안정화에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13 단백질이다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 약제학적 조성물의 제조시 사용하기 위한 증가된 활성을 갖는 ADAMTS 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 이들 방법은 증가된 활성을 갖는 ADAMTS 단백질의 증가된 발현에 적합한 조건하에 동물 단백질 부재 및 화학적으로 규명된 배양 배지의 사용을 포함한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13 단백질이다.
관련 측면에 있어서, 본 발명은 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질의 발현에 유용한 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 및 화학적으로 규명된 배지를 제공한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13 단백질이다.
도 1. 온도 및 pH 조건을 변화시키면서 동물 단백질 부재 배지에서 배양시킨 CHO 세포에서 발현되는 재조합 인간 ADAMTS13의 용적 FRETS-vWF73 생산성. 다양한 세포-배양 실험의 결과는 배양 온도 및 pH의 함수로서 정규화된 용적 ADAMTS13 FRETS-VWF73 생산성의 (a) 등고선 지도(contour plot) 및 (b) 표면 플롯 표시로서 제시되었다.
도 2. 온도 및 pH 조건을 변화시키면서 동물 단백질 부재 배지에서 배양시킨 재조합 인간 ADAMTS13을 발현시키는 CHO 세포의 특이적 활성 수준(FRETS-VWF73/ELISA에 의한 항원). 다양한 세포-배양 실험의 결과는 배양 온도 및 pH의 함수로서 특이적 활성의 (a) 등고선 지도 및 (b) 표면 플롯 표시로서 제시되었다.
발명의 상세한 설명
I. 서론
ADAMTS 단백질(즉, ADAMTS-1 내지 ADAMTS-20)은 통상적인 모듈러 도메인 조직화를 공유하는 분비된 아연 메탈로프로테이나제 그룹이다(검토를 위해, 참조: Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan 1;11:544-69). 모든 ADAMTS 단백질은 단일 펩티드로 이루어진 통상적인 코어 도메인 구조에 이어서, 프로도메인, 아연-의존성 메탈로프로테이나제 촉매 도메인, 디신테그린-유사 도메인, 트롬보스폰딘 타입 I 반복체, 시스테인-풍부 도메인 및 스페이서 도메인을 공유한다(참조: Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):31493-7). 또한, ADAMTS-4를 제외한 모두는 적어도 하나 이상의 트롬보스폰딘 타입 I 반복체 도메인을 함유하며, 많은 ADAMTS 단백질은 하나 이상의 부가 보조 도메인을 함유한다. 주목할 만하게, 모든 ADAMTS 단백질은 메탈로프로테이나제 촉매 도메인 내에 위치한 적어도 하나의 칼슘 결합 부위 및 적어도 하나의 아연 결합 부위를 함유하는 것으로 나타난다고 보고되었다(참조: Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), pp 881-888).
ADAMTS 단백질에 대한 생물학적 역할은 항혈관 생성, 신장 사이질 섬유증, 뼈 재형성, 난소 난포 발달, 아테롬성 경화증, 비뇨생식 발달 및 종양 성장/재형성(ADAMTS-1); 제7C형 엘러스-단로스 증후군(Ehler-Danlos syndrome type 7C) 및 보빈 더마토프락시스(Bovine dermatopraxis)(ADAMTS-2); 관절염, 아테롬성 경화증 및 건증(ADAMTS-4); 관절염 및 교모세포종(ADAMTS-5); 관절염(ADAMTS-7); 항혈관 생성, 뇌 악성종양, 관절염 및 아테롬성 경화증(ADAMTS-8); 관절염(ADAMTS-9, -12); 혈전성 혈소판 감소성 자반병(ADAMTS-13); 및 항혈전증/졸증(ADAMTS18)을 포함한, 다양한 질환 및 상태에 대해 보고되었다(검토를 위해, 참조: Lin and Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131).
재조합 ADAMTS13 (A13)은 앞서 포유동물 세포에서 발현되었지만, 특이적 활성은 세포 배양 조건에 따라 광범위하게 변한다. 많은 시판중인 배양 배지는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 항원 성분에 대한 FRETS-VWF73 검정법으로 측정되는 활성 비로서 표현되는, 특이적 활성이 높은 A13의 발현을 위해 충분치 않은 것으로 밝혀졌다. 한 측면에 있어서, 본 명세서에 제공된 방법은 증가된 수준의 전체 및 특이적 활성을 갖는 A13의 세포-배양 발현을 허용하는 몇몇 유용한 발견을 기본으로 한다.
본 명세서에 기술된 연구는 배양 배지 중 칼슘의 특정 최소 농도, 약 0.5 내지 약 1.5mM이 활성 A13의 발현을 위해 필요하다고 설명하였다. 또한, 배양 배지를 증가된 수준의 아연으로 보충함으로써, 생성된 발현 A13 단백질은 보다 높은 전체 및 특이적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 표준 화학적으로 규명된 배지(예: DMEM/F12 기본 배지)에서 발견되는 농도에 비하여, 정상 농도의 2 내지 3배인 부가의 아연으로 보충된 배양물에서, A13의 특이적 활성은 상당히 증가된다. 더욱이, A13의 특이적 활성의 부가 증가는 니코틴아미드(비타민 B3) 농도를 표준 DMEM/F12 기본 배지에서와 같이, 약 2㎎/L로부터 약 7㎎/L로 증가시켜 성취할 수 있다. 재조합 CHO 또는 HEK293 세포를 부가의 칼슘, 아연 및/또는 니코틴아미드로 보충시킨 배지에서 배양시킴으로써, 적어도 약 500mU/㎍, 1000mU/㎍, 약 2000mU/㎍ 이하의 특이적 활성이 재조합 인간 A13의 대규모 발현 배양물에서 성취될 수 있다. 재조합적으로 생성된 A13 단백질의 특이적 활성의 이들 수준은 이전에 보고되지 않았었다. 유용하게, 이들 증가된 A13 활성 수준은 동물 유래 성분이 없는 화학적으로 규명된 배지에서 성취됨으로써, 약제학적 제형을 위한 단백질의 제조에 적합한 일관되고 재생가능한 ADAMTS 단백질의 발현을 대규모로 허용할 수 있다. 더욱이, 이들 배지는 심지어 재조합 단백질(예: 인슐린)을 함유하지 않음으로써, 약제학적 투여를 위한 제형에 보다 안전하게 사용될 수 있는 생성물을 생성한다.
본 기술은 또한 표준 한외/정용여과 및 다른 정제 단계 도중 활성 및 특이적 활성의 손실을 방지하는 방법을 제공한다. 유용하게, 정용여과에 사용되는 완충액을 부가의 칼슘 및 아연으로 보충함으로써, FRETS-VWF73 검정법에 의해 측정되는 바와 같이, A13 활성의 손실에 상당한 감소가 성취될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 분비된 메탈로프로테이나제의 ADAMTS 그룹 간의 공유 구조-기능 관계로 인하여, 본 발명에 의해 제공되는 방법은 세포 배양물에서 모든 ADAMTS 단백질의 발현 및 세포 배지로부터의 회수를 허용한다.
II. 정의
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비타민 B3", "니코틴아미드", "니아신아미드", "니아신" 및 "니코틴산"은 비타민 B3 그룹의 일원을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 이 그룹의 일원은 본 발명의 방법에 사용되는 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "ADAMTS 단백질"은 메탈로프로테이나제의 트롬보스폰딘 타입 I 모티프 그룹을 갖는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제의 폴리펩티드를 의미한다. 이 그룹의 일원은 인간 단백질 ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS12 (NM_030955), ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (NM_139057), ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638), 및 ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851)을 포함한다. ADAMTS 단백질은 적어도 부분적인 생물학적 활성, 예를 들면, 전체 단백질에 의해 나타내는 활성, 특히 전체 단백질에 의해 나타내는 프로테아제 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 초과를 나타내는 전체 단백질 및 부분 폴리펩티드를 모두 포함한다. 어떤 경우에, ADAMTS 단백질은, 예를 들면, 효소 또는 화학적 방법에 의해 생체 내 또는 시험관 내에서 번역 후 변형될 것이다. 본 발명의 ADAMTS 단백질은 교호적으로 스플라이스된(spliced) 이소 형태, 보존적으로 변형된 단백질, 실질적으로 동일한 단백질 및 동족체 등을 포함하는 것으로 이해한다.
본 발명의 내용에 있어서, ADAMTS 단백질은, 예를 들면, 포유동물(예: 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 저빌(gerbil), 개, 고양이)로부터의 ADAMTS 그룹의 일원 및 이의 생물학적 활성 유도체를 포함한다. ADAMTS 단백질의 작용 단편 및 융합 단백질과 같은, 돌연변이 및 활성을 갖는 변이 ADAMTS 단백질이 또한 포함된다. 더욱이, 본 발명의 ADAMTS 단백질은 정제, 결실 또는 이들 모두를 용이하게 하는 태그(tag)를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 ADAMTS 단백질은 시험관 내 또는 생체 내에서 치료학적 잔기 또는 영상화에 적합한 잔기에 의해 추가로 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "ADAMTS13 단백질"은 ADAMTS13 활성, 특히 VWF의 잔기 Tyr-842 및 Met-843 사이에 펩티드 결합을 절단하는 능력을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 예시적 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 NP_620594 (ADAMTS13 이소 형태 1, 프리프로단백질)의 것 또는 NP_620594(ADAMTS13 이소 형태 1, 성숙 폴리펩티드)의 아미노산 75 내지 1427과 상당히 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 NP_620596 (ADAMTS13 이소 형태 2, 프리프로단백질)의 것 또는 NP_620594(ADAMTS13 이소 형태 2, 성숙 폴리펩티드)의 아미노산 75 내지 1371과 상당히 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 NP_620595 (ADAMTS13 이소 형태 3, 프리프로단백질)의 것 또는 NP_620595(ADAMTS13 이소 형태 1, 성숙 폴리펩티드)의 아미노산 75 내지 1340과 상당히 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, ADAMTS13 단백질은 vWF 절단 활성을 갖는 천연 변이체 및 vWF 절단 활성을 갖는 인공 작제물을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, ADAMTS13은 일부 기본 활성을 유지하는 천연 변이체, 대안 서열, 이소 형태 또는 성숙 단백질을 포함한다. 인간 집단에서 발견되는 ADAMTS13 돌연변이의 예는, 제한없이, R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W를 포함하며, 이들 중 많은 것은 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP)과 관련된 것으로 발견되었다. ADAMTS13 단백질은 또한 번역-후 변형을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, ADAMTS13은 잔기 614, 667 및 1354번에서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 의해 변형되는 것으로 나타났으며, 잔기 142, 146, 552, 579, 707, 828, 및 1235번이 또한 이 방식으로 변형될 수 있는 것으로 예상되었다.
단백질분해적으로 활성인 재조합 ADAMTS13은 Plaimauer 등의 문헌(2002, Blood. 15;100(10):3626-32) 및 US 2005/0266528에 기술된 바와 같이, 포유동물 세포 배양물에서 발현시켜 제조할 수 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다. ADAMTS13 발현 세포의 재조합 배양 방법은 Plaimauer B, Scheiflinger F.(Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):24-33, 이의 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다)에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "1유닛의 ADAMTS 활성"은 사용된 검정법과 무관하게, 풀링(pooled)된 정상 인간 혈장 1mL 중 활성의 양으로서 정의된다. 예를 들면, ADAMTS 단백질이 ADAMTS13인 경우에, 1유닛의 ADAMTS13 FRETS-VWF73 활성은 풀링된 정상 인간 혈장 1mL에 의해 절단되는 것과 동일한 양의 FRETS-VWF73 기질을 절단하는데 필요한 활성의 양이다 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr; 129(1):93-100). 편의상, ADAMTS13 활성은 기능 검정법, 예를 들면, ADAMTS13에 대한 기질로서 변형된 von Willebrand factor 펩티드를 사용하는 기능 검정법에 의해 측정할 수 있다(Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9): 1534-41). 재조합 인간 ADAMTS13 활성을 측정하는 바람직한 방법이 Gerritsen 등의 문헌(Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82: 1386- 1389)에 기술되어 있다. 한 구체예에서, 상기 정의한 바와 같은 ADAMTS13 단백질로서 고려하기 위하여, 폴리펩티드 또는 단백질은 본래 ADAMTS13의 vWF 절단 활성의 적어도 1%를 가져야 한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 본래 ADAMTS13 활성의 적어도 10%를 함유할 것이다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 본래 ADAMTS13 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 함유할 것이다. ADAMTS13 단백질의 양은 또한, 예를 들면, Rieger 등의 문헌(2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20)에 기술된 ELISA 방법을 사용하여 ADAMTS13 항원의 측정에 의해 결정할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "ADAMTS13 ㎍" 또는 "ADAMTS13 항원 ㎍"은 풀링된 정상 인간 혈장 1mL와 동일한 수준의 ELISA 검정법에 의해 감지할 수 있는 단백질을 제공하는 ADAMTS13의 양을 의미한다. 이는 정상 인간 혈장 1mL에 존재하는 ADAMTS13 1㎎의 공개된 측정치를 기본으로 하므로, 근사 측정치이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 유도체"는 ADAMTS 단백질의 내용에 사용되는 경우에, 재조합 DNA 기술을 통해 수득되는 폴리펩티드를 또한 포함한다. 이는 (i) 유전공학, 예를 들면, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통한 재조합 DNA의 제조, (ii) 형질감염에 의해, 즉 전기천공법 또는 미량 주입법을 통해 재조합 DNA를 전핵 또는 진핵 세포로 도입; (iii) 예를 들면, 연속식 또는 배치식 방법으로 상기 형질전환된 세포의 배양; (iv) 예를 들면, 구조적으로 또는 유도시 ADAMTS 단백질의 발현 및 (v) 예를 들면, (vi) 이온교환 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 등을 통해 실질적으로 정제된 재조합 ADAMTS 단백질을 수득하기 위하여, 예를 들면, 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포를 수확(harvest)함으로써 상기 ADAMTS 단백질의 분리를 위해 당해 분야에 공지된 방법을 포함할 수 있다. 용어 "생물학적 활성 유도체"는 또한 포유동물, 특히 인간의 순환계에서 ADAMTS 단백질의 생물학적/약물학적 특성, 예를 들면, 반감기를 개선하기 위하여, 제2 폴리펩티드(예: 면역글로불린 Fc 도메인 또는 알부민 도메인)와 함께, 키메릭(chimeric) 분자, 예를 들면, ADAMTS 단백질, 또는 이의 작용성 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "한외여과"는 수압이 반투과성 막에 대해 액체를 미는 다양한 막 여과법을 포함한다. 현탁된 고체 및 고분자량의 용질은 유지되는 반면에, 물 및 저분자량 용질은 막을 통해 통과된다. 이러한 분리 과정은 종종 거대분자(103 내지 106Da) 용액, 특히 단백질 용액의 정제 및 농축을 위해 사용된다. 수많은 한외여과 막은 이들이 보유한 분자의 크기에 따라 이용 가능하다. 한외여과는 통상 2㎚ 내지 0.05㎛의 막 기공 크기 및 1 내지 10bar의 작동 압력을 특징으로 하며, 특히 당 및 염과 같은 작은 분자로부터 단백질과 같은 콜로이드를 분리하는데 유용하다. 대조적으로, 나노여과는 통상 0.5 내지 2㎚의 막 기공 크기 및 5 내지 40bar의 작동 압력을 특징으로 하는 다른 압력-구동 여과법이다. 나노여과는 한편으로 당, 다른 유기 분자 및 다가 염 사이 및 다른 한편으론, 1가 염과 물 사이의 분리를 성취하기 위하여 빈번히 사용된다. 일반적으로, 한외여과는 전량 여과 방식(dead-end filtration mode) 또는 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration) 방식으로 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "정용여과(diafiltration)"는 종종 접선 유동 여과(TFF)로서 언급되는, 다른 막 여과법을 의미하며, 이때 액체는 한외여과 막의 표면을 따라 접선으로 펌핑된다. 통상적으로, 잔류물 액체는 막을 통과한 후 정용여과 완충액으로 희석시키고, 이어서 연속 유동 공정의 막으로 반송시킨다. 일반적으로, 정용여과는 전량 여과 방식 또는 접선 유동 여과(TFF) 방식으로 수행할 수 있다. 또한, 단일 시스템은, 예를 들면, 한외여과를 사용하여 샘플을 먼저 농축시킨 다음, 정용여과에 의해 완충액 교환을 수행하기 위하여, 한외여과 및 정용여과 모두의 작동을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리아민"은 탄소, 질소 및 수소로 구성되고, 둘 이상의 아미노 그룹을 함유하는 유기 화합물 그룹을 의미한다. 예를 들면, 상기 용어는 카다베린, 푸트레신, 아그마틴, 오르니틴, 스페르민 및 스페르미딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분자를 포함한다.
ADAMTS 단백질의 발현을 위해 사용되는 화학적으로 규명된 배양 배지의 특정 구체예에서, 폴리아민의 농도는 배지에 약 0.5 내지 약 30 mg/L, 또는 약 0.5 내지 약 20 mg/L, 또는 약 0.5 내지 약 10 mg/L, 또는 약 1 내지 약 10 mg/L, 또는 약 2 내지 약 10 mg/L, 또는 약 2 내지 약 8 mg/L, 또는 약 2 내지 약 5 mg/L의 범위인 농도로 존재한다. 한 특정 구체예에서, 폴리아민은 약 2 내지 약 8 mg/L의 농도인 푸트레신이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "화학적으로 규명된 배지(chemically defined medium)"는 모든 성분의 동정 및 농도가 공지된 합성 성장 배지를 의미한다. 화학적으로 규명된 배지는 이들이 개개 식물 또는 동물 유래 성분(예: 단백질, 폴리펩티드 등)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음에도 불구하고, 세균, 효모, 동물 또는 식물 추출물을 함유하지 않는다. 시판중인 화학적으로 규명된 배지의 비제한적 예는 다양한 EX-CELL® 배지(SAFC Biosciences, Inc), 다양한 Dulbecco's Modified Eagle's(DME) 배지(Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc) 및 Ham's 영양소 혼합물(Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc) 등을 포함한다. 화학적으로 규명된 배양 배지의 제조 방법은 당해 분야에, 예를 들면, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217, 및 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고펩티드 부재 배양 배지"는 올리고펩티드, 예를 들면, 단백질 가수분해물로부터 유래된 올리고펩티드를 포함하지 않는 단백질 부재 배지를 의미한다. 한 구체예에서, 배지는 20개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 본 발명의 한 구체예에서, 배지는 15개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 본 발명의 다른 구체예에서, 배지는 10개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 배지는 7개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 배지는 5개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 배지는 3개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 본 발명의 추가 구체예에 따르면, 배지는 2개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩티드를 포함하지 않는다. 올리고펩티드 부재 배양 배지의 제조 방법이 당해 분야에, 예를 들면, 미국 특허 제6,171,825 및 제6,936,441호, WO 2007/077217, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "혈청 부재 배양 배지"는 동물 혈청이 보충되지 않은 배양 배지를 의미한다. 종종 혈청 부재 배지가 화학적으로 규명된 배지임에도 불구하고, 혈청 부재 배지는 별도의 동물 또는 식물 단백질 또는 단백질 분획으로 보충할 수 있다. 혈청 부재 배양 배지의 제조 방법이 당해 분야, 예를 들면, 미국 특허 제6,171,825 및 제6,936,441호, WO 2007/077217, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "동물 단백질 부재 배양 배지"는 동물 혈청, 단백질 또는 단백질 분획이 보충되지 않은 배양 배지를 의미한다. 종종 동물 단백질 부재 배양 배지가 화학적으로 규명된 배지임에도 불구하고, 동물 단백질 부재 배양 배지는 식물 또는 효모 가수분해물을 함유할 수 있다. 동물 단백질 부재 배양 배지의 제조 방법이 당해 분야, 예를 들면, 미국 특허 제6,171,825 및 제6,936,441호, WO 2007/077217, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 특별한 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 원소를 갖는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 작제물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 프로모터에 기능적으로 결합된 전사되는 핵산을 포함한다.
용어 "이종(heterologus)"은 핵산의 일부에 대한 참조로 사용되는 경우에, 핵산이 본래 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들면, 새로운 작용성 핵산, 예를 들면, 한 공급원으로부터 프로모터 및 다른 공급원으로부터 암호화 부위를 제조하기 위하여 배열되는 관련없는 유전자로부터의 둘 이상의 서열을 갖는 핵산이 통상 재조합적으로 제조된다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 본래 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 서열을 포함함을 나타낸다(예: 융합 단백질).
"프로모터"는 핵산의 전사에 관여하는 핵산 조절 서열의 배열로서 정의된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 프로모터는, 예를 들면, 폴리머라제 II 타입 프로모터, TATA 원소의 경우에, 전사의 출발 지점 가까이에 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프모모터는 또한 선택적으로 전사의 출발 지점으로부터 몇천 개의 염기쌍만큼 많이 위치할 수 있는, 디스털 인핸서(distal enhancer) 또는 리프레서를 포함한다. "구성(constitutive)" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 상황하에 활성인 프로모터이다. "유도(inducible)" 프로모터는 환경 또는 발달 조절하에 활성인 프로모터이다. 용어 "기능적으로 결합된(operably linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 배열)과 제2 핵산 서열 사이에 작용성 결합을 의미하며, 이때 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 명시된 값으로부터 + 또는 -10%의 근사 범위를 나타낸다. 예를 들면, 용어 "약 20%"는 18 내지 22%의 범위를 포함한다.
III. ADAMTS 단백질 발현
한 측면에 있어서, 본 발명은 특이적 활성이 높은 트롬보스폰딘 모티프가 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS) 단백질의 발현 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로부터 선택된 적어도 하나의 성분이 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양함을 포함한다. 특정 구체예에서, ADAMTS 단백질은 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로부터 선택된 적어도 두 개의 성분이 보충된 배지에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된다. 특정 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현에 사용되는 배양 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지를 포함할 수 있다.
한 측면에 있어서, ADAMTS 단백질의 제조 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 상기 방법은 아연, 칼슘 및 니코틴아미드 중 적어도 하나로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시키는 단계; 배양물로부터 상청액의 분획을 제거하는 단계; 잔류 세포를 제거하기 위하여 원심분리 또는 여과 단계를 수행하는 단계; ADAMTS 단백질을 농축시키기 위해 한외여과 단계를 수행하는 단계; 및 적어도 칼슘 또는 아연을 포함하는 완충액으로 정용여과 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 칼슘의 농도는 적어도 약 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM, 0,75mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 5mM 또는 5mM 초과의 칼슘일 수 있다. 다른 구체예에서, 아연의 농도는 적어도 약 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM 또는 10μM 초과의 아연일 수 있다. 특정 구체예에서, 수확, 세포 부재 상청액 또는 정용여과 완충액은 상기 언급한 농도로 칼슘 및 아연의 혼합물을 함유한다. 특정 구체예에서, 한외여과 및/또는 정용여과 막의 컷 오프(cut off)는, 예를 들면, 약 150kD 또는 125kD 또는 100kD 또는 75kD 또는 50kD 또는 30kD 또는 10kD 또는 10kD 미만일 수 있다. 특정 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13 또는 이의 생물학적 활성 유도체이다. 특정 구체예에서, ADAMTS 단백질은 인간 ADAMTS13 단백질 또는 이의 생물학적 활성 유도체이다. 특정 구체예에서, 상기 방법에 사용되는 배양 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 이온교환 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 이루어진 그룹으로부터 선택된 정제 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구체예에서, 아연 보충은 아연을 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드 제제의 부가에 의해 제공될 수 있다. 예를 들면, 인슐린의 통상적인 제제는 약 1 내지 약 10㎎/L 인슐린에 의한 배지 보충으로 또한 Medscape 서버(server)에서 발견할 수 있는, Novolin N InnoLet SubQ, 재조합 인간 인슐린에 대한 상세한 모노그래프로부터 계산된 바와 같이, 약 0.03 내지 약 1.5μM 아연의 보충을 유발하는 농도로 아연을 함유한다. 따라서, 한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현에 사용되는 배양 배지는 아연-함유 인슐린 제제로 보충할 수 있다.
숙주 세포주를 배양하기 위해 선택된, 본 명세서에 기술된 바와 같이 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된, 기본 배지는 본 발명에 대해 제한적이지 않고, 포유동물 세포를 배양하는데 적합한 당해 분야에 공지된 것들 중 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다. Dulbecco's Modified Eagle 배지, Ham's F-12 배지, Eagle's Minimal Essential 배지 및 RPMI-1640 배지 등이 시판중이다. 성장 인자(예: 재조합 인슐린)의 부가는 선택이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키는 세포를 배양하기 위해 사용되는 기본 배지는 하나 이상의 시판중인 화학적으로 규명된 배지, 예를 들면, Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM) 및 Ham's F-12 배지의 혼합물을 포함할 수 있으며, 이는 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)가 아닌 다른 하나 이상의 성분으로 보충되었다. 시판중인 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있는 성분의 비제한적 예는 필수 아미노산(예: 글루타민), 비이온성 계면 활성제(예: Synperonic), 1차 아민(예: 에탄올아민), 폴리아민(예: 푸트레신), 미량 금속(예: 철) 및 완충제(예: 중탄산나트륨)를 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 표 1에 제공된 바와 같은 BCS 배지이다. 다른 특정 구체예에서, 배지는 BACD 배지, 예를 들면, BACD-A13 배지이다.
[표 1]
세포 배양 배지 BCS의 조성
Figure 112015036638747-pct00001

역사적으로, 동물 세포는 동물 혈청을 함유하는 배지에서 배양해 왔다. 그러나, 상기 배지는 불완전하게 정의되며, 감염의 위험을 갖는다. 따라서, 당해 분야의 것들은 재조합적으로 제조된 단백질을 완전히 포함하지 않거나, 이런 단백질을 적어도 포함하지 않는 "단백질 부재(protein-free)" 배지를 고안하였다. 인간 혈청 알부민은 재조합 단백질의 제조를 위해 혈청 부재 배양 보충물로서 통상 사용된다. 바람직한 배지는 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217 및 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 기술된 것을 포함한다.
선택적으로, 비-이온성 계면 활성제, 예를 들면, 폴리프로필렌 글리콜(예: Pluronic® F-61, Pluronic® F-68, Pluronic® F-71, Pluronic® F-108 또는 Synperonic®)을 소포제로서 배지에 가할 수 있다. 이 제제는 일반적으로 호기의 네가티브 효과("sparging)"로부터 세포를 보호하기 위하여 적용한다. 비이온성 계면 활성제의 양은 0.05 내지 10g/L, 바람직하게는 0.1 내지 5g/L의 범위일 수 있다.
US 제6,936,441호의 배지는 특히 CHO 세포의 배양에 아주 적합하지만, 또한 다른 세포와 함께 사용될 수 있다. 추가의 적합한 배지는 미국 특허원 제2007/0212770호(Baxter International Inc., Baxter Healthcare S.A.)에 기술된 올리고펩티드 부재 배지이다.
[표 2]
ADAMTS 단백질의 발현에 유용한 배양 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있는 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도의 예시적 농도
Figure 112015036638747-pct00002

한 구체예에서, 본 발명은 트롬보스폰딘 모티프가 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS) 단백질의 발현 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 약 2μM의 농도인 아연 또는 적어도 약 0.5mM의 농도인 칼슘 중 적어도 하나를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS1이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS2이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS3이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS4이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS5이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS6이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS7이다. ADAMTS 단백질은 ADAMTS8이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS9이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS10이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS11이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS12이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS14이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS15이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS16이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS17이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS18이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS19이다. 다른 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS20이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 약 2 내지 약 12μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 5μM의 아연을 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 약 5 내지 약 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 0.5mM의 칼슘을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 약 0.5 내지 약 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2μM의 아연 및 적어도 약 0.5mM의 칼슘을 함유한다.
또 다른 구체예에서, 니코틴아미드(비타민 B3)의 부가는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질의 발현 및 특이적 활성을 추가로 개선하는 것으로 밝혀졌다. 한 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2 내지 약 10㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다.
특정 구체예에서, 배양 배지는 동물 단백질 부재 배양 배지이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 화학적으로 규명된 배지이다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 하나 이상의 폴리아민을 포함할 수 있다. 특별한 구체예에서, 폴리아민은, 예를 들면, 적어도 0.5㎎/L의 농도인 푸트레신이다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 약 2 내지 약 8㎎/L의 푸트레신을 함유한다.
특정 구체예에서, 배양물에 사용되는 세포 또는 세포주는 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포 또는 포유동물 세포이다. 특정 구체예에서, 세포주는 인간 세포주, 햄스터 세포주 또는 마우스 세포주이다. 보다 특정 구체예에서, 세포주는 CHO, BHK 또는 HEK 세포주이다. 바람직한 구체예에서, 세포주는 CHO 세포주이다.
특정 구체예에서, ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산은 ADAMTS 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합된 조절 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 조절 서열은 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 구성 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 유도 프로모터이다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 연속식 세포 배양 시스템의 사용을 포함한다(즉, 연속식 세포-배양). 한 구체예에서, 연속식 배양 시스템은 케모스태트 배양 시스템이다(즉, 케모스태트 세포-배양). 다른 구체예에서, 연속식 배양 시스템은 터비도스탯(turbidostat) 배양 시스템이다(즉, 터비도스탯 세포-배양). 또 다른 구체예에서, 연속식 배양 시스템은 관류 배양 시스템이다(즉, 관류 세포-배양). 특정 구체예에서, 연속식 배양 시스템은 현탁 형태하에 작동될 수 있다. 다른 구체예에서, 연속식 배양 시스템은 부착 형태로 작동될 수 있다. 특정 구체예에서, 부착 형태는 마이크로캐리어, 예를 들면, 다공성 마이크로캐리어의 사용을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 배치식 세포 배양 시스템의 사용을 포함한다(즉, 배치식 세포-배양). 한 구체예에서, 배치식 배양 시스템은 단일-배치식 배양 시스템이다(즉, 단일-배치식 세포-배양). 다른 구체예에서, 배치식 배양시스템은 첨가식 배양 시스템이다(즉, 첨가식 세포-배양). 또 다른 구체예에서, 배치식 배양 시스템은 반복-배치식 배양 시스템이다(즉, 반복-배치식 세포-배양). 특정 구체예에서, 배치식 배양 시스템은 현탁 형태하에 작동될 수 있다. 다른 구체예에서, 배치식 배양 시스템은 부착 형태로 작동될 수 있다. 특정 구체예에서, 부착 형태는 마이크로캐리어, 예를 들면, 다공성 마이크로캐리어의 사용을 포함한다.
특정 구체예에서, 배양물은 약 35 내지 약 37℃의 온도에서 유지한다. 다른 구체예에서, 배양물은 약 6.9 내지 약 7.3의 pH에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 약 7.05 내지 약 7.15의 pH에서 유지한다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 적어도 600U/㎎ ADAMTS13 단백질의 특이적 활성을 가지면서 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질(즉, 발현된 ADAMTS13)을 수득한다. 다른 구체예에서, 특이적 활성은 적어도 800U/㎎ ADAMTS13 단백질일 것이다. 다른 구체예에서, 특이적 활성은 적어도 1000U/㎎ ADAMTS13 단백질일 것이다. 다른 구체예에서, 특이적 활성은 적어도 1500U/㎎ ADAMTS13 단백질일 것이다. 다른 구체예에서, 특이적 활성은 적어도 2000U/㎎ ADAMTS13 단백질일 것이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 하루에 배양물 L당 적어도 400U ADAMTS13 활성(U/L/D)이 수득되는 배양물을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 하루에 배양물 L당 적어도 800U ADAMTS13 활성(U/L/D)이 수득되는 배양물을 제공한다.
A. ADAMTS13
한 측면에 있어서, 본 발명은 증가된 전체 및/또는 특이적 활성을 갖는 ADAMTS13 단백질의 발현 방법을 제공한다. 유용하게는, 성장 배지를 칼슘, 아연 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충시켜, 특이적 활성이 높은 ADAMTS13 폴리펩티드가 재조합적으로 발현되고, 세포 배양물로부터 회수될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
ADAMTS13의 발현 방법이 WO 2009/086309에 제공되며, 이의 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다. 이 문헌은 배양 기간에 걸쳐 유지될 수 있는, 적절한 방법 및 배양 조건을 기술하고 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, ADAMTS13 단백질의 발현에 사용되는 세포 배양물은 일반적으로 34 내지 37℃ 또는 약 34 내지 37℃의 온도 및 6.8 내지 7.3 또는 약 6.8 내지 7.3의 pH에서 유지될 것이다.
배양 온도 및 pH를 모니터하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 일반적으로 생물반응기로 삽입되거나, 배양 배지가 순환되는 루프에 포함되거나, 배양 배지의 추출 샘플로 삽입되는 프로브(probe)에 따라 좌우된다. 적절한 인-라인(in-line) pH 센서는 Mettler Toledo InPro 3100/125/Pt100 센서(Mettler-Toledo Ingold, Inc., Bedford, MA)를 포함한다. 미리 한정된 수준으로 이를 유지하기 위하여 명시된 파라미터를 변화시키는 방법이 또한 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 온도를 일정하게 유지하는 것은 대개 생물반응기 또는 공급 배지(이것이 첨가식 또는 연속 공정인 경우)의 가열 또는 냉각을 포함하며; pH를 일정하게 유지하는 것은 대개 충분한 양의 적절한 완충액(통상 중탄산염)을 선택 및 공급하고, 산(예: 염산) 또는 알칼리(예: 수산화나트륨, 중탄산나트륨 또는 이들의 혼합물)를 필요에 따라, 공급 배지로 부가함을 포함한다. 인-라인 pH 프로브의 보정은 시간에 따라, 예를 들면, 수 일 또는 수 주의 기간에 걸쳐 드리프트될 수 있고, 이 동안에 세포는 배양될 수 있다. 이 경우에, 최근 보정된 오프-라인 프로브로부터 수득된 측정치를 사용하여 인-라인 프로브를 다시 셋팅하는 것이 유용할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로부터 선택된 적어도 하나의 성분으로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, ADAMTS 단백질은 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로부터 선택된 적어도 두 개의 성분으로 보충된 배지에서 발현된다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배양 배지일 수 있다.
1. 아연 보충
유리하게는, 증가된 ADAMTS13 효소 활성 및 특이적 활성은 아연으로 보충된 배지에서 성장시킨 세포 배양물로부터 회수될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 실시예 1은 1.432mg/L ZnSO4·7H2O (5μM 아연)를 함유하는 배양 배지에서 발현된 ADAMTS13 단백질이 단지 0.432mg/L ZnSO4·7H2O (1.5μM 아연)를 함유하는 배양 배지에서 발현된 ADAMTS13 단백질보다 특이적 활성이 40 내지 100% 더 높다고 설명하고 있다(비교, 표 10 및 표 11). 더욱이, 이 효과는 실시예 2(비교, 표 13 및 표 14); 실시예 4(표 16 내지 표 19) 및 실시예 5(표 20 및 표 21)에 제시된 바와 같이, 재생성 가능하다.
따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은 아연으로 보충된, 예를 들면, 적어도 2μM의 아연을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 특이적 활성이 증가된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한 아연으로 보충된, 예를 들면, 적어도 2μM의 아연을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 전체 활성 또는 특이적 활성이 증가된 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)의 제조 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유할 수 있다. 적합한 아연 농도 범위는 일반적으로 고농도, 예를 들면, 20μM, 25μM, 30μM 및 40μM 등보다 높은 농도의 아연의 존재하에 일어날 수 있는 세포 배양 독성에 의해 결정된다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 아연 농도가 특별한 배양 시스템을 억제하는 정도는 다른 요인들 중, ADAMTS 단백질을 발현시키는데 사용되는 세포의 형태, 사용된 배양 배지의 성분 및 배양에 대해 사용되는 작동 형태(예: 배치식 대 연속식; 현탁 대 부착; 케모스태트 대 관류; 등)에 따라 상당히 좌우될 것이다. 어떤 경우에, 보다 높은 아연 농도는 배양 배지의 성분이 용액으로부터 아연을 격리시키는 경우에, 예를 들면, 배양 배지가 알부민을 함유하는 경우에 필요할 수 있다. 따라서, 적절한 아연 농도 범위는 일반적으로 사용된 배양 세포, 배지 및 작동 형태의 동정에 의해 결정된다. 숙련가는 사용된 개개 배양 시스템을 기준으로 하여, 아연 보충물의 사용에 대한 적절한 상한선을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 함유하는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 함유하는 화학적으로 규명된 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 화학적으로 규명된 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 화학적으로 규명된 배양 배지는 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 화학적으로 규명된 배양 배지는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 화학적으로 규명된 배지는 동물 유래 단백질 및/또는 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현에 사용되는 배양 배지는 적어도 약 2μM 내지 적어도 약 12μM의 최종 농도인 아연으로 보충할 수 있다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2μM, 또는 적어도 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 보다 높은 수준의 아연의 최종 농도로 아연으로 보충할 수 있다. 일반적으로, 아연 염이 본 발명의 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있으며, 허용되는 염의 비제한적 예는 ZnSO4·7H2O, ZnSO3·2H2O, (C6H5O7)2Zn3·2H2O, ZnBr2, ZnBr2·2H2O, ZnCl2, Zn (NO3)2·6H2O, Zn(H2PO4)2·H2O, (C2H3O2)2Zn·2H2O 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연의 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위하여 사용된다.
2. 칼슘 보충
유리하게는, 증가된 ADAMTS13 효소 활성 및 특이적 활성은 칼슘으로 보충된 배지에서 성장된 세포 배양물로부터 회수될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 통상적인 세포 배양 배지, 예를 들면, DMEM/F12는 통상적으로 약 1mM의 칼슘을 함유한다. 역사적으로, 이들 높은 칼슘 수준이 배지로 도입되어 부착 세포 배양을 돕는다. 그러나, 오늘날, 현탁 배양을 위해 고안된 시판중인 배지는 상당히 낮은 칼슘 수준, 예를 들면, 약 0.1mM의 칼슘을 함유한다. 상기 보다 낮은 칼슘 수준은 현탁 방법을 통해 배양되는 세포의 응집을 방지함에 따라 좌우된다. 보다 낮은 칼슘 수준은 현탁액에 세포를 증식시키고, 재조합 단백질을 발현시키기에 충분한 것으로 공지되었지만, 본 발명자는 이들 낮은 칼슘 수준이 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현에 불충분함을 발견하였다.
따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은 칼슘으로 보충된, 예를 들면, 적어도 0.5mM의 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포의 배양에 의한 특이적 활성이 증가된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한 칼슘으로 보충된, 예를 들면, 적어도 0.5mM의 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포의 배양에 의한 전체 활성 또는 특이적 활성이 증가된 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)의 제조 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유할 수 있다.
한 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 함유하는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 함유하는 화학적으로 규명된 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 화학적으로 규명된 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 화학적으로 규명된 배양 배지는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 화학적으로 규명된 배지는 동물 유래 단백질 및/또는 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
일반적으로, 칼슘 염이 본 발명의 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있다. 허용되는 염의 비제한적 예는 CaCl2, CaCl2, CaFPO3·2H2O, CaI2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3·2H2O 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위하여 사용된다.
3. 니코틴아미드(비타민 B3) 보충
유리하게는, 증가된 ADAMTS13 효소 활성 및 특이적 활성은 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된 배지에서 성장된 세포 배양물로부터 회수될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 실시예 2는 7mg/L 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 발현된 ADAMTS13 단백질이 단지 2mg/L 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 발현된 ADAMTS13 단백질보다 특이적 활성이 60% 더 높다고 설명하고 있다(표 13; 비교 4일째 및 7일째와 11일째 비교). 놀랍게도, 7mg/L 니코틴아미드(비타민 B3) 및 5μM 아연을 함유하는 배지에서 ADAMTS13의 발현이 ADAMTS13 단백질의 특이적 활성에 있어서 200 내지 300% 증가를 일으키므로, 이 효과는 아연 보충에 의해 상승적이 된다(표 14 11일째와 표 13 4일째 및 7일째 비교).
따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된, 예를 들면, 적어도 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포의 배양에 의한 특이적 활성이 증가된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된, 예를 들면, 적어도 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포의 배양에 의한 전체 활성 또는 특이적 활성이 증가된 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)의 제조 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유할 수 있다. 적절한 니코틴아미드(비타민 B3) 농도 범위는 일반적으로 고농도의 니코틴아미드(비타민 B3)의 존재하에, 예를 들면, 15mg/L, 20mg/L, 30mg/L, 40mg/L보다 높은 농도 등에서 일어날 수 있는 세포 배양 독성에 의해 결정할 수 있다. 숙련가가 이해하는 바와 같이, 니코틴아미드(비타민 B3) 농도가 특별한 배양 시스템을 억제하는 정도는 다른 요인들 중, ADAMTS 단백질을 발현시키는데 사용되는 세포의 형태, 사용된 배양 배지의 성분, 및 배양을 위해 사용되는 작동 형태(예: 배치식 대 연속식; 현탁 대 부착; 케모스태트 대 관류; 등)에 따라 상당히 좌우된다. 어떤 경우에, 배양 배지의 성분이 용액으로부터 니코틴아미드(비타민 B3)를 격리시킬 수 있는 경우에 보다 고농도의 니코틴아미드(비타민 B3)가 요구될 수 있다. 따라서, 적절한 니코틴아미드(비타민 B3) 농도 범위는 일반적으로 사용된 배양 세포, 배지 및 작동 형태의 동정에 의해 결정된다. 한 기술은 사용된 개개 배양 시스템을 기준으로 하여, 니코틴아미드(비타민 B3) 보충물의 사용에 대한 적절한 상한선을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30mg/L 또는 약 0.5 내지 30mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 화학적으로 규명된 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 화학적으로 규명된 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 화학적으로 규명된 배양 배지는 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지는 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 화학적으로 규명된 배양 배지는 동물 유래 단백질 및/또는 폴리펩티드를 함유하지 않는다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30mg/L 또는 약 0.5 내지 30mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30mg/L 또는 약 0.5 내지 30mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에, 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30mg/L 또는 약 0.5 내지 30mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다)시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30mg/L 또는 약 0.5 내지 30mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양(이때, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3으로 유지한다)시킴을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30mg/L 또는 약 0.5 내지 30mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함한다. 또 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 관련 구체예에서, 배양 배지는 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 다른 관련 구체예에서, 배양 배지는 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3) 및 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
한 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13이 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 아연은 적어도 2μM, 5μM, 2 내지 12μM, 5 내지 12μM 또는 약 2μM, 5μM, 2 내지 12μM, 5 내지 12μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 농도로 배양 배지에 존재한다. 특정 구체예에서, 칼슘은 적어도 0.5mM, 1.5mM, 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5mM, 1.5mM, 0.5 내지 1.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 농도로 배양 배지에 존재한다. 특정 구체예에서, 니코틴아미드(비타민 B3)는 적어도 2mg/L, 7mg/L, 2 내지 7mg/L 또는 약 2mg/L, 7mg/L, 2 내지 7mg/L나, 적어도 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그 초과의 농도로 배양 배지로 존재한다.
본 명세서에 명확히 기술되고, 변이 14 내지 변이 93(표 3 내지 표 6)으로서 제공된 바와 같이, 세 성분(즉, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3))의 농도의 조합이 본 발명의 방법에 사용하기 위하여 시도되었다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 케모스태트 배양 조건이다. 다른 특정 구체예에서, 연속식 배양 조건은 관류 배양 조건이다. 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다.
[표 3]
ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한, 적어도 2㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지의 예시적 구체예
Figure 112015036638747-pct00003

[표 4]
ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한, 적어도 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지의 예시적 구체예
Figure 112015036638747-pct00004

[표 5]
ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한, 2 내지 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지의 예시적 구체예
Figure 112015036638747-pct00005

[표 6]
ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한, 적어도 3㎎/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그 초과의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지의 예시적 구체예
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또는 그 초과
B. 숙주 세포 및 벡터
재조합 ADAMTS 단백질은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서 발현시켜 제조할 수 있다. 진핵 세포의 예는 제한없이, 포유동물 세포(예: CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 및 HepG2); 곤충 세포(예: SF9 세포, SF21 세포, S2 세포, 및 고등 5개 세포) 및 효모 세포(예: Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 세포)를 포함한다. 한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포 및 포유동물 세포 등, 예를 들면, 인간 세포주, 햄스터 세포주 또는 마우스 세포주에서 발현될 수 있다. 한 특별한 구체예에서, 세포주는 CHO, BHK, 또는 HEK 세포주이다. 바람직한 구체예에서, 세포주는 CHO 세포주이다.
한 구체예에서, 세포는 원하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 제조하기 위하여 바람직하게는 제조 공정에서(즉, 적어도 1ℓ) 배양될 수 있는 포유동물 세포일 수 있다. 예로 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주(현탁 배양으로 성장시키기 위해 서브클론화된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR, 예를 들면, DUKX-B11 서브클론(CHO, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 Sertoli 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유선종양(MMT 060562, ATCC CCL51 ); TRI 세포(Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)를 포함한다. 바람직하게는, 세포주는 설치류 세포주, 특히 햄스터 세포주(예: CHO 또는 BHK)이다.
광범위한 벡터가 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위해 사용될 수 있고, 진핵 및 원핵 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 플라스미드 벡터는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현시 사용하기 위하여 시도되었다. 일반적으로, 숙주 세포와 양립성인 종으로부터 유래된 레플리콘 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 형질전환 세포에 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열뿐만 아니라, 복제 부위를 함유할 수 있다. 플라스미드는 하나 이상의 조절 서열, 예를 들면, 프로모터에 기능적으로 결합된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
재조합 ADAMTS 단백질을 발현시키는 안정한 CHO 세포 클론의 바람직한 제조 방법은 다음과 같다. DHFR 결핍 CHO 세포주 DUKX-B11은 필수적으로 미국 특허 제5,250,421호 (Kaufman et al., Genetics Institute, Inc.)에 기술된 바와 같이, DHFR 발현 벡터로 형질감염시켜 관련 재조합 단백질의 발현을 허용한다. 히포크산틴/티미딘(HT) 부재 배지에서 성장 및 재조합 ADAMTS 단백질의 발현을 암호화하는 관련 부위의 증폭에 의해 선택을 수행하고, DHFR 유전자는 메토트렉세이트의 증가된 농도에서 세포를 번식시켜 성취한다. 경우에 따라, CHO 세포주는, 필수적으로 US 제6,100,061호(Reiter et al, lmmuno Aktiengesellschaft)에 기술된 바와 같이, 혈청 및/또는 단백질 부재 배지에서 성장시키기 위해 채택할 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 안정한 HEK293 세포는 하이그로마이신 선택성 마커를 함유하는 작제물로 형질감염시키고, 항생제 내성에 의해 형질전환체를 선택하여 제조한다.
수용체-매개 내포 작용을 통해 세포를 감염시키거나 세포를 도입시키고, 숙주 세포 게놈으로 통합시켜 바이러스성 유전자를 안정하고 효율적으로 발현시키는 특정 바이러스의 능력은 외래 핵산을 세포(예: 포유동물 세포)로 전달하기 위한 눈에 띄는 후보 물질로 이들을 만든다. 따라서, 특정 구체예에서, 바이러스성 벡터는 발현을 위해 숙주 세포로 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 도입시키기 위해 사용된다. 바이러스성 벡터는 하나 이상의 조절 서열, 예를 들면, 프로모터에 기능적으로 결합된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 바이러스성 벡터는 조절 서열을 함유하지 않을 수도 있고, 대신에 ADAMTS 단백질의 발현을 유도하는 숙주 세포 내 조절 서열에 따라 좌우될 것이다. 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 바이러스성 벡터의 비제한적 예는 아데노바이러스성 벡터, AAV 벡터 및 레트로바이러스성 벡터를 포함한다.
한 구체예에서, 아데노바이러스 발현 벡터는 작제물의 패키징을 지지하고, 그 안에 클론화된 ADAMTS 작제물을 궁극적으로 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함한다. 아데노바이러스성 벡터는 7kb 이하의 외래 서열의 도입을 허용한다(Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).
다른 구체예에서, 아데노-결합 바이러스(AAU)는 발현을 위해 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. AAV 시스템은 앞서 기술되었고, 일반적으로 당해 분야에 잘 공지되어 있다 (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). rAAV 벡터의 생성 및 용도에 관한 상세한 설명은, 예를 들면, 본 명세서에 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로 각각 인용된, 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기술되어 있다.
한 구체예에서, 레트로바이러스성 발현 벡터는 발현을 위해 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포로 도입시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 시스템은 앞서 기술되었고, 일반적으로 당해 분야에 잘 공지되어 있다(Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). 특정 구체예에서, 레트로바이러스성 벡터는 렌티바이러스성 벡터이다(참조예: Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호).
원핵 발현을 위한 벡터의 비제한적 예는 플라스미드(예: pRSET, pET, pBAD 등)를 포함하며, 이때 원핵 발현 벡터에 사용되는 프로모터는 lac, trc, trp, recA, araBAD 등을 포함한다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예는 (i) 효모에서 발현의 경우, AOX1, GAP, GAL1, AUG1, 등과 같은 프로모터를 사용하는 벡터(예: pAO, pPIC, pYES, pMET); (ii) 곤충 세포에서 발현의 경우, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, 등과 같은 프로모터를 사용하는 벡터(예: pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, 등), 및 (iii) 포유동물 세포에서 발현의 경우, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 β-악틴과 같은 프로모터를 사용하는, 벡터(예: pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, 등) 및 바이러스성 시스템(예: 백신 바이러스, 아데노-결합 바이러스, 간 바이러스, 레트로바이러스 등)으로부터 유래된 벡터를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 세포-배양 방법은 마이크로캐리어의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명은 다른 측면 중, 대규모 ADAMTS 단백질의 발현 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 구체예의 세포-배양은 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 성취하기 위하여 높은 용적-배양 비표면적을 제공하기에 적합한 조건하에 큰 생물반응기에서 수행할 수 있다. 상기 성장 조건을 제공하기 위한 한 방법은 교반 탱크 생물반응기에 세포-배양을 위해 마이크로캐리어를 사용하는 것이다. 다른 구체예에서, 이들 성장 요건은 현탁 세포 배양의 사용을 통해 부합된다.
C. 배양 방법
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 배치식 또는 연속식 작동 형태하에 작동되는 세포 배양 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 배치식 세포 배양이 사용되는 경우에, 이들은 단독 배치식, 첨가식 또는 반복-배치식 형태하에 작동시킬 수 있다. 마찬가지로, 연속식 세포 배양은, 예를 들면, 관류, 터비도스탯 또는 케모스태트 형태하에 작동시킬 수 있다. 배치식 및 연속식 세포 배양은 현탁 또는 부착 조건하에 수행할 수 있다. 현탁 조건하에 작동하는 경우에, 세포는 배양 배지 내에 자유롭게 현탁되어 혼합될 것이다. 또한, 부착 조건하에서, 세포는 고체상, 예를 들면, 마이크로캐리어, 다공성 마이크로캐리어, 디스크 캐리어, 세라믹 카트리지, 중공 섬유, 플랫 시트 및 겔 매트릭스 등에 결합될 것이다.
배치식 배양은 통상 세포 접종물이 탱크 또는 발효기에서 최대 밀도로 배양되고, 단일 배치로서 수확되어 처리되는 대규모 세포 배양이다. 첨가식 배양은 통상 새로운 영양소(예: 성장-제한 기질) 또는 부가제(예: 생성물에 대한 전구체)로 보충되는 배치식 배양이다. 공급액은 대개 생물반응기의 희석을 피하기 위하여 상당히 농축시킨다. 반복-배치식 배양에서, 세포는 배양 배지로 가하여, 원하는 세포 밀도로 성장시킨다. 쇠퇴기 및 세포사(cell death)의 개시를 피하기 위하여, 이어서 배양물은 세포가 이들의 최대 농도에 이르기 전에 완전한 성장 배지로 희석시킨다. 희석 양 및 빈도는 광범위하게 변하며, 세포주의 성장 특성 및 배양 과정의 편의성에 따라 좌우된다. 상기 과정은 필요에 따라 여러 번 반복할 수 있고, 세포 및 배지가 계대 배양에서 폐기되지 않는 한, 배양물의 용적은 각각의 희석이 이루어지는 경우 단계적으로 증가한다. 증가된 용적은 용기 내에서 희석할 수 있도록 하기에 충분한 크기의 반응기를 가짐으로써 또는 희석된 배양물을 몇몇 용기로 나눔으로써 처리할 수 있다. 이러한 형태의 배양 이유는 기하급수적으로 성장하는 상태로 세포를 유지하기 위한 것이다. 일련의 계대 배양은 배양물의 용적이 항상 단계적으로 증가되고, 다중 수확할 수 있으며, 세포가 계속해서 성장하고, 과정은 원하는 한 오랫동안 계속할 수 있다는 점을 특징으로 한다. 특정 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)은 배치식 배양의 상청액을 수확한 후 회수할 수 있다.
연속식 배양은 새로운 배지의 유입에 의해 계속해서 영양소로 보충되는 현탁 배양일 수 있으며, 이때 배양 용적은 대개 소비된 배지의 동시 제거에 의해 일정하게 유지한다. 케모스태트 및 터비도스탯 방법에서, 추출된 배지는 세포를 함유한다. 따라서, 세포 배양 용기에 잔류하는 세포는 정상 상태를 유지하기 위하여 성장해야 한다. 케모스태트 방법에서, 성장 속도는 통상 희석 속도, 즉 새로운 배지가 부가되는 속도를 조절함으로써 조절한다. 배양시 세포의 성장 속도는, 예를 들면, 희석 속도의 변화에 의해 준최대 성장 속도로 조절할 수 있다. 대조적으로, 터비도스탯 방법에서, 희석 속도는 세포가 제시된 작동 조건(예: pH 및 온도)에서 성취될 수 있는 최대 성장 속도를 허용하도록 조절한다.
관류 배양시, 추출된 배지는, 예를 들면, 세포를 배양물로 재도입시키도록 유도하는 여과에 의해 또는 원심분리 방법에 의해 배양 용기에 유지되는, 세포가 고갈된다. 그러나, 통상 여과에 사용되는 막은 100%의 세포를 유지하지 못하므로, 배지가 추출되면 비율은 제거된다. 세포의 대부분이 배양 용기에 유지되기 때문에, 매우 높은 성장 속도로 관류 배양을 작동시키는 것이 결정적이지 않을 수 있다.
교반-탱크 반응기 시스템은 현탁 또는 부착 형태하에 작동되는 배치식 및 연속식 세포 배양을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 교반-탱크 반응기 시스템은 러시톤(Rushton), 하이드로포일(hydrofoil), 피치 블레이드(pitched blade) 또는 마린(marine)과 같은 교반기 중 어느 한 형태를 갖는 통상적인 교반 탱크로서 작동될 수 있다.
본 발명의 방법은 ADAMTS 단백질의 발현을 위해, 첨가식 세포-배양 또는 연속식 세포-배양(예: 관류 또는 케모스태트 세포- 배양)의 사용을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 적어도 약 12μM 이하의 농도로 아연이 보충된 첨가식 배양 배지가 증가된 특이적 활성을 갖는 ADAMTS 단백질의 발현을 위해 제공되는 것으로 밝혀졌다(표 20). 주목할 만하게, 12μM의 최종 농도로 아연이 보충된 첨가식 배양에서, 특정 세포 성장 속도 및 전체 활성은 영향이 없는 반면에, 발현된 ADAMTS13 단백질의 특이적 활성은 계속 증가된다. 이는 케모스태트 세포-배양을 사용하는 실험에서 보여지는 것과 대조적이다. 이들 실험에서, 5μM의 최종 농도인 아연에 의한 배양 배지의 보충은 상청액에서 ADAMTS13의 특이적 활성의 증가를 일으킨다(표 21). 그러나, 보다 높은 수준, 8.5μM 및 12μM의 보충시, 배양물 상청액에서 ADAMTS13의 특이적 활성이 높게 유지됨에도 불구하고, 특정 세포 성장 속도 및 전체 ADAMTS13 단백질 수율은 감소된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 2μM 또는 약 2μM, 적어도 5μM 또는 약 5μM, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM, 2 내지 5μM 또는 약 2 내지 5μM, 5 내지 12μM, 또는 약 5 내지 12μM, 또는 적어도 3μM, 4μM,, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 약 3μM, 4μM,, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연의 농도로 아연을 포함하는 배지를 사용한 첨가식 세포 배양의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 아연 농도는 적어도 약 5μM 내지 적어도 약 12μM일 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재, 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다.
1. 연속식 배양
유리하게는, 본 발명은 연속식 배양으로 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법을 제공한다. 이들 방법은 연장된 시간에 걸쳐 단일 배양물로부터 ADAMTS 단백질의 연속적인 발현 및 정제를 허용한다. 특히, 높은 수준의 ADAMTS13 단백질 발현 및 특이적 활성은 본 발명에 의해 제공되는 조건하에, 10L 케모스태트 생물반응기에서 적어도 53일 동안 유지될 수 있는 것으로 밝혀졌다(실시예 3, 참조 표 15). 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 연장된 기간 동안 높은 특이성을 갖는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일 또는 약 7일, 또는 적어도14일, 21일, 28일 또는 약 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주 또는 약 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월 또는 약 2개월이나, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 이들 구체예 중 일부는, 전체 ADAMTS 단백질 발현, 활성 또는 특이적 활성의 수준이 연장된 기간 동안 배양물에서 유지된다. 다른 구체예에서, 특정 성장 속도 및 세포 밀도 등은 연장된 기간 동안 배양물에서 유지된다. 일부 구체예에서, 배양 배지는, 예를 들면, 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 칼슘, 아연 또는 니코틴아미드(비타민 B3) 중 적어도 하나로 보충될 수 있다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, 연속식 세포 배양 기술은 적어도 7일 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 연속식 세포 배양 기술은 적어도 14일 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 연속식 세포 배양 기술은 적어도 21일 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 연속식 세포 배양 기술은 적어도 1개월 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 연속식 세포 배양 기술은 적어도 2개월 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 연속식 세포 배양 기술은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 그 초과의 개월 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키기 위하여 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법은 적어도 7일 동안 적어도 2μM 또는 약 2μM, 적어도 5μM 또는 약 5μM, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM, 2 내지 5μM 또는 약 2 내지 5μM, 3 내지 5μM 또는 약 3 내지 5μM, 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM, 또는 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연의 농도로 아연을 포함하는 배지에 의한 연속식 세포 배양의 사용을 포함할 수 있다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 연속식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 3μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 5μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 5μM 또는 약 2 내지 5μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 3 내지 5μM 또는 약 3 내지 5μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 3 내지 12μM 또는 약 3 내지 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 연속식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 1.0mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 1.0 내지 1.5mM 또는 약 1.0 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 적어도 2㎎/L 또는 약 2㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 연속식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 5㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 7㎎/L 또는 약 2 내지 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 5 내지 7㎎/L 또는 약 5 내지 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 3㎎/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 3㎎/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그 초과의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 아연 및 칼슘 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 연속식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연 및 칼슘의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연 및 칼슘 농도는 변이 94 내지 변이 113(표 7) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 연속식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 변이 114 내지 변이 133(표 8) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 연속식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 변이 134 내지 변이 149(표 9) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 연속식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 변이 14 내지 변이 93(표 3 내지 표 6) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, 배양물은 연장된 기간 동안 약 0.5×106 내지 4×107세포/㎖의 세포 밀도로 유지된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0×106 내지 약 1.0×107세포/㎖의 농도로 유지된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0×106 내지 약 4.0×106세포/㎖의 농도로 유지된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0×106 내지 약 4.0×106세포/㎖의 농도로 유지된다. 또 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 2.0×106 내지 약 4.0×106, 또는 약 1.0×106 내지 약 2.5×106, 또는 약 1.5×106 내지 약 3.5×106, 또는 다른 유사한 범위의 농도로 유지될 수 있다. 세포-배양물이 재조합 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 제조를 위해 유지되는 세포 밀도는 단백질 발현에 사용되는 배양-조건 및 배지에 따라 좌우된다. 당해 분야의 한 숙련가는 ADAMTS 단백질을 제조하는 세포 배양을 위한 최적의 세포 밀도를 용이하게 결정할 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 특이적 활성이 적어도 500U/㎎ A13 또는 약 500U/㎎ A13인, 적어도 500유닛 또는 약 500유닛의 ADAMTS13 활성 단위/배양물 ℓ/일(500U/L/D), 예를 들면, FRETS-VWF73 활성 단위의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 600 또는 약 600 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 700 또는 약 700 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 800 또는 약 800 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 900 또는 약 900 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1000 또는 약 1000 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1100 또는 약 1100 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1200 또는 약 1200 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1300 또는 약 1300 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1400 또는 약 1400 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1500 또는 약 1500 U/L/D의 제조를 허용한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 2000 또는 약 2000 U/L/D의 제조를 허용한다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 연장된 기간 동안 특이적 활성이 높은, 예를 들면, 특이적 활성이 적어도 약 600U/㎎ A13 단백질, 또는 적어도 약 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 또는, 그 이상의 U/㎎ A13 단백질인 ADAMTS13 단백질의 연장된 발현을 허용한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 케모스태트 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 터비도스탯 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 관류 세포 배양의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
2. 배치식 배양
다른 측면에 있어서, 본 발명은 배치식 배양으로 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 배양 배지는, 예를 들면, 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 칼슘, 아연 또는 니코틴아미드(비타민 B3) 중 적어도 하나로 보충될 수 있다. 한 특별한 구체예에서, 상기 방법은 단일-배치식 세포 배양의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 첨가식 세포 배양의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 반복 배치식 세포 배양의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, 첨가식 또는 반복 배치식 세포 배양 기술은 적어도 7일 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 첨가식 또는 반복 배치식 세포 배양 기술은 적어도 14일 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 첨가식 또는 반복 배치식 세포 배양 기술은 적어도 21일 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 첨가식 또는 반복 배치식 세포 배양 기술은 적어도 1개월 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 첨가식 또는 반복 배치식 세포 배양 기술은 적어도 2개월 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 첨가식 또는 반복 배치식 세포 배양 기술은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 변이 1 내지 변이 149(표 2 내지 표 9) 중의 어느 하나에 따르는 농도로 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 발현시키는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
특정 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현 방법은 적어도 7일 동안 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연, 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연, 2 내지 5μM 또는 약 2 내지 5μM의 아연, 3 내지 5μM 또는 약 3 내지 5μM의 아연, 5 내지 12μM, 또는 약 5 내지 12μM의 아연, 또는 적어도 3μM, 4μM,, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 약 3μM, 4μM,, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연의 농도로 아연을 포함하는 배지를 사용한 첨가식 또는 반복 배치식 세포 배양의 사용을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 첨가식 또는 반복 배치식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 1.0mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 1.0 내지 1.5mM 또는 약 1.0 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 적어도 2㎎/L 또는 약 2㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 첨가식 또는 반복 배치식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 5㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 7㎎/L 또는 약 2 내지 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 5 내지 7㎎/L 또는 약 5 내지 7㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 3㎎/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 3㎎/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그 초과의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 아연 및 칼슘 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 첨가식 또는 반복 배치식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연 및 칼슘의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연 및 칼슘 농도는 변이 94 내지 변이 113(표 7) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 첨가식 또는 반복 배치식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 변이 114 내지 변이 133(표 8) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 첨가식 또는 반복 배치식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 변이 134 내지 변이 149(표 9) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 적어도 7일 동안 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 첨가식 또는 반복 배치식 배양 조건하에 배양시킴을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 농도는 변이 14 내지 변이 93(표 3 내지 표 6) 중 하나일 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, 배양물은 연장된 기간 동안 약 0.5×106 내지 4×107세포/㎖의 세포 밀도로 유지된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0×106 내지 약 1.0×107세포/㎖의 농도로 유지된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0×106 내지 약 4.0×106세포/㎖의 농도로 유지된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 1.0×106 내지 약 4.0×106세포/㎖의 농도로 유지된다. 또 다른 구체예에서, 세포 밀도는 연장된 기간 동안 약 2.0×106 내지 약 4.0×106, 또는 약 1.0×106 내지 약 2.5×106, 또는 약 1.5×106 내지 약 3.5×106, 또는 다른 유사한 범위의 농도로 유지될 수 있다. 세포-배양물이 재조합 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 제조를 위해 유지되는 세포 밀도는 단백질 발현에 사용되는 배양-조건 및 배지에 따라 좌우된다. 당해 분야의 한 숙련가는 ADAMTS 단백질을 제조하는 세포 배양을 위한 최적의 세포 밀도를 용이하게 결정할 것이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 특이적 활성이 적어도 500U/㎎ A13 또는 약 500U/㎎ A13인, 적어도 500유닛 또는 약 500유닛의 ADAMTS13 활성 단위/배양물 ℓ/일(500U/L/D), 예를 들면, FRETS-VWF73 활성 단위의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 600 또는 약 600 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 700 또는 약 700 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 800 또는 약 800 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 900 또는 약 900 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1000 또는 약 1000 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1100 또는 약 1100 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1200 또는 약 1200 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1300 또는 약 1300 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1400 또는 약 1400 U/L/D의 제조를 허용한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 1500 또는 약 1500 U/L/D의 제조를 허용한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13의 발현 방법은 적어도 2000 또는 약 2000 U/L/D의 제조를 허용한다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 연장된 기간 동안 특이적 활성이 높은, 예를 들면, 특이적 활성이 적어도 약 600U/㎎ A13 단백질, 또는 적어도 약 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 또는, 그 이상의 U/㎎ A13 단백질인 ADAMTS13 단백질의 연장된 발현을 허용한다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 일부 구체예에서, 배양은 현탁 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 배양은 부착 배치식 배양으로서 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
3. 배양 조건
놀랍게도, 세포 생존률 및 ADAMTS13 활성은 세포 배양물의 온도 및 pH의 작은 변이에 의해 증가될 수 있는 것으로 또한 밝혀졌다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 발현된 ADAMTS13의 특이적 활성은 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 약 7.30 미만의 pH에서 배양시키는 경우에 상당히 개선된다. 보다 적은 정도임에도 불구하고, 온도도 또한 이들 연구에서 ADAMTS13의 특이적 활성에 기여하는 요인이다. 유사하게, 약 6.80 내지 약 7.3의 pH에서 성장시킨 배양물의 상청액 중 A13의 용적 생산성(FRETS-VWF73에 의해 측정)은 상기 범위보다 위 및 미만의 pH 수준에 비하여, 상당히 증가되는 것으로 밝혀졌다. ADAMTS13 생산성은 또한 배양물의 온도에 의해 영향을 받는다. 최대 활성은 약 34 내지 약 37℃의 온도에서 성장시킨 배양물에서 발견된다.
다른 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 약 34 내지 약 37℃의 온도로 배양 배지의 온도를 유지하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 36.5℃ 또는 그 미만, 36.0℃ 또는 그 미만, 35.5℃ 또는 그 미만, 또는 35.0℃ 미만의 온도로 유지할 수 있다. 특정 구체예에서, 온도는 약 36℃의 온도에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 위에서 언급한 온도 및 pH 범위의 조합으로, 예를 들면, 36.5℃ 또는 그 미만 및 예를 들면, 7.15 또는 그 미만의 pH로 유지한다. 바람직한 구체예에서, 배양물은 36.0℃의 온도 및 7.10의 pH에서 유지한다.
따라서, 일부 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현 방법은 약 6.8 내지 7.3의 pH로 배양 배지의 pH를 유지하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, pH는 약 7.0 내지 약 7.25 또는 약 7.05 내지 약 7.15일 수 있다. 특정 구체예에서, pH는 7.20 또는 그 미만, 7.15 또는 그 미만, 7.10 또는 그 미만, 또는 7.05 또는 그 미만의 pH에서 유지할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 배양 배지의 pH는 약 7.1의 pH에서 유지한다.
한 구체예에서, 본 발명은 34 내지 37℃ 또는 약 34 내지 37℃의 온도 및 6.8 내지 7.3 또는 약 6.8 내지 7.3의 pH에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는 ADAMTS 단백질의 발현 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃이고, pH는 6.8 내지 7.3 또는 약 6.8 내지 7.3이다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 35.5 내지 36.5℃ 또는 약 35.5 내지 36.5℃이고, pH는 6.8 내지 7.3 또는 약 6.8 내지 7.3이다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 36℃ 또는 약 36℃이고, pH는 6.8 내지 7.3 또는 약 6.8 내지 7.3이다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연으로 보충한다. 다른 특정 구체예에서, 배양 배지는 칼슘으로 보충한다. 다른 특정 구체예에서, 배양 배지는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연 및 칼슘으로 보충한다. 한 구체예에서, 아연 및 칼슘 농도는 변이 94 내지 변이 113(표 7) 중 하나이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 114 내지 변이 133(표 8) 중 하나이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 134 내지 변이 149(표 9) 중 하나이다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)와 함께 농축시킨다. 한 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 14 내지 변이 93(표 3 내지 표 6) 중 하나이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 34 내지 37℃ 또는 약 34 내지 37℃의 온도 및 6.9 내지 7.25 또는 약 6.9 내지 7.25의 pH에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는 ADAMTS 단백질의 발현 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃이고, pH는 6.9 내지 7.25 또는 약 6.9 내지 7.25이다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 35.5 내지 36.5℃ 또는 약 35.5 내지 36.5℃이고, pH는 6.9 내지 7.25 또는 약 6.9 내지 7.25이다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 36℃ 또는 약 36℃이고, pH는 6.9 내지 7.25 또는 약 6.9 내지 7.25이다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연으로 보충한다. 다른 특정 구체예에서, 배양 배지는 칼슘으로 보충한다. 다른 특정 구체예에서, 배양 배지는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연 및 칼슘으로 보충한다. 한 구체예에서, 아연 및 칼슘 농도는 변이 94 내지 변이 113(표 7) 중 하나이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 114 내지 변이 133(표 8) 중 하나이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 134 내지 변이 149(표 9) 중 하나이다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)와 함께 농축시킨다. 한 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 14 내지 변이 93(표 3 내지 표 6) 중 하나이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 34 내지 37℃ 또는 약 34 내지 37℃의 온도 및 7.0 내지 7.20 또는 약 7.0 내지 7.20의 pH에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴을 포함하는 ADAMTS 단백질의 발현 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃이고, pH는 7.0 내지 7.20 또는 약 7.0 내지 7.20이다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 35.5 내지 36.5℃ 또는 약 35.5 내지 36.5℃이고, pH는 7.0 내지 7.20 또는 약 7.0 내지 7.20이다. 다른 구체예에서, 배양물의 온도는 36℃ 또는 약 36℃이고, pH는 7.0 내지 7.20 또는 약 7.0 내지 7.20이다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연으로 보충한다. 다른 특정 구체예에서, 배양 배지는 칼슘으로 보충한다. 다른 특정 구체예에서, 배양 배지는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연 및 칼슘으로 보충한다. 한 구체예에서, 아연 및 칼슘 농도는 변이 94 내지 변이 113(표 7) 중 하나이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 114 내지 변이 133(표 8) 중 하나이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 한 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 134 내지 변이 149(표 9) 중 하나이다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)와 함께 농축시킨다. 한 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 14 내지 변이 93(표 3 내지 표 6) 중 하나이다.
마이크로캐리어 상에서 세포-성장의 개념은 먼저 van Wezel에 의해 기술되었고(van Wezel AL., Nature 1967 Oct 7;216(5110):64-5), 성장 배지에 현탁된 작은 고체 입자의 표면에 대한 세포 부착을 허용한다. 이들 방법은 높은 표면-대-용적 비를 제공하므로, 효율적인 영양소 이용을 허용한다. 더욱이, 진핵 세포주에서 분비된 단백질의 발현의 경우, 증가된 표면-대-용적 비는 더 높은 수준의 분비를 허용하므로, 배양물의 상청액에서 더 많은 단백질이 수득된다. 마지막으로, 이들 방법은 진핵 발현 배양물의 용이한 스케일-업을 허용한다.
ADAMTS 단백질을 발현시키는 세포는 세포 배양 성장 도중 구형 또는 다공성 마이크로캐리어에 결합될 수 있다. 마이크로캐리어는 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로즈와, Butler(1988. In:Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303)에 기술된 바와 같은 다른 것을 근거로 하는 마이크로캐리어 그룹으로부터 선택되는 마이크로캐리어일 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에 따라, ADAMTS 단백질을 발현시키는 세포는 구형 마이크로캐리어 상에서 배양한다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면, ADAMTS 단백질을 발현시키는 세포는 다공성 마이크로캐리어 상에서 배양한다. 또한, 구형 마이크로캐리어 상에서 세포를 바이오매스(biomass)로 성장시키고, 이들이 최종 발효기 바이오매스에 이르고, 다공성 마이크로캐리어 상에서 발현된 단백질의 제조 전에 세포를 계대 배양하거나, 그 반대로 할 수 있다. 구형 마이크로캐리어는 매끄러운 표면의 그룹, 예를 들면, Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, 및 Cytodex™ 3(GE Healthcare)과, 거대다공성 마이크로캐리어, 예를 들면, Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, 및 Cytoline™ 2(GE Healthcare)의 그룹으로부터 선택되는 것이다.
IV. 배양 배지
한 측면에 있어서, 본 발명은 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질의 발현에 유용한 배양 배지를 제공한다. 유용하게는, 배양 배지를 다양한 성분, 예를 들면, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)의 조합으로 보충함으로써, 상기 배지에서 배양된 세포에서 발현되는 ADAMTS(예: ADAMTS13) 효소의 활성은 상당히 개선되는 반면에, 효소는 더 높지않다면, 세포가 비-보충 배지에서 배양된 것 만큼 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다.
동물 단백질 부재 및 화학적으로 규명된 배양 배지의 제조 방법이 당해 분야에, 예를 들면, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217, 및 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있으며, 이들의 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다. 한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법에 사용된 배양 배지는 동물 단백질 부재 또는 올리고펩티드 부재 배지이다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 화학적으로 정의될 수 있다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 약 0.5 내지 약 10㎎/L의 농도로 적어도 하나의 폴리아민을 함유할 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 부가의 칼슘, 아연 및/또는 비타민 B3이 보충된 배양 배지가 제공된다. 특정 구체예에서, 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 특정 구체예에서, 동물 단백질 부재 또는 올리고펩티드 부재 배지는 이들의 기술이 모든 목적을 위해 본 명세서에 이의 전문이 참조로 인용되는, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217과, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 교시된 바와 같이 제조되며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용되고, 부가의 칼슘, 아연 및/또는 비타민 B3으로 보충된다. 특정 구체예에서, 화학적으로 규명된 배지는 Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM)와 유사할 수 있으며, 이는 부가의 칼슘, 아연 및/또는 비타민 B3이 보충되어, 상기 배지에서 배양된 세포에서 발현된 ADAMTS 단백질의 특이적 활성을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 동물 성분이 존재하지 않는다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 단백질, 예를 들면, 혈청(예: 소 태아 혈청)으로부터의 동물 단백질을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양물은 외인성 부가된 재조합 단백질을 갖는다. 다른 구체예에서, 단백질은 입증된 병원균이 없는 동물로부터 유래된다.
특정 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 농도인 적어도 하나의 폴리아민을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 10㎎/L 또는 약 0.5 내지 10㎎/L의 적어도 하나의 폴리아민을 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 적어도 하나의 폴리아민을 함유한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 오르니틴, 푸트레신, 스페르민 또는 스페르미딘 등의 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 푸트레신을 함유한다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지가 제공된다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2μM 또는 약 2μM이나, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유할 수 있다.
일반적으로, 아연 염이 본 발명의 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있다. 허용되는 염의 비제한적 예는 ZnSO4·7H2O, ZnSO3·2H2O, (C6H5O7)2Zn3·2H2O, ZnBr2, ZnBr2·2H2O, ZnCl2, Zn (NO3)2·6H2O, Zn(H2PO4)2·H2O, (C2H3O2)2Zn·2H2O 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연의 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위하여 사용된다. 다른 구체예에서, 아연 함유 펩티드 또는 단백질 제제, 예를 들면, 인슐린이 본 명세서에 제공된 배양물을 보충하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지가 제공된다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유할 수 있다.
일반적으로, 칼슘 염이 본 발명의 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있다. 허용되는 염의 비제한적 예는 CaCl2, CaCl2, CaFPO3·2H2O, CaI2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3·2H2O 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위하여 사용된다.
다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지가 제공된다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유할 수 있다.
유리하게는, 배양 배지를 아연 및 칼슘 모두로 보충함으로써, 상기 배양 배지에서 발현된 ADAMTS13 단백질의 특이적 활성이 상당히 증가되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 한 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위해 본 명세서에 제공된 배양 배지는 아연 및 칼슘 모두로 보충할 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 표 7에 제공된 수준으로, 즉 변이 94 내지 변이 113 중의 어느 하나에 따르는 수준으로 아연 및 칼슘을 보충할 수 있다.
[표 7]
ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한, 아연 및 칼슘 모두로 보충시킨 배양 배지의 예시적 구체예
Figure 112015036638747-pct00007

유사하게, 배양 배지를 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충함으로써, 상기 배양 배지에서 발현된 ADAMTS13 단백질의 특이적 활성이 상승적으로 증가되는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 이 효과는 실시예 2(표 14 11일째와 표 13 4일째 및 7일째 비교)에서 확인할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위해 본 명세서에 제공된 배양 배지는 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충될 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 표 8에 제공된 수준으로, 즉 변이 114 내지 변이 133 중의 어느 하나에 따르는 수준으로 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)를 보충할 수 있다.
[표 8]
ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충시킨 배양 배지의 예시적 구체예
Figure 112015036638747-pct00008

유리하게는, 배양 배지를 니코틴아미드 및 칼슘 모두로 보충함으로써, 상기 배양 배지에서 발현된 ADAMTS13 단백질의 특이적 활성이 상당히 증가되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 한 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위해 본 명세서에 제공된 배양 배지는 니코틴아미드(비타민 B3) 및 칼슘 모두로 보충될 수 있다. 예를 들면, 배양 배지는 표 9에 제공된 수준으로, 즉 변이 134 내지 변이 149 중의 어느 하나에 따르는 수준으로 니코틴아미드(비타민 B3) 및 칼슘을 보충할 수 있다.
[표 9]
ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한, 니코틴아미드(비타민 B3) 및 칼슘 모두로 보충시킨 배양 배지의 예시적 구체예
Figure 112015036638747-pct00009

일부 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 배양 배지는 액체나, 무수 또는 분말 형태로 제공될 수 있다. 배지는 단일 사용에 적합한 양으로 미리-나눠지거나, 1회 이상의 세포-배양에 사용될 수 있는 보다 큰 양으로 제공될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 배지는 멸균 형태로 제공된다. 따라서, 본 발명은 ADAMTS13 단백질의 발현 또는 제조용 키트를 또한 제공하며, 상기 키트는 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질의 발현에 적합한 배양 배지를 포함한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현에 유용한 배양 배지를 제공한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 약 2 내지 약 12μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 5μM의 아연을 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 약 5 내지 약 12μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 0.5mM의 칼슘을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 약 0.5 내지 약 1.5mM의 칼슘을 함유한다. 한 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2μM의 아연 및 적어도 약 0.5mM의 칼슘을 함유한다.
또 다른 구체예에서, 니코틴아미드(비타민 B3)의 부가는 세포 배양시 ADAMTS 단백질의 발현 및 특이적 활성을 추가로 개선하는 것으로 밝혀졌다. 한 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 약 2 내지 약 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다.
특정 구체예에서, 배양 배지는 동물 단백질 부재 배양 배지이다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 화학적으로 규명된 배지이다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 하나 이상의 폴리아민을 포함할 수 있다. 특별한 구체예에서, 폴리아민은, 예를 들면, 적어도 0.5mg/L의 농도인 푸트레신이다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 약 2 내지 약 8mg/L의 푸트레신을 함유한다.
1. 단백질 부재 배양 배지
특정 측면에 있어서, 본 발명은 외인성 부가된 단백질이 없는, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지를 제공한다. "단백질 부재 배양 배지" 및 관련 용어는 성장 도중 자연적으로 단백질을 분리하는, 배양물에서 세포에 대해 또는 세포가 아닌 다른 것에 대한 외인성 공급원으로부터의 단백질이 결여된 배양 배지를 의미한다. 한 구체예에서, 외인성 부가된 단백질이 없고(즉, 단백질 부재), 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지가 제공된다. 특정 구체예에서, 단백질 부재 배양 배지는, 예를 들면, 적어도 2mg/L, 또는 2 내지 30mg/L 또는 약 2 내지 30mg/L, 또는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 농도로 폴리아민을 함유한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 예시적인 단백질 부재 배양 배지가 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217과, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 교시되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM, 적어도 5μM 또는 약 5μM, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM, 또는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 단백질 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 단백질 부재 배양 배지가 제공된다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘, 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘, 또는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 단백질 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 단백질 부재 배양 배지가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 또는 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 단백질 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 단백질 부재 배양 배지가 제공된다.
2. 올리고펩티드 부재 배양 배지
특정 측면에 있어서, 본 발명은 외인성 부가된 올리고펩티드가 없는, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지를 제공한다. 한 구체예에서, 외인성 부가된 올리고펩티드가 없고(즉, 올리고펩티드 부재), 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지가 제공된다. 특정 구체예에서, 올리고펩티드 부재 배양 배지는, 예를 들면, 적어도 2mg/L, 또는 2 내지 30mg/L 또는 약 2 내지 30mg/L, 또는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 농도로 폴리아민을 함유한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 예시적인 올리고펩티드 부재 배양 배지가 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217과, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 교시되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM, 적어도 5μM 또는 약 5μM, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM, 또는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 올리고펩티드 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 올리고펩티드 부재 배양 배지가 제공된다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘, 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘, 또는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 올리고펩티드 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 올리고펩티드 부재 배양 배지가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 또는 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 올리고펩티드 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 올리고펩티드 부재 배양 배지가 제공된다.
3. 혈청 부재 배양 배지
특정 측면에 있어서, 본 발명은 혈청이 없는, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지를 제공한다. 한 구체예에서, 외인성 부가된 혈청이 없고(즉, 혈청 부재), 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지가 제공된다. 특정 구체예에서, 혈청 부재 배양 배지는, 예를 들면, 적어도 2mg/L, 또는 2 내지 30mg/L 또는 약 2 내지 30mg/L, 또는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 농도로 폴리아민을 함유한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 예시적인 혈청 부재 배양 배지가 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217과, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 교시되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM, 적어도 5μM 또는 약 5μM, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM, 또는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 혈청 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 혈청 부재 배양 배지가 제공된다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘, 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘, 또는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 혈청 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 혈청 부재 배양 배지가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 또는 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 혈청 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 혈청 부재 배양 배지가 제공된다.
4. 동물 단백질 부재 배양 배지
특정 측면에 있어서, 본 발명은 동물 단백질이 없는, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지를 제공한다. 한 구체예에서, 외인성 부가된 동물 단백질 또는 폴리펩티드가 없고(즉, 동물 단백질 부재), 아연, 칼슘 및/또는 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 배양 배지가 제공된다. 특정 구체예에서, 동물 단백질 부재 배양 배지는, 예를 들면, 적어도 2mg/L, 또는 2 내지 30mg/L 또는 약 2 내지 30mg/L, 또는 2 내지 8mg/L 또는 약 2 내지 8mg/L의 농도로 폴리아민을 함유한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 예시적인 동물 단백질 부재 배양 배지가 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217과, 미국 공개 특허원 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 교시되어 있으며, 이들 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.
한 구체예에서, 적어도 2μM 또는 약 2μM, 적어도 5μM 또는 약 5μM, 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM, 또는 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 동물 단백질 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 동물 단백질 부재 배양 배지가 제공된다.
다른 구체예에서, 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘, 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘, 또는 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 동물 단백질 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 동물 단백질 부재 배양 배지가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3), 또는 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 동물 단백질 부재 배양 배지가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 적어도 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유하는 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 발현을 위한 동물 단백질 부재 배양 배지가 제공된다.
V. ADAMTS 단백질 정제
ADAMTS13은 vWF의 큰 다합체를 절단하여 응고 활성을 조절하는 작용을 하는 경우에, 생체 내에서 혈장으로 분비된다. 발현 후 포유동물 세포의 ADAMTS13을 분비하는 능력은 세포 배양시 ADAMTS13 조성물의 제조 및 정제 도중 이용될 수 있다. 예를 들면, 포유동물 세포 배양물에서 재조합 ADAMTS13을 발현시킴으로써, ADAMTS13 조성물은 세포를 수확하거나 분해할 필요없이, 배양물 상청액으로부터 직접 용이하게 회수할 수 있다. 이는 다중 배양 지연 및 회수 기간없이 다량의 단백질을 제조하는 기술, 예를 들면, 연속식 세포 배양(예: 관류 또는 케모스태트 세포 배양)의 사용을 허용한다. 본 발명의 한 측면에 있어서, 세포 배양물로부터 특이적 활성이 높은 ADAMTS 단백질의 정제 방법이 제공된다.
따라서, 한 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 배양물에서 발현되어, 배양물 상청액으로부터 직접 회수된다. 이러한 방식으로, ADAMTS13 단백질은 배양물의 분획을 제거하고, 상청액의 다른 성분으로부터 ADAMTS13을 정제함으로써 회수된다. 일반적으로, 이는 여과 또는 원심분리에 의해 상청액을 따라 회수되는 세포의 분리 및 하나 이상의 ADAMTS13 정제 단계에 상청액을 적용시킴을 포함한다.
이의 기술이 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된, 미국 공개 특허원 제2005/0266528호 및 Zheng et al.,(2001, Blood, 98:1662-1666)은 ADAMTS13의 예시적인 정제 방법을 제공한다. 정제된 ADAMTS13은 통상적인 방법에 따라 제형화되어, 예를 들면, TTP를 치료하기 위하여 치료학적으로 사용될 수 있다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)의 제조 방법을 제공한다. 처음 구체예에서, 상기 방법은 (a) 동물 단백질 부재 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시키는 단계; (b) 배양물로부터 상청액의 분획을 제거하는 단계; (c) 잔류하는 세포를 제거하기 위하여 여과 또는 원심분리 단계를 수행하는 단계; (d) ADAMTS 단백질을 농축시키기 위하여 한외여과 단계를 수행하는 단계 및 (e) 적어도 약 0.5μM의 아연 및 적어도 약 0.1mM의 칼슘을 포함하는 완충액을 사용한 정용여과 단계를 수행함으로써, ADAMTS 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 세포의 배양 단계는 배치식 세포 배양을 포함한다. 한 구체예에서, 세포의 배양 단계는 연속식 세포 배양을 포함한다.
특정 구체예에서, 배양 배지는 칼슘을 함유한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 0.5mM의 칼슘을 함유한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 특정 구체예에서, 정용여과 완충액은 적어도 약 5μM의 아연 및 적어도 약 2mM의 칼슘을 함유한다.
특정 구체예에서, ADAMTS13 특이적 활성의 약 20% 미만은 단계 (c)의 말기 및 단계 (e)의 말기 사이에 손실된다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 특이적 활성의 약 10% 미만은 단계 (c)의 말기 및 단계 (e)의 말기 사이에 손실된다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 적어도 약 1000U/㎎의 특이적 활성을 갖는다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 적어도 약 1500U/㎎의 특이적 활성을 갖는다.
A. 완충액 교환
통상적으로, 배양물 상청액으로부터 분비된 단백질을 정제하는 경우에, 정제 과정의 제1 단계는 관심있는 단백질의 추가 정제를 용이하게 하는, 완충액으로 배양 배지를 교환함을 포함한다. 제한 없이, 정용여과, 투석, 완충액 교환 기술, 겔 투과 및 크로마토그래피 등을 포함한, 몇몇 옵션이 배양 배지를 완충액으로 교환하기 위하여 존재한다.
ADAMTS13 단백질 조성물은 배양물로부터 상청액의 수확와 정제 단계 사이에 시간의 길이에 무관하게, 새로운 완충액의 도입을 필요로 하는 상기 정제 단계, 예를 들면, 정용여과, 투석, 완충액 교환, 크로마토그래피 및 유사한 단계 도중 이들의 특이적 활성의 상당 비율이 손실되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 유용하게는, 본 발명자는 정용여과, 투석, 완충액 교환, 겔 투과 및 크로마토그래피 단계와 같은 시스템으로 도입되는 완충액에 아연 및 칼슘을 포함함으로써, ADAMTS13 조성물의 높은 특이적 활성이 유지됨을 발견하였다. 이의 입증으로서, 실시예 6은 칼슘 및 아연이 결여된 완충액에 의한 ADAMTS13 조성물의 정용여과가 평균적으로 조성물의 특이적 활성의 거의 25% 손실을 야기하는 반면에, 칼슘 및 아연의 포함은 이 손실을 거의 전적으로 방지한다고 설명하고 있다(표 22). 따라서, 본 발명은 완충액 시스템으로 아연 및 칼슘의 포함에 의해, 정용여과, 또는 유사한 방법, 예를 들면, 투석, 완충액 교환, 크로마토그래피 후 ADAMTS 단백질 조성물에 대한 활성 손실의 감소 방법을 제공한다.
한 구체예에서, (a) 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시키는 단계; (b) ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 함유하는 배양 배지 상청액의 일부를 회수하는 단계 및 (c) 배양 배지 상청액을 아연 및 칼슘을 함유하는 완충액으로 교환시켜, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물의 정제 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연, 칼슘 및 선택적으로 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 바람직한 구체예에서, 세포의 배양 단계는 연속식 배양(예: 관류 또는 케모스태트 배양)을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 배양물은 34 내지 37℃의 온도에서 유지한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 배양물은 6.9 내지 7.2의 pH에서 유지한다.
한 특정 구체예에서, 배양 배지 상청액을 완충액으로 교환시키는 단계는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 0.5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유하는 완충액의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 완충액은 적어도 2mM 또는 약 2mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 농도는 적어도 약 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 5mM 또는 그 초과의 칼슘일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연의 농도는 적어도 약 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM 또는 그 초과의 아연일 수 있다. 일반적으로, 상기 농도의 조합은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.
한 구체예에서, 칼슘 및 아연을 함유하는 완충액에 의한 완충액 교환(예: 정용여과, 투석, 겔 투과 등)을 수행함으로써 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13)의 완충액을 교환하는 방법이 제공된다. 한 특정 구체예에서, 상기 방법은 적어도 0.5mM 또는 약0.5mM의 칼슘 및 적어도 0.5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유하는 완충액의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 완충액은 적어도 1mM 또는 약 1mM의 칼슘 및 적어도 1μM 또는 약 1μM의 아연을 함유한다. 한 구체예에서, 완충액은 적어도 2mM 또는 약 2mM의 칼슘 및 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 함유한다. 다른 구체예에서, 완충액은 적어도 2mM 또는 약 2mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 완충액은 0.5 내지 5mM의 칼슘 및 0.5 내지 5μM의 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 농도는 적어도 약 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 5mM 또는 그 초과의 칼슘일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연의 농도는 적어도 약 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM 또는 그 초과의 아연일 수 있다. 특정 구체예에서, 수확, 세포 부재 상청액 또는 정용여과 완충액은 상기 언급한 농도로 칼슘 및 아연의 조합을 함유한다.
다른 구체예에서, ADAMTS 용액을 농축시키기 위하여 또는 ADAMTS 용액의 완충액 교환을 위해 사용되는 세포 함유 수확, 세포 부재 상청액 또는 정용여과 완충액을 칼슘 및 아연으로 보충함을 포함하는, 세포 배양물에서 발현 후 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)의 효소 활성의 안정화 방법이 제공된다. 한 특정 구체예에서, 상기 방법은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 0.5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유하는 완충액의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 완충액은 적어도 2mM 또는 약 2mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 농도는 적어도 약 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 5mM 또는 그 초과의 칼슘일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연의 농도는 적어도 약 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM 또는 그 초과의 아연일 수 있다. 특정 구체예에서, 수확, 세포 부재 상청액 또는 정용여과 완충액은 상기 언급한 농도로 칼슘 및 아연의 조합을 함유한다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 제공된 상기 방법은 개개 단계 도중 존재하는 특이적 활성의 15% 미만의 손실을 야기한다. 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 제공된 상기 방법은 개개 단계 도중 존재 후 특이적 활성의 10% 미만의 손실을 야기한다. 특별한 구체예에서, 회수된 배양물 상청액에 존재하는 특이적 활성의 15% 미만이 초기 완충액 교환 단계(예: 정용여과 또는 투석) 도중 손실된다. 바람직한 구체예에서, 회수된 배양물 상청액에 존재하는 특이적 활성의 10% 미만이 초기 완충액 교환 단계(예: 정용여과 또는 투석) 도중 손실된다.
B. 크로마토그래피
특정 구체예에서, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물은 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의해 추가로 강화된다. 한 구체예에서, (a) 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시키는 단계; (b) ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 함유하는 배양 배지 상청액의 일부를 회수하는 단계; (c) 배양 배지 상청액을 아연 및 칼슘을 함유하는 완충액으로 교환시켜, 처음 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물을 형성하는 단계 및 (d) ADAMTS 단백질을 크로마토그래피 단계에 의해 추가로 강화시켜, 강화된 ADAMTS(예: ADAMTS13) 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 강화된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물의 제공 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연, 칼슘 및 선택적으로 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 바람직한 구체예에서, 세포의 배양 단계는 연속식 배양(예: 관류 또는 케모스태트 배양)을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 배양물은 34 내지 37℃의 온도에서 유지한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 배양물은 6.9 내지 7.2의 pH에서 유지한다.
한 특정 구체예에서, 완충액에 의한 배양 배지 상청액의 교환 단계 및/또는 크로마토그래피 단계는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 0.5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유하는 완충액의 사용을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 두 단계는 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 0.5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유하는 완충액의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 완충액은 적어도 2mM 또는 약 2mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 농도는 적어도 약 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 5mM 또는 그 초과의 칼슘일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연의 농도는 적어도 약 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM 또는 그 초과의 아연일 수 있다. 일반적으로, 상기 농도의 조합은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.
한 구체예에서, 크로마토그래피 단계에 사용되는 완충액(들)을 아연 및 칼슘으로 보충시켜 크로마토그래피 도중 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물의 특이적 활성을 유지하는 방법이 제공된다. 한 특정 구체예에서, 상기 방법은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 0.5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유하는 완충액의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 완충액은 적어도 2mM 또는 약 2mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 농도는 적어도 약 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 5mM 또는 그 초과의 칼슘일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연의 농도는 적어도 약 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM 또는 그 초과의 아연일 수 있다. 일반적으로, 상기 농도의 조합은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.
ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)을 정제하기 위하여 사용될 수 있는 크로마토그래피 기술의 비제한적 예는 음이온 교환 크로마토그래피(AEC), 양이온 교환 크로마토그래피(CEC), 소수성 교환 크로마토그래피(HIC), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(HAP), 면역-친화성 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피(즉, 겔 투과) 또는 다른 적합한 크로마토그래피 단계를 포함한다. 크로마토그래피 단계는 배치식 또는 칼럼 형태로 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 이들 크로마토그래피 기술을 수행하는데 사용되는 완충액은 아연 및 칼슘을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 상기 방법은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘 및 적어도 0.5μM 또는 약 0.5μM의 아연을 함유하는 완충액의 사용을 포함한다. 다른 구체예에서, 완충액은 적어도 2mM 또는 약 2mM의 칼슘 및 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 함유한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 농도는 적어도 약 0.1mM, 0.3mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 5mM 또는 그 초과의 칼슘일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연의 농도는 적어도 약 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 5μM, 10μM 또는 그 초과의 아연일 수 있다. 일반적으로, 상기 농도의 조합은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다.
적합한 음이온 교환 수지가 본 명세서에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 사용하기에 적합한 음이온 교환 수지의 비제한적 예는 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 암모늄(Q) 수지를 포함한다.
적합한 양이온 교환 수지가 본 명세서에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 사용하기에 적합한 양이온 교환 수지의 비제한적 예는 카복시메틸(CM), 술포프로필(SP), 메틸 술포네이트(S) 수지를 포함한다.
적합한 하이드록시아파타이트 또는 다른 칼슘-계 수지가 본 명세서에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 적합한 수지의 비제한적 예는 하이드록시아파타이트 수지, 플루오르아파타이트 수지, 플루오르하이드록시아파타이트 수지 등을 포함한다.
적합한 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지가 본 명세서에 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 적합한 수지의 비제한적 예는 페닐-수지, 메틸-수지, 부틸-수지 및 옥틸-수지 등을 포함한다.
특정 구체예에서, ADAMTS13 단백질(예: ADAMTS13)은, 예를 들면, 항체, 압타머(aptamer), 또는 ADAMTS13 단백질(예: ADAMTS13)에 상당히 특이적인 다른 결합 분자에 콘쥬게이트된 수지에 의한 면역-친화성 크로마토그래피에 의해 추가로 강화시킬 수 있다.
한 구체예에서, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 완충액 교환, 정용여과, 투석, 겔 투과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 나노여과, 한외여과 및 멸균 여과 등을 포함한, ADAMTS 활성 손실의 감소 방법은 개개 단계 도중 20% 미만의 순 손실을 야기한다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 개개 단계 도중 존재하는 특이적 활성의 15% 미만의 손실을 야기한다. 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 개개 단계 도중 존재 후 특이적 활성의 10% 미만의 손실을 야기한다. 특별한 구체예에서, 회수된 배양물 상청액에 존재하는 특이적 활성의 15% 미만이 초기 완충액 교환 단계(예: 정용여과 또는 투석) 도중 손실된다. 바람직한 구체예에서, 회수된 배양물 상청액에 존재하는 특이적 활성의 10% 미만이 초기 완충액 교환 단계(예: 정용여과 또는 투석) 도중 손실된다.
C. 바이러스 비활성화 및/또는 제거
특정 구체예에서, ADAMTS(예: ADAMTS13) 조성물의 제조를 위해 본 명세서에 제공되는 방법은 적어도 하나의 바이러스성 비활성 또는 제거 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 적어도 2개 또는 적어도 3개의 바이러스성 비활성화 또는 제거 단계를 포함한다. 본 명세서에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 바이러스성 비활성화 또는 제거 단계의 비제한적 예는 용매 세제 처리(Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 및 Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, 이의 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 확실히 인용된다), 나노여과(Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 및 Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, 이의 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 확실히 인용된다)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 용매 세제 처리 및 나노여과를 포함한 ADAMTS(예: ADAMTS13) 조성물의 제조 방법을 제공한다.
한 구체예에서, (a) 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시키는 단계; (b) ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 함유하는 배양 배지 상청액의 일부를 회수하는 단계; (c) 배양 배지 상청액을 아연 및 칼슘을 함유하는 완충액으로 교환시켜, 처음 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물을 형성하는 단계; (d) 선택적으로, ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 크로마토그래피 단계에 의해 추가로 강화시키는 단계 및 (e) 적어도 하나의 바이러스 비활성화 또는 제거 단계를 수행함으로써, 바이러스 안정성이 보증된 ADAMTS(예: ADAMTS13) 조성물을 제공하는 단계를 포함하는, 바이러스 안정성이 보증된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물의 제공 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 배양 배지는 아연, 칼슘 및 선택적으로 니코틴아미드(비타민 B3)를 함유한다. 바람직한 구체예에서, 세포의 배양 단계는 연속식 배양(예: 관류 또는 케모스태트 배양)을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 배양물은 34 내지 37℃의 온도에서 유지한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 배양물은 6.9 내지 7.2의 pH에서 유지한다. 한 구체예에서, 바이러스 제거 단계는 나노여과이다.
1. 용매 및 세제(S/D) 처리
ADAMTS 배양물에 존재할 수 있는 다양한 바이러스 오염물을 비활성시키기 위하여, 하나 이상의 ADAMTS(예: ADAMTS13) 중간체 용액을 용매 세제(S/D) 처리에 적용시킬 수 있다. 용액의 세제 처리 방법이 당해 분야에 잘 공지되어 있다(검토를 위해, 참조: Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42, 이들의 기술은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 확실히 인용된다). 일반적으로, 표준 S/D 처리는 본 명세서에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, S/D 처리에 대한 예시적 방법이 하기에 제공된다.
한 구체예에서, Triton X-100, Tween-20, 및 트리(n-부틸)포스페이트 (TNBP)는 각각 1.0%, 0.3% 및 0.3% 또는 약 1.0%, 0.3% 및 0.3%의 최종 농도로 ADAMTS(예: ADAMTS13) 중간체 용액에 부가된다. 그 다음에, 혼합물을 적어도 약 1시간 동안 18 내지 25℃ 또는 약 18 내지 25℃의 온도에서 교반한다.
2. 나노여과 및 한외/정용여과
본 명세서에 제공된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13) 조성물의 바이러스 부하를 감소시키기 위하여, 조성물은 적절한 나노여과 장치를 사용하여 나노여과시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 나노여과 장치는 평균 기공 크기가 15 내지 200㎚ 또는 약 15 내지 200㎚이다. 이 용도에 적합한 나노필터의 예는 제한없이, DVD, DV 50, DV 20(Pall), Viresolve NFP® Viresolve NFR®(Millipore), Planova®15N, 20N, 35N, 및 75N(Planova)을 포함한다. 특정 구체예에서, 나노필터는 평균 기공 크기가 15 내지 72㎚ 또는 약 15 내지 72㎚, 또는 19 내지 35㎚ 또는 약 19 내지 35㎚, 또는 15㎚, 19㎚, 20㎚, 35㎚ 또는 72㎚나, 약 15㎚, 19㎚, 20㎚, 35㎚ 또는 72㎚일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 나노필터는 평균 기공 크기가 19㎚, 20㎚ 또는 35㎚, 또는 약 19㎚, 20㎚ 또는 35㎚(예: Asahi PLANOVA®20N 또는 PLANOVA®35N 필터 또는 이의 등가물)이다.
나노여과에 이어서, 여액은 선택적으로 한외여과에 의해 농축시키고/시키거나, 완충액 조성물은 정용여과에 의해 조절할 수 있다. 특정 구체예에서, 한외여과는 개방 채널 스크린(open channel screen)이 있는 카세트에서 수행하며, 한외여과 막은 공칭 분획분자량(NMWCO: nominal molecular weight cut off)이 175kD 미만 또는 약 175kD 미만 또는, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 미만 또는 약 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 미만, 또는 더 적은 kDa이다. 바람직한 구체예에서, 한외여과 막은 NMWCO가 30kDa 이하이다. 다른 바람직한 구체예에서, 한외여과 막은 NMWCO가 30kDa 이하이다.
3. 동결건조 및 열 처리
또 다른 구체예에서, 이미 다른 바이러스 비활성화 또는 제거 단계(예: 나노여과)에 적용될 수 있는, 동결건조된 ADAMTS13 단백질(예: ADAMTS13) 조성물의 바이러스 활성은 동결건조된 조성물의 열 처리에 의해 추가로 감소시킬 수 있다. 혈액 인자 중 바이러스성 부하의 비활성화를 위한 열 처리가 당해 분야에 잘 공지되어 있다(참조 예: Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40).
VI. ADAMTS 조성물
유용하게는, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된 세포 배양물에서 발현된 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)이 예상밖으로 높은 특이적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, 특이적 활성이 높은 상기 ADAMTS 단백질의 연속 발현 및 회수를 위한 방법이 개발되었다. 예를 들면, 본 명세서에 제공된 연속식 세포 배양 방법은 1주 보다 더 긴 동안 특이적 활성이 1000U/㎎을 초과하는 하루에 ℓ당 1㎎을 초과하는 ADAMTS13의 발현을 허용한다. 유사하게, ADAMTS13 단백질의 정제 도중 통상 직면하는 활성의 손실을 감소시키는 방법이 또한 본 명세서에 제공된다.
따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 방법에 따라 세포 배양물에서 발현된 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)을 제공한다. 예를 들면, 단백질이 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로부터 선택된 적어도 하나의 성분으로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시킴으로써 발현되는, ADAMTS 단백질 조성물이 제공된다. 또한, 본 명세서에 제공된 방법에 따라 정제되는 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)이 제공된다. 예를 들면, 완충액 교환 단계를 포함하는 방법에 따라 정제된 ADAMTS 단백질 조성물이 제공되며, 이때 교환 완충액은 아연 및 칼슘을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질 조성물은 ADAMTS13 조성물이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 명세서에 제공된 방법에 따라 세포 배양물에서 ADAMTS 단백질의 발현을 포함하는 방법에 의해 제조되는 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)을 제공한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
관련 측면에 있어서, 본 발명은 배양 배지로부터 ADAMTS 단백질의 정제 도중적어도 하나의 완충액에 아연 및 칼슘 모두의 함유를 포함하는 방법에 의해 제조되는 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)을 제공한다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
본 발명은 본 명세서에 제공된 방법에 의해 제조되는 ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)을 제공한다. 한 구체예에서, ADAMTS 조성물(예: ADAMTS13 조성물)은 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로부터 선택된 적어도 하나의 성분으로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 특정 구체예에서, ADAMTS 조성물은 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로부터 선택된 적어도 두 개의 성분으로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 또 다른 구체예에서, 배양 배지는 칼슘, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충한다. 일부 구체예에서, 배양 배지는 동물 단백질 부재, 올리고펩티드 부재 또는 화학적으로 규명된 배지일 수 있다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)은 적어도 2μM 또는 약 2μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 적어도 5μM 또는 약 5μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 한 구체예에서, 상기 조성물은 2 내지 12μM 또는 약 2 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 5 내지 12μM 또는 약 5 내지 12μM의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 적어도 2μM 또는 약 2μM, 또는 적어도 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 그 초과의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 다른 구체예에서, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 현탁 형태로 작동되는 케모스태트, 터비도스탯, 또는 관류 배양 조건하에 수행한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 방법은 부착 형태로 작동되는 케모스태트, 터비도스탯, 또는 관류 배양 조건하에 수행한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 배치식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 현탁 형태로 작동되는 단일-배치식, 반복-배치식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 방법은 부착 형태로 작동되는 단일-배치식, 반복-배치식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 한 구체예에서, ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)의 한 구체예에서, ADAMTS 단백질의 발현에 사용되는 배양 배지는 적어도 약 2 내지 적어도 약 12μM의 최종 농도로 아연으로 보충할 수 있다. 특정 구체예에서, 배양 배지는 적어도 약 2μM, 또는 적어도 약 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 20μM, 25μM, 30μM, 또는 보다 높은 수준의 아연의 최종 농도로 아연으로 보충할 수 있다. 일반적으로, 아연 염이 본 발명의 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있으며, 허용되는 염의 비제한적 예는 ZnSO4·7H2O, ZnSO3·2H2O, (C6H5O7)2Zn3·2H2O, ZnBr2, ZnBr2·2H2O, ZnCl2, Zn (NO3)2·6H2O, Zn(H2PO4)2·H2O, (C2H3O2)2Zn·2H2O 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 아연의 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위하여 사용된다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
다른 구체예에서, ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 다른 구체예에서, ADAMTS 조성물은 적어도 1.5mM 또는 약 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 한 구체예에서, ADAMTS 조성물은 0.5 내지 1.5mM 또는 약 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS 조성물은 적어도 0.5mM 또는 약 0.5mM이나, 적어도 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM 또는 약 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM, 0.9mM, 1.0mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM, 1.7mM, 1.8mM, 1.9mM, 2.0mM, 2.25mM, 2.5mM, 2.75mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 또는 그 초과의 칼슘을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 다른 구체예에서, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 현탁 형태로 작동되는 케모스태트, 터비도스탯, 또는 관류 배양 조건하에 수행한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 방법은 부착 형태로 작동되는 케모스태트, 터비도스탯, 또는 관류 배양 조건하에 수행한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 배치식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 현탁 형태로 작동되는 단일-배치식, 반복-배치식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 방법은 부착 형태로 작동되는 단일-배치식, 반복-배치식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 한 구체예에서, ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
일반적으로, 칼슘 염이 본 발명의 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있다. 허용되는 염의 비제한적 예는 CaCl2, CaCl2, CaFPO3·2H2O, CaI2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3·2H2O 등을 포함한다. 특정 구체예에서, 칼슘의 약제학적으로 허용되는 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위하여 사용된다.
다른 구체예에서, ADAMTS 단백질 조성물(예: ADAMTS13 조성물)은 적어도 2mg/L 또는 약 2mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 다른 구체예에서, ADAMTS 조성물은 적어도 7mg/L 또는 약 7mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 한 구체예에서, ADAMTS 조성물은 2 내지 10mg/L 또는 약 2 내지 10mg/L의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS 조성물은 적어도 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 약 2mg/L, 3mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L, 7mg/L, 8mg/L, 9mg/L, 10mg/L, 15mg/L, 20mg/L, 또는 그보다 높은 농도의 니코틴아미드(비타민 B3)를 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 포유동물 세포를 배양시켜 제조한다. 한 구체예에서, 배양물은 35 내지 37℃ 또는 약 35 내지 37℃에서 유지한다. 특정 구체예에서, 배양물은 36℃ 또는 약 36℃에서 유지한다. 다른 구체예에서, 배양물의 pH는 6.9 내지 7.3 또는 약 6.9 내지 7.3에서 유지한다. 한 구체예에서, 배양물의 온도 및/또는 pH는 적어도 7일 동안 유지한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 연속식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 현탁 형태로 작동되는 케모스태트, 터비도스탯, 또는 관류 배양 조건하에 수행한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 방법은 부착 형태로 작동되는 케모스태트, 터비도스탯, 또는 관류 배양 조건하에 수행한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 배치식 배양 조건하에 수행한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 현탁 형태로 작동되는 단일-배치식, 반복-배치식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 다른 특정 구체예에서, 상기 방법은 부착 형태로 작동되는 단일-배치식, 반복-배치식 또는 첨가식 배양 조건하에 수행한다. 한 구체예에서, ADAMTS 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포는 포유동물 세포이다. 특별한 구체예에서, 포유동물 세포는 햄스터, 인간 또는 마우스 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포주, HEK 293 세포주 또는 BHK 세포주이다. 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 동물 단백질 및/또는 폴리펩티드 부재 배양 배지에서 배양시킨다. 또 다른 구체예에서, 포유동물 세포는 합성 배양 배지에서 배양시키며, 이는 동물 단백질 및 폴리펩티드가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 한 구체예에서, 배양 배지는 0.5 내지 30㎎/L 또는 약 0.5 내지 30㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 배양 배지는 2 내지 8㎎/L 또는 약 2 내지 8㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리아민은 푸트레신이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 조성물은 아연 및 칼슘 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 특정 구체예에서, 아연 및 칼슘 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연 및 칼슘 농도는 변이 94 내지 변이 113(표 7) 중 하나이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 구체예에서, 배양은 관류 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 케모스태트 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 첨가식 또는 반복-배치식 배양이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 조성물은 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 특정 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 114 내지 변이 133(표 8) 중 하나이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 구체예에서, 배양은 관류 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 케모스태트 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 첨가식 또는 반복-배치식 배양이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 조성물은 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 모두로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 특정 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 134 내지 변이 149(표 9) 중 하나이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 구체예에서, 배양은 관류 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 케모스태트 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 첨가식 또는 반복-배치식 배양이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
한 구체예에서, ADAMTS 조성물은 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충된 배양 배지에서 ADAMTS 단백질(예: ADAMTS13)을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시켜 제조한다. 특정 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 본 명세서에 기술된 것들 중 어느 하나일 수 있다. 특정 구체예에서, 아연, 칼슘 및 니코틴아미드(비타민 B3) 농도는 변이 14 내지 변이 93(표 3 내지 표 6) 중 하나이다. 특정 구체예에서, 배양물은 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 5주, 6주, 7주, 또는 적어도 2개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개월 또는 더 긴 동안 유지된다. 한 구체예에서, 배양은 관류 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 케모스태트 배양이다. 다른 구체예에서, 배양은 첨가식 또는 반복-배치식 배양이다. 바람직한 구체예에서, ADAMTS 단백질은 ADAMTS13이다.
다른 구체예에서, 특이적 활성이 높은, 예를 들면, 특이적 활성이 적어도 600U/㎎ A13 단백질인 ADAMTS13 조성물이 제공된다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 700U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 800U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 900U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1000U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1100U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1200U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1300U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1400U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1500U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1600U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1700U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1800U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 1900U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 2000U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 2100U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 2200U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 2300U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 2400U/㎎이다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 조성물은 특이적 활성이 적어도 2500U/㎎이다.
VII. 실시예
실시예 1
첨가식 실험은 화학적으로 규명된 BACD-A13 배지에서 인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 HEK293 세포주 1020/1 013-2의 생물반응기 배양물을 사용하여 수행한다. 배양 배지를 부가의 아연으로 보충하는 효과를 연구한다.
인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 HEK293 세포는 20% 공기 포화의 용해 산소 농도를 사용하여 37℃에서 7.20의 인라인 조절된 pH 하에 블레이드 임펠러가 있는 1.5L 생물반응기에서 첨가식 세포-배양에 의해 배양시킨다. 세포 현탁액은 DMEM/F12 기본 화학적으로 규명된 배양 배지(BACD-A13; 표 12)를 함유하는 2개의 동일한 생물반응기로 옮긴다. 두 배양물을 DMEM/F12에서와 같이, 0.432㎎/L ZnSO4·7H2O에 의해 또는 1.432㎎/L의 최종 농도를 위한 1㎎/L ZnSO4·7H2O의 부가 보충에 의해 제조된 BACD-A13 배지에서 성장시킨다. 다른 방법으로, 두 개의 첨가식 배양물은 동일하게 처리되므로, 서로에 대해 직접 비교할 수 있다.
배양물 상청액에서 A13의 활성은 잔류하는 세포를 제거하기 위하여 상청액을 원심분리 또는 여과한 후 FRETS-VWF73 검정법에 의해 측정한다. A13의 총 양은 A13-특이적 항체를 사용하여 ELISA에 의해 측정한다(표 10). 표준 DMEM/F12 아연 농도를 갖는 BACD-A13 배지를 사용하는 배양물로부터의 상청액은 각각 3일째 및 6일째 A13 활성이 728 및 826mU/mL이다. 배양물에 대한 특이적 활성은 각각 482mU/㎍ 및 526mU/㎍ A13이다. 대조적으로, 단지 다소 개선된 A13 발현 수율을 가지면서(3일째 및 6일째 각각 7% 및 19%), Zn이 부가 보충된 배양물로부터의 상청액은 극적으로 개선된 전체 및 특이적 활성 A13 활성을 나타낸다(표 11). 표 10 및 표 11의 결과를 비교함으로써 알 수 있는 바와 같이, 0.432㎎/L ZnSO4·7H2O에서 성장시킨 배양물에 비하여, 1.432㎎/L ZnSO4·7H2O의 존재하에 성장시킨 배양물의 경우 전체 A13 FRETS-VWF73 활성은 3일째에 118% 더 높고(1589 대 728), 6일째에 61% 더 높다(1381 대 728). 유사하게, 보충된 배양물에서 A13 단백질의 특이적 활성은 3일째에 104% 더 높고(981 대 482mU/㎍), 6일째에 42% 더 높다(739 대 526mU/㎍).
생물반응기로부터 샘플을 취하여, ELISA에 의해 A13에 대해 분석하고, A13 활성을 FRETS-VWF73 검정법으로 측정한다. 세포 계수는 뉴클리오카운터(Nucleocounter) 기술에 의해 측정한다. 희석 속도를 측정하고, 성장 속도 및 용적 생산성의 계산을 위해 사용한다.
[표 10]
아연 보충없는 BACD-A13 배지를 사용하여 1.5L 생물반응기에서 수행되는 첨가식 배양물 1에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00010

[표 11]
아연 보충된 BACD-A13 배지를 사용하여 1.5L 생물반응기에서 수행되는 첨가식 실험에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00011

[표 12]
화학적으로 규명된 BACD-A13 세포 배양 배지의 조성
Figure 112015036638747-pct00012

Figure 112015036638747-pct00013

실시예 2
첨가식 실험은 화학적으로 규명된 BACD-A13 배지에서 인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포주 ＃938의 생물반응기 배양물을 사용하여 수행한다. 배양 배지를 부가의 아연 및/또는 비타민 B3으로 보충하는 효과를 연구한다.
인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포가 화학적으로 규명된 BCS 배지(BCS 배지)에 채택한다. Development Working Cell Bank＃01 (DWCB＃01)로부터 입수한 클론 ＃938을 해동시키고, 세포 접종물을 BCS 배지에서 제조한다. 세포를 블레이드 임펠러가 있는 2개의 1.5L 생물반응기로 옮기고, 20% 공기 포화의 용해 산소 농도를 사용하여 37℃에서 7.20의 인라인 조절된 pH 하에 등록상표된 BACD-A13 배지에서 첨가식 세포-배양에 의해 성장시킨다. 두 배양물을 DMEM/F12에서와 같이, 0.432㎎/L ZnSO4·7H2O에 의해 또는 1.432㎎/L의 최종 농도를 위한 1㎎/L ZnSO4·7H2O의 부가 보충에 의해 제조된 BACD-A13 배지에서 성장시킨다. 다른 방법으로, 두 개의 첨가식 배양물은 동일하게 처리되므로, 서로에 대해 직접 비교할 수 있다. 상청액을 4일째 및 7일째에 수확하고, A13 단백질 및 활성 수준에 대해 검정한다. 7일째 수확 후, 두 배양물은 7.02㎎/L의 최종 농도를 위해, 부가의 5㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)로 보충하고, 다시 4일 동안 동일한 조건하에 성장시킨다. 상청액을 다시 11일째에 수확하고, A13 단백질 및 활성 수준을 검정한다.
아연 보충 없이 성장시킨 제1 배양물에서, 수확된 상청액 중 A13 활성 수준은 4일째 및 7일째 각각 642 및 488mU/mL이다(표 13). 이들 상청액에 대한 특이적 활성은 4일째 및 7일째 각각 371 및 273mU/㎍이다. 앞서 실시예 1에서 알 수 있는 바와 같이, 부가의 아연으로 보충된 배양물 상청액에서 A13의 전체 및 특이적 활성은 상당히 증가된다(4일째 및 7일째 수확시 표 13 및 표 14 비교). 앞에서와 같이, 두 배양물에서 제조된 전체 A13은 유사하지만, 부가의 아연으로 보충된 제2 배양물의 상청액으로부터의 A13은 4일째 및 7일째 78% 및 75% 더 큰 특이적 활성뿐만 아니라, 4일째 및 7일째 40% 및 104% 더 큰 전체 활성을 갖는다(표 14 대 표 13). 총 A13 수율 및 세포 성장 속도를 포함한, 다른 파라미터는 부가의 아연 보충에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
7일째 상청액을 수확 후, 두 배양물은 부가의 5㎎/L의 니코틴아미드(비타민 B3)로 다시 보충하고, 다시 4일 동안 동일한 조건하에 성장시킨다. 상청액을 11일째에 앞에서와 같이 수확한다. 비타민 B3 보충으로 두 배양물의 상청액에서 발견되는 A13의 전체 FRETS-VWF73 활성 및 특이적 활성이 증가된다(표 13 및 표 14, 11일째). 주목할 만하게, 이들 값은 두 배양물에서 대략 두 배이다. 11일째, 부가의 아연 및 비타민 B3이 보충된 배양물 2로부터의 상청액은 배양물 1로부터 수확된 상청액에서보다 거의 200% 더 큰(2366 대 791mU/mL) 전체 활성 및 174% 더 큰(1189 대 432mU/㎍) 특이적 활성을 나타낸다.
니코틴아미드 단독에 의한 배지의 보충은 A13의 전체 활성(791mU/mL 대 488mU/mL; 7일째 및 11일째 표 13 비교) 및 특이적 활성(432mU/㎍ 대 273mU/㎍; 7일째 및 11일째 표 13 비교)의 약 60% 증가를 일으킨다. 유사하게, 아연 단독에 의한 보충은 A13의 전체 활성 및 특이적 활성의 약 70 내지 80% 증가를 일으킨다(4일째 및 7일째 표 13 및 표 14 비교). 놀랍게도, 니코틴아미드 및 아연 모두에 의한 배양 배지의 보충은 A13의 전체 활성의 약 300 내지 400%(표 14 11일째와 표 13 4일째 및 7일째 비교) 및 특이적 활성의 약 200 내지 300%(표 14 11일째와 표 13 4일째 및 7일째 비교)의 상승적 증가를 일으키며, 이는 아연 및 니코틴아미드의 효과 사이에 예상밖의 상승적 상호작용을 나타내는 것이다.
[표 13]
배치식 실험 CP_07/18_M04: hA13 CHO Klon ＃985/1 938 DWCB＃01에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00014

[표 14]
Figure 112015036638747-pct00015

실시예 3
인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포주 ＃640-2의 케모스태트 세포-배양물을 부가의 아연 및 비타민 B3이 보충된 화학적으로 규명된 BACD-A13 배지에서 성장시킨다. 10L 배양물을 53일 동안 유지하고, A13 단백질 및 활성 생성을 시간에 따라 모니터한다.
인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포가 화학적으로 규명된 등록상표된 배지(BCS 배지)에 채택된다. 세포 뱅크 바이알을 해동시키고, 세포 접종물을 BCS 배지에서 제조한다. A13 발현 클론 ＃640-2로부터 유도된 세포는 Rushton 형태 임펠러가 있는 10L 생물반응기로 옮기고, 20% 공기 포화의 용해 산소 농도를 사용하여 37℃에서 7.15 내지 7.20의 인라인 조절된 pH 하에 등록상표된 BACD-A13 배지에 의해 반복 배치식 배양으로 배양시킨다. 두 배치 배양물을 10L의 최종 작업 용적으로 성장시킨 후, 생물반응기를 5일째에 연속식 배지 공급물로 스위칭시키고, 케모스태트 형태로 다시 48일 동안 작동시킨다.
생물반응기로부터 상등액 샘플을 주 1회 취하고, ELISA에 의해 A13 단백질 생성 및 FRETS-VWF73 검정법에 의해 A13 활성에 대해 분석한다. 세포 계수는 뉴클리오카운터 기술에 의해 측정한다. 희석 속도를 측정하고, 성장 속도 및 용적 생산성의 계산을 위해 사용한다.
1.432㎎/L ZnSO4·7H2O 및 7.02㎎/L 니코틴아미드의 최종 농도로 아연 및 니코틴아미드를 보충한 화학적으로 규명된 BACD-A13 배지를 사용하는 연속식 배양 조건하에, 0.9 내지 1.3㎎/L/D의 A13 단백질 생성 및 약 800 내지 1100mU/㎍ A13의 특이적 활성의 높은 수준이 성취된다(표 15). 이들 결과는 실시예 2에서와 같이, CHO 클론 ＃938에 의해 성취되는 단백질 생성 및 특이적 활성과 일치한다. 주목할 만하게, 용적 및 세포 특이적 생산성은 아마도 시간에 따라 성장 속도 및 희석 속도가 증가되기 때문에, 오랜 기간 배양시 시간에 따라 증가된다. 발현된 A13의 높은 특이적 활성은 배양물이 케모스태트 조건하에 성장되는 적어도 전체 7주에 걸쳐 적어도 일정하게 높은 수준으로 유지될 수 있다. 실제로, 배양물에서 생성된 A13의 특이적 활성은 2주째 약 800mU/㎍ A13으로부터 7주째 약 1100mU/㎍ A13으로 실제로 증가된다.
[표 15]
연속식 배양 실험 CP_07/30_F02:hA13 CHO Klon ＃987/1 640-2에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00016

실시예 4
첨가식 및 케모스태트 세포-배양 실험은 화학적으로 규명된 BACD-A13 배지에서 인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포주 ＃640-2의 생물반응기 배양물을 사용하여 수행한다. 배양 배지를 상이한 크기의 아연으로 보충하는 효과를 연구한다.
인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포가 첨가식 형태로, 화학적으로 규명된 등록상표된 BCS 배지에 채택한다. 간단하게, DWCB＃05를 해동시키고, 세포 접종물을 BCS 배지에서 제조한다. 세포를 블레이드 임펠러가 있는 1.5L 생물반응기로 옮기고, 20% 공기 포화의 용해 산소 농도를 사용하여 37℃에서 7.20의 인라인 조절된 pH 하에 단 아연 보충은 없고, 7㎎/L의 최종 농도로 니코틴아미드로 보충된 등록상표된 BACD-A13 배지에서 성장시킨다. 그 다음에, 배치식 세포 현탁액은 상이한 Zn 보충하에(0.432㎎/L; 0.932㎎/L; 및 1.432㎎/L ZnSO4·7H2O의 최종 농도로 0㎎/L; 0.5㎎/L 및 1.0㎎/L ZnSO4·7H2O), 7㎎/L의 최종 농도로 니코틴아미드로 보충된 BACD-A13 배지를 함유하는 3개의 동일한 생물반응기로 나눈다.
BACD-A13 배지는 아연의 부가 보충하에 또는 보충없이 0.432㎎/L ZnSO4·7H2O를 포함한다. 또한, 배양물 및 배지는 동일하므로, 서로에 대해 직접 비교할 수 있다. 배양물은 약 1주 동안 첨가식 형태로 성장시키고, 상등액은 A13 단백질 생성 및 FRETS-VWF73 활성에 대해 검정한다. 그 다음에, 3개의 모든 생물반응기를 케모스태트 배양 형태로 스위칭시키고, 상기 기술한 바와 같이, 상이하게 아연이 보충된 배지를 사용하여 연속식 배양 조건하에 약 2주 동안 작동시킨다.
실시예 1 및 2에 보여진 결과와 일치하는, 첨가식 배양 조건하에, 0.5㎎/L 또는 1.0㎎/L ZnSO4·7H2O에 의한 배지의 보충은 부가의 아연으로 보충되지 않은 배지에 비하여(437mU/㎍), 상등액에서 A13 단백질의 특이적 활성을 상당히 증가시킨다(각각, 785mU/㎍ 및 876mU/㎍) (표 16). 앞에서와 같이, 총 A13 단백질 생성 및 특이적 세포 성장을 포함한, 다른 파라미터는 부가 아연에 의한 보충에 의해 영향받지 않는다.
[표 16]
부가의 아연 보충하에 및 보충없는 배지에서 인간 A13 발현의 첨가식 실험에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00017

생물반응기를 케모스태트 형태로 스위칭시킨 후, 배양물은 상기 기술한 바와 같이, 상이하게 아연이 보충된 배지를 사용하여 약 1주(2주째) 동안 연속식 배양 조건하에 성장시킨다. 생물반응기로부터 상등액 샘플을 주 1회 취하고, ELISA에 의해 A13 단백질 생성 및 FRETS-VWF73 검정법에 의해 A13 활성에 대해 분석한다. 첨가식 형태하에 성장시킨 배양물에 대해 보여지는 결과와 유사하게, 부가의 아연에 의한 연속식 배양 성장을 위해 사용되는 성장 배지의 보충은 보충이 없는 것에 비하여(553mU/㎍)(표17, 표18, 및표19), 1주 후 A13 특이적 활성의 실질적인 개선을 일으킨다(각각 0.5㎎/L 및 1.0㎎/L ZnSO4·7H2O 보충에 대해 697mU/㎍ 및 729mU/㎍).
이미, 연속식 세포-배양에서 발현되는 A13의 특이적 활성이 연장된 기간에 걸쳐 실제로 개선되는 것으로 나타났다(참조: 실시예 3). 이 결과가 반복될 수 있는 지를 연구하기 위하여, 부가의 아연으로 보충시킨 배지에서 성장시킨 배양물을 다시 1주 동안 계속한다. 표 18 및 표 19에서 알 수 있는 바와 같이, 두 배양물의 상등액 중 A13의 특이적 활성은 시간에 따라 다시 증가된다. 0.5㎎/L ZnSO4·7H2O로 보충된 배지의 상등액에서 발견되는 A13의 특이적 활성은 2주째 697mU/㎍으로부터 3주째 759mU/㎍으로 증가된다(표 18). 유사하게, 1.0㎎/L ZnSO4·7H2O로 보충된 배지의 상등액에서 발견되는 A13의 특이적 활성은 2주째 729mU/㎍으로부터 3주째 812mU/㎍으로 증가된다(표 19). 앞에서와 같이, 특이적 세포 성장은 부가의 아연에 의한 보충에 의해 영향받지 않는다. 그러나, 주목할 만하게, A13 단백질 생성은 아연으로 보충되지 않은 배양물에서의 생성에 비하여, 부가 아연으로 보충된 두 배양물에서 증가되는 것으로 나타났다.
[표 17]
아연의 부가 보충없는 케모스태트 세포-배양 실험에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00018

[표 18]
0.5㎎/L의 아연이 부가 보충된 케모스태트 세포-배양 실험에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00019

[표 19]
1.0㎎/L의 아연이 부가 보충된 케모스태트 세포-배양 실험에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00020

실시예 5
첨가식 및 케모스태트 세포-배양 실험은 화학적으로 규명된 BACD-A13 배지에서 인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포주 ＃F6의 생물반응기 배양물을 사용하여 수행한다. 배양 배지를 더 높은 수준의 아연으로 보충하는 효과를 연구한다.
인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포가 첨가식 형태로, 화학적으로 규명된 등록상표된 배지, BCS 배지에 채택한다. 채택된 모집단을 서브클로닝하고, 클론 ＃F6이 이로부터 유래된다.
간단하게, DWCB＃19를 해동시키고, 세포 접종물을 BCS 배지에서 제조한다. 세포를 블레이드 임펠러가 있는 3개의 1.5L 생물반응기로 옮기고, 각각 1.432㎎/L, 2.432㎎/L 및 3.432㎎/L ZnSO4·7H2O의 최종 농도를 위해 1.0㎎/L, 2.0㎎/L 및 3.0㎎/L ZnSO4·7H2O로 보충시킨 등록상표된 BACD-A13 배지에서 성장시킨다. 배양물은 20% 공기 포화의 용해 산소 농도를 사용하여 36℃에서 7.15의 인라인 조절된 pH 하에 성장시킨다.
배양물은 약 1주 동안 반복 배치식 형태(3개의 배치)로 성장시키고, 상등액은 A13 단백질 생성 및 FRETS-VWF73 활성에 대해 검정한다. 그 다음에, 3개의 모든 생물반응기를 케모스태트 배양 형태로 스위칭시키고, 상기 기술한 바와 같이, 상이하게 아연이 보충된 배지를 사용하여 연속식 배양 조건하에 10일 동안 작동시킨다.
첨가식 배양 조건하에, 증가량의 아연에 의한 배양 배지의 보충은 배양물 상등액에서 분비되는 A13의 특이적 활성을 추가로 증가시킨다. 상기 보고된 앞의 결과와 일관되게, 부가의 1.0㎎/L ZnSO4·7H2O에 의한 배지의 보충은 806mU/㎍의 높은 특이적 활성을 야기한다. 아연 농도에 있어서의 추가 증가, 즉 2.0㎎/L 및 3.0㎎/L에 의한 보충은 심지어 A13 특이적 활성의 보다 높은 수준을 야기한다(각각, 880mU/㎍ 및 889mU/㎍)(표 20). 앞에서와 같이, 총 A13 단백질 생성 및 특이적 세포 성장을 포함한, 다른 파라미터는 부가 아연에 의한 보충에 의해 영향받지 않는다.
[표 20]
아연의 부가 보충에 의한 배치식 실험에 대한 발효 데이터(3개 배치의 평균 데이터)
Figure 112015036638747-pct00021

생물반응기를 케모스태트 형태로 스위칭시킨 후, 배양물은 상기 기술한 바와 같이, 상이하게 아연이 보충된 배지를 사용하여 10일 동안 연속식 배양 조건하에 성장시킨다. 생물반응기로부터의 상등액 샘플은 ELISA에 의해 A13 단백질 생성 및 FRETS-VWF73 검정법에 의해 A13 활성에 대해 분석한다. 첨가식 형태하에 성장시킨 배양물에 대해 보여지는 결과와 달리, 보다 높은 수준의 아연에 의한 연속식 배양 성장을 위해 사용되는 성장 배지의 보충은 특이적 성장 속도 및 전반적인 세포 생존률을 감소시킨다. 부가의 1.0㎎/L ZnSO4·7H2O로 보충시킨 배지에서 성장시킨 케모스태트 배양물은 상기 기술한 앞의 결과와 일치하는 높은 세포 생존률(88.6%) 및 특이적 성장 속도(0.256/일)(표 21)를 계속해서 나타낸다.
대조적으로, 보다 높은 수준의 ZnSO4·7H2O, 2.0㎎/L 및 3.0㎎/L로 보충시킨 배지에서 성장시킨 배양물은 세포 생존률(각각, 72.1% 및 80.4%) 및 특이적 성장 속도(각각, 0.091 및 0.134/일)의 수준에 있어서 상당한 감소를 나타낸다. 그러나, 주목할 만하게, 두 배양물 상등액 중 A13의 특이적 활성은 높게 남는다(각각, 863mU/㎍ 및 771mU/㎍)(표 21).
[표 21]
아연의 부가 보충에 의한 케모스태트 세포-배양 실험에 대한 발효 데이터
Figure 112015036638747-pct00022

실시예 6
인간 A13 단백질은 50L 생물반응기에서 부가의 아연 및 니코틴아미드로 보충된 화학적으로 규명된 BACD-A13 배지에서 재조합 CHO 세포주 ＃640-2에서 발현된다. 배양물의 상등액을 하베스트 후, 아연 및 칼슘이 존재 및 존재하지 않는 완충액을 사용한 한외/정용여과(50kD) 단계의 비교를 수행한다.
인간 ADAMTS13을 발현시키는 재조합 CHO 세포가 화학적으로 규명된 등록상표된 배지, BCS 배지에 채택된다. 간단하게, DVCB를 해동시키고, 세포 접종물을 BCS 배지에서 제조한다. 세포는 10L 생물반응기를 통해 Rushton 형태 임펠러가 있는 50L 생물반응기로 옮기고, 20% 공기 포화의 용해 산소 농도를 사용하여 37℃에서 7.15 내지 7.20의 인라인 조절된 pH 하에 등록상표된 BACD-A13 배지에서 케모스태트 형태로 배양시킨다.
생물반응기로부터 상등액을 여과하고, 세포 부재 하베스트를 50kD PES 막을 사용하여 한외여과(농도 요인 대략 1:10)한 다음, pH 7.7에서 50mM NaCl 및 20mM TRIS를 함유하는 완충액 5용적을 사용하여 정용여과시킨다. 2mM Ca 및 5μM Zn의 존재 또는 부재하에 정용여과 완충액은 정용여과 및 크로마토그래피 정제 사이에 활성 손실의 효과를 측정하기 위하여 비교한다.
ELISA에 의해 검출되는 mU FRETS-VWF73/㎍ A13으로서 기록되는, 특이적 활성은 정용여과 직후 및 추가 정제를 위해 샘플을 부하하기 직전에 측정한다. 샘플은 최대 3일 동안(약 80시간 미만) 약 2 내지 8℃에서 저장한다. 샘플을 장기간 저장하는 경우에, 이들은 정용여과 말기 및 크로마토그래피 개시 사이에서 -15℃ 미만으로 유지한다. 샘플을 측정하고, 정용여과 직후 및 크로마토그래피 칼럼을 부하하기 직전에 비교한다.
한외/정용여과 단계와 부가의 정제 단계 사이에 비교적 짧은 유지 시간에도 불구하고, 정용여과 완충액에 아연 및 칼슘이 결여되는 경우에, A13 특이적 활성의 상당한 손실(23.3%)이 유발된다. 대조적으로, 2mM Ca 및 5μM Zn을 함유하는 정용여과 완충액이 사용되는 경우에, A13 특이적 활성의 손실(7.3%)은 상당히 감소된다(표 22).
[표 22]
칼슘 및 아연의 존재 및 부재하에 정용여과 완충액을 사용한 정용여과 실험의 결과
Figure 112015036638747-pct00023

실시예 7
케모스태트 및 관류 연속식 세포-배양법은 몇몇 재조합 CHO 세포주에서 발현되는 A13의 상대적 생성 및 특이적 활성을 측정하기 위하여 비교한다.
간단하게, 재조합 인간 A13을 발현시키는 재조합 CHO 세포의 상이한 클론이 접종물 제조를 위해 사용되는, 화학적으로 규명된 등록상표된 배지(BCS)에 채택된다. 세포는 1.432㎎/L ZnSO4·7H2O 및 7.02㎎/L 니코틴아미드의 최종 농도로 아연 및 니코틴아미드로 보충시킨 등록상표된 BACD-A13 배지 중 생물반응기 배양물에서 추가로 배양시킨다. 그 다음에, 각 세포 클론으로부터의 접종물을 두 생물반응기로 옮기고, 이들 중 하나는 표 23에 제시된 바와 같이, 케모스태트 조건(CST)하에 배양시키며, 다른 하나는 관류하에 배양시킨다. 세포는 Cytopore™ II 마이크로캐리어(GE Bioscience) 상에서 약 2×106 내지 4×106세포/㎖의 밀도로 배양시킨다.
배양물은 3 내지 4주 동안 연속식 배양 조건하에 성장시키고, 생물반응기로부터의 상등액 샘플은 ELISA에 의해 A13 단백질 생성 및 FRETS-VWF73 검정법에 의해 A13 활성에 대해 분석한다. 표 23에 제시된 값은 3 내지 4주간의 기간 동안 평균을 나타낸다. 상기 실시예 1 내지 6에서 수득된 결과와 일관되게, 케모스태트 하에 성장시킨 배양물은 약 700 내지 약 1000mU/㎍의 높은 특이적 활성을 갖는 약 1 내지 약 2㎎/L/d A13 단백질을 생성한다(표 23). 놀랍게도, 관류 배양 조건하에 성장시킨 배양물은 케모스태트 조건하에 성장시킨 동일한 클론보다 배양물 상등액 중 A13의 보다 높은 단백질 생성 및 활성 수준을 일관되게 나타낸다. 관류 배양시 제조된 A13에 대한 특이적 활성은 매우 높으며, 4개의 클론 중 3개는 적어도 약 1000mU/㎍을 나타낸다.
[표 23]
케모스태트 및 관류 세포-배양을 비교하는 실험으로부터의 결과
Figure 112015036638747-pct00024

실시예 8
화학적으로 규명된 동물 단백질 부재 배양 배지를 사용하여 진핵 세포 배양물에서 성장시킨 재조합 인간 ADAMTS13 단백질의 생성에 대한 온도 및 pH의 효과를 측정하기 위하여, 배양물은 35.0 내지 38.0℃의 온도 및 7.05 내지 7.30의 pH에서 성장시킨다.
간단하게, 인간 A13을 발현시키는 재조합 CHO 세포는 등록상표된 BACD-A13 배지 중, 블레이드 임펠러가 있는 1.5L 생물반응기로 옮긴다. 배양물은 20% 공기 포화의 용해 산소 농도를 사용하여 35.0 내지 38.0℃ 범위의 온도에서 7.05 내지 7.30의 인라인 조절된 pH 하에 성장시킨다. 실험은 반응 표면 접근법을 사용하여 고안하고 수행한다. 통계학적 분석은 통계학적 Software package Minitab® 15.1.0.0을 사용하여 수행한다.
생물반응기로부터 샘플을 취하고, ELISA에 의해 A13에 대해 분석하며, A13 활성은 FRETS-VWF73 검정법에 의해 측정한다. 세포 계수는 뉴클리오카운터 기술에 의해 측정한다. 희석 속도를 측정하고, 성장 속도 및 용적 생산성의 계산을 위해 사용한다.
도 1 및 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 온도 및 pH는 모두 용적 A13 생산성(FRETS-VWF73에 의해 측정, 도 1) 및 특이적 활성(ELISA에 의한 FRETS-VWF73 활성/항원, 도 2)에 대해 실질적인 효과를 갖는다. 특히, 최대 용적 FRETS 생산성은 약 7.05 내지 7.2, 특히 약 7.10의 보다 낮은 pH 범위 및 약 35.0 내지 37.0℃, 특히 약 36℃의 온도에서 성장시킨 배양물에서 성취된다. 특히, 최대 특이적 활성(ELISA에 의한 항원에 대한 FERTS-VWF73)은 약 7.05 내지 7.2, 특히 7.10 미만의 보다 낮은 pH 범위 및 약 35.0 내지 37.0℃, 특히 36℃ 미만의 온도에서 성장시킨 배양물에서 성취된다. 특히, A13 생성에 대한 최적의 조건은 최적 수율 및 생성물 품질면에서, 약 36℃의 온도 및 약 7.10의 pH의 조합에 의해 성취된다.
본 명세서에 기술된 실시예 및 실험은 단지 예시적 목적을 위한 것이고, 이의 측면에서 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 숙련가에게 제시될 것이며, 본 출원 및 첨부된 특허청구범위의 취지 및 범위 내에서 포함되는 것으로 이해해야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 이의 전문이 본 명세서에 참조로 인용된다.

Claims (59)

  1. 3μM 이상의 아연을 포함하는 배양 배지에서 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 들어있는 세포를 배양시키는 것을 포함하는, 트롬보스폰딘 모티프 13가 있는 디신테그린 및 메탈로프로테이나제(ADAMTS13) 단백질의 발현 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 3 내지 12μM의 아연을 함유하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 5μM의 아연을 함유하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 5 내지 12μM의 아연을 함유하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 0.5mM의 칼슘을 함유하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배양 배지가 0.5 내지 1.5mM의 칼슘을 함유하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 2㎎/L의 니코틴아미드를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 7㎎/L의 니코틴아미드를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 2 내지 10㎎/L의 니코틴아미드를 함유하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 0.5㎎/L의 폴리아민을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폴리아민이 푸트레신인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배양 배지가 2 내지 8㎎/L의 푸트레신을 함유하는 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 동물 단백질을 함유하지 않는 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 화학적으로 규명된(chemically defined) 배지인 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포 및 포유동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포주, 햄스터 세포주 및 마우스 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포주인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포주가 CHO 세포주, BHK 세포주 및 HEK 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 세포주가 CHO 세포주인 방법.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAMTS13 단백질을 암호화하는 핵산이 유도 프로모터(inducible promoter)를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배치식(batch) 세포 배양을 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 배치식 세포 배양이 반복-배치식(repeated-batch) 세포 배양인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 배치식 세포 배양이 첨가식(fed-batch) 세포 배양인 방법.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 연속식 세포 배양을 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 연속식 세포 배양이 연속식 현탁 세포 배양을 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 연속식 세포 배양이 연속식 부착 세포 배양을 포함하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 배양을 케모스태트(chemostat) 형태로 수행하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 배양을 관류 형태로 수행하는 방법.
  28. 제25항에 있어서, 마이크로캐리어(microcarrier)가 세포를 배양시키기 위해 사용되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 마이크로캐리어가 다공성 마이크로캐리어인 방법.
  30. 제23항에 있어서, 배양물을 적어도 7일 동안 유지하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 배양물을 적어도 1개월 동안 유지하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 배양물을 적어도 2개월 동안 유지하는 방법.
  33. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물을 35 내지 37℃의 온도에서 유지하는 방법.
  34. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양물을 6.9 내지 7.3의 pH에서 유지하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 배양물을 7.05 내지 7.15의 pH에서 유지하는 방법.
  36. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADAMTS13 단백질이 인간 ADAMTS13인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 배양 배지 중 상기 ADAMTS13 단백질의 특이적 활성이 적어도 600U/㎎ ADAMTS13 단백질인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 배양 배지 중 상기 ADAMTS13 단백질의 특이적 활성이 적어도 800U/㎎ ADAMTS13 단백질인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 배양물이 적어도 400U ADAMTS13 활성/배양물 L/일(U/L/D)로 수득되는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 배양물이 적어도 800U ADAMTS13 활성/배양물 L/일(U/L/D)로 수득되는 방법.
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