KR20210149117A - 재조합 단백질의 연속 생산 - Google Patents

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Abstract

본 개시 내용은 재조합 단백질의 연속 생산을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용은 재조합 단백질의 연속 생산을 위해 포집 크로마토그래피, 포집후 크로마토그래피, 바이러스 여과, 및 한외여과/정용여과를 사용하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.

Description

재조합 단백질의 연속 생산
본 출원은 2019년 4월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/828,755호의 이익을 주장하며, 그 개시 내용은 본원에 참조로서 명시적으로 포함된다.
본 개시 내용은 재조합 단백질의 연속 생산을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용은 재조합 단백질의 연속 생산을 위해 포집 크로마토그래피, 포집후 크로마토그래피, 바이러스 여과, 및 한외여과/정용여과를 사용하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
연속 제조는 석유화학 및 식품 생산과 같은 산업의 경우 일상적인 생산 방식이다. 연속 공정의 이점에는 정상 상태 작동, 장비 크기 감소, 대량 생산성, 간소화된 공정 흐름, 낮은 주기 시간 및 자본 비용 절감이 있다. 문헌[Konstantinov et al., J. Pharm. Sci. 104(3): 813-20 (2015)].
연속 제조는 바이오제약 산업에서 널리 구현되지 않았다. 업스트림 및 다운스트림 개발에 대한 기술 요구사항이 다소 다르기 때문에 지속적인 다운스트림 작업에 대한 경험은 제한적이다. 따라서, 바이오제약 산업을 위하여 작업자 상호작용을 최소화하면서 장기간 실행할 수 있는 통합된 연속 바이오프로세스에 대한 요구가 여전히 이루어지고 있다.
재조합 단백질의 연속 생산 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (a) 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 사용하여 실질적으로 무세포 샘플로부터 재조합 단백질을 포집하고, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템으로부터 재조합 단백질을 용리하여, 재조합 단백질을 포함하는 용출액을 생산하는 단계로서, 재조합 단백질을 포함하는 단일 혼합물로 단일 또는 다중 용출액이 균질화되는 단계, (b) 상기 단일 혼합물을 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템에 적용하고, 재조합 단백질을 포함하는 생성물 산출물을 수집하는 단계, 및 (c) 상기 생성물 산출물을 한외여과 및 정용여과에 적용하여 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 단계 (a)로부터 단계 (c)까지 통합되고, 연속적이다.
또한, 재조합 단백질의 생산을 위한 제조 시스템이 본원에 제공되며, 상기 제조 시스템은, (a) 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 생물반응기를 포함하는 제1 단위 작업, (b) 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 포함하는 제2 단위 작업, (c) 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템을 포함하는 제3 단위 작업, 및 (d) 한외여과 시스템 및 정용여과 시스템을 포함하는 제4 단위 작업을 포함한다.
또한, 재조합 단백질의 연속 생산 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, (a) 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 사용하여 실질적으로 무세포 샘플로부터 재조합 단백질을 포집하고, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템으로부터 재조합 단백질을 용리하여, 재조합 단백질을 포함하는 용출액을 생산하는 단계로서, 재조합 단백질을 포함하는 단일 혼합물로 상기 용출액이 균질화되는 단계, (b) 상기 균질화된 단일 혼합물을 바이러스 불활성화시키는 단계, (c) 단계 (b)로부터의 상기 균질화된 단일 혼합물을 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템에 적용하고, 재조합 단백질을 포함하는 생성물 산출물을 수집하는 단계, (d) 상기 단계의 생성물 산출물을 바이러스 여과에 적용하는 단계, 및 (e) 단계 (d)로부터의 생성물 산출물을 한외여과 및 정용여과에 적용하여 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 단계 (a)로부터 단계 (e)까지 통합되고, 연속적이다.
다른 양태, 실시형태 및 구현예는 해당되는 경우 첨부된 도면을 참조하여 하기의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 본원에 개시된 방법의 공정 흐름을 예시하는 개략도이다. 공정 흐름은 하기를 포함하는 인라인 완충액(in-line buffer)을 사용하여 재조합 단백질을 생산하기 위한 연속 공정을 포함한다: (1) 이중 교번 접선 유동(ATF) 필터 및 세포 분리와 결합된 생물반응기에서 재조합 단백질의 생산("BRX"로 표지됨), (2) 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 포집하여, 포집 크로마토그래피 시스템에 연결된 생물반응기로부터 수득된 배양 배지에 존재하는 재조합 단백질 포집("포집"으로 표시됨), (3) 배지의 바이러스 불활성화("VI"로 표시됨), (4) 상기 배지를 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템에 적용("포집후"로 표시됨), (5) 상기 배지의 바이러스 여과, 및 (6) 상기 배지의 한외여과/정용여과.
도 2a 및 2b는 본원에 개시된 방법 및 시스템의 단위 작업 통합의 개요를 도시한다. 도 2a는 각 작업 단위에 대한 연속 작업을 위한 단위 작업 통합 기간을 도시한다. 도 2b는 각 단위 작업에 대한 평균 단백질 체류 시간을 도시한다. 본원에 개시된 방법 및 시스템은 25일 동안 약 5 kg 의약 물질을 생성하였다.
도 3a 내지 3f는 본원에 개시된 방법 및 시스템에 대한 단백질 A 작업 성능을 나타내는 그래프이다. 도 3a는 단백질 A 용출액 농도(g/L)를 나타내고, 도 3b는 단백질 A 용출액 잔류 숙주 세포 단백질을 나타내고, 도 3c는 단백질 A 용출액 잔류 단백질을 나타내고, 도 3d는 단백질 A 입구 질량 흐름을 나타내고, 도 3e 및 3f는 단백질 A 자외선 크로마토그램을 나타낸다.
도 4a 내지 4g는 본원에 개시된 방법 및 시스템에 대한 바이러스 불활성화 작업 성능을 나타내는 그래프이다. 도 4a는 단위 작업 전반에 걸쳐 유지되는 바이러스 불활성화 pH를 나타내고, 도 4b는 불활성화 전 단백질 농도를 나타내고, 도 4c는 바이러스 불활성화 동안 단백질 질량 흐름을 나타내고, 도 4d는 바이러스 불활성화 동안 산 흐름을 나타내고, 도 4e는 바이러스 불활성화 동안 염기 흐름을 나타내고, 도 4f는 바이러스 불활성화 동안 고분자량 종을 나타내고, 도 4g는 바이러스 불활성화후 단백질 농도를 나타낸다.
도 5a 내지 5d는 본원에 개시된 방법 및 시스템에 대한 포집후 작업 성능을 나타내는 그래프이다. 도 5a는 포집후 용출액 잔류 단백질 A를 나타내고, 도 5b는 포집후 용출액 단백질 농도를 나타내고, 도 5c는 자외선 크로마토그램을 나타내고, 도 5d는 포집후 용출액 잔류 숙주 세포 단백질을 나타낸다.
도 6a는 본원에 기재된 방법 및 시스템에 대한 바이러스 여과의 개략도를 나타낸다. 도 6a 내지 6g는 본원에 개시된 방법 및 시스템에 대한 바이러스 여과 작업 성능을 나타내는 그래프이다. 도 6b는 바이러스 여과후 단백질 농도를 나타내고, 도 6c는 바이러스 여과 후 고분자량 종을 나타내고, 도 6d는 바이러스 여과 중 단백질 질량 플럭스를 나타내고, 도 6e는 바이러스 여과 중 여과액 부피 플럭스를 나타내고, 도 6f는 바이러스 여과 중 막횡단 압력을 나타내고, 도 6g는 바이러스 여과 중 필터 성능을 나타낸다.
도 7a 내지 7e는 본원에 개시된 방법 및 시스템에 대한 한외여과 작업 성능을 나타내는 그래프이다. 도 7a는 한외여과 후 단백질 농도 및 전환을 나타내고, 도 7b는 한외여과 중 필터 성능을 나타내고, 도 7c는 한외여과 중 입구 단백질 질량 플럭스를 나타내고, 도 7d는 한외여과 중 투과물 부피 플럭스를 나타내고, 도 7e는 한외여과 중 막횡단 압력을 나타낸다.
도 8a 내지 8e는 본원에 개시된 방법 및 시스템에 대한 정용여과 작업 성능을 나타내는 그래프이다. 도 8a는 정용여과 중 투과물 부피 플럭스를 나타내고, 도 8b는 정용여과 중 단백질 질량 플럭스를 나타내고, 도 8c는 정용여과 중 막횡단 압력을 나타내고, 도 8d는 정용여과 비율을 나타내고, 도 8e는 정용여과 동안 필터 성능을 나타낸다.
도 9a 내지 9h는 본원에 개시된 방법 및 시스템을 사용하여 생산된 의약 물질에 대한 속성을 보여주는 그래프이다. 도 9a는 의약 물질의 농도를 나타내고, 도 9b는 의약 물질의 고분자량 종을 나타내고, 도 9c는 의약 물질의 전하 프로파일을 나타내고, 도 9d는 의약 물질의 삼투압 농도를 나타내고, 도 9e는 의약 물질의 pH를 나타내고, 도 9f는 의약 물질에 대한 ELISA에 의해 측정된 숙주 세포 단백질을 나타내고, 도 9g는 의약 물질의 비-환원 순도를 나타내고, 도 9h는 의약 물질의 잔류 단백질 A를 나타낸다.
본 개시 내용은 재조합 단백질의 연속 생산을 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용은 재조합 단백질의 생산을 위해 포집 크로마토그래피, 포집후 크로마토그래피, 및 한외여과/정용여과를 사용하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법 및 시스템은 재조합 단백질의 연속적이고 시간-효율적인 생산을 제공한다.
본 개시 내용에 따라 이용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다.
일부 구현예에서, 재조합 단백질을 생산하기 위한 연속 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 사용하여 실질적으로 무세포 샘플로부터 재조합 단백질을 포집하고, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템으로부터 재조합 단백질을 용리하여, 재조합 단백질을 포함하는 용출액을 생산하는 단계로서, 재조합 단백질을 포함하는 단일 혼합물로 용출액이 균질화되는 단계, 상기 균질화된 단일 혼합물을 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템에 적용하고, 재조합 단백질을 포함하는 생성물 산출물을 수집하는 단계, 및 상기 생성물 산출물을 한외여과 및 정용여과에 적용하여 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 통합되고, 연속적으로 실행된다.
또한, 재조합 단백질을 생산하기 위한 제조 시스템이 본원에 제공되며, 상기 제조 시스템은 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 생물반응기를 포함하는 제1 작업 단위, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 포함하는 제2 작업 단위, 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템을 포함하는 제3 작업 단위, 및 한외여과 시스템 및 정용여과 시스템을 포함하는 제4 작업 단위를 포함한다.
일부 구현예에서, 제조 시스템은 제1 작업 단위와 제2 작업 단위 사이에 위치된 제5 작업 단위를 포함하고, 제5 작업 단위는 바이러스 불활성화를 수행하기 위한 서브시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 제조 시스템은 제3 작업 단위와 제4 작업 단위 사이에 위치된 제6 작업 단위를 포함하고, 제6 작업 단위는 바이러스 여과를 수행하기 위한 제2 서브시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 제조 시스템은 제3 서브시스템을 포함하는 제7 단위 작업을 포함하고, 제3 서브시스템은 치료 의약 물질을 제형화하기 위한 인라인 부형제를 포함한다.
본원에서 사용된 "실질적으로 무세포"는 특정 물질, 예컨대 포유류 세포가 적어도 또는 약 90% 존재하지 않는(예를 들어, 적어도 또는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 또는 약 99% 존재하지 않는, 또는 약 100% 존재하지 않는) 샘플을 의미한다.
특정 구현예에서, 실질적으로 무세포 샘플은 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 관류식 생물반응기, 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 유가식 생물반응기, 또는 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 정화된 액체 배양물로부터 제거된다.
본원에 사용된 "액체 배양 배지"는, 세포가 시험관 내에서 성장 또는 증식하도록 하는 충분한 영양분을 함유한 유체를 의미한다. 예를 들어, 액체 배양 배지는 하기 중 1가지 이상을 함유할 수 있다: 아미노산(예를 들어, 20가지의 아미노산), 퓨린(예를 들어, 하이포잔틴), 피리미딘(예를 들어, 티미딘), 콜린, 이노시톨, 티아민, 폴산, 비오틴, 칼슘, 니아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 티미딘, 시아노코발아민, 피루베이트, 리포산, 마그네슘, 글루코스, 나트륨, 칼륨, 철, 구리, 아연, 및 나트륨 중탄산염. 일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 포유류로부터의 혈청을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 포유류로부터의 혈청 또는 다른 추출물을 함유하지 않는다(정의된 액체 배양 배지). 일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 미량 금속, 포유류 성장 호르몬, 및/또는 포유류 성장 인자를 함유할 수 있다. 추가의 적합한 액체 배양 배지는 당업계에 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능하다.
본원에 사용된 "관류식 생물반응기"는 제1 액체 배양 배지 중 복수의 세포를 포함하는 생물반응기를 의미하며, 여기서, 생물반응기에 존재하는 세포의 배양은 제1 액체 배양 배지의 주기적 또는 연속적 제거 및 이와 동시에 또는 그 직후에 실질적으로 동일한 부피의 제2 액체 배양 배지를 생물반응기에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 기간 동안 증분식 기간(예를 들어, 약 24시간의 기간, 약 1분 내지 약 24시간의 기간, 또는 24시간 초과의 기간)에 걸쳐 제거되고 첨가되는 제1 액체 배양 배지의 부피(예를 들어, 매일을 기반으로 한 배양 배지 재공급률)의 증분식 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)가 있다. 매일 제거되고 교체되는 배지의 분율은 배양되는 특정 세포, 초기 접종 밀도, 및 특정 시간에서의 세포 밀도에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용된 "유가식 생물반응기"는 세포 성장 및 생성물 형성에 필요한 영양분이 하나 이상의 공급 스트림에 의해 간헐적으로 또는 연속적으로 공급되는 복수의 세포를 함유하는 생물반응기를 의미한다.
본원에 사용된 "정화된 액체 배양 배지"는 박테리아 또는 효모 세포가 실질적으로 존재하지 않는(예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99% 존재하지 않는) 박테리아 또는 효모 세포 배양물로부터 얻은 액체 배양 배지를 의미한다.
본원에 사용된 "재조합 단백질"은 면역글로불린, 단백질 단편, 조작된 단백질, 혈액 인자, 나노바디 또는 효소를 의미하며, 따라서 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
본원에 사용된 "단위 작업"은 재조합 단백질의 제조 방법에서 수행될 수 있는 기능적 단계, 또는 재조합 단백질의 제조 과정에서 사용되는 시스템의 구성요소를 의미한다. 예를 들어, 작업의 단위는 여과(예를 들어, 재조합 치료 단백질을 포함하는 유체로부터 오염 박테리아, 효모 바이러스, 또는 마이코박테리아, 및/또는 입자상 물질의 제거), 포집, 에피토프 태그 제거, 정제, 수용 또는 저장, 폴리싱, 바이러스 비활성화, 재조합 단백질을 함유하는 유체의 이온 농도 및/또는 pH 조절, 및 원치 않는 염의 제거일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연속 방법" 또는 "연속 시스템"은 유체가 단위 작업의 적어도 일부를 통해 연속적으로 공급되는 방법 또는 시스템을 의미한다. 단위 작업은 장기간 연속 유량 입력을 처리할 수 있는 경우 연속적이다. 연속적인 단위 작업은 최소 내부 보유 체적을 갖는다. 산출은 연속적이거나 순환 방식으로 생성된 작은 패킷으로 이산화될 수 있다. 방법은 그 사이에 0 또는 최소 보유 체적이 있는 통합된(물리적으로 연결된) 연속 단위 작업으로 구성되는 경우 연속적이다.
본원에 사용된 "통합형 방법"은, 특정 결과(예를 들어, 액체 배양 배지로부터 재조합 단백질의 생성)를 달성하기 위해 공동으로 기능하는 구성 요소들을 사용하여 수행되는 방법을 의미한다.
본원에 사용된 "용출액"은 검출가능한 양의 재조합 단백질을 함유하는 크로마토그래피 컬럼 또는 크로마토그래피 막으로부터 방출되는 유체를 의미한다.
본원에 사용된 "크로마토그래피 배지"는 크로마토그래피 컬럼에 패킹된 물질을 의미한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 시스템은 폐쇄 시스템이다. 폐쇄 시스템은 외부 환경에 대한 노출을 제한하도록 설계 및 운영되는 단위 작업을 포함한다. 재료가 폐쇄 시스템에 도입될 수 있지만, 생성물이 실내 환경에 노출되는 것을 방지하는 방식으로 추가해야 한다.
본원에 개시된 방법 및 시스템은 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 포집하고, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템으로부터 재조합 단백질을 용리하여 재조합 단백질을 포함하는 용출액을 생성하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 포집 크로마토그래피 시스템에 함유되는 크로마토그래피 배지는 포집 메커니즘(예를 들어, 단백질 A-결합 포집 메커니즘, 단백질 G-결합 포집 메커니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포집 메커니즘, 기질-결합 포집 메커니즘, 공동 인자-결합 포집 메커니즘, 태그-결합 포집 메커니즘, 및/또는 압타머-결합 포집 메커니즘)을 이용하는 수지일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템은 수지 비드, 다공성 멤브레인, 또는 나노섬유로 이루어진 크로마토그래피 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 배지는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 혼합-모드 크로마토그래피를 위해 기능화된다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 배지는 단백질 A-기반 수지이다.
일부 구현예에서, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템은 주기적 역류 크로마토그래피 시스템(PCCS)이다. 일부 구현예에서, PCCS는 2개의 크로마토그래피 컬럼을 포함하거나, 최대, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 8개 초과의 컬럼을 작동시킬 수 있는 수정된
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KTA 시스템(GE Healthcare, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 포함한다. 일부 구현예에서, PCCS는 컬럼-스위칭 메커니즘을 이용한다. 컬럼-스위칭 사건은 크로마토그래피 시스템을 통과하는 유체 내 재조합 단백질의 특정 수준에 해당하는 UV 흡광도, 액체(예를 들어, 완충액)의 특정 부피, 또는 특정 경과 시간에 의해 검출되는 재조합 단백질 수준의 검출에 의해 작동될 수 있다.
포집 크로마토그래피 시스템들을 사용하여 재조합 단백질을 포집하기 위해서는, 포집 크로마토그래피 시스템들의 로딩, 세척, 용출, 및 재생의 순차적 크로마토그래피 단계를 수행해야 한다.
일부 구현예에서, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템으로부터의 용출액은 재조합 단백질을 포함하는 단일 혼합물로 균질화된다. 일부 구현예에서, 균질화된 단일 혼합물은 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템에 적용되고, 재조합 단백질을 포함하는 생성물 산출물이 수집된다. 포집후 크로마토그래피 시스템은 원하는 최종 순도에 근접한 재조합 단백질-함유 유체에 남아있는 미량 또는 소량의 오염물이나 불순물을 제거하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템은 수지 비드, 다공성 멤브레인, 또는 나노섬유로 이루어진 크로마토그래피 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 배지는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 혼합-모드 크로마토그래피를 위해 기능화된다. 일부 구현예에서, 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 컬럼은 주기적 역류 크로마토그래피 시스템(PCCS)이다.
포집후 크로마토그래피 시스템들을 사용하여 재조합 단백질을 후-포집하기 위해서는, 포집후 크로마토그래피 시스템들의 로딩, 세척, 용출, 및 재생의 순차적 크로마토그래피 단계를 수행해야 한다.
일부 구현예에서, 방법 및 시스템은 재조합 단백질을 추가로 정제 및 농축하기 위한 한외여과(UF) 및/또는 정용여과(DF)를 포함한다. UF/DF는 재조합 단백질의 농도를 증가시킬 뿐만 아니라 완충 염을 특정 제제 완충액으로 대체할 수 있다. 한외여과(UF)는 정수압이 반투막에 대해 액체를 밀어내는 일종의 막 여과를 의미한다. 일부 구현예에서, UF는 단일 TFF 및 고성능 접선 유동 여과(HPTFF)를 포함하는 접선 유동 여과(TFF)로 수행된다. 단일 패스 접선 유동 여과(SPTFF)는 모듈을 통한 단일 패스의 변환(투과 유량을 입구 공급 유량으로 나눈 값)이 시스템을 잔류물을 위한 재활용(재순환) 루프 없이 작동할 수 있을 만큼 충분히 큰 임의의 TFF 시스템을 의미한다. SPTFF는 예를 들어 크로마토그래피 또는 침전 단계 전에 공정 부피를 줄이기 위해 다른 단위 작업 사이의 인라인 농축에 사용할 수 있다. Zydney, Biotechnol. Bioeng. 113(3): 465-75 (2016).
본원에 사용된 "정용여과"는 항체, 펩타이드, 핵산 및 기타 생체분자와 같은 단백질을 함유하는 용액으로부터 염 또는 완충 성분을 제거하거나, 대체시키거나, 또는 염 또는 완충 성분의 농도를 더 낮추기 위해 한외여과 막을 사용하는 방법을 의미한다. 연속 정용여과(일정 부피 정용여과라고도 함)는 물 또는, 제형 완충액과 같은 새로운 완충액을 잔류물에 첨가하여 잔류물에서 원래의 완충염(또는 기타 저분자량 종)을 세척하여 재조합으로 생산된 폴리펩타이드를 함유하는 제형을 형성하는 것을 포함한다. 전형적으로, 새로운 완충액은 여과액이 생성되는 것과 동일한 속도로 첨가되어 정용여과 동안 잔류물 부피와 생성물 농도가 눈에 띄게 변하지 않도록 한다. 특정 구현예에서, 정용여과는 단일-통과 정용여과 카세트를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 균질화된 단일 혼합물은 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템에 적용되기 전에 바이러스 불활성화에 적용된다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화는 용매-세제 용액 불활성화, 가열 불활성화, 또는 산성 pH 불활성화를 포함한다.
용매-세제 바이러스 불활성화의 경우, 절차는 재조합 단백질을 포함하는 샘플을 유기 용매 및 세제에 적용하는 것을 포함한다. 용매-세제 조합은 트리-n-부틸 포스페이트 및 Triton X-100™, Tween 80™ 및 소듐 콜레이트 등과 같은 당업계에 공지된 임의의 용매-세제 조합일 수 있다.
가열 불활성화를 통한 바이러스 불활성화는 재조합 단백질을 포함하는 샘플을 상승된 온도에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플을 45℃, 46℃, 47℃, 48℃ 이상 및 최대 약 49℃, 50℃, 51℃ 이하의 온도 및 초과 온도까지 가열하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 45℃ 내지 65℃의 온도까지 가열된다.
샘플이 가열되는 동안의 시간의 기간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 샘플은 1분 내지 6시간의 기간 동안 표적 온도까지 가열된다. 일부 구현예에서, 샘플은 10 내지 180분, 20 내지 180분, 20 내지 60분 또는 20 내지 40분의 기간 동안 표적 온도까지 가열된다.
일부 구현예에서, 산성 pH 불활성화는 균질화된 단일 혼합물을 하나 이상의 용액과 인라인으로 낮은 pH로 조정하고, 바이러스 불활성화 혼합물이 수득되는 기간 동안 상기 조정된 균질화된 단일 혼합물을 낮은 pH에서 인큐베이션함으로써 수행된다.
본원에 개시된 방법 및 시스템은 UV 흡광도에 의해 검출된 재조합 단백질 수준의 검출, 유속 검출, 및/또는 액체(예를 들어, 완충액) 부피 검출을 포함하는 인라인 모니터링을 포함한다. 재조합 단백질 농도 모니터링(예를 들어, UV 모니터링에 의해 수행되는 모니터링)은 피드백 제어로 생성물 농도의 인라인 측정을 할 수 있는 임의의 도구에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 균질화된 단일 혼합물은 15분 내지 2시간의 기간 동안 낮은 pH에 노출된다. 특정 구현예에서, 낮은 pH는 3 내지 5의 pH이다. pH 수준의 선택은 재조합 단백질 및 다른 완충액 성분의 안정성 프로파일에 의존한다. 바이러스 불활성화 후, 항체 용액의 pH는 방법을 계속하기 전에 더 중성인 pH, 예를 들어 4.0 내지 8.5로 조정할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 불활성화는 문헌[Parker et al.,　Biotechnol. Bioeng.　115(3):　606-16 (2018)]에 기재된 바와 같이 관형 유동 반응기에서 수행된다. 일부 구현예에서, 관형 유동 반응기는 적어도 30분의 규정된 최소 체류 시간을 갖는다.
일부 구현예에서, 바이러스 여과와 같은 바이러스 제거 단계는 포집후 크로마토그래피 시스템으로부터 생성물 산출물의 수집 후에 포함된다. 바이러스 제거 단계는 바이러스 불활성화 처리에 더 내성이 있는 작은 외피가 없는 바이러스를 제거하기 위해 수행된다. 일부 구현예에서, 바이러스 여과는 가압 루프가 압력 용기, 바이러스 제거 필터 및 멸균 필터를 포함하는 가압 루프에서 수행된다. 일부 구현예에서, 가압 루프 내의 바이러스 제거 필터는 중공사 바이러스 필터이다. 일부 구현예에서, 압력 용기는 일회용의 폐쇄된 멸균 가능한 용기이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "멸균 가능한"은 공지된 멸균 방법과 양립할 수 있는 재료로 형성된 용기를 의미한다. 일부 구현예에서, 바이러스 여과는 데드-엔드 여과를 사용하여 수행된다. 본원에 사용된 바와 같이, "데드-엔드 여과"는 여과되는 전체 유체 스트림이 재순환 또는 잔류물 흐름 없이 필터를 통과되는 여과를 의미한다. 일부 구현예에서, 바이러스 제거 필터는 한외여과기 또는 나노여과기이다. 적합한 바이러스 여과 시스템의 예는 국제 공개 번호 WO 2018/035116에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 제1 단위 작업은 제2 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 제2 단위 작업은 제3 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 제3 단위 작업은 제4 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 단위 작업은 제5 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 제5 단위 작업은 제2 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 제2 단위 작업은 제3 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 제3 단위 작업은 제6 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 제6 단위 작업은 제4 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템은 제1 단위 작업, 제2 단위 작업, 제3 단위 작업 및 제4 단위 작업 각각 사이에 서지 용기를 포함한다. 서지 용기는 다음 작업 단위로 이동하기 전에 임의의 액체 배양을 보유할 수 있다.
본원에 기재된 시스템은 또한, 임의의 단위 작업 사이에 배치된 유체 도관을 포함할 수 있다. 적합한 유체 도관은, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 또는 플라스틱으로 제조된 튜브일 수 있다. 유체 도관은 다음 중 하나 이상을 임의의 조합으로 또한 포함할 수 있다: 유체 도관과 유체 연통되고 인라인 완충액 조절 저장소(들) 내에 저장된 완충액이 유체 도관에 존재하는 유체에 첨가되도록 위치한 하나 이상의 인라인 완충액 조절 저장소; 및 유체 도관에 존재하는 유체를 여과(예를 들어, 박테리아를 제거)할 수 있도록 유체 도관 내에 배치된 하나 이상의 필터.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 시스템은 펌프 시스템을 포함한다. 펌프 시스템은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 당업계에 공지된 하나 이상의 펌프, 당업계에 공지된 하나 이상의 필터, 및 하나 이상의 UV 검출기.
일부 구현예에서, 한외여과/정용여과 후, 하나 이상의 부형제가 생성물 산출물에 첨가되어 치료 의약 물질을 생성한다.
본원에 사용된 "치료 의약 물질"은, 오염 단백질, 지질, 및 핵산(예를 들어, 액체 배양 배지에 존재하거나 숙주 세포(예를 들어, 포유류, 효모, 또는 박테리아 숙주 세포)로부터의 오염 단백질, 지질, 및 핵산) 및 생물학적 오염물(예를 들어, 바이러스 및 박테리아 오염물)로부터 충분히 정제되었거나 단리되어, 더 이상의 실질적 정제 및/또는 오염 제거 단계 없이 약제로 제형화될 수 있는 재조합 단백질을 포함하는 물질을 의미한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 시스템은 스키드(skid)에 있다. 본원에 사용된 "스키드(skid)"는 본원에 기술된 시스템을 위한 플랫폼 또는 지지대 역할을 할 수 있는 3차원 고체 구조물을 지칭한다. 스키드가 이동을 가능하게 하는 하나 이상의 구조물(예를 들어, 휠, 롤러 등)을 포함하는 경우 시스템 또는 그 일부에 이동성을 부여한다.
일부 구현예에서, 방법 및 시스템은 적어도 약 40%, 50%, 55%, 또는 60%, 및 최대 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 재조합 단백질 회수율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제 회수율은 적어도 약 60% 내지 약 70%이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 또한, 적어도 약 5일, 10일, 20일, 또는 30일, 및 최대 적어도 약 280일, 290일, 300일, 310일, 320일, 약 330일, 340일, 350일, 또는 365일의 연속 기간에 걸쳐 적어도 약 5 g/일, 10 g/일 또는 20 g/일, 30 g/일, 또는 40 g/일, 및 최대 적어도 약 200 g/일, 300 g/일 또는 400 g/일, 500 g/일, 또는 1000 g/일의 치료 단백질 의약 물질 중 재조합 단백질의 순 수율을 발생시킨다.
실시예
다음의 실시예는 본 개시 내용의 특정 구현예 및 이의 다양한 용도를 예시하는 것이다. 이들 실시예는 설명 목적으로만 제시되는 것일 뿐, 본 개시 내용의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 이해해서는 안 된다.
실시예 1: 재조합 단백질의 연속 생산
이중 ATF와 결합된 100-L 강화 관류식 생물반응기를 사용하여 70일 동안 재조합 모노클로날 항체(mAb)를 생성하였다. 무세포 mAb-함유 배지(수확물)는 추가 처리를 위해 100-L 수확 서지 용기로 계속 펌핑하였다.
항체 함유 배지는 파일럿 규모의 제자리-스팀 PCC 스키드에서 결합 및 용리 MCC 모드에서 작동되는 2X 1-L(8 × 20 cm) 사전 포장 및 조사된 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 포집하였다. 2개의 컬럼 중 하나가 수확 서지 용기로부터 항상 로딩되고 포집 단계에 대한 평균 입구 체적 유량이 관류식 생물반응기로부터의 평균 출구 체적 유량과 일치하도록 포집 단계를 실행하였다. 단백질 A 컬럼에 대한 로딩은 델타(Delta) UV에 의해 대략 3% 돌파로 제어되었다. 바이러스 불활성화 전에 개별 포집 컬럼 용출액을 5-L 혼합 용기에 수집하였다. 단백질 A 작업은 12일째에 관류식 생물반응기와 통합하고, 58일 동안 계속 실행하였다. 단백질 A 작업 성능을 요약하는 데이터는 도 3a 내지 3f에 도시되어 있다.
개별 단백질 A 용출액을 5-L 혼합 용기에서 혼합하여 바이러스 불활성화 단위 작업을 위한 균질한 스트림을 보장하였다. 혼합 용기의 유출은 전체 용기가 다음 단백질 A 용리 주기 전에 처리되도록 자동화되었다. 균질화된 단백질 A 용출액을 3.6의 목표 pH로 1 M 아세트산을 첨가하여 인라인으로 조정하였다. 그런 다음 낮은 pH로 조정된 단백질 A 용출액을 최소 체류 시간이 30분 이상인 관형 유동 반응기(TFR)를 통해 펌핑하여 낮은 pH에서 완전한 바이러스 불활성화를 달성하기에 충분한 시간을 보장했다. 그런 다음, 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액을 4.5의 목표 pH로 0.75 M 아세트산나트륨을 첨가하여 인라인으로 조정하였다. 그런 다음, 조정된 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액을 멸균 등급 필터를 통해 처리하고, 추가 처리를 위해 작은 서지 용기에 연속적으로 수집했다. 바이러스 불활성화 작업은 15일째에 이전 작업과 통합하고, 55일 동안 계속 실행하였다. 바이러스 불활성화 작업 성능을 요약하는 데이터는 도 4a 내지 4g에 도시되어 있다.
조정된 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액은 통과 모드에서 작동되는 혼합-모드 음이온 교환 수지 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지를 사용하는 2개의 직교 크로마토그래피 작업을 통해 추가로 처리되었다. 본 실시예 공정의 경우, 두 가지 포집후 크로마토그래피 작업 사이에 단계 간 조정이 없었기 때문에 혼합-모드 컬럼으로부터의 흐름이 소수성 상호작용 컬럼에 직접 로드될 수 있다. 포집후 트레인은 2X 0.2 L(5 × 10 cm) 사전 포장된 혼합 모드 컬럼과 2X 0.2 L(5 × 10 cm) 사전 포장된 소수성 상호작용 컬럼으로 구성되어 있으며, 단백질 A 작업과 동일한 PCC 스키드에서 MCC 모드로 작동한다. 조정되고 바이러스가 불활성화된 단백질 A 용출액 스트림은 약 2개의 단백질 A 용출액에 상응하는 질량이 각 포집후 사이클에 로드되도록 자동화된 컬럼 로딩으로 2개의 평행한 포집후 트레인 중 하나에 지속적으로 로드되었다.
결합된 혼합-모드/소수성 상호작용 흐름(포집후 용출액으로 표시됨)은 추가 처리를 위해 작은 서지 용기에 연속적으로 수집했다. 포집후 크로마토그래피 작업은 23일째에 이전 단위 작업과 통합하고, 47일 동안 계속 실행하였다. 포집후 크로마토그래피 작업 성능을 요약하는 데이터는 도 5a 내지 5d에 도시되어 있다.
포집후 용출액은 접선 흐름 모드에서 작동되는 0.1 m2 Planova 20N(AK Bio) 바이러스 제거 필터를 통해 추가로 처리하였다. 포집후 용출액은 도 6a에 도시된 바와 같이, 서지 용기로부터 압력 용기, 바이러스 제거 필터, 멸균 등급 필터 및 연동 펌프가 포함된 가압 루프로 연속적으로 전달되어, 재순환을 구동하였다. 루프의 압력은 바이러스 필터(투과물 플럭스)를 통한 순 체적 유량이 포집후 작업에서 나오는 순 체적 유량과 동일하도록 자동화되었다. Planova 20N 필터는 예비 바이러스 검증 연구에 따라 주기적으로 교체하였다. 바이러스 여과된 물질을 추가 처리를 위해 작은 서지 용기에 연속적으로 수집했다. 바이러스 여과 작업은 29일째에 이전 단위 작업과 통합하고, 41일 동안 계속 실행하였다. 바이러스 여과 작업 성능을 요약하는 데이터는 도 6b 내지 6f에 도시되어 있다.
바이러스 여과된 물질을 0.065 m2 ILC 단일-통과 TFF(SP-TFF) 카세트를 사용하는 한외여과를 통해 추가로 처리하고, 65 g/L의 표적 mAb 농도로 농축시켰다. 바이러스 여과 작업으로부터의 출구 유량과 일치하는 체적 유량으로 바이러스 여과 후 서지 용기에서 SP-TFF 카세트의 입구로 물질을 펌핑했다. SP-TFF 카세트로부터의 잔류물 유속은 목표 농도 값을 유지하기 위해 생성물 농도의 인라인 측정을 통해 피드백 루프를 사용하여 자동으로 제어하였다. 그런 다음, 농축된 mAb 스트림을 단일-패스 정용여과(SP-DF) 카세트의 입구로 직접 펌핑하여 인라인 완충액 교환을 수행했다. 정용여과 완충액을 SP-DF 카세트의 완충액 입구로 펌핑하고, 완충액 대 생성물 흐름의 일정한 비율을 유지하기 위해 완충액 흐름을 자동화했다. 잔류물 유속은 입구 유속과 일치하도록 제어하였다. 완충액 교환된 DF 잔류물 스트림은 농축된 부형제 용액의 인라인 첨가에 의해 제형화하여, 제형화된 벌크를 생성하였다. 제형화된 벌크를 멸균 등급 필터를 통해 추가로 처리하여 의약 물질을 생성하고, 이를 일회용 용기에 수집했다. 한외여과 및 정용여과 작업은 42일째에 이전 단위 작업과 통합하고, 29일 동안 계속 실행하였다. 제형 작업 및 의약 물질 생성은 46일째에 통합하고, 25일 동안 계속 실행하였다. 25일 동안 6개의 의약 물질 배치가 생성되었다. 한외여과 및 정용여과 작업 성능을 요약하는 데이터는 도 7a 내지 7e 및 도 8a 내지 8d에 도시되어 있다. 도 9a 내지 9h는 생성된 의약 물질에 대한 속성을 보여준다.
실시예 2: 재조합 단백질의 연속 생산
이중 ATF와 결합된 100-L 강화 관류식 생물반응기를 사용하여 27일 동안 재조합 모노클로날 항체(mAb)를 생성하였다. 무세포 mAb-함유 배지(수확물)는 추가 처리를 위해 100-L 수확 서지 용기로 계속 펌핑하였다.
항체 함유 배지는 파일럿 규모의 제자리-스팀 PCC 스키드에서 결합 및 용리 MCC 모드에서 작동되는 2X 1-L(8 × 20 cm) 사전 포장 및 조사된 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 포집하였다. 2개의 컬럼 중 하나가 수확 서지 용기로부터 항상 로딩되고 포집 단계에 대한 평균 입구 체적 유량이 관류식 생물반응기로부터의 평균 출구 체적 유량과 일치하도록 포집 단계를 실행하였다. 단백질 A 컬럼에 대한 로딩은 델타(Delta) UV에 의해 대략 3% 돌파로 제어되었다. 바이러스 불활성화 전에 개별 포집 컬럼 용출액을 5-L 혼합 용기에 수집하였다. 단백질 A 작업은 12일째에 관류식 생물반응기와 통합하고, 15일 동안 계속 실행하였다.
개별 단백질 A 용출액을 5-L 혼합 용기에서 혼합하여 바이러스 불활성화 단위 작업을 위한 균질한 스트림을 보장하였다. 혼합 용기의 유출은 전체 용기가 다음 단백질 A 용리 주기 전에 처리되도록 자동화되었다. 균질화된 단백질 A 용출액을 3.6의 목표 pH로 1 M 아세트산을 첨가하여 인라인으로 조정하였다. 그런 다음 낮은 pH로 조정된 단백질 A 용출액을 최소 체류 시간이 30분 이상인 3D-인쇄된 감마 조사 관형 유동 반응기(TFR)를 통해 펌핑하여 낮은 pH에서 완전한 바이러스 불활성화를 달성하기에 충분한 시간을 보장했다. 그런 다음, 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액을 4.5의 목표 pH로 0.75 M 아세트산나트륨을 첨가하여 인라인으로 조정하였다. 그런 다음, 조정된 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액을 멸균 등급 필터를 통해 처리하고, 추가 처리를 위해 작은 서지 용기에 연속적으로 수집했다. 바이러스 불활성화 작업은 13일째에 이전 작업과 통합하고, 14일 동안 계속 실행하였다.
조정된 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액은 통과 모드에서 작동되는 혼합-모드 음이온 교환 수지 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지를 사용하는 2개의 직교 크로마토그래피 작업을 통해 추가로 처리되었다. 포집후 트레인은 2X 0.2 L(5 × 10 cm) 사전 포장된 및 감마-조사된 혼합-모드 컬럼과 2X 0.2 L(5 × 10 cm) 사전 포장된 및 감마-조사된 소수성 상호작용 컬럼으로 구성되어 있으며, MCC 모드로 작동한다. 조정되고 바이러스 불활성화된 단백질 A 용출액 스트림은 2개의 혼합-모드 컬럼 중 하나에 연속적으로 로드되었고, 혼합-모드 컬럼의 통과 흐름은 2개의 소수성 상호작용 컬럼 중 하나에 지속적으로 로드되었다. 혼합-모드 및 소수성 상호작용 컬럼은 각각의 로딩 용량에 독립적으로 로드되었다.
포집후 크로마토그래피 작업은 14일째에 이전 단위 작업과 통합하고, 13일 동안 계속 실행하였다.
포집후 용출액은 접선 흐름 모드에서 작동되는 0.1 m2 Planova 20N(AK Bio) 바이러스 제거 필터를 통해 추가로 처리하였다. 포집후 용출액은 소수성 상호작용 컬럼의 출구에서 압력 용기, 바이러스 제거 필터, 멸균 등급 필터 및 연동 펌프가 포함된 가압 루프로 연속적으로 전달되어, 재순환을 구동하였다. 루프의 압력은 바이러스 필터(투과물 플럭스)를 통한 순 체적 유량이 포집후 작업에서 나오는 순 체적 유량과 동일하도록 자동화되었다. 바이러스 여과된 물질을 추가 처리를 위해 작은 서지 용기에 연속적으로 수집했다. 바이러스 여과 작업은 14일째에 이전 단위 작업과 통합하고, 13일 동안 계속 실행하였다.
단일-통과 모드에서 작동되는, 직렬로 2 × 0.1 m2 감마선-조사된 TFF 캡슐을 사용하여 한외여과를 통해 상기 바이러스 여과된 물질을 추가로 처리하였다. 바이러스 여과된 물질을 110 g/L의 표적 mAb 농도로 농축하였다. 바이러스 여과 작업으로부터의 출구 유량과 일치하는 체적 유량으로 바이러스 여과 후 서지 용기로부터 TFF 캡슐의 입구로 물질을 펌핑했다. TFF 캡슐의 잔류물 유속은 목표 농도 값을 유지하기 위해 생성물 농도의 인라인 측정을 통해 피드백 루프를 사용하여 자동으로 제어하였다. 그런 다음, 농축된 mAb 스트림을 감마-조사 단일-패스 정용여과(SP-DF) 카세트의 입구로 직접 펌핑하여 인라인 완충액 교환을 수행했다. 정용여과 완충액을 SP-DF 카세트의 완충액 입구로 펌핑하고, 완충액 대 생성물 흐름의 일정한 비율을 유지하기 위해 완충액 흐름을 자동화했다. 잔류물 유속은 입구 유속과 일치하도록 제어하였다. 완충액 교환된 DF 잔류물 스트림은 농축된 부형제 용액의 인라인 첨가에 의해 제형화하여, 제형화된 벌크를 생성하였다. 제형 완충액의 첨가는 피드백 루프 및, 제형화된 스트림에서 부형제의 수준을 측정하는 인라인 센서를 통해 제어되었다. 제형화된 벌크를 멸균 등급 필터를 통해 추가로 처리하여 의약 물질을 생성하고, 이를 일회용 용기에 수집했다. 한외여과 및 정용여과는 18일째에 이전 단위 작업과 통합하고 20일째에 제형화 작업을 통합하였다. 인라인 센서 문제로 인해 UF/DF 및 제형화 작업은 캠페인 종료 이전에 정상 상태에 도달하지 못했다.
본 개시 내용은 다양한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 변형 및 변경이 당업자에 의해 이루어질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 첨부된 청구범위는 청구된 본 개시 내용의 범위 내에 있는 모든 그러한 등가적 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 게다가, 본원에서 사용된 섹션의 제목은 단지 구조적 목적을 위한 것으로서, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 기재된 각각의 구현예는, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 특성 또는 구현예는, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 다른 특성 또는 특성들 또는 구현예 또는 구현예들과 조합될 수 있다.
본 출원에서 인용된 모든 참고 문헌은 본원에 참고로서 명시적으로 포함된다.

Claims (41)

  1. 재조합 단백질의 연속 생산 방법으로서,
    (a) 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 사용하여 실질적으로 무세포 샘플로부터 재조합 단백질을 포집하고, 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템으로부터 재조합 단백질을 용리하여, 재조합 단백질을 포함하는 용출액을 생산하는 단계로서, 재조합 단백질을 포함하는 단일 혼합물로 상기 용출액이 균질화되는 단계;
    (b) 상기 균질화된 단일 혼합물을 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템에 적용하고, 재조합 단백질을 포함하는 생성물 산출물을 수집하는 단계; 및
    (c) 상기 생성물 산출물을 한외여과 및 정용여과하여 재조합 단백질을 정제하는 단계
    를 포함하며,
    상기 방법은 단계 (a)에서 단계 (c)까지 통합되고 연속적인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균질화된 단일 혼합물을 단계 (a) 후에 바이러스 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 바이러스 불활성화는 용매-세제 용액 불활성화, 가열 불활성화, 또는 산성 pH 불활성화를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 산성 pH 불활성화가,
    (a) 하나 이상의 용액을 첨가하여 상기 균질화된 단일 혼합물을 인라인으로 낮은 pH로 조정하는 단계; 및
    (b) 상기 조정된 균질화된 단일 혼합물을 낮은 pH에서 일정 기간 동안 인큐베이션하여 바이러스 불활성화 혼합물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 일정 기간은 15분 내지 2시간인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    단계 (b)의 생성물 산출물을 바이러스 여과시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    실질적으로 무세포 샘플은 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 관류식 생물반응기, 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 유가식 생물반응기, 또는 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 정화된 액체 배양물로부터 제거되는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템 및 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템은 수지 비드, 다공성 멤브레인, 또는 나노섬유를 포함하는 크로마토그래피 배지를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 크로마토그래피 배지는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 혼합-모드 크로마토그래피를 위해 기능화되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 친화성 크로마토그래피 배지는 단백질 A-기반 수지인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템 및 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템은 주기적 역류 크로마토그래피 시스템(PCCS)인, 방법.
  12. 제4항에 있어서,
    상기 조정된 균질화된 단일 혼합물을 낮은 pH에서 일정 기간 동안 인큐베이션하여 바이러스 불활성화를 초래하는 단계가 관형 유동 반응기에서 수행되는, 방법.
  13. 제4항에 있어서,
    하나 이상의 용액의 첨가가 인라인 재조합 단백질 농도 측정 및 인라인 유속 측정에 기초하는, 방법.
  14. 제6항에 있어서,
    상기 바이러스 여과가 가압 루프에서 수행되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 가압 루프가 압력 용기, 바이러스 제거 필터 및 멸균 필터를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 압력 용기는 일회용의 폐쇄된 멸균 가능한 용기인, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 바이러스 제거 필터는 한외여과기 또는 나노여과기인, 방법.
  18. 제6항에 있어서,
    상기 바이러스 여과는 데드-엔드 여과를 사용하여 수행되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 데드-엔드 여과는 한외여과기 또는 나노여과기를 사용하여 수행되는, 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 한외여과는 단일 통과 접선 흐름 여과로 수행되는, 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 정용여과는 단일-통과 정용여과 카세트를 사용하여 수행되는, 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    단계 (c) 후에 하나 이상의 부형제를 첨가하여 치료 의약 물질을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 재조합 단백질의 생산을 위한 제조 시스템으로서,
    (a) 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 포함하는 생물반응기를 포함하는 제1 단위 작업;
    (b) 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템을 포함하는 제2 단위 작업;
    (c) 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템을 포함하는 제3 단위 작업; 및
    (d) 한외여과 시스템 및 정용여과 시스템을 포함하는 제4 단위 작업
    을 포함하는 제조 시스템.
  25. 제24항에 있어서,
    제1 단위 작업과 제2 단위 작업 사이에 위치하는 제5 단위 작업을 추가로 포함하고, 상기 제5 단위 작업은 바이러스 불활성화를 수행하기 위한 서브시스템을 포함하는, 시스템.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 서브시스템은 관형 유동 반응기인, 시스템.
  27. 제24항에 있어서,
    제3 단위 작업과 제4 단위 작업 사이에 위치하는 제6 단위 작업을 추가로 포함하고, 상기 제6 단위 작업은 바이러스 여과를 수행하기 위한 제2 서브시스템을 포함하는, 시스템.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 시스템 및 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템은 수지 비드, 다공성 멤브레인, 또는 나노섬유를 포함하는 크로마토그래피 배지를 포함하는, 시스템.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 크로마토그래피 배지는 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 혼합-모드 크로마토그래피를 위해 기능화되는, 시스템.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 친화성 크로마토그래피 배지는 단백질 A-기반 수지인, 시스템.
  31. 제24항에 있어서,
    상기 하나 또는 복수의 포집 크로마토그래피 컬럼 및 하나 또는 복수의 포집후 크로마토그래피 시스템은 주기적 역류 크로마토그래피 시스템(PCCS)인, 시스템.
  32. 제26항에 있어서,
    관형 유동 반응기는 적어도 30분의 규정된 최소 체류 시간을 갖는, 시스템.
  33. 제27항에 있어서,
    바이러스 여과를 수행하기 위한 제2 서브시스템은 바이러스 제거 필터 및 멸균 필터를 포함하는 가압 용기인, 시스템.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 가압 용기는 일회용의 폐쇄된 멸균 가능한 용기인, 시스템.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 바이러스 제거 필터는 한외여과기 또는 나노여과기인, 시스템.
  36. 제24항에 있어서,
    상기 제1 단위 작업은 제2 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 상기 제2 단위 작업은 제3 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하고, 상기 제3 단위 작업은 제4 단위 작업 상의 입구에 연결된 출구를 포함하는, 시스템.
  37. 제24항에 있어서,
    제1 단위 작업, 제2 단위 작업, 제3 단위 작업 및 제4 단위 작업 각각 사이에 서지 용기를 추가로 포함하는, 시스템.
  38. 제24항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 시스템.
  39. 제24항에 있어서,
    상기 시스템은 스키드(skid) 상에 있는, 시스템.
  40. 제24항에 있어서,
    상기 시스템은 폐쇄된, 시스템.
  41. 제24항에 있어서,
    제3 서브시스템을 포함하는 제7 단위 작업을 추가로 포함하고, 상기 제3 서브시스템은 치료 의약 물질을 제형화하기 위한 인라인 부형제를 포함하는, 시스템.
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