TW202102519A - 重組蛋白的連續式生產 - Google Patents

Abstract

本揭示內容涉及用於連續式生產重組蛋白的方法和系統。在特定的實施例中，本文涉及使用捕獲層析、後捕獲層析、病毒過濾、和超過濾/透析過濾以連續式生產重組蛋白的方法和系統。

Description

重組蛋白的連續式生產

本揭示內容涉及用於連續式生產重組蛋白的方法和系統。在特定的實施例中，本揭示內容涉及使用捕獲層析、後捕獲層析、病毒過濾、和超過濾/透析過濾連續式生產重組蛋白的方法和系統。

連續式製造是用於諸如石油化工和食品生產等行業的例行性生產方式。連續式過程的益處包括定態的操作、減少設備尺寸、高容積生產力、簡化工藝流程、低週期時間、和降低資本成本。Konstantinov等人，J. Pharm.Sci. 104(3): 813-20 (2015)。

連續式製造尚未在生物製藥行業中廣泛實施。由於上游和下游開發的技術需求差異很大，因此連續進行下游操作的經驗有限。因此，對於生物製藥行業來說，仍然需要整合型連續式生物生產方式，其能夠長時間運作，並可將操作者的互動降到最低。

本文提供了一種用於生產重組蛋白的連續式方法，所述方法包括：(a) 使用一個或多個捕獲層析系統從實質上不含細胞的樣品中捕獲所述重組蛋白，並且從所述一個或多個捕獲層析系統中沖提出所述重組蛋白，以產生包含所述重組蛋白的沖提物，其中將單一或多個沖提物均質化成包含所述重組蛋白的單一混合物；(b) 使所述單一混合物經受一個或多個後捕獲層析系統並且收集包含所述重組蛋白的產物輸出物，以及(c) 使所述產物輸出物經受超過濾和透析過濾，以純化所述重組蛋白，其中所述方法是從步驟(a)至步驟(c)整合且連續式的。

本文還提供了一種用於生產重組蛋白的製造系統，所述製造系統包括：(a) 第一單元操作，所述第一單元操作包括包含產生所述重組蛋白的宿主細胞的生物反應器，(b) 第二單元操作，所述第二單元操作包括一個或多個捕獲層析系統，(c) 第三單元操作，所述第三單元操作包括一個或多個後捕獲層析系統，以及(d) 第四單元操作，所述第四單元操作包括超過濾系統和透析過濾系統。

本文還提供了一種用於生產重組蛋白的連續式方法，所述方法包括：(a) 使用一個或多個捕獲層析系統從實質上不含細胞的樣品中捕獲所述重組蛋白，並且從所述一個或多個捕獲層析系統中沖提出所述重組蛋白，以產生包含所述重組蛋白的沖提物，其中將所述沖提物均質化成包含所述重組蛋白的單一混合物，(b) 使經均質化的單一混合物經受病毒失活，(c) 使來自步驟(b)的均質化的單一混合物經受一個或多個後捕獲層析系統並且收集包含所述重組蛋白的產物輸出物，(d) 使所述步驟的產物輸出物經受病毒過濾，以及(e) 使來自步驟 (d) 的產物輸出物經受超過濾和透析過濾，以純化所述重組蛋白，其中所述方法是從步驟(a)至步驟 (e) 整合且連續式的。

通過以下詳細描述和申請專利範圍，並且適當時參考附圖，本文的其他方面、實施例和實現方式將變得顯而易見。

本揭示內容涉及用於連續式生產重組蛋白的方法和系統。在特定的實施例中，本揭示內容涉及使用捕獲層析、後捕獲層析、和超過濾/透析過濾的用於生產重組蛋白的方法和系統。本文描述的方法和系統提供了連續且時間效率的重組蛋白生產。

如根據本揭示內容所用，除非另外指示，否則所有技術和科學術語均應理解為具有與一般熟習此項技術者通常理解的相同含義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。

在一些實施例中，本文提供了一種用於生產重組蛋白的連續式方法，所述方法包括使用一個或多個捕獲層析系統從實質上不含細胞的樣品中捕獲所述重組蛋白，並且從所述一個或多個捕獲層析系統中沖提出所述重組蛋白，以產生包含所述重組蛋白的沖提物，其中將所述沖提物均質化成包含所述重組蛋白的單一混合物，使經均質化的單一混合物通過一個或多個後捕獲層析系統並且收集包含所述重組蛋白的產物輸出物，以及使所述產物輸出物經受超過濾和透析過濾，以純化所述重組蛋白，其中所述方法是整合的並且連續式運行。

本文還提供了一種用於生產重組蛋白的製造系統，所述製造系統包括：第一操作單元，所述第一操作單元包括包含產生所述重組蛋白的宿主細胞的生物反應器，第二操作單元，所述第二操作單元包括一個或多個捕獲層析系統，第三操作單元，所述第三操作單元包括一個或多個後捕獲層析系統，以及第四操作單元，所述第四操作單元包括超過濾系統和透析過濾系統。

在一些實施例中，所述製造系統包括位於第一操作單元與第二操作單元之間的第五操作單元，其中所述第五操作單元包括用於執行病毒失活的子系統。在一些實施例中，所述製造系統包括位於第三操作單元與第四操作單元之間的第六操作單元，其中所述第六操作單元包括用於執行病毒過濾的第二子系統。在一些實施例中，所述製造系統包括第七單元操作，所述第七單元操作包括第三子系統，其中所述第三子系統包括用於配製治療性藥物物質的線上賦形劑（in-line excipient）。

如本文所用的「實質上不含細胞」是指至少或約90%不含（例如，至少或約95%、96%、97%、98%、或至少或約99%不含，或約100%不含）指定物質（諸如哺乳動物細胞）的樣品。

在特定的實施例中，所述實質上不含細胞的樣品係從包含產生所述重組蛋白之宿主細胞的灌注型生物反應器、包含產生所述重組蛋白之宿主細胞的分批補料型生物反應器、或包含產生所述重組蛋白之宿主細胞的澄清液體營養素中所取出。

如本文所用的「液體培養基」是指含有足夠營養物，能讓細胞體外生長或增殖的流體。例如，液體培養基可以含有以下中的一種或多種：胺基酸（例如，20種胺基酸）、嘌呤（例如，次黃嘌呤）、嘧啶（例如，胸苷）、膽鹼、肌醇、硫胺素、葉酸、生物素、鈣、菸鹼醯胺（niacinamide）、吡哆醇、核黃素、胸苷、氰鈷胺、丙酮酸鹽、硫辛酸、鎂、葡萄糖、鈉、鉀、鐵、銅、鋅和碳酸氫鈉。在一些實施例中，液體培養基可以含有來自哺乳動物的血清。在一些實施例中，液體培養基不含來自哺乳動物的血清或其他提取物（限定的液體培養基）。在一些實施例中，液體培養基可以含有痕量金屬、哺乳動物生長激素和/或哺乳動物生長因子。另外的合適液體培養基是本領域已知的並且是可商購的。

如本文所用的「灌注型生物反應器」是指一種生物反應器，其含有在第一液體培養基中的多個細胞，其中存在於所述生物反應器中細胞的培養，包括週期性或連續式取出所述第一液體培養基，並且同時或此後不久將實質上相同體積的第二液體培養基添加到所述生物反應器中。在一些實施例中，在培養期間（例如，按每天計的培養基再進料速率），在遞增的時間內（例如，約24小時的時間段、約1分鐘與約24小時之間的時間段、或大於24小時的時間段），第一液體培養基取出和加入的體積有遞增的變化（例如，增加或減少）。。每天取出和更換的培養基比率可以根據培養的特定細胞、初始接種密度、和在特定時間的細胞密度而有所變化。

如本文所用的「分批補料型生物反應器」是指含有多個細胞的生物反應器，其中利用一或多個進料流來間歇地或連續地提供細胞生長和產物形成的必需營養素。

如本文所用的「澄清液體培養基」是指從細菌或酵母細胞培養物中所獲得之實質上不含（例如，至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、或99%不含）細菌或酵母細胞的液體培養基。

如本文所用的「重組蛋白」是指免疫球蛋白、蛋白質片段、工程化的蛋白質、血液因子、奈米抗體、或酶，包括抗體或其抗體片段。

如本文所用的「單元操作」是指可以在製造重組蛋白的方法中進行的功能步驟，或在製造重組蛋白的過程中使用的系統的元件。例如，操作單元可以是過濾（例如，從含有重組治療性蛋白的流體中去除污染細菌、酵母病毒、或分枝桿菌、和/或特定物質）、捕獲、去除表位標籤、純化、保持或儲存、精製、病毒失活、調節含有重組蛋白之流體的離子濃度和/或pH、和去除不需要的鹽。

如本文所用的術語「連續式方法」或「連續式系統」是指一種方法或系統，其中係通過單元操作的至少一部分來連續地提供流體。如果一個單元操作能夠長時間地處理連續的流量輸入，則它是連續的。連續的單元操作具有最小的內部保持體積。輸出可以是連續的或者以迴圈方式產生的小包而離散化的。如果方法由整合型（物理上連接的）連續式單元操作（其之間的保持體積為零或最小）所構成，則它是連續的。

如本文所用的「整合型方法」是指使用結構元件進行的方法，所述結構元件協同發揮作用，以實現特定結果（例如，從液體培養基中產生重組蛋白）。

如本文所用的「沖提物」是指從層析管柱或層析膜排出的流體，其含有可檢測量的重組蛋白。

如本文所用的「層析介質」是指填充到層析管柱中的材料。

在一些實施例中，本文揭示的系統是密閉系統。密閉系統包括設計為和操作成限制暴露於外部環境的單元操作。可以將材料引入密閉系統中，但是必須以避免產物暴露於室內環境的方式進行添加。

本文揭示的方法和系統包括使用一個或多個捕獲層析系統來捕獲重組蛋白，並且從所述一個或多個捕獲層析系統中沖提出所述重組蛋白，以產生包含所述重組蛋白的沖提物。一個或多個捕獲層析系統中含有的層析介質可以是利用捕獲機制（例如，蛋白質A結合捕獲機制、蛋白質G結合捕獲機制、抗體或抗體片段結合捕獲機制、底物結合捕獲機制、輔因子結合捕獲機制、標籤結合捕獲機制、和/或適配體結合捕獲機制）的樹脂。在一些實施例中，所述一個或多個捕獲層析系統包括由樹脂粒、多孔膜、或奈米纖維組成的層析介質。在一些實施例中，所述層析介質被官能化以用於親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水相互作用層析、或混合模式層析。在一些實施例中，所述親和層析介質是基於蛋白質A的樹脂。

在一些實施例中，所述一個或多個捕獲層析系統是週期性逆流層析系統（periodic counter current chromatography system，PCCS）。在一些實施例中，PCCS包括兩個層析管柱或包括經修改的ÄKTA系統（GE Healthcare，皮斯卡塔韋，新澤西州），其能夠以最多例如四個、五個、六個、七個、八個或多於八個管柱來運行。在一些實施例中，PCCS利用管柱切換機制。管柱切換事件可以通過檢測重組蛋白的位準（通過對應於在通過層析系統之流體中重組蛋白的某個位準的UV吸光度來檢測）、液體（例如，緩衝液）的特定體積、或經過的特定時間來觸發。

為了使用捕獲層析系統來捕獲重組蛋白，必須依序進行負載（loading）、洗滌、沖提、和再生捕獲層析系統的層析步驟。

在一些實施例中，將來自所述一個或多個捕獲層析系統的沖提物，均質化成包含所述重組蛋白的單一混合物。在一些實施例中，使經均質化的單一混合物通過一個或多個後捕獲層析系統，並且收集包含所述重組蛋白的產物輸出物。使用後捕獲層析系統從含有接近最終希望純度的重組蛋白之流體中去除剩餘的痕量或少量污染物或雜質。在一些實施例中，所述一個或多個後捕獲層析系統包括由樹脂粒、多孔膜、或奈米纖維組成的層析介質。在一些實施例中，所述層析介質被官能化以用於親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水相互作用層析、或混合模式層析。在一些實施例中，所述一個或多個後捕獲層析管柱是週期性逆流層析系統（PCCS）。

為了使用後捕獲層析系統對重組蛋白進行後捕獲處理，必須依序進行負載、洗滌、沖提、和再生後捕獲層析系統的層析步驟。

在一些實施例中，所述方法和系統包括超過濾（UF）和/或透析過濾（DF），以進一步純化和濃縮重組蛋白。UF/DF可以增加重組蛋白的濃度，並且用特定配製緩衝液來替換緩衝鹽類。超過濾（UF）是指一種類型的膜過濾，其中靜水壓力迫使液體壓向半透膜。在一些實施例中，UF係以切向流動過濾（TFF）來進行，其包括單一TFF和高性能切向流動過濾（HPTFF）。單程切向流動過濾（SPTFF）是指的任何一種TFF系統，其中單程通過模組的轉化率（滲透物流速除以入口進料流速）足夠大，而使得系統可以在沒有針對滲餘物的回收（再迴圈）回路的情況下操作。SPTFF可以用於進行其他單元操作之間的線上濃縮，例如以在層析或沉澱步驟之前減少處理體積。Zydney,Biotechnol.Bioeng. 113(3): 465-75 (2016)。

如本文所用的「透析過濾」是指使用超過濾膜從含有諸如抗體、胜肽、核酸和其他生物分子的蛋白質的溶液中去除、置換或降低鹽類或緩衝組分的濃度的方法。連續式透析過濾（也稱為恆定體積透析過濾）涉及通過向滲餘物中添加水或新緩衝液（諸如配製緩衝液）來洗出滲餘物中的原始緩衝鹽（或其他低分子量種類），以形成含有重組產生的多肽的調配物。典型地，以與產生濾液相同的速率來添加新的緩衝液，使得在透析過濾期間，滲餘物體積和產物濃度不會明顯變化。在特定的實施例中，所述透析過濾是使用單程透析過濾匣來進行的。

在一些實施例中，使經均質化的單一混合物在經受一個或多個後捕獲層析系統之前經受病毒失活。在一些實施例中，病毒失活包括溶劑-洗滌劑溶液失活、加熱失活、或酸性pH失活。

對於溶劑-洗滌劑病毒失活來說，步驟係涉及使包含重組蛋白的樣品經受有機溶劑和洗滌劑。溶劑-洗滌劑組合可以是本領域已知的任何溶劑-洗滌劑組合，諸如磷酸三正丁酯和Triton X-100™、Tween 80™和膽酸鈉及其他。

通過熱失活來進行的病毒失活，涉及使包含重組蛋白的樣品經過較高的溫處理。在一些實施例中，所述方法包括將樣品加熱至大於或等於45ºC、46ºC、47ºC、48ºC，並且最多約大於或等於49ºC、50ºC、51ºC和更高的溫度。在一些實施例中，將樣品加熱至在45ºC與65ºC之間的溫度。

樣品的加熱時間可以有所變化。例如，在一些實施例中，將樣品加熱至目標溫度，以持續1分鐘與6小時之間的時間。在一些實施例中，將樣品加熱至目標溫度，以持續在10與180分鐘之間、在20與180分鐘之間、在20與60分鐘之間、或在20與40分鐘之間的時間。

在一些實施例中，酸性pH失活係通過以下方式進行：將均質化的單一混合物用一或多種溶液線上調節至低pH，並且將經調節的均質化的單一混合物在所述低pH下培養一段時間，以產生病毒失活混合物。

本文揭示的方法和系統包括線上監測，包括檢測重組蛋白的位準（通過UV吸光度來檢測）、檢測流速、和/或檢測流體（例如緩衝液）的體積。監測重組蛋白濃度（例如，通過UV監測進行監測）可以通過帶有回饋控制且能夠線上測量產物濃度的任何工具來確定。

在一些實施例中，將均質化的單一混合物係暴露於低pH下持續15分鐘至2小時。在特定的實施例中，所述低pH是在3與5之間的pH。pH位準的選擇係取決於重組蛋白和其他緩衝組分的穩定性特徵曲線。病毒失活後，在繼續所述方法之前可以將抗體溶液的pH調節至更中性的pH，例如在4.0至8.5之間。

在一些實施例中，病毒失活在管式流動反應器中進行，如Parker等人，Biotechnol. Bioeng. 115(3): 606-16 (2018) 所描述。在一些實施例中，所述管式流動反應器具有至少30分鐘的限定最小停留時間（defined minimum residence time）。

在一些實施例中，在從後捕獲層析系統中收集產物輸出物之後包括病毒移除步驟，諸如病毒過濾。進行病毒移除步驟以移除更耐受病毒失活處理的小型無包膜病毒。在一些實施例中，在加壓回路中進行病毒過濾，其中所述加壓回路包括壓力器皿、病毒移除過濾器、和滅菌過濾器。在一些實施例中，所述加壓回路中的病毒移除過濾器是中空纖維病毒過濾器。在一些實施例中，所述壓力器皿是單次使用的、密閉的且可滅菌的器皿。如本文所用，術語「可滅菌的」是指由與已知滅菌方法相容的材料形成的器皿。在一些實施例中，使用封閉端型過濾進行病毒過濾。如本文所用，「封閉端型過濾」是指其中所過濾的整個流體流經過過濾器，而沒有回收或滲餘物流動的過濾。在一些實施例中，所述病毒移除過濾器是超過濾器或奈米過濾器。合適的病毒過濾系統的例子揭示在國際公開號WO 2018/035116中，將其通過引用併入本文中。

在一些實施例中，所述第一單元操作包括與在所述第二單元操作上的入口連接的出口，其中所述第二單元操作包括與在所述第三單元操作上的入口連接的出口，其中所述第三單元操作包括與在所述第四單元操作上的入口連接的出口。在一些實施例中，所述第一單元操作包括與在所述第五單元操作上的入口連接的出口，其中所述第五單元操作包括與在所述第二單元操作上的入口連接的出口，其中所述第二單元操作包括與所述第三單元操作上的入口連接的出口，其中所述第三單元操作包括與在所述第六單元操作上的入口連接的出口，其中所述第六單元操作包括與在所述第四單元操作上的入口連接的出口。

在一些實施例中，本文揭示的系統包括在所述第一單元操作、所述第二單元操作、所述第三單元操作、和所述第四單元操作中的每個之間的緩衝器皿。緩衝器皿能夠在移入下一個操作單元之前保持任何液體培養物。

本文描述的系統還可以包括佈置在任何單元操作之間的流體導管。合適的流體導管可以是由聚乙烯、聚碳酸酯或塑膠製成的管。流體導管還可以包括以任何組合的以下中的一種或多種：一個或多個線上緩衝液調節儲存器，其與流體導管流體連通，並且定位成使得將儲存在一個或多個線上緩衝液調節儲存器內的緩衝液，添加到存在於流體導管中的流體；以及一或多個過濾器，其被佈置在流體導管中，使得它們能夠過濾（例如，去除細菌）存在於流體導管中的流體。

在一些實施例中，本文提供的系統包括幫浦系統。幫浦系統可以包括以下中的一或多種：本領域已知的一個或多個幫浦、本領域已知的一個或多個過濾器、和一個或多個UV檢測器。

在一些實施例中，在超過濾/透析過濾之後，將一或多種賦形劑添加到產物輸出物中，以產生治療性藥物物質。

如本文所用的「治療性藥物物質」是指包含重組蛋白的物質，所述重組蛋白已充分純化，或與污染性蛋白質、脂質和核酸（例如，存在於液體培養基中的污染性蛋白質、脂質和核酸或者與宿主細胞（例如，哺乳動物、酵母或細菌宿主細胞）和生物污染物（例如，病毒和細菌污染物）分離，並且可被配製成藥劑，而無需任何進一步的實質純化和/或淨化步驟。

在一些實施例中，本文揭示的系統是在滑軌上的。如本文所用的「滑軌」是指可以充當用於本文描述的系統的平臺或支撐物的三維實體結構。如果滑軌包括一個或多個能夠移動的結構（例如，輪、滾筒等），則它可以為系統或其一部分賦予移動性。

在一些實施例中，所述方法和系統具有至少約40%、50%、55%、或60%，並且最多約65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的重組蛋白回收率。在一些實施例中，純化回收率是至少約60%至約70%。

在一些實施例中，本文描述的方法和系統導致治療性蛋白質藥物物質中的重組蛋白，其淨產率為在至少約5天、10天、20天、或30天，並且最多約至少約280天、290天、300天、310天、320天、330天、340天、350天、或365天的連續時間段內，至少為約5 g/天、10 g/天或20 g/天、30 g/天或40 g/天，並且最多約至少約200 g/天、300 g/天、400 g/天、500 g/天、或1000 g/天。實例

以下實例說明本揭示內容的具體實施例以及它們的各種用途。所述實例僅出於解釋性目的來闡述，並且不應被解釋為以任何方式限制本揭示內容的範圍。實例 1 ：重組蛋白的連續式生產

使用接合有雙ATF的100-L強化型灌注型生物反應器，以在70天的過程中生產重組單株抗體（mAb）。將不含細胞而含有mAb的培養基（收穫物）連續泵送到100 L的收穫緩衝器皿中，以進一步處理。

含有抗體的培養基係使用2X 1-L（8 x 20 cm）預包裝且經輻照的蛋白質A親和層析管柱來捕獲，其係以結合及沖提MCC模式（bind-and-elute MCC mode）並在前導規模就地蒸汽（pilot scale steam-in-place）PCC滑軌上操作。執行捕獲步驟，使得兩管柱其中之一者始終從收穫物緩衝器皿中負載，並且進入捕獲步驟中的平均入口體積流速與離開灌注型生物反應器的平均出口體積流速係匹配。通過Delta UV將在蛋白質A柱上的負載量控制在大約3%的突破量（breakthrough）。在病毒失活之前，將各自的捕獲管柱沖提物收集在5-L混合器皿中。在第12天將蛋白質A操作係與灌注型生物反應器整合，並且連續運行58天。圖3A至3F係顯示總結蛋白質A操作性能的資料。

各自的蛋白質A沖提物係混合在5-L混合器皿中以確保有均質流，以進行病毒失活單元操作。混合器皿的流出是自動化的，使得在下一個蛋白質A沖提迴圈之前整個器皿係有被處理過。均質化的蛋白質A沖提物係藉由添加1 M的乙酸以線上調節其目標pH至3.6。然後將低pH值調節的蛋白質A沖提物泵送過管式流動反應器（TFR），其中限定最小停留時間 ≥ 30分鐘，以確保在低pH下有足夠的時間來實現完全的病毒失活。然後，病毒失活的蛋白質A沖提物係藉由添加0.75 M的乙酸鈉以線上調節其目標pH至4.5。然後將經調節的病毒失活的蛋白質A沖提物通過滅菌級過濾器處理，並且連續地收集在小型緩衝器皿中，以進一步處理。在第15天將病毒失活操作與先前的操作整合，並且連續運行55天。圖4A至4G係顯示總結病毒失活操作性能的資料。

將經調整的病毒失活的蛋白質A沖提物通過兩個正交層析操作進一步處理，其使用混合模式陰離子交換樹脂和疏水相互作用層析樹脂，以流通模式操作。對於此實例過程，兩個後捕獲層析操作之間不存在步驟間調節，從而允許流過物從混合模式管柱直接負載到疏水相互作用管柱上。後捕獲列（post capture train）由2X 0.2 L（5 x 10 cm）預填充混合模式管柱和2X 0.2 L（5 x 10 cm）預填充疏水相互作用管柱所組成，其係與蛋白質A操作相同，係在PCC滑軌上以MCC模式操作。將經調節且病毒失活的蛋白質A沖提物流連續負載在兩個平行的後捕獲列其中之一者上，其中管柱負載是自動化的，使得每個後捕獲迴圈中負載相當於大約2倍蛋白質A沖提物的質量。

將組合的混合模式/疏水相互作用流過物（標記為後捕獲沖提物）連續地收集在小型緩衝器皿中，以進一步處理。在第23天將後捕獲層析操作與先前的單元操作整合，並且連續運行47天。圖5A-5D係顯示總結後捕獲層析操作性能的資料。

將後捕獲沖提物通過0.1 m² Planova 20N（AK Bio）病毒移除過濾器進一步處理，其以切向流動模式操作。將後捕獲沖提物從緩衝器皿連續轉移至加壓回路，該加壓回路含有壓力器皿、病毒移除過濾器、滅菌級過濾器、和蠕動幫浦，以驅動再迴圈，如圖6A所示。回路中的壓力是自動化的，因此通過病毒過濾器的淨體積流速（滲透物通量）等於從後捕獲操作出來的淨體積流速。根據初步的病毒驗證研究，週期性地更換Planova 20N過濾器。將病毒過濾的材料連續地收集在小型緩衝器皿中，以進一步處理。在第29天將病毒過濾操作與先前的單元操作整合，並且連續運行41天。圖6B至6F係顯示總結病毒過濾操作性能的資料。

將病毒過濾的材料使用0.065 m² ILC單程TFF（SP-TFF）盒通過超過濾進一步處理，並且濃縮至65 g/L的目標mAb濃度。將材料從後病毒過濾緩衝器皿泵送至SP-TFF盒的入口，其體積流速係與離開病毒過濾操作的出口流速相匹配。使用回饋回路，通過線上測量產物濃度，來自動控制離開SP-TFF盒的滲餘物流速，以維持目標濃度值。然後將濃縮的mAb流直接泵送至單程透析過濾（SP-DF）盒的入口，以進行線上緩衝液交換。將透析過濾緩衝液泵送至SP-DF盒的緩衝液入口，並且將緩衝液流量自動化，使緩衝液與產物流量的比率維持恆定。控制滲餘物流速以匹配入口流速。然後通過線上添加濃縮的賦形劑溶液，來調配緩衝液交換的DF滲餘物流，以產生經調配的物料。經調配的物料係通過滅菌級過濾器進一步處理，以產生藥物物質，將其收集在單次使用的器皿中。在第42天將超過濾和透析過濾操作與先前的單元操作整合，並且連續運行29天。在第46天將調配操作和藥物物質產生進行整合，並且連續地運行25天。在25天的過程中，產生6個批次的藥物物質。圖7A至7E和圖8A至8D係顯示總結超過濾和透析過濾操作性能的資料。圖9A至9H顯示所產生的藥物物質的屬性。實例 2 ：重組蛋白的連續式生產

使用接合有雙ATF的100-L強化式灌注型生物反應器，以在27天的過程中生產重組單株抗體（mAb）。將不含細胞而含有mAb的培養基（收穫物）連續泵送到100 L的收穫物緩衝器皿中，以進一步處理。

含有抗體的培養基係使用2X 1-L（8 x 20 cm）預包裝且經輻射照射過的蛋白質A親和層析管柱來捕獲，其係以結合與沖提MCC模式操作，並在前導規模就地蒸汽（steam-in-place）PCC滑軌上進行。執行捕獲步驟，使得兩管柱其中之一者始終從收穫物緩衝器皿中負載，並且進入捕獲步驟中的平均入口體積流速係與離開灌注型生物反應器的平均出口體積流速為匹配。通過Delta UV將在蛋白質A柱上的負載量控制在大約3%的突破量。在病毒失活之前，將各自的捕獲管柱沖提物收集在5-L的混合器皿中。在第12天將蛋白質A操作與灌注型生物反應器整合，並且連續運行15天。

所述各自的蛋白質A沖提物係混合在5-L混合器皿中，以確保有均質流，以進行病毒失活單元操作。混合器皿的流出是自動化的，使得整個器皿係在下一個蛋白質A沖提迴圈之前有被處理過。均質化的蛋白質A沖提物係通過添加1 M乙酸以線上調節其目標pH至3.6。然後，低pH值調節的蛋白質A沖提物係泵送通過以3D列印並經γ射線輻射照射過的管式流動反應器（TFR），其中限定最小停留時間 ≥ 30分鐘，以確保在低pH下有足夠的時間來實現完全的病毒失活。然後，病毒失活的蛋白質A沖提物係通過添加0.75 M乙酸鈉以線上調節其目標pH至4.5。然後，經調節的病毒失活的蛋白質A沖提物係通過滅菌級過濾器處理，並且連續地收集在小型緩衝器皿中，以進一步處理。在第13天將病毒失活操作與先前的操作整合，並且連續運行14天。

經調整的病毒失活的蛋白質A沖提物係通過兩個正交層析操作進一步處理，其係使用混合模式陰離子交換樹脂和疏水相互作用層析樹脂，以流通模式操作。後捕獲列係由以MCC模式操作的2X 0.2 L（5 x 10 cm）預填充且經γ射線輻射照射的混合模式管柱和2X 0.2 L（5 x 10 cm）預填充且經γ射線輻射照射過的疏水相互作用管柱所組成。經調節且病毒失活的蛋白質A沖提物流，係連續負載在兩個混合模式管柱其中之一者上，並且將混合模式管柱的流過物連續地負載在兩個疏水相互作用管柱其中之一者上。將混合模式管柱和疏水相互作用管柱分別負載至其各自的負載能力。

在第14天將後捕獲層析操作與先前的單元操作整合，並且連續運行13天。

將捕獲後沖提物通過0.1 m² Planova 20N（AK Bio）病毒移除過濾器進一步處理，其係以切向流動模式操作。將捕獲後沖提物從疏水相互作用管柱的出口連續地轉移至加壓回路，該加壓回路含有壓力器皿、病毒移除過濾器、滅菌級過濾器、和蠕動幫浦，以驅動再迴圈。回路中的壓力是自動化的，因此通過病毒過濾器的淨體積流速（滲透物通量）等於從後捕獲操作出來的淨體積流速。將病毒過濾的材料連續地收集在小型緩衝器皿中，以進一步處理。在第14天將病毒過濾操作與先前的單元操作整合，並且連續運行13天。

將病毒過濾的材料使用串聯的2x0.1 m² 經γ射線輻射照射過的TFF膠囊通過超過濾進一步處理，其以單程模式操作。將病毒過濾的材料濃縮至110 g/L的目標mAb濃度。將材料從後病毒過濾緩衝器皿泵送至TFF膠囊的入口，其體積流速係與離開病毒過濾操作的出口流速相匹配。使用回饋回路通過線上測量產物濃度，來自動控制離開TFF膠囊的滲餘物流速，以維持目標濃度值。然後將濃縮的mAb流直接泵送至經γ射線輻射照射過的單程透析過濾（SP-DF）盒的入口，以進行線上緩衝液交換。將透析過濾緩衝液泵送至SP-DF盒的緩衝液入口，並且將緩衝液流量自動化，緩衝液與產物流量的比率維持恆定。控制滲餘物流速以匹配入口流速。然後通過線上添加濃縮的賦形劑溶液，來調配緩衝液交換的DF滲餘物流，以產生經調配的物料。通過回饋回路和線上感測器（其測量經調配的流中的賦形劑位準），來控制經調配緩衝液的添加。將經調配的物料通過滅菌級過濾器進一步處理，以產生藥物物質，將其收集在單次使用的器皿中。第18天將超過濾和透析過濾操作與先前的單元操作整合，並且在第20天整合調配操作。由於線上感測器的問題，UF/DF和配製操作在運轉（campaign）結束之前未達到穩定狀態。

雖然本文已經根據各種實施例加以描述，但是應當理解，熟習此項技術者會想到變化和修改。因此，所附申請專利範圍旨在涵蓋在如所請求之本文範圍內的所有此類等效變化。另外，本文使用的章節標題僅出於架構性目的，而不被解釋為限制所描述的主題。

除非有明確的相反指示，否則可以將本文描述的每個實施例與其他任何一個或多個實施例加以組合。特言之，除非有明確的相反指示，否則可以將指示為較佳或有利的任何特徵或實施例與指示為較佳或有利的其他任何一個或多個特徵或一個或多個實施例加以組合。

所有本申請案中引用的參考文獻，均係藉由引用而明確地納為本文揭露內容之一部。

無。

圖1是展示了本文揭示的方法的工藝流程的示意圖。所述工藝流程包括使用線上緩衝液生產重組蛋白的連續式過程，其包括：(1) 在接合有雙交替切向流動（ATF）過濾器和細胞分離的生物反應器中生產重組蛋白（標記為「BRX」），(2) 捕獲重組蛋白，使用一個或多個捕獲層析系統來捕獲重組蛋白，該重組蛋白存在於與捕獲層析系統連接的生物反應器中獲得之培養基中（標記為「捕獲」），(3) 培養基的病毒失活（標記為「VI」），(4) 使培養基通過一個或多個後捕獲層析系統（標記為「後捕獲後」），(5) 培養基的病毒過濾，以及(6) 培養基的超過濾/透析過濾。

圖2A和2B顯示本文揭示的方法和系統的單元操作整合的概述。圖2A顯示每個操作單元之連續式操作的單元操作整合持續時間。圖2B顯示每個單元操作的平均蛋白質停留時間。本文揭示的方法和系統經25天的時間段產生約5 kg藥物物質。

圖3A至3F是曲線圖，所述曲線圖顯示本文揭示的方法和系統之蛋白質A操作性能。圖3A顯示蛋白質A沖提物濃度（g/L），圖3B顯示蛋白質A沖提物殘留的宿主細胞蛋白質，圖3C顯示蛋白質A沖提物殘留蛋白質，圖3D顯示蛋白質A入口質量流量，並且圖3E和3F顯示蛋白質A紫外線層析圖。

圖4A至4G是曲線圖，所述曲線圖顯示本文揭示的方法和系統的病毒失活操作性能。圖4A顯示在整個單元操作中維持的病毒失活pH，圖4B顯示失活之前的蛋白質濃度，圖4C顯示在病毒失活期間的蛋白質質量流量，圖4D顯示在病毒失活期間的酸流量，圖4E顯示在病毒失活期間的鹼流量，圖4F顯示在病毒失活期間的高分子量種類，並且圖4G顯示在病毒失活之後的蛋白質濃度。

圖5A至5D是曲線圖，所述曲線圖顯示本文揭示的方法和系統的後捕獲操作性能。圖5A顯示後捕獲沖提物殘留蛋白質A，圖5B顯示後捕獲沖提物蛋白質濃度，圖5C顯示紫外線層析圖，並且圖5D顯示後捕獲沖提物殘留的宿主細胞蛋白質。

圖6A顯示本文揭示的方法和系統的病毒過濾的示意圖。圖6B至6G是曲線圖，所述曲線圖顯示本文揭示的方法和系統的病毒過濾操作性能。圖6B顯示在病毒過濾之後的蛋白質濃度，圖6C顯示在病毒過濾之後的高分子量種類，圖6D顯示在病毒過濾期間的蛋白質質量通量，圖6E顯示在病毒過濾期間的濾液體積通量，圖6F顯示在病毒過濾期間的跨膜壓力，並且圖6G顯示在病毒過濾期間的過濾器性能。

圖7A至7E是曲線圖，所述曲線圖顯示本文揭示的方法和系統的超過濾操作性能。圖7A顯示在超過濾之後的蛋白質濃度和轉化率，圖7B顯示在超過濾期間的過濾器性能，圖7C顯示在超過濾期間的入口蛋白質質量通量，圖7D顯示在超過濾期間的滲透物體積通量，並且圖7E顯示在超過濾期間的跨膜壓力。

圖8A至8E是曲線圖，所述曲線圖顯示本文揭示的方法和系統的透析過濾操作性能。圖8A顯示在透析過濾期間的滲透物體積通量，圖8B顯示在透析過濾期間的蛋白質質量通量，圖8C顯示在透析過濾期間的跨膜壓力，圖8D顯示透析過濾比率，並且圖8E顯示在透析過濾期間的過濾器性能。

圖9A至9H是曲線圖，所述曲線圖顯示使用本文揭示的方法和系統生產之藥物物質的屬性。圖9A顯示藥物物質的濃度，圖9B顯示藥物物質的高分子量種類，圖9C顯示藥物物質的電荷特徵曲線，圖9D顯示藥物物質的重量滲透濃度，圖9E顯示藥物物質的pH，圖9F顯示以ELISA測量藥物物質之宿主細胞蛋白質，圖9G顯示藥物物質的非還原純度，並且圖9H顯示藥物物質的殘留蛋白質A。

Claims (41)

1. 一種用於生產重組蛋白的連續式方法，所述方法包括： (a)       使用一個或多個捕獲層析系統從實質上不含細胞的樣品中捕獲所述重組蛋白，並且從所述一個或多個捕獲層析系統中沖提出所述重組蛋白，以產生包含所述重組蛋白的沖提物，其中將所述沖提物均質化成包含所述重組蛋白的單一混合物； (b)       使經均質化的單一混合物通過一個或多個後捕獲層析系統，並且收集包含所述重組蛋白的產物輸出物；以及 (c)       使所述產物輸出物經受超過濾和透析過濾，以純化所述重組蛋白； 其中所述方法從步驟(a)至步驟(c)是整合且連續式的。
2. 如請求項1所述的方法，其進一步包括在步驟(a)之後使經均質化的單一混合物經受病毒失活。
3. 如請求項2所述的方法，其中病毒失活包括溶劑-洗滌劑溶液失活、熱失活、或酸性pH失活。
4. 如請求項3所述的方法，其中所述酸性pH失活包括： (a)       通過添加一種或多種溶液將經均質化的單一混合物線上調節至低pH；以及 (b)       將經調節的均質化的單一混合物在所述低pH下培養一段時間，以產生病毒失活混合物。
5. 如請求項4所述的方法，其中所述時間在15分鐘至2小時之間。
6. 如請求項1所述的方法，其進一步包括使步驟(b)的產物輸出物經受病毒過濾。
7. 如請求項1所述的方法，其中所述實質上不含細胞的樣品係從包含產生所述重組蛋白之宿主細胞的灌注型生物反應器、包含產生所述重組蛋白之宿主細胞的分批補料型生物反應器、或包含產生所述重組蛋白之宿主細胞的澄清液體培養物中所取出。
8. 如請求項1所述的方法，其中所述一個或多個捕獲層析系統和所述一個或多個後捕獲層析系統包括層析介質，所述層析介質包括樹脂粒、多孔膜、或奈米纖維。
9. 如請求項8所述的方法，其中所述層析介質被官能化以用於親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水相互作用層析、或混合模式層析。
10. 如請求項9所述的方法，其中所述親和層析介質是基於蛋白質A的樹脂。
11. 如請求項1所述的方法，其中所述一個或多個捕獲層析系統和所述一個或多個後捕獲層析系統是週期性逆流層析系統（periodic counter current chromatography system，PCCS）。
12. 如請求項4所述的方法，其中將經調節的均質化的單一混合物在所述低pH下培養一段時間以產生病毒失活是在管式流動反應器中進行的。
13. 如請求項4所述的方法，其中所述一種或多種溶液的添加係基於線上重組蛋白濃度測量和線上流速測量。
14. 如請求項6所述的方法，其中所述病毒過濾是在加壓回路中進行的。
15. 如請求項14所述的方法，其中所述加壓回路包括壓力器皿、病毒移除過濾器、和滅菌過濾器。
16. 如請求項15所述的方法，其中所述壓力器皿是單次使用的、密閉的且可滅菌的器皿。
17. 如請求項16所述的方法，其中所述病毒移除過濾器是超過濾器或奈米過濾器。
18. 如請求項6所述的方法，其中所述病毒過濾是使用封閉端型過濾進行的。
19. 如請求項18所述的方法，其中所述封閉端型過濾是使用超過濾器或奈米過濾器進行的。
20. 如請求項1所述的方法，其中所述超過濾是用單程切向流動式過濾進行的。
21. 如請求項1所述的方法，其中所述透析過濾是使用單程透析過濾匣進行的。
22. 如請求項1所述的方法，其中所述重組蛋白是抗體或其抗原結合片段。
23. 如請求項1所述的方法，其進一步包括在步驟(c)之後添加一種或多種賦形劑，以產生治療性藥物物質。
24. 一種用於生產重組蛋白的製造系統，所述製造系統包括： (a)       第一單元操作，所述第一單元操作包括包含產生所述重組蛋白之宿主細胞的生物反應器； (b)       第二單元操作，所述第二單元操作包括一個或多個捕獲層析系統； (c)       第三單元操作，所述第三單元操作包括一個或多個後捕獲層析系統；以及 (d)       第四單元操作，所述第四單元操作包括超過濾系統和透析過濾系統。
25. 如請求項24所述的系統，其進一步包括位於所述第一單元操作與所述第二單元操作之間的第五單元操作，其中所述第五單元操作包括用於執行病毒失活的子系統。
26. 如請求項25所述的系統，其中所述子系統是管式流動反應器。
27. 如請求項24所述的系統，其進一步包括位於所述第三單元操作與所述第四單元操作之間的第六單元操作，其中所述第六單元操作包括用於執行病毒過濾的第二子系統。
28. 如請求項24所述的系統，其中所述一個或多個捕獲層析系統和所述一個或多個後捕獲層析系統包括層析介質，所述層析介質包括樹脂粒、多孔膜、或奈米纖維。
29. 如請求項28所述的系統，其中所述層析介質被官能化以用於親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水相互作用層析、或混合模式層析。
30. 如請求項29所述的系統，其中所述親和層析介質是基於蛋白質A的樹脂。
31. 如請求項24所述的系統，其中所述一個或多個捕獲層析管柱和所述一個或多個後捕獲層析系統是週期性逆流層析系統（PCCS）。
32. 如請求項26所述的系統，其中所述管式流動反應器具有至少30分鐘的限定最小停留時間。
33. 如請求項27所述的系統，其中所述用於執行病毒過濾的第二子系統是加壓容器，所述加壓容器包括病毒移除過濾器和滅菌過濾器。
34. 如請求項33所述的系統，其中所述加壓容器是單次使用的、密閉的且可滅菌的容器。
35. 如請求項33所述的系統，其中所述病毒移除過濾器是超過濾器或奈米過濾器。
36. 如請求項24所述的系統，其中所述第一單元操作包括與所述第二單元操作之入口連接的出口，其中所述第二單元操作包括與所述第三單元操作之入口連接的出口，其中所述第三單元操作包括與所述第四單元操作之入口連接的出口。
37. 如請求項24所述的系統，其進一步包括在所述第一單元操作、所述第二單元操作、所述第三單元操作、和所述第四單元操作中的每個之間的緩衝器皿。
38. 如請求項24所述的系統，其中所述重組蛋白是抗體或其抗原結合片段。
39. 如請求項24所述的系統，其中所述系統是在滑軌上的。
40. 如請求項24所述的系統，其中所述系統是密閉的。
41. 如請求項24所述的系統，其進一步包括第七單元操作，所述第七單元操作包括第三子系統，其中所述第三子系統包括用於配製治療性藥物物質的線上賦形劑。

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