ES2913277T3 - Producción mejorada de glicoproteínas utilizando manganeso - Google Patents

Abstract

Un método para producir una composición eritropoyética que comprende glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis sialiladas, que comprende las etapas de: cultivar una célula huésped sensible al manganeso que produce una glicoproteína estimulante de la eritropoyesis en un medio de cultivo que contiene una cantidad de manganeso eficaz para aumentar la sialilación de dicha composición eritropoyética producida por dicha célula huésped sensible al manganeso, en donde la concentración de manganeso en dicho medio de cultivo oscila entre 0,4 y 40 μM, y en donde la glicoproteína estimulante de la eritropoyesis es eritropoyetina, darbepoyetina o análogos funcionales de las mismas, y en donde la célula huésped sensible al manganeso es una célula de mamífero.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción mejorada de glicoproteínas utilizando manganeso

La presente invención reivindica el beneficio bajo 35 USC § 119 de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N° 60/748.880, que se presentó el 8 de diciembre de 2005.

Campo de la Invención

La invención se refiere a métodos de cultivo celular y a medios que contienen manganeso que mejoran la glicosilación o sialilación de glicoproteínas, incluyendo la eritropoyetina y sus análogos o derivados.

Antecedentes

La eritropoyetina (EPO) es una hormona glicoproteica que normalmente es sintetizada y secretada por las células peritubulares en el riñón y funciona como el principal regulador homeostático de la producción de glóbulos rojos. La eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) se utiliza clínicamente para tratar anemias y aumentar la producción de glóbulos rojos en numerosas afecciones diferentes, tales como pericirugía, insuficiencia renal crónica, efectos secundarios del tratamiento contra el VIH o el VHC y efectos secundarios de la quimioterapia contra el cáncer. La biosíntesis farmacéutica de glicoproteínas tales como la EPO se complica por la necesidad tanto de altos niveles de expresión como de un procesamiento post-traduccional adecuado, que implica la adición de cadenas de oligosacáridos ramificados enlazadas a N y enlazadas a O. Strnad (2010, Biotechnol Progress, 26(3):653-663) informa que parámetros tales como la velocidad de agitación y el volumen de trabajo pueden afectar a la glicosilación de la EPO producida por células CHO.

En las glicoproteínas, los azúcares se unen al átomo de nitrógeno de la amida en la cadena lateral de la asparagina (denominado enlace N) o al átomo de oxígeno en la cadena lateral de la serina o la treonina (denominado enlace O). El procedimiento para formar hidratos de carbono enlazados a N comienza con la adición de 14 monosacáridos a un dicol enlazado a lípidos en el retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés). Después de su formación, este complejo de hidratos de carbono se transfiere entonces a la proteína mediante el complejo de oligosacariltransferasa (OST) en un proceso denominado «glicosilación central» en el ER. El complejo de oligosacariltransferasa (OST) es una unidad multiproteica compuesta por riboforina I, II, OST48 y DAD1 (Kelleher y Gilmore 1997 PNAS 94(10):4994-4999; Kelleher et al. 2003 Molecular Cell 12(1 ):101-111; Kelleher et al. 1992 Cell 69(1):55-65).

Posteriormente, los polipéptidos son transportados al complejo de Golgi en donde se agregan las cadenas de azúcar enlazadas a O y las cadenas de azúcar enlazadas a N se modifican de muchas maneras diferentes. En los compartimientos cis y mediano del complejo de Golgi, el complejo enlazado a N de 14 sacáridos original se puede recortar mediante la eliminación de residuos de manosa (Man) y se puede alargar mediante la adición de residuos de N-acetilglucosamina (GlcNac) y/o fucosa (Fuc). Las diversas formas de hidratos de carbono enlazadas a N tienen en común un núcleo de pentasacárido que consiste en tres residuos de manosa y dos de N-acetilglucosamina. Finalmente, en el Golgi trans, se pueden agregar otros residuos de GlcNac, seguidos de galactosa (Gal) y un ácido siálico terminal (Sial). El procesamiento de hidratos de carbono en el complejo de Golgi se denomina "glicosilación terminal" para distinguirlo de la glicosilación central.

El ácido siálico es un nombre genérico para una familia de aproximadamente 30 monosacáridos ácidos naturales que con frecuencia son los azúcares terminales de los hidratos de carbono que se encuentran en las glicoproteínas y los glicolípidos. La sialilación de glicoproteínas recombinantes es muy importante y puede impartir muchas propiedades significativas a la glicoproteína, incluyendo la carga, la inmunogenicidad, la resistencia a la degradación de la proteasa, la tasa de eliminación de plasma y la bioactividad.

Las unidades finales de hidratos de carbono complejos pueden adoptar muchas formas, algunas de las cuales tienen dos, tres o cuatro ramas (denominadas biantenario, triantenario o tetraantenario). A continuación, se muestra un ejemplo de estructura biantenaria enlazada a N:

M íin -G Ic N a c - G a l — S ia l

i .

As-paragina - G le N a c - GleN&c - Man

\ ■ ■

Man — GleÑac — Gal — Siali

Un cierto número de enzimas implicadas en la glicosilación utilizan cationes divalentes como cofactores. Por ejemplo, numerosas enzimas implicadas en la síntesis de oligosacáridos enlazados a dolicol requieren cationes divalentes como cofactores para su actividad (Couto et al. 1984 J. Biol. Chem. 259(1):378-382; Jensen y Schutzbach 1981 J. Biol. Chem. 256(24):12899-12904; Sharma et al. 1982 European Journal of Biochemistry 126(2):319-25). La enzima que cataliza la adición de hidrato de carbono enlazado a O al polipéptido también requiere un catión divalente para la actividad (Sugiura et al. 1982 J. Biol. Chem. 257(16):9501-9507). El manganeso (Mn++) es un cofactor necesario para la enzima p-galactosido-a-1,3-galactosiltransferasa, que cataliza la adición de galactosa terminal a los azúcares de N-acetilglucosamina alargados (Witsell et al. 1990 J. Biol. Chem. 265(26): 15731-7). Anteriormente se informó que el manganeso en una concentración de 0,1 mM o 1 mM revirtió parcialmente la reducción en la ocupación de eritropoyetina ligada a N y ligada a O provocada por A23187, un compuesto que agota los cationes divalentes (Kaufman et al. 1994 Biochemistry 33(33):9813-9). El documento EP 1085083 A1 describe un medio de crecimiento para cultivar una célula animal con el fin de obtener una proteína producida por dicha célula. Si bien el medio puede contener, entre otros, sulfato de manganeso, los autores no comentan sobre la concentración de dicho sulfato de manganeso. El documento WO 98/08934 A1 describe un medio de crecimiento para cultivar células huésped para la producción de proteínas que se dice que contiene sales de manganeso tal como MnCl2 en una concentración inferior a 0,01 gM.

Se ha demostrado previamente que rHuEPO contiene tres estructuras de hidratos de carbono ramificadas enlazadas a N y una enlazada a O que están altamente sialiladas (Takeuchi et al. 1988 J. Biol. Chem. 263(8):3657-3663). La EPO desialilada es virtualmente inactiva para inducir la eritropoyesis in vivo debido a la rápida eliminación de esta proteína modificada por el receptor de glicoproteína asialo del hepatocito (Ashwell y Harford 1982 Annual Review of Biochemistry 51 (1 ):531 -554; Goochee et al. 1991 Bio/Technology. 9(12):1347-55). También Yoon et al. (2003, Biotechnol and Bioengineer, 82(3):289-298) enfatizan la importancia de la alta sialilación de EPO para su actividad biológica in vivo. Otros estudios han demostrado que la sialilación y la glicosilación disminuyen la cinética de unión de la EPO al receptor de la EPO. (Darling et al. 2002 Biochemistry 41(49): 14524-31.)

El documento EP 1298 217 A1 describe la producción de la glicoproteína antitrombina III en células CHO-K1 en presencia de manganeso 0,059 gM.

Los documentos WO 85/02610 A1 y WO 95/05465 A1 describen un procedimiento para la producción de eritropoyetina que comprende el cultivo de células CHO en un medio que contiene suero de ternero fetal al 5 % y, como consecuencia, cantidades potencialmente pequeñas de manganeso.

El documento WO 00/65070 A2 describe un método para producir un activador del plasminógeno tisular (t-PA) en presencia de cationes de metales divalentes.

Rayner et al. (1995), BioMetals vol. 8, páginas 188-192 informa de un método para la eliminación de cationes de metales traza de medios de cultivo que se complementan con suero de ternero fetal.

Shantha et al. (2001) Biochemistry 2001, 40, 8868-8876 describe experimentos de glicosilación in vitro utilizando la molécula inmunoadhesina TNFR-IgG.

La darbepoyetina alfa es un nuevo análogo de glicosilación de la eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) que contiene dos sitios de glicosilación enlazados a N adicionales. La darbepoyetina tiene una actividad de unión al receptor disminuida, pero exhibe una semivida sérica tres veces más prolongada y una actividad in vivo incrementada como resultado de esta persistencia incrementada en la circulación. Se ha demostrado que la actividad in vivo de los análogos de la EPO se correlaciona con el número de hidratos de carbono enlazados a N. (Elliott et al., Exp Hematol.

200432(12): 1146-55.)

La rHuEPO producida en células CHO puede exhibir un grado variable de glicosilación y sialilación. (Takeuchi et al., 1989 PNAS 86(20):7819-22, Zanette et al., 2003 Journal of Biotechnology 101 (3):275-287). Dado que la sialilación de la EPO es un factor importante en la bioactividad in vivo, la consistencia en la glicosilación y niveles más altos de sialilación de rHuEPO y sus análogos son cualidades deseables cuando se produce proteína recombinante para usos terapéuticos. Por lo tanto, existe la necesidad de medios de cultivo y métodos de cultivo que mejoren la glicosilación o sialilación de glicoproteínas producidas en cultivos celulares.

Sumario de la Invención

En un aspecto, la invención proporciona medios de cultivo que comprenden células huésped de mamífero y una cantidad no tóxica de manganeso eficaz para aumentar la sialilación de una composición de glicoproteínas producida por células huésped de este tipo. Específicamente, la invención proporciona medios de cultivo que comprenden células huésped de mamífero que producen glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis y manganeso a una concentración de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 40 pM, en donde la glicoproteína estimulante de la eritropoyesis es eritropoyetina o darbepoyetina o un análogo funcional de cualquiera de éstas.

En una realización de este medio de cultivo, las células huésped secretan una composición eritropoyética.

En otra realización de este medio de cultivo, el manganeso está en una concentración de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 10 pM.

En otra realización de este medio de cultivo, las glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis comprenden (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma; y/o (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (darbepoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para producir una composición eritropoyética que comprende glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis sialiladas, que comprende las etapas de: cultivar una célula huésped de mamífero sensible al manganeso que produce una glicoproteína estimulante de la eritropoyesis en un medio de cultivo que contiene una cantidad de manganeso eficaz para aumentar la sialilación de dicha composición eritropoyética producida por dicha célula huésped sensible al manganeso, en donde la concentración de manganeso en dicho medio de cultivo oscila entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 40 pM, y en donde la glicoproteína estimulante de la eritropoyesis es eritropoyetina, darbepoyetina o análogos funcionales de las mismas.

Preferiblemente, el método comprende, además, la etapa de recuperar una composición eritropoyética en la que menos de aproximadamente el 5 % de las moléculas estimulantes de la eritropoyesis están menos sialiladas.

La cantidad de manganeso utilizada en el método de la invención es preferiblemente eficaz para aumentar el porcentaje de moléculas estimulantes de la eritropoyesis altamente sialiladas.

Además, la cantidad de manganeso utilizada en el método de la invención es preferiblemente eficaz para aumentar el porcentaje de moléculas estimulantes de la eritropoyesis que están glicosiladas en sitios potenciales de glicosilación enlazados a O.

En una realización adicional, la cantidad de manganeso utilizada en el método de la invención es eficaz para aumentar el porcentaje de galactosa entre los azúcares fijados a las moléculas estimulantes de la eritropoyesis.

Preferiblemente, el medio de cultivo utilizado en el método de la invención está esencialmente libre de suero.

En aún otra realización, las moléculas estimulantes de la eritropoyesis utilizadas en el método de la invención comprenden: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma, y/o (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (darbepoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma.

Preferiblemente, la célula huésped utilizada en el método de la invención es una célula CHO.

El manganeso utilizado en el método de la invención preferiblemente está en una concentración de 0,4 a aproximadamente 4 pM.

Preferiblemente, el medio de cultivo utilizado en el método de la invención comprende, además, uno o más aminoácidos complementarios seleccionados del grupo que consiste en asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, isoleucina, leucina, triptófano o valina.

En aún otra realización, las células huésped se cultivan en el método de la invención en botellas rotatorias.

El manganeso utilizado en el método de la invención preferiblemente está en una concentración de 0,4 a aproximadamente 4 pM.

Preferiblemente, el medio de cultivo utilizado en el método de la invención comprende, además, uno o más aminoácidos complementarios seleccionados del grupo que consiste en asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, isoleucina, leucina, triptófano o valina.

En aún otra realización, las células huésped se cultivan en el método de la invención en botellas rotatorias.

En una realización adicional, el manganeso se añade en el método de la invención después de una fase de crecimiento celular rápido. En otra realización, la fase de crecimiento celular rápido dura un período que varía entre aproximadamente 2 y 20 días.

En aún otra realización, el manganeso se añade en el método de la invención después de dos ciclos de recolección. En otra realización, el primer ciclo de recolección dura aproximadamente 8 días y el segundo ciclo de recolección dura aproximadamente 7 días.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 muestra la cantidad de rHuEPO en la fracción de flujo como un porcentaje de la cantidad cargada en la columna y muestra los resultados del medio de cultivo sin manganeso añadido y con 4 pM de manganeso añadido.

La Figura 2 muestra la cantidad de rHuEPO en la fracción retenida por IEX como un porcentaje de la cantidad cargada en la columna y muestra los resultados del medio de cultivo sin manganeso añadido y con 4 pM de manganeso añadido.

La Figura 3 muestra la cantidad de darbepoyetina en la fracción retenida por IEX como un porcentaje de la cantidad cargada en la columna, después de cada uno de los ciclos de recolección, y muestra resultados del medio de cultivo sin manganeso añadido y con 4 pM de manganeso añadido.

La Figura 4 muestra el porcentaje de moléculas de rHuEPO en las que los sitios O estaban ocupados con glicosilación y muestra los resultados del medio de cultivo sin manganeso añadido y con 4 pM de manganeso añadido.

La Figura 5 muestra el porcentaje de moléculas de darbepoyetina en las que los sitios O estaban ocupados con glicosilación, después de cada uno de los ciclos de recolección, y muestra los resultados del medio de cultivo sin manganeso agregado y con 4 pM de manganeso añadido.

La Figura 6 muestra el porcentaje de moléculas de darbepoyetina en las que los sitios O estaban ocupados con glicosilación y muestra los resultados del medio de cultivo con concentraciones variables de manganeso. La Figura 7 muestra formas de glicosilación representativas identificadas por MALDI-TOF MS.

La Figura 8 muestra el porcentaje de rHuEPO altamente sialilada recuperable obtenida después del cultivo en medios estándar, medios enriquecidos (medios estándar complementados con aminoácidos) y medios enriquecidos con concentraciones variables de manganeso.

La Figura 9 muestra el porcentaje de rHuEPO sialiladas a un nivel bajo obtenidas después del cultivo en medios estándar, medios enriquecidos y medios enriquecidos con concentraciones variables de manganeso. La Figura 10 muestra el porcentaje de ocupación del sitio O por glicosilación obtenido después del cultivo en medios estándar, medios enriquecidos y medios enriquecidos con concentraciones variables de manganeso.

Descripción Detallada de la Invención

La invención proporciona medios de cultivo y métodos de cultivo celular que mejoran la sialilación de glicoproteínas, particularmente moléculas estimulantes de la eritropoyesis tales como la eritropoyetina de SEQ ID NO: 3, o análogos, variantes o derivados de la misma, incluyendo la darbepoyetina de SEQ ID NO: 2.

Glicoproteínas recombinantes producidas en células CHO pueden exhibir un grado variable de glicosilación y sialilación. Formas altamente sialiladas de moléculas de glicoproteína pueden separarse de las formas sialiladas a un nivel bajo (incluyendo las no sialiladas) de moléculas de este tipo mediante cromatografía de intercambio aniónico. Los ácidos siálicos, al ser ácidos y, por lo tanto, estar cargados negativamente, son capturados en la columna, de modo que las moléculas altamente sialiladas quedan retenidas en la columna mientras que las formas sialiladas a un nivel bajo fluyen a su través. La cantidad de glicoproteína en cada una de las fracciones (retenidas en la columna frente a la fracción de flujo) puede determinarse y compararse con la cantidad de partida de glicoproteína cargada desde el medio de cultivo celular.

En esta memoria se ha demostrado que la adición de manganeso al medio de cultivo produce alteraciones significativas en el procesamiento post-traduccional de moléculas estimulantes de la eritropoyesis, tales como eritropoyetina y darbepoyetina, por parte de las células cultivadas que producen eritropoyetina. El manganeso disminuye la cantidad de glicoproteína sialilada a un nivel bajo producida (y aumenta la cantidad de glicoproteína altamente sialilada recuperada), aumenta el número de sitios potenciales de glicosilación enlazados a O que están ocupados por cadenas de azúcar, aumenta el número de sitios potenciales de glicosilación enlazados a N que están ocupado por cadenas de azúcar, aumenta la galactosilación terminal de las cadenas de azúcar y aumenta la sialilación terminal de las cadenas de azúcar. El manganeso no pareció alterar el grado de ramificación de las cadenas de azúcar (p. ej., una, dos, tres o cuatro ramificaciones). El manganeso también invierte la reducción de la sialilación observada cuando el medio de cultivo se complementa periódicamente con aminoácidos agotados durante el cultivo celular, p. ej., asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, isoleucina, leucina, triptófano y valina.

La expresión "composición eritropoyética", tal como se utiliza en esta memoria, significa una colección de moléculas estimulantes de la eritropoyesis que contienen sitios de glicosilación, y entre las cuales al menos algunas de las moléculas llevan una cadena de azúcar que comprende al menos un residuo siálico terminal (es decir, moléculas de este tipo están "sialiladas"). De manera similar, la expresión "composición de glicoproteína", tal como se utiliza en esta memoria significa una colección de moléculas de glicoproteína, entre las cuales al menos algunas de las moléculas están sialiladas.

La expresión "moléculas estimulantes de la eritropoyesis", tal como se utiliza en esta memoria, incluye eritropoyetina humana (SEQ ID NO: 3) o una variante, derivado o análogo biológicamente activo de la misma, incluyendo un derivado modificado químicamente de una proteína o análogo de este tipo. Los aminoácidos 1 a 165 de SEQ ID NO: 3 constituyen la proteína madura. Otro ejemplo de molécula estimulante de la eritropoyesis es darbepoyetina (SEQ ID NO: 2). Los aminoácidos 1 a 165 de s Eq ID NO: 2 constituyen la proteína madura. También se contemplan análogos de eritropoyetina (SEQ ID NO.: 3) o darbepoyetina (SEQ ID NO: 2), con 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología con SEQ ID n O: 3 o SEQ ID NO: 2, respectivamente, y aún conservando la actividad eritropoyética.

Secuencias ejemplares, la fabricación, la purificación y el uso de la eritropoyetina humana recombinante se describen en un cierto número de publicaciones de patentes, que incluyen, pero no se limitan a la Patente de EE.UU. de Lin 4.703.008 y Lai et al. Patente de EE.UU. 4.667.016.

La darbepoyetina es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilado que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de rHuEPO que proporcionan dos cadenas de hidratos de carbono adicionales. Más específicamente, la darbepoyetina contiene dos cadenas de hidratos de carbono enlazadas a N adicionales en los residuos de aminoácido 30 y 88 de SEQ ID NO: 2. Secuencias ejemplares, la fabricación, purificación y el uso de darbepoyetina y otros análogos de la tropoyetina se describen en un cierto número de publicaciones de patentes, incluyendo Strickland et al., 91/05867, Elliott et al., documento WO 95/05465, Egrie et al., documento WO 00/24893 y Egrie et al. documento WO 01/81405.

Tal como se utiliza en esta memoria, "análogos" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene inserciones, deleciones o sustituciones en relación con la secuencia principal, al tiempo que sigue manteniendo sustancialmente la actividad biológica de la secuencia principal, según se determina utilizando ensayos biológicos conocidos por los expertos en la técnica. "Variantes" incluyen variantes alélicas que se producen de forma natural, variantes de corte y empalme o formas polimórficas de la secuencia principal. "Derivados" de polipéptidos análogos, variantes o que se producen de forma natural incluyen aquellos que han sido modificados químicamente, por ejemplo, para fijarse a polímeros hidrosolubles (p. ej., polietilenglicol), radionucleidos u otros restos diagnósticos u objetivo o terapéuticos, cualquiera de los cuales puede ser fijado directa o indirectamente a través de enlazadores.

La expresión "actividad eritropoyética" significa actividad para estimular la eritropoyesis como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo de ratón policitérmico exhipóxico. Véase, p. ej. Cotes y Bangham, Nature, 191:1065 (1961).

La expresión "célula huésped sensible al manganeso", tal como se utiliza en esta memoria, significa una célula huésped que produce una glicoproteína y que responde al manganeso añadido en su medio de cultivo aumentando la sialilación, ya sea aumentando el porcentaje de moléculas de glicoproteína sialiladas producidas o aumentando el grado de sialilación (es decir, el número de ácidos siálicos por molécula) de las moléculas de glicoproteína producidas. Para las composiciones eritropoyéticas, las células huésped sensibles al manganeso incluyen células huésped que responden al manganeso añadido aumentando el porcentaje de moléculas estimulantes de la eritropoyesis altamente sialiladas recuperadas después de la cromatografía de intercambio aniónico llevada a cabo como se describe más adelante. En realizaciones ejemplares, las células huésped sensibles al manganeso pueden incluir células huésped que crecen ancladas a una superficie sólida, p. ej., en botellas rotatorias. Cualesquiera células huésped sensibles al manganeso descritas en esta memoria pueden utilizarse de acuerdo con la invención.

Componentes del medio de cultivo

La invención proporciona un medio de cultivo que comprende una cantidad de manganeso eficaz para aumentar la sialilación de una composición de glicoproteínas producida por células de mamífero cultivadas en este medio de cultivo. En una realización, dicha cantidad de manganeso no es tóxica para las células, es decir, no reduce la viabilidad celular, el crecimiento celular o la producción de proteínas. En realizaciones relacionadas, la invención proporciona un medio de cultivo que comprende una cantidad de manganeso eficaz para aumentar la sialilación de una composición eritropoyética producida por células cultivadas en este medio de cultivo.

La cantidad de manganeso en los medios de cultivo de la invención está entre 0,4 y 40 pM. Si bien la calidad de las composiciones eritropoyéticas mejora claramente con la adición de manganeso 40 pM a los cultivos de células huésped, en algunos casos el rendimiento de la proteína secretada en el medio se reduce sustancialmente, lo que indica un efecto tóxico de una concentración de manganeso de este tipo. La concentración de manganeso en el medio de cultivo (es decir, la concentración final después de añadir el medio complementado con manganeso a las células huésped en cultivo) varía de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 40 pM, o de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 10 pM, o de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 4 pM. En otras realizaciones ejemplares, la concentración de manganeso en el extremo inferior del intervalo deseado puede variar de aproximadamente 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 o 4 pM o superior; la concentración de manganeso en el extremo superior del intervalo también puede variar hasta aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 pM.

La concentración de manganeso en el medio de cultivo añadido a las células se puede ajustar para lograr la concentración final deseada de manganeso en el sistema de cultivo. Por ejemplo, con procedimientos discontinuos que implican la eliminación completa y la sustitución del medio de cultivo, se añade a las células un medio de cultivo de sustitución que contiene Mn2+ 4 pM para conseguir un medio de cultivo final con Mn2+ 4 pM. Alternativamente, cuando se utilizan procedimientos de perfusión continua, la concentración de manganeso en los medios añadidos deberá ser mayor para lograr un medio de cultivo final con la concentración deseada de Mn2+ dentro de un intervalo. El ajuste de la concentración puede ser llevado a cabo fácilmente por un experto en la técnica.

El medio de cultivo también puede incluir cualquier otro ingrediente necesario o deseable conocido en la técnica, tales como hidratos de carbono, incluyendo glucosa, aminoácidos esenciales y/o no esenciales, lípidos y precursores de lípidos, precursores de ácidos nucleicos, vitaminas, sales inorgánicas, oligoelementos, incluyendo metales raros y/o factores de crecimiento celular. El medio de cultivo puede estar definido químicamente o puede incluir suero, hidrolizados vegetales u otras sustancias derivadas. El medio de cultivo puede estar esencial o totalmente libre de suero o de componente animal. Esencialmente libre de suero significa que el medio carece de suero o contiene una cantidad insignificante de suero.

El medio de cultivo también puede incluir aminoácidos complementarios agotados durante el cultivo celular, p. ej., asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, isoleucina, leucina, triptófano y valina. El complemento de aminoácidos puede estar en el medio de crecimiento inicial y/o en el medio añadido durante o después de la fase de crecimiento rápido.

El medio puede incluir lípidos y/o precursores de lípidos, tales como colina, etanolamina o fosfoetanolamina, colesterol, ácidos grasos, tales como ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ésteres metílicos, D-alfa-tocoferol, p. ej., en forma de acetato, ácido esteárico; ácido mirístico, ácido palmítico, ácido palmitoleico; o ácido araquidónico. Está disponible un cierto número de mezclas de lípidos comercialmente disponibles.

El medio puede incluir un complemento de hierro que comprende hierro y una molécula de transporte sintética a la que se une el hierro. El medio puede incluir compuestos inorgánicos u oligoelementos, suministrados como sales apropiadas, tales como sodio, calcio, potasio, magnesio, cobre, hierro, zinc, selenio, molibdeno, vanadio, manganeso, níquel, silicio, estaño, aluminio, bario, cadmio, cromo, cobalto, germanio, potasio, plata, rubidio, zirconio, fluoruro, bromuro, yoduro y cloruro. Está disponible un cierto número de mezclas de oligoelementos comercialmente disponibles.

El medio también puede incluir opcionalmente un tensioactivo no iónico o un agente tensioactivo para proteger las células de la mezcla o aireación. El medio de cultivo también puede comprender tampones tales como bicarbonato de sodio, fosfatos monobásicos y dibásicos, HEPES y/o Tris.

En realizaciones ejemplares, el medio es medio DMEM/F-12 (Gibco) que contiene suero al 5 %. DMEM incluye las siguientes sales inorgánicas: cloruro de calcio, sulfato cúprico, nitrato o sulfato férrico, cloruro de potasio, sulfato o cloruro de magnesio, cloruro de sodio, dihidrógeno-fosfato de sodio, bicarbonato de sodio, sulfato de zinc; los siguientes aminoácidos L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L-glutámico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina; los siguientes lípidos y vitaminas: biotina, D-pantotenato de calcio, cloruro de colina, ácido fólico, mio-inositol, niacinamida, nicotinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, vitamina B12 (cobalamina), timidina, ácido linoleico, ácido lipoico; y otros componentes, incluyendo D-glucosa, rojo fenol, hipoxantina, piruvato de sodio, putrescina y HEPES.

El medio de cultivo también puede comprender inductores de la producción de proteínas tal como butirato de sodio, o cafeína. Otros inductores conocidos incluyen, pero no se limitan a los siguientes compuestos: N-acetil-L-cisteina, actinomicina D, 7-amino-, bafilamicina A1, Streptomyces griseus, calfostin C, Cladosporium cladosporioides, camptotecina, Camptotheca acuminata, CAPE, 2-cloro-2’-desoxiadenosina, 2-cloro-2’-desoxiadenosina 5’-trifosfato, sal de tetralitio, cicloheximida, ciclofosfamida monohidrato, ciclosporina, Trichoderma polysporum, daunorrubicina, hidrocloruros, dexametasona, doxorrubicina, hidrocloruro, (-)-epigalocatequina galatos, etopósidos, etopósido fosfatos, ET-18-OCH3, 5-fluorouracilo, H-7, dihidrocloruro, genisteina, 4-hidroxinonenal, 4-hidroxifenilretinamida, hidroxiurea, inhibidor de IL-1 p, (±)-S-nitroso-N-acetilpenicilamina, S-nitrosoglutation, forbol-12-miristato-13-acetato, puromicina, dihidrocloruro, ácido 1 -pirrolidinacarboditioico, sal de amonio, quercetina, dihidratos, rapamicina, butirato sódico, 4-fenilbutirato sódico, D-eritro-esfingosina, N-acetil-, D-eritro-esfingosina, N-octanoil-, estaurosporina, Streptomyces sp., Sulindac, Tapsigargin, TRAIL, E. coli, tricostatina A, Streptomyces sp., (±)-verapamilo, hidrocloruro, veratridina, vitamina D3, 1a,25-dihidroxi- y succinato de vitamina E (VWR y Calbiochem).

El medio de cultivo excluye opcionalmente A23187 u otros compuestos que agotan los cationes divalentes.

Métodos de cultivo

La invención también proporciona métodos para producir una composición de glicoproteína tal como una composición eritropoyética, que puede incluir el cultivo de una célula huésped sensible al manganeso en cualquiera de los medios de cultivo descritos en esta memoria. Métodos de este tipo pueden incluir, además, la etapa de recuperar la composición de glicoproteína, p. ej., la composición eritropoyética, de las células huésped o del medio de cultivo. El manganeso se puede incluir en el medio de cultivo inicial durante la fase de crecimiento inicial o se puede añadir en fases posteriores. El manganeso puede tener un mayor efecto cuando se añade después de una fase de crecimiento rápido durante la cual se alcanza el crecimiento máximo o casi máximo de la célula huésped, por ejemplo, un período de más de 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 o 22 días, o hasta 22, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55 días y puede tener un efecto incluso mayor después de un crecimiento celular prolongado, p. ej., después de dos ciclos de recolección. Cuando la proteína recombinante se secreta en el medio, el medio se puede recolectar periódicamente, de modo que las mismas células huésped se pueden utilizar a lo largo de varios ciclos de recolección. En realizaciones ejemplares, las células huésped que producen moléculas estimulantes de la eritropoyesis se incuban en tres ciclos de recolección por lotes discretos. Para cada uno de los ciclos, el medio se recolecta y se reemplaza por medio nuevo. El primer ciclo puede ser, p. ej., de 8 días; el segundo ciclo, p. ej., de 7 días; y el tercer ciclo, p. ej., de 5 días de duración.

Puede utilizarse cualquier célula huésped de mamífero conocida en la técnica para producir proteínas glicosiladas.

Células de mamífero ejemplares incluyen variedades de CHO, BHK, HEK-293, NS0, YB2/3, SP2/0, y células humanas, tales como PER-C6 o HT1080, así como VERO, HeLa, COS, Md Ck , NIH3T3, Jurkat, Saos, PC-12, HCT 116, L929, Ltk, WI38, CV1, TM4, W138, Hep G2, MMT, una línea celular leucémica; células madre embrionarias u óvulos fertilizados.

Se conocen en la técnica una diversidad de sistemas de cultivo, que incluyen matraces T, matraces giratorios y agitadores, botellas rotatorias y biorreactores de tanque agitado. El cultivo en botellas rotatorias se lleva a cabo generalmente mediante la siembra de células en botellas rotatorias que están parcialmente llenas (p. ej., al 10-30 % de su capacidad) con medio y se hacen rotar lentamente, lo que permite que las células se adhieran a los lados de las botellas y crezcan hasta la confluencia. El medio celular se recolecta decantando el sobrenadante, que se reemplaza por medio nuevo. También se pueden cultivar células dependientes del anclaje en microportadores, p. ej., esferas poliméricas, que se mantienen en suspensión en biorreactores de tanque agitado. Alternativamente, las células se pueden cultivar en suspensión de una sola célula.

El medio de cultivo se puede añadir en un procedimiento discontinuo, p. ej., en que el medio de cultivo se añade una vez a las células en una sola tanda, o en un proceso de alimentación discontinua en el que se añaden periódicamente pequeñas tandas de medio de cultivo. El medio se puede recolectar al final del cultivo o varias veces durante el cultivo. Los procedimientos de producción por perfusión continua también son conocidos en la técnica e implican la alimentación continua de medio reciente en el cultivo, al tiempo que el mismo volumen se extrae continuamente del reactor. Los cultivos perfundidos generalmente logran densidades celulares más altas que los cultivos discontinuos y se pueden mantener durante semanas o meses con recolecciones repetidas.

Los métodos para controlar la sialilación de una glicoproteína recombinante, particularmente para controlar los niveles de ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) en las cadenas de azúcar, se describen en la Patente de EE.UU. N° 5.459.031, y métodos de este tipo se pueden utilizar en unión con los medios de cultivo y los métodos de cultivo descritos en esta memoria. Los métodos implican el ajuste de los parámetros de cultivo, incluyendo la concentración de dióxido de carbono, para lograr el contenido deseado de NGNA en hidratos de carbono.

Evaluación de la glicosilación y sialilación

Para composiciones de glicoproteínas, se puede determinar un incremento o una mejora en la sialilación mediante cromatografía de intercambio aniónico de acuerdo con Elliott et al., Biochemistry, 33(37): 11237-45 (1994). Se espera que las proteínas más altamente sialiladas tengan una carga más negativa y se unan más fuertemente a la columna, mientras que las menos sialiladas y las asialoproteínas fluyen a través o se eluyen fácilmente. La cantidad de moléculas de glicoproteína en cada una de las dos fracciones (retenida en resina frente a fracción de flujo) puede determinarse, p. ej., mediante ELISA, y compararse con la cantidad de partida de dichas moléculas cargadas desde el medio de cultivo celular. Kits ELISA ejemplares se venden comercialmente e incluyen R & D Systems, kit IVD Human EPO EIA.

La cromatografía se lleva a cabo como sigue. Para eliminar las células y los desechos, el medio en el que se han cultivado células de mamífero que producen una molécula estimulante de la eritropoyesis u otra glicoproteína, se centrifuga a aproximadamente 1000 rpm y se filtra a través de un filtro de 0,45 micras. Este material se somete luego a cromatografía de intercambio aniónico con el fin de prepurificar una fracción que contiene principalmente las cuatro a siete especies más sialiladas de las moléculas de glicoproteína. Se puede utilizar una resina de intercambio iónico fuerte tal como, por ejemplo, TRICORN™ Mono-Q 5/50 GL (Amersham, parte n° 17-5166-01) u otras resinas de intercambio aniónico fuerte, en particular aquellas que tienen la amina cuaternaria -CH2-N+-(CH3)3 como el grupo funcional de la resina. El procedimiento exacto dependerá del número máximo teórico de residuos de ácido siálico que pueden contener las moléculas de glicoproteína particulares. Por ejemplo, un número máximo teórico de residuos de ácido siálico para la eritropoyetina humana, que tiene 3 sitios N-glicano y 1 sitio O-glicano, es (3 x 4) 2 = 14. Esto supone que cada uno de los sitios N-glicano puede tener hasta cuatro ramificaciones (ya que las especies pentaantenarias son raras) y que cada uno de los sitios de O-glicano pueden tener hasta dos ramificaciones. Haciendo suposiciones similares para la darbepoyetina, que tiene 5 sitios de N-glicano y 1 sitio de O-glicano, el máximo teórico para la darbepoyetina es (5 x 4) 2 = 22. Los tampones utilizados para eluir las moléculas de glicoproteína de la columna de intercambio aniónico están diseñados para: (11) eluir de la columna la mayoría o todas las moléculas de proteína que pertenecen a especies que están menos sialiladas que un grupo de especies que consiste en aproximadamente el tercio superior de las especies más sialiladas (para la eritropoyetina, las especies "altamente sialiladas" son aquellas que tienen 9-14 residuos de ácido siálico por molécula de proteína, y para darbepoyetina las especies «altamente sialiladas» son aquellas que tienen 17-22 residuos de ácido siálico por molécula de proteína); (2) luego eluir las moléculas de proteína que pertenecen a las cuatro a siete especies más altamente sialiladas, y (3) finalmente eliminar las especies más cargadas de la columna, que pueden incluir glicoformas que portan N-glicanos sulfatados. Por lo tanto, la composición exacta de los tampones de lavado y elución se pueden ajustar de acuerdo con el número máximo teórico de residuos de ácido siálico en la molécula de glicoproteína. Un experto en la técnica puede realizar dichos ajustes basándose en la optimización empírica rutinaria de los parámetros de la columna y analizando el material que sale de la columna en geles analíticos de enfoque isoeléctrico.

Los geles analíticos de enfoque isoeléctrico de poliacrilamida que pueden separar diferentes formas cargadas de moléculas estimulantes de la eritropoyesis que portan diferentes números de residuos de ácido siálico también se pueden realizar esencialmente como se describe en la Guide to Isoelectric Focusing (APB, RW 5/5/98) de Amersham-Pharmacia en urea 6 M utilizando anfolitos disponibles comercialmente (pH 3 a 5 para la eritropoyetina humana o pH 2 a 4 para la darbepoyetina). Otros intervalos de pH para anfolitos pueden ser apropiados para otras moléculas estimulantes de la eritropoyesis con números sustancialmente diferentes de residuos de ácido siálico.

Para la eritropoyetina, el grado de sialilación se estima determinando el porcentaje de proteína eritropoyética total cargada en una columna de intercambio aniónico que eluye en una fracción que contiene principalmente especies de eritropoyetina altamente sialiladas que tienen de 9 a 14 residuos de ácido siálico por molécula de proteína.

Para la darbepoyetina, el grado de sialilación se estima determinando el porcentaje de proteína eritropoyética total cargada en una columna de intercambio aniónico que eluye en una fracción que contiene principalmente especies de eritropoyetina altamente sialiladas que tienen de 18 a 22 residuos de ácido siálico por molécula de proteína.

Un aumento en el porcentaje de moléculas estimulantes de la eritropoyesis recuperada de la agrupación retenida en la resina (o una reducción en el porcentaje de moléculas de este tipo observadas en la fracción de flujo) con relación al control (p. ej., producido a partir de medios sin manganeso o cantidades de oligoelementos de manganeso) indica un aumento en la sialilación, ya sea aumentando el porcentaje de moléculas sialiladas producidas o aumentando su grado de sialilación.

La estructura real del glicano se puede determinar mediante cualesquiera técnicas conocidas en la técnica, que incluyen digestión enzimática de hidratos de carbono, inmunotransferencia de lectina, espectroscopia 1H-RMN 1D y 2D, técnicas de espectroscopia de masas que incluyen espectrometría de masas en tándem con ionización por electropulverización (ESI MS) o espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI -TOF MS) y/o marcaje fluorescente de N-glicanos liberados enzimáticamente, seguido de resolución por HPLC y comparación con muestras de control de N-glicanos conocidas.

Una técnica ejemplar, descrita en los ejemplos que figuran a continuación, para determinar la cantidad de glicoproteína con un sitio de glicosilación en O ocupado implica la digestión con N-glicanasa para eliminar los hidratos de carbono enlazados a N, seguido de HPLC de fase inversa para separar la composición de glicoproteína en dos picos. La identificación de picos como sitio O ocupado o sitio O desocupado puede confirmarse mediante espectrometría de masas.

La ramificación y la sialilación del sitio N, incluyendo el porcentaje de moléculas sialiladas producidas y el grado de sialilación de las moléculas sialiladas, se pueden determinar analizando el contenido estructural de las glicoproteínas mediante el mapeo de N-glicanos y la secuenciación enzimática, p. ej., mediante digestión con N-glicanasa y neuraminidasa, acoplada a la espectrometría de masas MALDI-TOF para la determinación del tamaño de los azúcares liberados. Una técnica ejemplar se describe en los ejemplos siguientes.

El porcentaje de azúcares fijados a las moléculas estimulantes de la eritropoyesis que son galactosa se puede determinar, p. ej., mediante digestión con neuraminidasa más galactosidasa, seguida de separación por HPLC o espectrometría de masas MALDI-TOF para determinar el tamaño de los azúcares liberados. Una técnica ejemplar se describe en los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Métodos de Producción de Proteínas

Este ejemplo describe un método de cultivo celular para la producción de eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO, SEQ ID NO: 3) o darbepoyetina (SEQ ID NO: 2). Una línea celular Dh Fr menos CHO se transfectó de forma estable con una secuencia de ADN genómico que contenía el gen de la eritropoyetina humana (Patente de EE.UU. Lin 4.703.008) o una secuencia de ADNc que codifica el gen de la darbepoyetina (SEQ ID NO: 1). Se inocularon botellas rotatorias (850 cm2) con 1,7 x 107 células totales y se cultivaron durante 5 días en 450 ml de medio DMEM/F-121:1 (Gibco) que contenía suero al 5 %. Los cultivos se lavaron una vez con PBS y luego se incubaron en tres ciclos de cosecha discontinuos discretos. Los medios se reemplazaron dos veces en los primeros 14 días; el tercer ciclo fue de 5 a 6 días de duración. Para la eritropoyetina, en cada una de las recolecciones, el medio de cultivo acondicionado se eliminó por completo y se añadió DMEM/F-12 1:1 nuevo sin suero ("Medios Estándar") para reemplazar el medio recolectado. Cuando se incluyó manganeso en el medio de cultivo, se añadió cloruro de manganeso (Sigma) a todos los medios de cultivo de reemplazo a la concentración deseada, p. ej., 0,4, 4 o 40 pM. Las botellas rotatorias se cubrieron con una mezcla de gases que contenía 80 torr de pCO2, 130 torr de pO2 y N2 equilibrado después de cada adición de medio. Las células productoras de darbepoyetina se cultivaron en condiciones similares a las células productoras de eritropoyetina, excepto que los Medios Estándar era 2X 1:1 DMEM/F-12 (sin suero):

Ejemplo 2:

Cuantificación de rHuEPO o Darbepoyetina en Medios de Cultivo Recolectados

200 pl de medio recolectado producido de acuerdo con el Ejemplo 1 se analizó en cuanto a la cantidad de rHuEPO o darbepoyetina producida, utilizando HPLC de fase inversa. Las muestras se separaron en un polímero PLRPS (4,6 mm x 150 mm; 1000 Á (Polymer Laboratories) en condiciones de fase inversa (gradiente AB lineal de 30 % - 55 % de B a lo largo de 17 minutos; tampón A: TFA al 0,1% en H2O, tampón B: TFA al 0,1% en CH3CN al 90 % (Sigma)). El tiempo de retención de rHuEPO o darbepoyetina dentro del medio de cultivo se comparó con un patrón purificado de rHuEPO o darbepoyetina (Amgen Inc.). Se utilizó Software de Waters Millennium para integrar manualmente las áreas de los picos de rHuEPO o darbepoyetina para asegurar una integración consistente. Las áreas de los picos integrados de muestras desconocidas se cuantificaron comparándolas con una curva patrón conocida.

Ejemplo 3:

Efecto del manganeso en formas altamente sialiladas y menos sialiladas de moléculas estimulantes de la eritropoyesis

Se cultivaron células CHO que producían rHuEPO como se describe en el Ejemplo 1 con y sin MnCl24 pM añadido. Los medios acondicionados recogidos después del tercer ciclo de recolección se analizaron para determinar el porcentaje de recuperación de formas altamente sialiladas de rHuEPO. Se cultivaron células CHO que producían darbepoyetina como se describe en el Ejemplo 1 con y sin MnCl2 4 pM añadido. Se analizaron los medios acondicionados recogidos después de cada uno de los tres ciclos de recolección.

Las formas sialiladas inferiores de rHuEPO se separaron del material altamente sialilado utilizando el método de intercambio aniónico como se describe en Elliott et al., Biochemistry, 33(37): 11237-45 (1994). Brevemente, la rHuEPO altamente sialilada, que tiene una fuerte carga negativa, se une a la resina, mientras que la rHuEPO menos sialilada se lava a través de la columna. El medio de cultivo celular de cada una de las botellas rotatorias obtenido como se describe en el Ejemplo 1 se concentró primero sesenta veces, hasta aproximadamente 5-15 mg/mL, utilizando una membrana de 10.000 MWCO y luego se intercambió el tampón por Tris 10 mM pH 7,0. Este medio concentrado e intercambiado con tampón se cargó en una columna de intercambio aniónico fuerte que tenía una amina cuaternaria como grupo funcional. El material no unido que fluyó a través de Tris 10 mM o eluyó con poca sal se recogió como la fracción menos sialilada. El material unido a la columna de intercambio iónico (IEX) se eluyó con sal mayor que la fracción altamente sialilada "recuperable".

La cantidad total de rHuEPO en una o ambas fracciones se midió utilizando un kit ELISA obtenido de R&D Systems (kit Quantikine IVD Human EPO EIA), siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante, y se comparó con la cantidad total de rHuEPO en los medios de recolección cargados en la columna. Se realizaron diluciones de 1:1.000.000 y 1:500.000 de cada una de las muestras de flujo continuo antes del análisis con el fin de caer dentro de la curva estándar del ensayo. Se separó una fracción altamente sialilada de darbepoyetina utilizando métodos similares a los arriba descritos para aislar las isoformas con 17-22 residuos de ácido siálico y se midió utilizando RP-HPLC.

Los resultados de un experimento representativo para rHuEPO se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 1 muestra la cantidad de rHuEPO en la fracción de flujo como porcentaje de la cantidad cargada en la columna y demuestra que la adición de 4 gM de manganeso redujo la fracción menos sialilada de EPO en comparación con el control, del 10,01 % al 3,39 %. La Figura 2 muestra la cantidad de rHuEPO en la fracción retenida en la IEX como porcentaje de la cantidad cargada en la columna y demuestra que la adición de 4 gM de manganeso aumentó el porcentaje de EPO recuperable en la fracción altamente sialilada en comparación con el control, del 24 % al 28 %.

Los resultados de un experimento representativo para darbepoyetina se muestran en la Figura 3. La Figura 3 muestra los datos de cada uno de los ciclos de recolección y demuestra que la adición de manganeso 4 gM aumentó el porcentaje de darbepoyetina recuperable en la fracción altamente sialilada en comparación con el control, de 32,8 % a 36,3 % después de la tercera recolección. La adición ulterior de N-acetilmanosamina 7 mM pareció proporcionar un incremento adicional en el % de darbepoyetina recuperable al 41,1 % después de la tercera recolección:

Estos datos demuestran que la adición de Mn2+ al medio de cultivo disminuyó la producción de formas menos sialiladas de eritropoyetina y darbepoyetina en cultivos de células CHO y aumentó el porcentaje de formas altamente sialiladas recuperables.

En experimentos llevados a cabo con una línea de células CHO adaptadas para crecer en cultivo en suspensión en grandes tanques y/o células CHO adaptadas a cultivo en suspensión en medio libre de suero, no se observó efecto alguno del manganeso sobre la fracción de darbepoyetina menos sialilada.

Ejemplo 4:

Caracterización del sitio O de rHuEPO

Se cultivaron células CHO que producían rHuEPO como se describe en el Ejemplo 1 con y sin MnCl24 gM añadido. Los medios acondicionados no fraccionados después del tercer ciclo de recolección se analizaron para determinar el porcentaje de ocupación del sitio O de rHuEPO. Se cultivaron células CHO que producían darbepoyetina como se describe en el Ejemplo 1 con y sin MnCl24 gM añadido. Se analizaron los medios acondicionados recogidos después de cada uno de los tres ciclos de recolección. Las células CHO que producen darbepoyetina también se cultivaron como se describe en el Ejemplo 1 con MgCl2 0,4, 1, 4, 10 y 40 gM y se analizaron los medios del tercer ciclo de recolección.

El porcentaje de sitios enlazados a O ocupados con glicosilación se cuantificó eliminando primero las estructuras enlazadas a N mediante digestión con N-glicanasa (Sigma) de los medios de cultivo celular, seguido de cromatografía HPLC de fase inversa. Específicamente, se añadieron 5 U de N-Glicanasa (Sigma) a 10 gL de muestras de medios de cultivo concentrados (1:60) y se digirieron a 37 °C durante tres horas. Luego, las muestras se analizaron mediante cromatografía de fase inversa utilizando una columna Zorbax C-8 (150 mm x 2,1 mm (VWR) utilizando un gradiente AB lineal de 35 % - 60 % de B a lo largo de 30 minutos (tampón A: TFA al 0,1% en H2O, tampón B: TFA al 0,1% en CH3CN al 90 % (Sigma)). El cromatograma resultante separa la rHuEPO en dos picos; el primer pico corresponde al péptido rHuEPO del sitio O ocupado, mientras que el segundo pico, más pequeño, corresponde al péptido rHuEPO del sitio O desocupado.

Para confirmar que estos dos picos representaban sitios O ocupados y desocupados, se recogieron las fracciones correspondientes a estos picos y se compararon con rHuEPO purificada digerida con N-glicanasa (Amgen Inc.). El análisis SDS-PAGE demostró que la digestión con N-glicanasa reduce el peso molecular aparente de rHuEPO de 32 kDal a un doblete con un componente principal de 18,5 kDal y un componente secundario que migra ligeramente más rápido. El pico más grande migró con la banda más grande de rHuEPO digerida con N-glicanasa, mientras que el pico menor migró con la banda más pequeña de rHuEPO. El mapeo del péptido Lys-C en combinación con la espectrometría de masas confirmó que el pico más grande corresponde a la rHuEPO que contiene un hidrato de carbono enlazado a O, mientras que el pico más pequeño corresponde a la rHuEPO sin un hidrato de carbono enlazado a O.

Los resultados de un experimento representativo que analiza la ocupación del sitio O para rHuEPO se muestran en la Figura 4. La Figura 4 demuestra que la adición de manganeso 4 pM aumentó la ocupación del sitio O para rHuEPO en comparación con el control, del 88,1 % al 91,6 %.

Los resultados de experimentos representativos para darbepoyetina se muestran en las Figuras 5 y 6. La Figura 5 muestra datos de cada uno de los ciclos de recolección y demuestra que la adición de manganeso 4 pM aumentó la ocupación del sitio O para darbepoyetina en comparación con el control, de 76,8 % a 86 % después de la tercera recolección.

La Figura 6 muestra los datos del tercer ciclo de recolección de darbepoyetina y demuestra que la ocupación del sitio O aumentó con el aumento de las concentraciones de manganeso. Sin embargo, manganeso 40 pM afectó negativamente a los niveles de producción de proteínas, lo que resultó en una disminución relativa total del 17 % en los mg de darbepoyetina producidos a lo largo de los tres ciclos de recolección combinados. Por el contrario, el manganeso 10 pM no pareció afectar sustancialmente a la producción de proteína.

Estos datos demuestran que la adición de Mn2+ al medio de cultivo aumenta la ocupación del sitio O para la eritropoyetina y la darbepoyetina producidas en cultivos de células CHO.

Ejemplo 5:

Evaluación de la Ramificación del sitio N de rHuEPO y la ocupación del sitio N

Para determinar la ramificación del sitio N de rHuEPO o darbepoyetina producida de acuerdo con el Ejemplo 1; se analiza el contenido estructural de las fracciones menos sialiladas mediante mapeo de N-glicanos y secuenciación enzimática junto con espectrometría de masas MALDI-TOF para la determinación del tamaño. Brevemente, el procedimiento requiere que los N-glicanos se liberen enzimáticamente con 1 U/mL de N-Glicanasa (Sigma), luego se desalen y desproteinen utilizando cromatografía PGC (VWR). Los N-glicanos libres se marcan en el extremo reductor con una etiqueta fluorescente 2-aminobenzamida (2AB) mediante aminación reductora (Sigma). Se realiza un segundo procedimiento de limpieza utilizando cromatografía en papel (VWR). Las agrupaciones de 2ABN-glicanos se mapean en una columna Dionex PA1 con detección de fluorescencia (excitación 330 nm, emisión 420 nm) utilizando un gradiente de acetato de sodio de 50-150 mM a 1,67 mM/min con hidróxido de sodio (Sigma) a 50 mM isocrático. Las agrupaciones de 2ABN-glicanos se desialilan utilizando 1 U/mL de neuraminidasa de A. ureafaciens con y sin 0,5 U/mL de galactosidasa de B. testes. Todas las digestiones se realizan a 37 °C durante 18 h. Se obtiene un análisis de tamaño adicional de todas las agrupaciones de 2ABN-glicanos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (Voyager, Applied BioSystems). La matriz es ácido 2,5-dihidroxibenzoico saturado en acetonitrilo al 70 %, TFA al 0,05 % (Sigma) y se mezcla en una relación de 1:1 con la agrupación de 2AB N-glicano en la sonda. Los ajustes de MALDI son los siguientes: Tensión de aceleración: 20.000 V; Tensión de red: 94 %; Hilo guía: 0,05 %; Tiempo de retardo de extracción: 75 ns; Intensidad del láser: 2300; Intervalo de masas: 500-5000.

Para determinar la ocupación de rHuEPO ligada a N, se digieren 10 pg de un patrón de rHuEPO (Amgen Inc.) con 0,04 U de N-glicanasa (Sigma) durante la noche a temperatura ambiente para obtener una escala de peso molecular de rHuEPO con formas ocupadas enlazadas a N variables. Se cargan 0,1 pg de rHuEPO total recolectada de los medios de recolección y se separan mediante SDS-PAGE (Novex, Invitrogen) y luego se transfieren a PVDF. Los borrones se sondan con un anticuerpo monoclonal contra rHuEPO.

Ejemplo 6:

Efecto de la complementación con aminoácidos en la producción y glicosilación de rHuEPO.

Para determinar el efecto de la adición de aminoácidos en la producción de rHuEPO durante el cultivo celular, los niveles de los veinte aminoácidos se determinaron mediante análisis de aminoácidos en los medios de partida ("Medios Estándar" del Ejemplo 1) y luego nuevamente después de cinco días de incubación en el tercer ciclo de recolección como se describe arriba en el Ejemplo 1. Nueve aminoácidos específicos (no esenciales y esenciales) se agotaron a niveles bajos (< 3 mg/L) durante este período de cultivo: cisteína, isoleucina, leucina, triptófano, valina, asparagina, ácido aspártico, glutamato y glutamina. Las concentraciones de estos 8 aminoácidos en medios estándar se duplicaron para crear medios enriquecidos. El medio enriquecido consistía en medio DMEM/F-12 1:1 sin suero complementado con una reserva de aminoácidos al 1 % (2,25 g/L de asparagina; 1,99 g/L de ácido aspártico; 1,76 g/L de cisteína; 3,13 g/L de cistina; 2,21 g/L de ácido glutámico; 5,45 g/L de isoleucina; 5,91 g/L de leucina; 0,90 g/L de triptófano; y 5,29 g/L de valina). Las células se cultivaron en Medios Estándar o en Medios Enriquecidos, que se utilizó durante todo el proceso de cultivo de veintiún días. Después del tercer ciclo de recolección, se recogieron los medios y se cuantificó la rHuEPO en los medios recolectados mediante HPLC de fase inversa.

Las células CHO cultivadas en Medios Enriquecidos mostraron un incremento modesto del 12 % en la producción de rHuEPO en comparación con las células de control cultivadas en Medios Estándar. Sin embargo; aunque los Medios Enriquecidos mejoró la producción de proteína rHuEPO, la cantidad de material menos sialilado se duplicó, lo que provocó una disminución general de la rHuEPO altamente sialilada en comparación con los cultivos de control. El cambio en la cantidad de rHuEPO que se encontró en la agrupación menos sialilada se debió a un menor grado de sialilación de los hidratos de carbono individuales más que a un menor grado de ramificación de hidratos de carbono. MALDI-TOF analizó las estructuras de los hidratos de carbono enlazados a N que se encuentran en rHuEPO en las fracciones menos sialiladas. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 1 que figura a continuación.

Con el fin de confirmar algunas de las masas vistas por MALDI-TOF, la fracción menos sialilada se digirió con neuraminidasa o con neuraminidasa y galactosidasa. Se analizaron masas que representaban estructuras de hidratos de carbono altamente ramificadas y se compararon entre los cultivos de control cultivados en Medios Estándar y los cultivos desarrollados en presencia de Medios Enriquecidos. Se observaron masas que representaban estructuras de hidratos de carbono muy ramificadas (Figura 7; estructuras M - T). La complementación con aminoácidos en los Medios Enriquecidos dio como resultado una masa correspondiente a una estructura altamente ramificada a la que le falta toda su galactosa terminal (Figura 7, estructura L). Se detectaron masas similares de estructuras ramificadas a las que les faltaba galactosa tanto en los cultivos de control como en los Medios Enriquecidos (Figura 7, estructuras E, G-I, K, M-N, Q-R). Estos datos indican que el grado de ramificación en rHuEPO producido en Medios Estándar y Medios Enriquecidos es similar y sugiere que la pérdida de residuos de ácido siálico puede deberse a una disminución de la galactosilación de hidratos de carbono enlazados a N altamente ramificados.

Ejemplo 7:

Manganeso revirtió los efectos de la complementación con aminoácidos en la glicosilación

Se cultivó rHuEPO de acuerdo con el Ejemplo 1 en Medios enriquecidos solo o Medios Enriquecidos más MnCh 0,4, 4 y 40 gM. En los primeros momentos del cultivo, cuando los números de células son bajos y la carga metabólica es mínima, los Medios Enriquecidos no tienen efecto alguno sobre la glicosilación de rHuEPO. Sin embargo, la restauración de estas agrupaciones agotadas provocó finalmente defectos tanto en la ocupación de oligosacáridos como en la sialilación, después del tercer ciclo de recolección.

Los resultados de diversos experimentos representativos se muestran en las Figuras 9, 10 y 11. La Figura 8 demuestra que el cultivo de células huésped en Medios Enriquecidos (complementados con aminoácidos) redujo el porcentaje de rHuEPO altamente sialilada recuperable (43 % control frente a 29 %, con complementación de aminoácidos). La Figura 8 también muestra que añadir manganeso a los Medios Enriquecidos a 40, 4 y 0,4 gM mejoró el porcentaje de recuperación (31 % a 40 gM, 42 % a 4 gM, 41 % a 0,4 gM).

La Figura 9 demuestra que el cultivo de células huésped en Medios Enriquecidos (complementados con aminoácidos) aumentó el porcentaje de rHuEPO menos sialilada recuperable (7,3 % control frente a 13 %, con complementación de aminoácidos). La Figura 9 también demuestra que la adición de manganeso a Medios Enriquecidos redujo en gran medida el porcentaje de rHuEPO menos sialilada producida en todas las concentraciones de Mn2+. (1,6 % a 40 gM, 2,1 % a 4 gM y 2,4 % a 0,4 gM).

La Figura 10 demuestra que el cultivo de células huésped en Medios Enriquecidos (complementados con aminoácidos) reduce el porcentaje de la ocupación de sitios O por cadenas de azúcares (76,2 % control frente a 74,8 %, con complementación de aminoácidos). La Figura 10 también demuestra que añadir manganeso a los Medios Enriquecidos aumentó el porcentaje de la ocupación de sitios O (84,4 % a 40 gM, 86,1 % a 4 gM, 84,6 % a 0,4 gM).

Si bien la calidad de rHuEPO mejoró claramente con la adición de Mn2+ 40 gM a los cultivos, el rendimiento de la proteína rHuEPO secretada en los medios se redujo sustancialmente a esta concentración de Mn2+ (al 36 % del control a Mn2+ 40 gM). Los niveles de producción de proteína se mantuvieron altos cuando se añadieron concentraciones de Mn2+ de 4 y 0,4 gM a los Medios Enriquecidos (109 y 114 % del control, respectivamente).

Adicionalmente, la adición de Mn2+ dio como resultado masas consistentes con azúcares ramificados que contenían formas completamente galactosiladas. La digestión adicional con neuraminidasa más galactosidasa confirmó estos resultados, ya que se obtuvieron masas consistentes con estructuras centrales que carecían de residuos de galactosa. Dentro de la agrupación de rHuEPO menos sialilada, la adición de Mn2+ dio como resultado estructuras predominantemente biantenarias, mientras que los medios de control y de aminoácidos enriquecidos contenían estructuras de N-glicanos más altamente ramificadas que carecían de galactosa terminal como se describió arriba (Figura 7; estructuras H, J, O, S).

Para descartar una posible limitación del nucleótido de azúcar donante UDP-Gal como causa de la galactosilación reducida, también se ensayó cada una de las condiciones para cantidades relativas de UDP-Gal. Los datos demuestran que los niveles de UDP-Gal en cada una de las condiciones fueron estadísticamente indistinguibles y, por lo tanto, no son la causa de la galactosilación reducida observada con la complementación de aminoácidos en Medios Enriquecidos. La disponibilidad de UDP-Gal tampoco fue un factor en la mejora de la galactosilación observada después de la adición de Mn2+.

Por lo tanto, los datos demuestran que la adición de Mn2+ al Medio Enriquecido, en todas las concentraciones de Mn2+, redujo notablemente la fracción de rHuEPO menos sialilada producida y aumentó la recuperación de formas de rHuEPO altamente sialiladas. Se demostró que los efectos sobre la sialilación aumentan con concentraciones crecientes de manganeso de una manera dependiente de la dosis. La adición de manganeso también mejoró la galactosilación de rHuEPO en la fracción menos sialilada y aumentó la ocupación enlazada a O. La mejora en la glicosilación fue independiente del nivel de producción de rHuEPO. La evaluación de la ocupación del sitio N por

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una composición eritropoyética que comprende glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis sialiladas, que comprende las etapas de: cultivar una célula huésped sensible al manganeso que produce una glicoproteína estimulante de la eritropoyesis en un medio de cultivo que contiene una cantidad de manganeso eficaz para aumentar la sialilación de dicha composición eritropoyética producida por dicha célula huésped sensible al manganeso, en donde la concentración de manganeso en dicho medio de cultivo oscila entre 0,4 y 40 pM, y en donde la glicoproteína estimulante de la eritropoyesis es eritropoyetina, darbepoyetina o análogos funcionales de las mismas, y en donde la célula huésped sensible al manganeso es una célula de mamífero.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa de recuperar una composición eritropoyética en la que menos del 5 % de las moléculas estimulantes de la eritropoyesis están menos sialiladas.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de manganeso es eficaz para aumentar el porcentaje de moléculas estimulantes de la eritropoyesis altamente sialiladas.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de manganeso es eficaz para aumentar el porcentaje de moléculas estimulantes de la eritropoyesis que están glicosiladas en sitios potenciales de glicosilación enlazados a O.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad de manganeso es eficaz para aumentar el porcentaje de galactosa entre los azúcares fijados las moléculas estimulantes de la eritropoyesis.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el medio de cultivo está esencialmente libre de suero.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que las moléculas estimulantes de la eritropoyesis comprenden:

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma, y/o (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (darbepoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en el que la la célula huésped es una célula CHO.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en el que el manganeso está en una concentración de 0,4 a 4 pM.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en el que el medio de cultivo comprende, además, uno o más aminoácidos complementarios seleccionados del grupo que consiste en asparagina, ácido aspártico, cisteína, cistina, isoleucina, leucina, triptófano o valina.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que las células huésped se cultivan en botellas rotatorias.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el manganeso se añade después de una fase de rápido crecimiento celular, en el que dicha fase de rápido crecimiento celular dura preferiblemente un período que oscila entre 2 y 20 días.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el manganeso se añade después de dos ciclos de recolección, y en el que el primer ciclo de recolección es preferiblemente de 8 días y el segundo ciclo de recolección es preferiblemente de 7 días.

14. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa de recuperar la composición eritropoyética que comprende dichas glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis sialiladas de las células huésped y el medio de cultivo.

15. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, la etapa de recuperar la composición eritropoyética que comprende glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis altamente sialiladas de las células huésped y el medio de cultivo.

16. El método de la reivindicación 14 o 15, en el que dicha recuperación comprende la separación de moléculas estimulantes de la eritropoyesis altamente sialiladas de moléculas estimulantes de la eritropoyesis menos sialiladas y no sialiladas a través de cromatografía de intercambio aniónico.

17. Un medio de cultivo que comprende células huésped sensibles al manganeso que producen glicoproteínas estimulantes de la eritropoyesis y manganeso a una concentración de 0,4 a 40 pM, en el que la glicoproteína estimulante de la eritropoyesis es eritropoyetina, darbepoyetina o análogos funcionales de las mismas, y en el que la célula huésped sensible al manganeso es una célula de mamífero.

18. El medio de cultivo de la reivindicación 17, en donde las células huésped secretan una composición eritropoyética.

19. El medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 17-18, en donde el manganeso está en una concentración de 0,4 a 10 pM.

20. El medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en donde las moléculas estimulantes de la eritropoyesis comprenden

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma; y/o (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (darbepoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma.