ES2252876T3

ES2252876T3 - Proceso para preparar polipeptidos con glicolizacion adecuada.

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Publication number: ES2252876T3
Application number: ES98965223T
Authority: ES
Inventors: Reinhard Franze; Horst Eberhardt; Claus Wallerius
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: AR018023A1; WO1999028455A1; US6673575B1; ES2252876T5; JP3394240B2; ATE309350T1; JP4384400B2; EP1036179B2; AR020735A1; JP2003180392A; JP2001525342A; AU2051899A; DK1036179T4; EP1036179B1; EP1036179A1; DK1036179T3; DE59813187D1

Abstract

Proceso para aumentar el grado de glicolización al preparar un polipéptido glicolizado a partir de células de mamíferos o de insectos, el cual consiste en cultivar las células de mamíferos o de insectos en un medio de cultivo adecuado y obtener el polipéptido deseado de las células o/y del sobrenadante del cultivo, caracterizado porque durante el cultivo se efectúa una adición de nutrientes - que comprende al menos dos carbohidratos - controlada y ajustada al consumo, en función de la correspondiente demanda de las células.

Description

Proceso para preparar polipéptidos con glicolización adecuada.

La presente invención se refiere a un proceso para incrementar el grado de glicolización durante la preparación de un polipéptido mediante el cultivo de células de mamíferos y de insectos, y a la obtención del polipéptido originado en el medio de cultivo y/o en las células. En tal proceso, el polipéptido glicolizado objeto de la preparación puede producirse por recombinación mediante activación genética endógena o de modo natural por parte de las células.

La preparación de glicoproteínas mediante el cultivo de células eucariotas se lleva a cabo generalmente en medios de cultivo habituales del comercio. Entonces puede ser necesario añadir ciertos substratos al medio de cultivo, para conseguir la glicolización deseada del polipéptido. Esto está descrito en la patente japonesa H6-292 592 para un proceso discontinuo en pequeños volúmenes (< 1000 ml), con una reducida densidad celular inicial (5 \times 10^{4} células/ml) y un tiempo de cultivo corto (48 h), tomando como ejemplo un anticuerpo IgM humano. En dicho proceso, para la preparación recombinante de anticuerpos en células de mamíferos, p.ej. en células CHO, en vez de la glucosa habitualmente utilizada se emplea otro azúcar, por ejemplo fructosa, manosa, galactosa, N-acetilglucosamina, ribosa, fucosa, N-acetilgalactosamina o similar. Asimismo se revela un método de cultivo en varias etapas, que consiste en cultivar primero las células en un medio que lleva glucosa, el cual se intercambia luego con un medio que contiene otro azúcar.

Sin embargo, el proceso descrito en la patente japonesa H6-292 592 tiene serios inconvenientes. El consumo del azúcar durante el cultivo celular hace variar continuamente su concentración en el medio de cultivo y por lo tanto no se puede garantizar que el grado de glicolización de los polipéptidos sea elevado y estable. Además, el proceso discontinuo no es adecuado cuando la glicolización deseada requiere una concentración constante del substrato, ya que las concentraciones iniciales de los substratos disminuyen continuamente debido al metabolismo celular. Asimismo, las grandes concentraciones de azúcar necesarias para tener densidades celulares altas y un grado de glicolización elevado y constante deben establecerse ya al comienzo de la fermentación, pero en estas condiciones se inhibe el crecimiento de las células y por tanto se limita la densidad celular que podría alcanzarse. Por consiguiente, con el proceso descrito en la patente japonesa antes citada no es posible una producción rentable de polipéptidos altamente glicolizados.

Es conocido el cultivo de células eucarióticas mediante un proceso discontinuo con alimentación simultánea (de carga alimentada), en el cual se agrega solución nutriente durante el cultivo. Con este tipo de proceso, empleando una realimentación adecuada, se puede lograr una mayor densidad celular y un cultivo más duradero. Bajo este aspecto hay que mencionar la publicación de Ljunggren y Häggström (Biotech. Bioeng. 44 (1994), 808-818), donde se describe la influencia de los cultivos limitados de substrato y realimentados en la obtención de un anticuerpo a partir de células de ratón. En este caso, las células se cultivan bajo la adición controlada de glucosa y glutamina. Los autores encontraron una disminución de productos secundarios no deseados y un efecto positivo sobre la producción de anticuerpos, debido a las bajas concentraciones de glucosa y glutamina. Otro ejemplo es la alimentación continua y limitada del aminoácido esencial glutamina, lo cual produce un crecimiento celular mejorado (Ljunggren y otros, Biotech. Lett. 12 (1990), 705-710). El objeto de la alimentación de glutamina es reducir la formación de amoniaco, que es tóxico para las células animales (Mirabet y otros, Biotechnol. Bioeng. 56 (1997), 530-537).

Gawlitzek y otros (Biotechnol. Bioeng. 57 (1998), 518-528) señalan que, debido a las altas concentraciones de iones amonio o de glucosamina en los medios de cultivo de células eucariotas BHK-21, se halla un aumento en la complejidad de las estructuras de carbohidrato unidas a N en las glicoproteínas recombinantes segregadas por las células cultivadas. Sin embargo, este hallazgo se contradice con los resultados de Borys y otros (Biotechnol. Bioeng. 43 (1994), 505-514) o de Andersen y Goochee (Biotechnol. Bioeng. 47 (1995), 96-105) que comprobaron cómo las mayores concentraciones de amonio en el medio de cultivo inhibían la glicolización. Por tanto, es evidente que el control de la formación de amonio en el cultivo solo es un aspecto aislado e insuficiente, para preparar proteínas adecuadamente glicolizadas de manera rentable.

El grado de glicolización de los polipéptidos puede tener una gran influencia en su actividad biológica, lo cual se demuestra en el siguiente ejemplo de la eritropoyetina (EPO). La EPO es una glicoproteína humana que estimula la producción glóbulos rojos. La EPO se halla en el plasma sanguíneo de las personas sanas a concentraciones muy bajas, de manera que por esta vía no es posible prepararla en grandes cantidades. Las patentes EP-B-0 148 605 y EP-B-0 205 564 describen la preparación de EPO humana recombinante en células CHO. La EPO descrita en la patente EP-B-0 148 605 presenta un peso molecular mayor que el de la EPO urinaria y ninguna O-glicolización. La EPO descrita en la patente EP-B-0 205 564 a partir de células CHO está disponible, entretanto, en grandes cantidades y en forma
pura.

También es conocida la obtención de EPO humana a partir de la orina de pacientes con anemia aplásica (Miyake y otros, J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558-5564).

La EPO recombinante y la EPO urinaria se obtienen como mezcla de distintas isoformas, de las cuales es sabido que se diferencian por su grado de sialilación. Estas isoformas presentan distintos puntos isoeléctricos y pueden separarse por enfoque isoeléctrico o por electroforesis capilar (véase Tsao y otros, Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196; Nieto y otros, Anal. Commun. 33(1996), 425-427; Tran y otros, J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471; Bietot y otros, J. Chromatogr. 759 (1997), 177-184; Watson y otros, Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393). Las isoformas con mayor número de ácidos siálicos poseen la máxima actividad específica, mientras que las de menor número tienen la actividad más baja (véase p.ej. Imai y otros, Eur. J. Biochem. 194 (1990), 457-462; patente EP-A-o 428 267).

Takeuchi y otros, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989), 7819-7822) describen una relación de la actividad biológica con el contenido de ácido siálico y la proporción de estructuras de carbohidrato bi- y tetrarramificadas. Takeuchi y otros llegan también a la conclusión de que las unidades de N-acetil-lactosamin-disacárido presentes en las estructuras de carbohidrato de la EPO no tienen ninguna relación con la actividad biológica.

Fukuda y otros (Blood 73 (1989), 84-89) se ocupan de la velocidad de eliminación de EPO de la circulación sanguínea, que contribuye de manera esencial a la actividad biológica, y llegan a la conclusión de que la EPO con un mayor número de unidades de N-acetil-lactosamina se elimina más rápidamente de la sangre que la EPO sin unidades de lactosamina. Morimoto y otros (Glycoconjugate J. 13 (1996), 1093-1120) describen la separación de isoformas de EPO por cromatografía de intercambio iónico mediante columna mono-Q, de modo que cada fracción individual solo consta de pocas isoformas. Los análisis efectuados con estas fracciones muestran una distribución equivalente de todas las estructuras en todas las fracciones. No se encuentra ninguna relación entre el contenido en estructuras bi- y trirramificadas o el contenido en unidades de N-acetil-lactosamina y la actividad específica.

Por lo tanto, del citado estado técnico se infiere que existe una correlación general de la actividad biológica con la estructura de los azúcares, sobre todo en cuanto al contenido en ácidos siálicos.

Sorprendentemente se comprobó que, con una alimentación continua de substratos carbohidratados, ajustada al consumo, durante una fermentación de elevada densidad celular, y/o con el uso de una mezcla de al menos 2 carbohidratos durante el cultivo, se logra un gran rendimiento de la proteína deseada, por ejemplo la EPO, con un alto grado de glicolización.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere, por lo tanto, a un proceso para incrementar el grado de glicolización al preparar un polipéptido glicolizado a partir de células de mamíferos y de insectos, que consiste en cultivar las células de mamíferos y de insectos en un medio adecuado y extraer el polipéptido deseado de las células y/o del sobrenadante del cultivo. El proceso se caracteriza porque durante el cultivo se añade un medio nutritivo, de manera controlada y ajustada al consumo, que comprende como mínimo 2 y preferentemente 3 hidratos de carbono, en función del correspondiente consumo de la célula.

Los hidratos de carbono se eligen preferentemente entre mono- y disacáridos como glucosa, glucosamina, ribosa, fructosa, galactosa, manosa, sacarosa, lactosa, manosa-1-fosfato, manosa-1-sulfato y manosa-6-sulfato. Por ejemplo, son medios nutritivos adecuados los que contienen glucosa o/y manosa o/y galactosa. Se obtuvieron resultados especialmente buenos con medios nutritivos basados en una mezcla de glucosa, galactosa y manosa, en relación másica de por ejemplo 1:(0,5-3):(1-5) y sobre todo 1:(0,7-2,4):(1,8-4,0), empleando con especial preferencia cada hidrato de carbono en forma D(+). La concentración total de todos los azúcares durante la fermentación está comprendida preferentemente en un intervalo de 0,1 a 10 g/l, con especial preferencia en un intervalo de 2 hasta 6 g/l de medio de cultivo. La adición de la mezcla de carbohidratos se realiza en función del respectivo consumo de las células, tal como se expone a continuación.

Una forma de ejecución preferida del proceso de la presente invención se caracteriza por la adición suplementaria durante el cultivo, de modo controlado y ajustado al consumo, de como mínimo un aminoácido esencial para la correspondiente línea celular cultivada, en función del respectivo consumo de las células.

Para posibilitar una adición de nutrientes ajustada al consumo, se determina continuamente o a intervalos de tiempo adecuados, p.ej. al menos una vez al día, la concentración de los parámetros relacionados con la demanda de nutrientes de las células y se calculan sus niveles de consumo. Así pueden determinarse cuantitativa o/y cualitativamente los nutrientes que necesitan las células y llevarlos al medio de cultivo en composición y cantidad adecuada. Dichos parámetros pueden ser nutrientes o productos metabólicos de las células, como por ejemplo la concentración de glutamina, de amonio, de glucosa o/y de lactato, sobre todo la concentración de glutamina.

Con la adición de nutrientes controlada y ajustada al consumo puede lograrse una glicolización mucho mejor, incluso para una fermentación de elevada densidad celular (densidad celular al recolectar > 10 \times 10^{5} células/ml y preferentemente > 20 \times 10^{5} células/ml) realizada en grandes fermentadores (de volumen > 1 l, p.ej. de 50 hasta 10.000 l).

Los nutrientes añadidos según dicha forma de ejecución de la presente invención comprenden aminoácidos esenciales, p.ej. glutamina o/y triptófano, o/y carbohidratos, así como, preferentemente, aminoácidos no esenciales, vitaminas, oligo-elementos, sales o/y factores de crecimiento, p.ej. insulina. Preferentemente, los nutrientes llevan como mínimo un amino-ácido esencial y al menos dos carbohidratos. Estos nutrientes se dosifican preferentemente disueltos al cultivo de fermentación. Los nutrientes contienen preferentemente, al menos, glutamina y carbohidratos, sobre todo una mezcla de al menos 2 carbohidratos, tal como se ha dicho anteriormente. Se usa con especial preferencia una mezcla de glucosa, galactosa y manosa. También es preferible añadir los nutrientes de modo ajustado al consumo durante toda la fase de crecimiento celular, es decir, según la concentración de los parámetros escogidos, medida en el medio de cultivo.

La relación cuantitativa de glutamina a carbohidratos en la solución nutriente se elige, preferentemente, de manera que corresponda esencialmente a la relación de consumo en el fermentador. De este modo se puede lograr una concentración ampliamente constante de cada substrato en el fermentador. La concentración de glutamina se mantiene, preferentemente, a un valor < 150 mg/l en el medio de cultivo, y se impide que se forme una concentración de amonio \geq 2,3 mmol/l en el medio de cultivo. La concentración global de los azúcares durante la fermentación - como ya se ha indicado con anterioridad - está comprendida preferentemente en un intervalo de 0,1 a 10 g/l, con especial preferencia en un intervalo de 2 hasta 6 g/l de medio de cultivo.

La solución nutriente utilizada contiene una relación másica de glutamina respecto a los azúcares comprendida preferentemente en el intervalo de 1:3 hasta 20 y con especial preferencia de 1:5 hasta 15, referido a azúcar total. Cuando se emplea una solución nutriente que contiene glutamina y los tres azúcares glucosa, galactosa y manosa, la relación másica de glutamina respecto a los azúcares es, preferentemente, de 1:(1 hasta 3):(1 hasta 5):(2 hasta 8) y con especial preferencia de 1:(1,5 hasta 2,2):(1,5 hasta 3,6):(4 hasta 6).

El proceso según la presente invención es básicamente apropiado para preparar cualquier polipéptido glicolizado. No obstante, se prefieren los polipéptidos que contienen uno o varios radicales de ácido siálico, ya que el proceso según la presente invención permite aumentar especialmente el grado de sialilación de los polipéptidos. También se puede influir en el grado de ramificación.

El proceso según la presente invención es especialmente adecuado para preparar polipéptidos de uso terapéutico, pues su actividad biológica y, por tanto su eficacia farmacéutica, depende de la glicolización y sobre todo del grado de sialilación o/y de ramificación. Los polipéptidos glicolizados se pueden escoger, por ejemplo, del grupo formado por glicoproteínas fisiológicamente activas como las linfocinas, citocinas, inmunoglobulinas y hormonas, p.ej. EPO, trombopoyetina (TPO), G-CSF, GM-CSF, interleucinas, interferones, factores de coagulación sanguínea y activadores hísticos del plasminógeno. Se puede tratar de polipéptidos humanos naturales o de muteínas recombinantes de estos polipéptidos humanos. Se prefiere especialmente el polipéptido EPO glicolizado.

Para el cultivo se puede usar cualquier tipo de células de mamíferos o insectos. Se utilizan preferentemente células de mamíferos, p.ej. células de hámster derivadas, como las de tipo CHO o BHK, o sobre todo células humanas. Además se prefiere que las células de mamíferos sean líneas celulares continuas de origen animal o humano, como por ejemplo las líneas celulares humanas HeLaS3 (Puck y otros, J. Exp. Meth. 103 (1956), 273-284), Namalwa (Nadkarni y otros, Cancer 23(1969), 64-79), HT1080 (Rasheed y otros, Cancer 33 (1973), 1027-1033) o bien líneas celulares derivadas de éstas. La producción del polipéptido deseado en las células cultivadas se puede realizar mediante

(a): expresión de un gen endógeno natural,

(b): expresión de un gen endógeno activado o/y

(c): expresión de un gen exógeno (recombinante).

Se prefieren sobre todo las células, en las cuales la producción del polipéptido deseado tiene lugar por expresión de un gen endógeno activado por recombinación homóloga, y que son capaces de producir grandes cantidades de
EPO.

En principio, las células pueden cultivarse tal como se desee. Sin embargo se prefiere el cultivo en forma de suspensión. Además se prefiere cultivar las células en un medio con bajo contenido de suero, p.ej. 1% (v/v) como máximo o, sobre todo, en un medio exento de suero, p.ej. en un medio de fermentación libre de suero y pobre en proteínas (véase p.ej. la patente WO 96/35718). Son ejemplos de medios de cultivo apropiados los medios basales, como p.ej. RPMI 1640, DMEM, F12 o eRDF con los suplementos adecuados. El proceso según la presente invención permite el cultivo en fermentadores grandes, es decir, en un volumen de cultivo superior a 1 l, preferentemente mayor de 10 l, por ejemplo entre 50 l y 10.000 l. Asimismo, el proceso según la presente invención permite una fermentación de alta densidad celular, lo cual significa que la concentración de células tras la fase de crecimiento (es decir, en el momento de la recolección) supera las 10 \times 10^{5} células/ml y con especial preferencia 20 \times 10^{5} células/ml.

El cultivo se realiza preferentemente en régimen periódico con realimentación ajustada al consumo, de modo que tras una fase de crecimiento se recoge parte del caldo de cultivo y el resto permanece en el fermentador, que a continuación se rellena con medio de cultivo fresco hasta el volumen de trabajo. Con el proceso según la presente invención, el deseado polipéptido glicolizado puede cosecharse con rendimientos muy elevados. Así, por ejemplo, en el momento de la recolección, la concentración del polipéptido deseado es de al menos 30 mg y sobre todo, al menos, de 40 mg por l del medio de cultivo.

En otra forma de ejecución, el proceso se caracteriza porque el cultivo tiene lugar a una temperatura \leq 35,5ºC, con preferencia entre 33 y 35,0ºC. Sorprendentemente se comprobó que justo al bajar la temperatura durante el cultivo, aumenta claramente el porcentaje de polipéptidos con la glicolización deseada.

De aquí en adelante, la presente invención se ilustra con las siguientes figuras y ejemplos, relativos a la preparación de EPO en células HeLaS3.

En las figuras se indica:

Figura 1 porcentaje relativo de cada isoforma de EPO según los carbohidratos añadidos al medio de cultivo y

Figura 2 actividad biológica de preparados de EPO según los carbohidratos añadidos al medio de cultivo.

Ejemplos Ejemplo 1 Determinación de la actividad específica de la EPO in vivo

Para la actividad biológica in vivo de la EPO es básico el grado de glicolización, p.ej. la cantidad de estructuras tetrarramificadas respecto al número total de cadenas hidrocarbonadas, la cantidad de unidades de N-acetil-lactosamina respecto a un punto de glicolización de la molécula de EPO y el contenido de ácido siálico por molécula de EPO. Según el número de ácidos siálicos unidos en posición terminal resultan hasta 14 isoformas, que, por su carga, pueden separarse p.ej. mediante la electroforesis capilar de zona (CZE). Las formas más ácidas muy sializadas 1 a 5 son decisivas para la actividad biológica in vivo de la EPO.

La acción de la EPO, dependiente de la dosis, sobre la proliferación y diferenciación de las células precursoras de los eritrocitos se determinó in vivo con ratones mediante el aumento de reticulocitos en la sangre tras la administración de EPO.

A tal efecto, se administraron a ocho ratones, por vía parenteral, distintas dosis de la muestra de EPO analizada y de una EPO estándar (calibrada contra el patrón EPO-WHO). A continuación, los ratones se mantuvieron en condiciones definidas y constantes. A los 4 días de la administración de la EPO se extrajo sangre de los ratones y los reticulocitos se tiñeron con naranja de acridina. El número de reticulocitos por 30.000 eritrocitos se determinó por microfluorimetría en un citómetro de flujo analizando el histograma de fluorescencia roja.

La actividad biológica se calculó a partir de los valores del número de reticulocitos, para distintas dosis de la muestra y del estándar, según el método descrito por Linder de la determinación del contenido por pares mediante rectas paralelas (Linder, Planificación y evaluación de ensayos, 3ª edición, 1969, editorial Birkenhäuser, Basilea).

Ejemplo 2 Determinación del contenido en radicales de ácido siálico

El contenido de ácido siálico se determinó por cromatografía HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico a pH elevado con detección amperométrica pulsada), con un sistema Dionex, tras la disociación enzimática de los ácidos siálicos con neuraminidasa procedente de Arthrobacter ureafaciens (A. ureaf., de Boehringer Mannheim).

Unas muestras con 22 \mug de EPO procedentes de distintos preparados de líneas celulares CHO y humanas (p.ej., HeLaS3) se ajustaron a una concentración de 0,2 mg de EPO/ml con tampón de fosfato-Na 5 mM, de pH 7,2. Una mitad de cada muestra se usó para determinar exactamente la cantidad de EPO mediante RP-HPLC. Se agregaron 5 mM U de neuraminidasa de A. ureaf. a la 2ª mitad de las muestras y se incubaron durante la noche (aprox. 18 h) a 37ºC. A continuación, las muestras incubadas se dividieron en dos mitades, se diluyeron 20 veces con H_{2}O hasta 500 \mul y 50 \mul (equivalentes a unos 27 pmoles de EPO) de las diluciones se analizaron con el sistema Dionex. Para ello se emplearon los siguientes parámetros cromatográficos:

\vskip1.000000\baselineskip

Columna:	CarboPac PA 100
Caudal:	1,0 ml/min.
Sensibilidad del detector:	300 nA
Gradiente:	t (min.)	% de tampón B
	0	17
	7	17
	9	100
	12	100
	13	0
	20	0

Tampón A:	NaOH 0,1 M
Tampón B:	NaOH 0,1 M; acetato-Na 0,5 M

\newpage

La cantidad de ácido siálico en la muestra cromatografiada se calculó mediante una recta de calibración, obtenida con los valores de un patrón de ácido siálico (de Boehringer Mannheim) cromatografiado comparativamente. El contenido de ácido siálico (moles de ácido siálico/mol de EPO) se calculó partiendo del resultado de la determinación de ácido siálico (sistema Dionex) y de la determinación mediante RP-HPLC de la cantidad de EPO empleada.

Ejemplo 3 Determinación del porcentaje de estructuras bi-, tri- y tetrarramificadas de carbohidratos

La analítica de las estructuras de carbohidrato unidas a través de N se realizó por cromatografía HPAEC-PAD sobre un sistema Dionex. Los asialo-oligosacáridos de preparaciones de EPO procedentes de las líneas celulares CHO y humanas (p.ej. de la HeLa S3) se obtuvieron por disociación enzimática con N-glicosidasa F (de Boehringer Mannheim) y con neuraminidasa de A. ureaf. (de Boehringer Mannheim).

Empleando unidades de ultracentrifugación MicroCon (de Amicon, tamaño de exclusión 10 kD) se desmineralizaron aprox. 30 \mug de EPO por cada muestra y se ajustaron a una concentración de 0,3 mg/ml con tampón de fosfato-Na 10 mM, de pH 7,2. A continuación, se añadió 1 U de N-glicosidasa F y 10 mU de neuraminidasa a cada muestra y se incubaron durante la noche (aprox. 18 h) a 37ºC. Para separar la porción de polipéptido de la EPO, de los oligosacáridos disociados, las muestras se centrifugaron, tras la incubación, con centrífugas Ultrafree (de Millipore, tamaño de exclusión 10 kD) y luego el aparato Ultrafree se lavó dos veces con 20 \mul de H_{2}O. Los oligosacáridos contenidos en el extracto líquido se completaron hasta 150 \mul con H_{2}O y 100 \mul del mismo se analizaron en el sistema Dionex, empleando los siguientes parámetros cromatográficos:

Columna:	CarboPac PA 100
Caudal:	1,0 ml/min.
Sensibilidad del detector:	300 nA
Gradiente:	t (min.)	% de tampón B
	0	0
	2	0
	60	10
	62	100
	67	100
	69	0
	80	0

Tampón A:	NaOH 0,1 M
Tampón B:	NaOH 0,1 M; acetato-Na 0,5 M

La identificación de los picos en un cromatograma de N-azúcares del tipo complejo se efectuó con patrones de oligosacáridos (de Oxford Glyco Systems) y se verificó mediante la digestión enzimática de los oligosacáridos de la EPO con el enzima endo-\beta-galactosidasa o fucosidasa, seguida de análisis en el sistema Dionex. Los porcentajes de las estructuras bi-, tri- y tetrarramificadas se calcularon según las áreas de los picos - representantes de la correspondiente estructura de N-azúcar - respecto al área total de los picos (suma de las áreas de los picos de las estructuras bi-, tri- y tetrarramificadas).

Ejemplo 4 Determinación del porcentaje de unidades de N-acetil-lactosamina y del porcentaje promedio de unidades de N-acetil-lactosamina adicionales (repeticiones)

El número total de unidades N-acetil-lactosamina en las estructuras de carbohidratos unidas a la EPO a través de N (o sea, en las estructuras de carbohidrato nucleares) se calculó partiendo de las áreas de los picos de los cromatogramas de los experimentos del ejemplo 3.

El porcentaje del contenido promedio (n) de unidades de N-acetil-lactosamina por cadena hidrocarbonada se calculó del modo siguiente:

n = \Sigma % (bi)\times2 + % (tri)\times3 + % (tetra)\times4 + % (tri + 1r)\times4 + % (tetra + 1r)\times5 + % (tri + 2r)\times5 + % (tetra + 2r)\times6

donde

: % (bi) = porcentaje de estructuras birramificadas respecto al número total de cadenas hidrocarbonadas

: % (tri) = porcentaje de estructuras trirramificadas sin unidades adicionales de N-acetil-lactosamina

: % (tetra) = porcentaje de estructuras tetrarramificadas sin unidades adicionales de N-acetil-lactosamina

: % (tri + 1r) = porcentaje de estructuras trirramificadas con 1 unidad adicional de N-acetil-lactosamina

: % (tetra + 1r) = porcentaje de estructuras tetrarramificadas con 1 unidad adicional de N-acetil-lactosamina

: % (tri + 2r) = porcentaje de estructuras trirramificadas con 2 unidades adicionales de N-acetil-lactosamina

: % (tetra + 2r) = porcentaje de estructuras tetrarramificadas con 2 unidades adicionales de N-acetil-lacto-samina.

Otro parámetro importante es el porcentaje de unidades de N-acetil-lactosamina, que como "repeticiones" pueden estar unidas a las estructuras de carbohidrato nucleares. El contenido de repeticiones se indica como porcentaje de estructuras de carbohidrato con repeticiones, referido a la totalidad de estructuras de carbohidrato (bi + tri + tetra = 100%). Este porcentaje de repeticiones puede ser distinto en las preparaciones de EPO, según si provienen de células CHO o de células humanas.

Ejemplo 5 Influencia de la realimentación controlada y ajustada al consumo sobre la actividad biológica de la EPO

Los cultivos se efectuaron en régimen periódico con una realimentación ajustada al consumo (Repeated Fed Batch), a la temperatura de 36,5ºC. Para ello, en un fermentador agitado (volumen total de trabajo: 10 l) se cargó un medio de cultivo exento de suero, con bajo contenido en proteína, y se inyectó una vez con un cultivo de inóculo. La densidad celular tras la inyección quedó comprendida en el intervalo de 3 \pm 1 \times 10^{5} células vivas/ml.

Tras una fase de crecimiento de 144 \pm 24 horas se recogió una parte del caldo de cultivo. El resto permaneció en el fermentador y constituyó el inóculo para la siguiente fase de crecimiento; entonces se rellenó el fermentador con medio de cultivo fresco hasta el volumen de trabajo.

El sobrenadante del cultivo, con la EPO, se obtuvo centrifugando el cultivo de fermentación.

Durante la fase de crecimiento, el cultivo se alimentó continuamente con solución nutriente. Para ello se acopló al fermentador un depósito con solución nutriente, que contenía aminoácidos, vitaminas, insulina, oligoelementos, sales, glutamina y carbohidratos. Se realizaron dos fermentaciones del modo siguiente:

En la fermentación A la solución nutriente llevaba como azúcar D-(+)-glucosa y en la fermentación B llevaba los azúcares D-(+)-glucosa, D-(+)-galactosa y D-(+)-manosa. En la fermentación B, la relación másica de la glutamina respecto a los azúcares era de 1:2,2:3,6:6. La concentración de cada uno de los azúcares en la solución nutriente estaba comprendida entre 7,2 y 18 g/l.

Durante la fermentación B se analizó periódicamente la concentración de glutamina en el cultivo y se calculó el consumo. El caudal instantáneo de solución nutriente se adaptó a la demanda de nutrientes de las células. En la fermentación A la concentración de glutamina no se usó como magnitud reguladora. En la fermentación B, la solución nutriente contiene una mezcla de los azúcares D-(+)-glucosa, D-(+)-galactosa y D-(+)-manosa en relación másica 2:3:5. Durante el cultivo, la concentración de todos los azúcares en el fermentador se mantuvo en un intervalo de 2 a 6 g/l mediante una realimentación adecuada.

A causa del crecimiento, la densidad celular superó las 20 \times 10^{5} células/ml, llegando normalmente a las 30 \pm 10 \times 10^{5} células/ml en el momento de la recolección. En este punto, la concentración de EPO llegó típicamente a 40 \pm 10 mg/l.

En los caldos de cultivo recogidos se determinó la concentración de eritropoyetina humana, p.ej. mediante ELISA. La distribución porcentual de las isoformas resultantes de esta proteína se determinó p.ej. mediante separación por electroforesis capilar de zona (CZE).

La tabla 1 muestra comparativamente la distribución de isoformas de la EPO entre una fermentación A realimentada con una solución nutriente que contiene glucosa y una fermentación B con realimentación controla y ajustada al consumo de una solución nutriente que lleva glucosa, manosa y galactosa. La proporción de isoformas de la EPO en la fermentación B se calculó como porcentaje de las correspondientes isoformas en la fermentación A. Estas últimas se normalizaron respectivamente a 100%. Los datos demuestran que las deseadas isoformas de EPO 2-4, más glicolizadas durante la fermentación, se dan en mucha mayor proporción que en la fermentación A.

TABLA 1

Denominación de la isoforma en la	1	2	3	4	5	6	7	8
CZE
	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]
Fermentación A:	n.d.	100	100	100	100	100	100	100
realimentación con glucosa
Fermentación B:	n.d.	136	140	115	102	91	76	55
realimentación ajustada al consumo
con glucosa, manosa y galactosa
n.d. = no determinable, porque el valor está por debajo del límite de detección

El patrón de isoformas obtenido mediante realimentación se reprodujo en cuatro recolecciones sucesivas de una fermentación realimentada con la solución nutriente, de manera controlada y ajustada al consumo.

Ejemplo 6 Influencia de la temperatura de cultivo en la actividad biológica de la EPO

Se procedió del modo descrito en el ejemplo 5 (fermentación B), por lotes realimentados, con alimentación controlada y ajustada al consumo, pero a una temperatura de fermentación de 35,0ºC en lugar de 36,5ºC y a una escala de 1000 l.

La tabla 2 muestra comparativamente la distribución de isoformas de la EPO entre una fermentación C a 36,5ºC y una fermentación D a 35,0ºC, realimentadas respectivamente bajo control con una solución nutriente. La proporción de isoformas de la EPO en la fermentación D se calculó como porcentaje de las correspondientes isoformas en la fermentación C. Estas últimas se normalizaron respectivamente a 100%. Estos datos demuestran que las isoformas ácidas de EPO 2 hasta 4 aumentan de modo decisivo al rebajar la temperatura.

TABLA 2

Denominación de la isoforma en la	1	2	3	4	5	6	7	8
CZE
Distribución relativa de las isoformas	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]	[%]

Fermentación C:	n.d.	100	100	100	100	100	100	100
temperatura 36,5ºC
Fermentación D:	n.d.	131	116	110	94	100	88	86
temperatura 35,0ºC
n.d. = no determinable, porque el valor está por debajo del límite de detección

Ejemplo 7 Influencia de varias composiciones de carbohidratos en el medio de cultivo sobre la actividad biológica de la EPO

El proceso expuesto a continuación demuestra la posibilidad de variar la calidad de la eritropoyetina humana modificando la composición de carbohidratos en el medio realimentado.

Se muestran dos variantes del proceso arriba descrito (designadas en lo sucesivo fermentación E y fermentación F), que se distinguen por la composición de los medios empleados.

En ambas preparaciones, la receta del medio de cultivo se basó en un medio eRDF modificado. No se usó ningún suero, sino insulina recombinante (única adición proteica) y otros suplementos (p.ej. selenita, putrescina, hidrocortisona, sulfato de hierro) habituales en los medios exentos de suero o de proteínas.

La solución nutriente de realimentación también estaba basada en un medio eRDF modificado, pero no llevaba las sales KCl, Na_{2}HPO_{4} y NaCl.

La diferencia importante entre las fermentaciones E y F estriba en la adición de distintos monosacáridos al medio de realimentación.

Fermentación E

Para la fermentación E se usó el azúcar D-(+)-glucosa, normalmente empleado. La concentración inicial fue de 3 g/l. Mediante una realimentación adecuada con solución nutriente que contenía glucosa, su concentración en el caldo de cultivo se mantuvo constante a 3 \pm 0,5 g/l durante todo el cultivo.

La duración del cultivo fue típicamente de 100 \pm 20 h. La concentración de EPO en el momento de la recolección fue típicamente de 40 \pm 10 mg/l.

Fermentación F

En la fermentación F, junto a la D-(+)-glucosa se utilizaron los azúcares D-(+)-galactosa y D-(+)-manosa en una relación 1:2:3, para el medio de realimentación. Durante el cultivo, la concentración de todos los azúcares se mantuvo en un intervalo entre 0,25 g/l y 3,5 g/l mediante una realimentación adecuada.

Se purificó la eritropoyetina de los sobrenadantes del cultivo. El proceso de purificación estaba diseñado para que no se alterara la distribución de las isoformas relevantes de la glicoproteína.

La distribución de isoformas de la eritropoyetina purificada se determinó de la manera anteriormente descrita. Las estructuras de carbohidrato de las isoformas de la eritropoyetina humana y su distribución son diferentes en los sobrenadantes de cultivo de las fermentaciones E y F. La fermentación F presenta un porcentaje de las isoformas 2, 3 y 4 claramente superior en comparación con la fermentación E. Estas diferencias son debidas a una realimentación con los monosacáridos manosa y galactosa (véase la fig. 1).

La actividad biológica, determinada mediante el ensayo Normo-Maus (ejemplo 1), se correlaciona con la distribución y las estructuras de carbohidratos de las isoformas de la EPO (fig. 2). Las estructuras de carbohidratos de los preparados de EPO obtenidos de los sobrenadantes de los cultivos E y F se analizaron por CZE y HPAEC.

En la tabla 3 se indica el grado de ramificación (contenido de bi-, tri- y tetraestructuras), el contenido de unidades N-acetil-lactosamina (LE), el contenido de ácido siálico (SA) y el producto de LE y SA de ambos preparados de EPO.

TABLA 3

	bi [%]	tri [%]	tetra [%]	Contenido de SA	Contenido de LE	LE x SA
Fermentación E	12,6	25,4	62,0	10,8	10,8	116,7
Fermentación F	10,1	19,2	70,6	11,6	11,25	130,5

Claims

1. Proceso para aumentar el grado de glicolización al preparar un polipéptido glicolizado a partir de células de mamíferos o de insectos, el cual consiste en cultivar las células de mamíferos o de insectos en un medio de cultivo adecuado y obtener el polipéptido deseado de las células o/y del sobrenadante del cultivo,

caracterizado porque

durante el cultivo se efectúa una adición de nutrientes - que comprende al menos dos carbohidratos - controlada y ajustada al consumo, en función de la correspondiente demanda de las células.

2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza una mezcla de carbohidratos que contiene glucosa, manosa o/y galactosa.

3. Proceso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque durante el cultivo se efectúa una adición suplementaria, controlada y ajustada al consumo, de al menos un aminoácido esencial.

4. Proceso según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la demanda celular se determina midiendo la concentración de unos parámetros escogidos de los nutrientes y de los productos metabólicos.

5. Proceso según la reivindicación 4, caracterizado porque la concentración de glutamina se determina como magnitud de regulación.

6. Proceso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los nutrientes también contienen amino-ácidos no esenciales, vitaminas, oligoelementos, sales o/y factores de crecimiento, p.ej. insulina.

7. Proceso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido glicolizado es EPO.

8. Proceso según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el cultivo se efectúa a una temperatura \leq 35,5ºC.