JP2003180392A - 適当にグリコシル化されたポリペプチドの製造方法 - Google Patents

適当にグリコシル化されたポリペプチドの製造方法

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】グリコシル化されたポリペプチドを製造する方
法の提供。 【解決手段】真核細胞を培養し、培地または／および細
胞からペプチドを単離することによって適切にグリコシ
ル化されたポリペプチドを製造する方法の提供。この方
法では、所望のグリコシル化ポリペプチドが、内因性遺
伝子の活性化を用いた組換えによって、または自然に細
胞により生産され得る。真核細胞の培地に少なくとも２
つの炭水化物の混合物を添加することにより高度にグリ
コシル化された、ＥＰＯのような所望の蛋白質を高収量
で得られる方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、真核細胞を培養し、培地または
/および細胞からペプチドを単離することによって適当
にグリコシル化されたポリペプチドを製造する方法に関
する。この方法では、所望のグリコシル化ポリペプチド
が、内因性遺伝子の活性化を用いた組換えによって、ま
たは細胞により自然に生産され得る。
【０００２】培養真核細胞による糖蛋白質の製造は、一
般に市販の培地中で行われる。ポリペプチドに所望のグ
リコシル化が起きるためには、特定の基質を培地に添加
する必要がある場合がある。これは、特開平6-292 592
に、例としてヒトのIgM抗体を少量（<1000 ml）で低い
開始細胞密度（5 x 104細胞/ml）にて、短時間培養（48
h）を行ったバッチプロセスが記載されている。この場
合、たとえばCHO細胞のような哺乳類細胞における抗体
の組換え生産には、一般的なグルコースの代わりにフル
クトース、マンノース、ガラクトース、N-アセチルグル
コサミン、リボース、フコース、N-アセチルガラクトサ
ミン等の別の糖が使用されている。さらに、細胞をまず
グルコースを含む培地で培養し、その後、別の糖を含む
培地で置き換える、複数の段階を持つ培養方法が開示さ
れている。
【０００３】しかし、特開平6-29592に説明される方法
には、重大な問題点がある。細胞培養中、糖が消費され
るために培地中の糖濃度は、常に変化しているので、ポ
リペプチドが常に高度にグリコシル化されるとは保証さ
れない。さらに、細胞の代謝のために開始時の基質濃度
は継続的に低下するので、所望のグリコシル化に一定の
基質濃度が必要な場合には、バッチプロセスは不適当で
ある。また、高細胞密度と高レベルのグリコシル化に必
要な高濃度の糖は、発酵の開始時にすでに提供される必
要があるが、しかしながらこれは細胞の増殖を阻害する
ため、得られる細胞密度には限界が生じる。したがっ
て、上述の日本特許出願公開公報に記述される方法で
は、高度にグリコシル化されたポリペプチドの経済的な
製造は不可能である。
【０００４】培養中に栄養溶液を添加するフィーディン
グを行うバッチプロセス(フェッド・バッチ(fed-batc
h))による真核細胞の培養は公知である。この種の方法
では、適当なフィーディングによって、細胞を高密度
で、より長期間培養することができる。その一例として
は、必須アミノ酸のグルタミンを連続的、限定的にフィ
ーディングして、細胞の増殖が改善されるものがある
（Ljunggrenら、Biotech. Lett. 12 (1990), 705-71
0）。グルタミンのフィーディングの目的は、動物細胞
に対して毒性を持つアンモニウムの形成を低下させるこ
とである（Mirabetら、Biotechnol. Bioeng. 56 (199
7), 530-537）。
【０００５】ガウリツェック（Gawlitzek）ら（Biotech
nol. Bioeng. 57 (1998), 518-528）は、培養真核細胞B
HK-21の培地中でアンモニウムイオンまたはグルコサミ
ンの濃度が上昇すると、培養細胞の分泌する組換え糖蛋
白質中のN-結合炭水化物構造の複雑さが増すと記述して
いる。しかし、この結果はボリス（Borys）ら（Biotech
nol. Bioeng. 43 (1994), 505-514）またはアンダーソ
ン（Andersen）およびグーチー（Goochee）ら（Biotech
nol. Bioeng. 47 (1995), 95-105）の、培地中のアンモ
ニウム濃度の上昇によってグリコシル化が阻害されると
いう結果と一致しない。したがって、培養中のアンモニ
ウム形成の制御は、独立した局面にすぎず、したがって
適当にグリコシル化された蛋白質の経済的な製造には十
分ではないことは明らかである。
【０００６】ポリペプチドのグリコシル化のレベルは、
その生物活性に大きく影響し得る。これは、以下のエリ
スロポエチン(EPO)の例で説明される。EPOは赤血球の生
産を刺激する、ヒトの糖蛋白質である。EPOは健常人の
血漿中に非常に低濃度でしか存在しないので、この方法
で大量のEPOを提供するのは不可能である。EP-B-0 148
605およびEP-B-0 205 564は、CHO細胞における組換えヒ
トEPOの製造を記載している。EP-B-0 148 605に記載さ
れるEPOは、尿中のEPOよりも分子量が大きく、O-グリコ
シル化されていない。EP-B-0 205 564に記載されるCHO
細胞のEPOは、現在は大量に純粋な形で入手できる。
【０００７】さらに、再生不良性貧血の患者の尿由来の
ヒトEPOの単離は既知である（Miyakeら、J. Biol. Che
m. 252 (1977), 5558-5564）。
【０００８】組換えEPOおよび尿のEPOは、シアリル化の
レベルの異なる種々のアイソフォームの混合物として単
離される。これらのEPOアイソフォームは、異なる等電
点を持ち、等電点電気泳動法またはキャピラリー電気泳
動法によって分離できる（Tsaoら、Biotech. Bioeng. 4
0 (1992), 1190-1196; Nietoら、Anal. Commun. 33 (19
96), 425-427; Tranら、J. Chromatogr. 542 (1991), 4
59-471; Bietotら、J.Chromatogr. 759 (1997), 177-18
4; Watsonら、Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393参
照）。シアル酸の数が最高のアイソフォームは比活性が
最大で、シアル酸の数が最低のアイソフォームは活性が
最小である(例、Imaiら、Eur. J. Biochem. 194 (199
0), 457-462; EP-A-0 428 267参照)。
【０００９】タケウチ（Takeuchi）ら（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822）は、生物活性と
シアル酸含量との関係ならびにバイアンテナおよびテト
ラアンテナ炭水化物構造の比率を記述している。さらに
タケウチ（Takeuchi）らは、EPO炭水化物構造中に存在
するN-アセチルラクトサミン2糖ユニットは、生物活性
とは相関がないと結論づけている。
【００１０】フクダ（Fukuda）ら（Blood 73 (1989), 8
4-89）は、生物活性に重要な貢献をする血液循環からの
EPOの除去速度を調べ、比較的多数のN-アセチルラクト
サミンユニットを持つEPOのほうが、ラクトサミンユニ
ットを持たないEPOよりも早く循環血中から除去される
と結論づけた。モリモト（Morimoto）ら（Glycoconjuga
te J. 13 (1996), 1093-1120）は、モノＱクロマトグラ
フィーを用いて、個々の画分が少数のアイソフォームの
みからなるようにEPOアイソフォームを分離した。これ
らの画分を用いた実験では、すべての画分中にすべての
構造が同等に分布していることが示された。バイアンテ
ナ構造もしくはトリアンテナ構造の含有量、またはN-ア
セチルラクトサミンユニットの含有量と比活性との間に
は相関は見られなかった。
【００１１】このように、該先行技術は、糖の構造、特
にシアル酸の含量と生物活性との間に一般的な相関があ
ることを示す。
【００１２】驚くべきことに、高密度の細胞の発酵中に
炭水化物を含む基質を細胞の要求にしたがって連続的に
フィーディングしたり、または／および培養中に少なく
とも2つの炭水化物の混合物を使用すると、高レベルに
グリコシル化された、EPOのような所望の蛋白質が高収
量で得られることが見出された。
【００１３】したがって、本発明の第1の局面は、真核
細胞からグリコシル化ポリペプチドを単離する方法であ
って、真核細胞を適当な培地で培養し、所望のポリペプ
チドを細胞または/および培養上清から単離するもので
あり、培地に少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ
の炭水化物の混合物を添加することを特徴とする方法に
関する。
【００１４】炭水化物は、好ましくは、グルコース、グ
ルコサミン、リボース、フルクトース、ガラクトース、
マンノース、スクロース、ラクトース、マンノース-1-
リン酸、マンノース-1-硫酸、およびマンノース-6-硫酸
のような単糖類および二糖類からなる群より選択され
る。栄養培地は、たとえば、グルコースまたは/および
マンノースまたは/およびガラクトースを含むものが適
当である。特に良い結果は、たとえば質量比1:(0.5〜
3):(1〜5)、特に1:(0.7〜2.4):(1.8〜4.0)でグルコー
ス、ガラクトースおよびマンノースの混合物を含む栄養
培地で得られ、各炭水化物のD(+)型が使用されるのが特
に好ましい。発酵中のすべての糖の培地中の総濃度は、
好ましくは0.1〜10 g/lの範囲で、特に好ましくは2〜6
g/lの範囲である。炭水化物の混合物は、以下にさらに
詳しく説明されるように、好ましくは細胞の各々の要求
に依存して添加される。
【００１５】本発明の第2の局面は、真核細胞からグリ
コシル化ポリペプチドを単離する方法である。この方法
では、真核細胞が適当な培地で培養され、所望のポリペ
プチドが細胞または/および培養上清から単離される
が、この方法は、細胞のそれぞれの要求に応じて、個々
の培養細胞株につき少なくとも1つの必須アミノ酸また
は/および少なくとも1つの炭水化物を含む栄養素が、培
養時に調節されながら且つ要求に応じて添加されるとい
う特徴を持つ。
【００１６】需要に応じて栄養素を添加することができ
るように、細胞の栄養要求性およびその消費速度と相関
するパラメーターの濃度を、連続的またはたとえば少な
くとも1日1回といった適当な間隔で測定する。このよう
にすると、細胞に必要な栄養を定量的または/および定
性的に決定し、適当な組成と量とを培地に添加すること
が可能になる。そのようなパラメーターは、グルタミ
ン、アンモニウム、グルコースまたは/およびラクトー
スの濃度、特にグルタミン濃度のような栄養素または細
胞の代謝産物であり得る。
【００１７】調節され需要に応じた栄養分の添加が行わ
れる結果、大きな発酵槽（容積 > 1l、たとえば50〜10,
000 l）内で高細胞密度（回収時の細胞密度 > 10 x 105
細胞/ml、および好ましくは > 20 x 105細胞/ml）の発
酵でも、グリコシル化をかなり向上できる。
【００１８】本発明のこの局面にしたがって添加される
栄養素は、グルタミンまたは/およびトリプトファンの
ような必須アミノ酸または/および炭水化物で、好まし
くはさらに非必須アミノ酸、ビタミン、微量元素、塩ま
たは/およびたとえばインスリンのような増殖因子を含
む。栄養素は好ましくは少なくとも1つの必須アミノ酸
および少なくとも1つの炭水化物を含む。これらの栄養
素は、好ましくは溶解した状態で発酵培養液に計量しな
がら添加する。この栄養素は好ましくは少なくともグル
タミンおよび炭水化物、特に上記の少なくとも2つの炭
水化物の混合物を含む。グルコース、ガラクトースおよ
びマンノースの混合物が特に好ましくは使用される。ま
た、細胞の増殖期全体に渡って、需要に応じて、すなわ
ち培養液中で測定される選択されたパラメーターの濃度
に応じて、栄養素が添加されることが好ましい。
【００１９】栄養溶液中のグルタミンと炭水化物の量比
は、好ましくは発酵槽中の消費比率に対応するように選
択される。これによって、発酵槽中の個々の基質の濃度
が実質的に一定に維持され得る。グルタミンの濃度は、
好ましくは培地中で < 150 mg/l である値に維持され、
培地中のアンモニウム濃度が≧2.3 mmol/l になるのを
予防する。発酵中の糖の総濃度は、すでに説明したよう
に、好ましくは0.1〜10 g/lで、特に好ましくは2〜6 g/
lの範囲である。
【００２０】使用する栄養溶液は、糖全体量に対するグ
ルタミンの質量比が好ましくは1:3〜20で、特に好まし
くは1:5〜15となる範囲でグルタミンを含む。グルタミ
ンならびにグルコース、ガラクトース、およびマンノー
スの3つの糖を含む栄養溶液を使用する場合には、グル
タミンと糖の質量比は、好ましくは1:(1〜3):(1〜5):(2
〜8)および特に好ましくは1:(1.5〜2.2):(1.5〜3.6):(4
〜6)である。
【００２１】本発明に係る方法は、任意のグリコシル化
ポリペプチドの製造に基本的に適している。しかし、本
発明に係る方法によって、特にポリペプチドのシアリル
化のレベルが上昇するので、1つまたはいくつかのシア
ル酸残基を持つポリペプチドが適している。また、アン
テナ構造にも影響を与えることが可能である。
【００２２】本発明に係る方法は、特に治療に使用する
ポリペプチドの製造に適している。これは、その生物活
性および薬効がグリコシル化、および特にシアリル化の
レベルまたは/およびアンテナ構造に依存するためであ
る。たとえば、グリコシル化ポリペプチドは、リンホカ
イン、サイトカイン、免疫グロブリン、およびホルモン
（例えばEPO、トロンボポエチン(TPO)、G-CSF、GM-CS
F、インターロイキン、インターフェロン、血液凝固因
子および組織プラスミノゲン活性化因子）のような生理
学的に活性な糖蛋白質からなる群より選択され得る。ポ
リペプチドは、天然のヒトのポリペプチドまたはそのよ
うなヒトポリペプチドの組換え変異蛋白質であり得る。
グリコシル化ポリペプチドEPOは特に好ましい。
【００２３】培養に用いる細胞は、原則的には酵母細胞
または昆虫細胞のような任意の真核細胞で良い。しか
し、真核細胞は好ましくは、たとえばCHOもしくはBHKの
ようなハムスターに由来する細胞または特にヒト細胞の
ような哺乳類細胞である。また、真核細胞は、ヒト細胞
株HeLaS3（Puckら、J. Exp. Meth. 103 (1956), 273-28
4）、Namalwa（Nadharniら、Cancer 23 (1969), 64-7
9）、HT1080（Rasheedら、Cancer 33 (1973), 1027-103
3）のような動物もしくはヒト由来の連続培養細胞株ま
たはそれから由来する細胞株が好ましい。所望のポリペ
プチドは、(a) 天然の内因性遺伝子の発現によって、
(b) 活性化した内因性遺伝子の発現によって、または/
および(c) 外因性遺伝子の(組換えによる)発現によっ
て、培養細胞から製造できる。
【００２４】たとえば、欧州特許出願第97 112 640.4号
に開示される大量のEPOを生産することのできる細胞株
のように、所望のポリペプチドが相同組換えによって内
因性遺伝子の発現の活性化により製造される細胞が特に
好ましい。
【００２５】細胞は基本的に、任意の望ましい方法で培
養できる。しかし、懸濁培養が好ましい。さらに、例え
ば最高１％(v/v)または特に無血清培地といった血清含
量の低い培地、例として無血清・低蛋白質発酵培地（国
際公開公報第96/35718号参照）にて細胞を培養すること
が好ましい。適当な培地の例には、適当な添加物、たと
えばRPMI 1640、DMEM、F12またはeRDFを含む基本培地が
ある。本発明に係る方法では、大型発酵槽、すなわち培
養容積が1 l以上、好ましくは10 l以上、たとえば50 l
〜10,000 lでの培養が可能である。また、本発明に係る
方法では、高細胞密度の発酵が可能であり、増殖期の後
（回収時）の細胞密度が10 x 105細胞/ml以上、および
特に好ましくは20 x 105細胞/ml以上である。
【００２６】培養は好ましくは要求に応じてフィーディ
ングを行う反復バッチプロセスで行う。これは増殖期の
後に培養液の一部を回収し、培養液の残りは発酵槽に残
し、その後これに作業容積まで新しい培地を充填する。
本発明に係る方法を用いると、非常に高い収量で所望の
グリコシル化ポリペプチドを回収することができる。し
たがって、回収時の濃度は、たとえば培地1 l 当たり所
望のポリペプチドが少なくとも30 mg、および特に少な
くとも40 mgである。
【００２７】本発明の別の局面は、真核細胞からグリコ
シル化ポリペプチドを単離する方法である。この方法で
は、真核細胞を適当な培地で培養し、細胞または/およ
び培養上清から所望のポリペプチドを単離し、この方法
は培養温度が≦35.5℃、好ましくは33〜35℃で行われる
という特徴を持つ。驚くべきことに、所望のグリコシル
化されたポリペプチドの割合は、培養時の温度を低下さ
せるとかなり上昇することがわかった。
【００２８】本発明は、HeLa S3細胞におけるEPOの製造
に関する以下の図面および実施例によって、さらに説明
される。
【００２９】実施例1 インビボにおけるEPOの比活性の
決定 EPOのインビボでの生物活性に重要な要素は、たとえば
炭水化物鎖の合計数に対するテトラアンテナ構造の数、
EPO分子の1つのグリコシル化部位に対するN-アセチルラ
クトサミンユニットの数、およびEPO 1分子あたりのシ
アル酸含有量のような、グリコシル化の度合いである。
末端結合したシアル酸の数に対応して最高14のアイソフ
ォームが生じ、これはたとえばキャピラリーゾーン電気
泳動法(CZE)によってその電荷に基づいて分離できる。
最も酸性の高度にシアリル化したアイソフォーム1〜5に
より、EPOのインビボ生物活性が決定される。
【００３０】赤血球前駆細胞の増殖と分化に対するEPO
の用量依存活性は、EPO投与後の血中の網状赤血球の増
加によって、マウスにおいてインビボで決定された。
【００３１】このために、種々の用量の分析するEPO試
料およびEPO標準（EPO WHO標準に標準化）が、それぞれ
8匹のマウスに非経口的に投与された。その後マウスは
定められた一定の条件下に置かれた。EPO投与の4日後に
マウスrから血液が採取され、網状赤血球がアクリジン
オレンジで染色された。赤血球30,000あたりの網状赤血
球数は、フローサイトメーターでマイクロ蛍光定量法に
よって赤色蛍光ヒストグラムを分析して決定した。
【００３２】生物活性は、リンダ（Linder,「Planen un
d Auswerten von Versuchen」, 第3版、1969，Birkenha
user Verlag, Basel）の記述した平行直線を用いた濃度
のペアでの決定方法にしたがって、種々の用量の試料と
標準の網状赤血球数から計算した。
【００３３】実施例2 シアル酸残基含有量の決定 シアル酸含有量は、アルスロバクター・ウレアファシエ
ンス（Arthrobacter ureafaciens）（A. ureaf., Boehr
inger Mannheim）のノイラミニダーゼによってシアル酸
を酵素切断した後、HPAEC-PAD（パルス電流検出つきの
高pH陰イオン交換クロマトグラフィー）およびDionexシ
ステムを用いたクロマトグラフィーで決定した。
【００３４】種々のCHOおよびヒト細胞株（例、HeLa S
3）由来のEPO 22μgを含む各調製物を、5 mM リン酸ナ
トリウム緩衝液（pH 7.2）中でEPO濃度が0.2 mg/mlにな
るように調整した。各調製物の半分を用いて、RP-HPLC
によってEPOの正確な量を決定した。A. ureaf由来のノ
イラミニダーゼ5 mM Uを試料の残り半分に添加し、37℃
で一晩（約18時間）インキュベートした。その後、消化
反応液を半分に分割し、H2Oで20倍に希釈し500μlとし
て、その内の50μl（約27 pmolのEPOに対応）をDionex
システムに添加した。この際、以下のクロマトグラフィ
ーパラメーターが使用された。
【００３５】添加した試料中のシアル酸の量は、同様に
分析したシアル酸標準（BoehringerMannheim）の値から
得た検量線を用いて決定した。シアル酸含有量（molシ
アル酸/mol EPO）は、シアル酸量の決定結果（Dionexシ
ステム）およびRP-HPLCで決定した使用したEPO量から計
算された。
【００３６】実施例3 バイアンテナ、トリアンテナ、
およびテトラアンテナの炭水化物構造の比率の決定 N-結合炭水化物構造は、Dionexシステム上でHPAEC-PAD
によりクロマトグラフィー分析した。CHOおよびヒト細
胞株（例えば、HeLa S3）由来のEPO試料のアシアロオリ
ゴ糖は、N-グリコシダーゼF（Boehringer Mannheim）お
よびA. ureaf.由来のノイラミニダーゼ（Boehringer Ma
nnheim）を用いた酵素切断によって単離した。
【００３７】反応液あたり約30μgのEPOをMicroCon超遠
心ユニット（Amicon、排除サイズ10kD）を用いて脱塩
し、10 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）によって
0.3 mg/mlの濃度に調整した。その後、1 UのN-グリコシ
ダーゼFおよび10 mUのノイラミニダーゼを各反応液に添
加し、37℃で一晩（約18時間）インキュベートした。切
断したオリゴ糖からEPOポリペプチド部分を分離するた
めに、インキュベーション後に反応液をUltrafree遠心
ユニット（Millipore、排除サイズ10 kD）を用いて遠心
し、Ultrafreeユニットを20μlのH2Oで2度洗った。濾過
液中のオリゴ糖にH2Oを加えて150μlにし、その内の100
μlをDionexシステムで分析した。この際、以下のクロ
マトグラフィーパラメーターが使用された。
【００３８】複合型N-糖のクロマトグラムのピークは、
標準オリゴ糖（Oxford Glyco Systems）により同定し、
EPOのオリゴ糖を酵素エンド-β-ガラクトシダーゼまた
はフコシダーゼにより酵素消化した後、Dionexシステム
で分析することによって確認した。バイアンテナ、トリ
アンテナ、およびテトラアンテナ構造の割合は、ピーク
面積全体（バイアンテナ、トリアンテナ、およびテトラ
アンテナ構造のピーク面積の合計）に対する対応するN-
糖構造のピーク面積を用いて計算した。
【００３９】実施例4 N-アセチルラクトサミンユニッ
トの含有量と付加的N-アセチルラクトサミンユニット
（リピート）の平均含有量の決定 EPOのN-結合型炭水化物構造（例えばコアの炭水化物構
造）におけるN-アセチルラクトサミンユニットの総数
は、実施例3の実験のクロマトグラムのピーク面積から
計算された。
【００４０】1つの炭水化物鎖あたりのN-アセチルラク
トサミンユニットの平均含有量の数(n)は、以下のよう
にして計算された。 式中、 % (bi) = 炭水化物鎖の総数に対するバイアンテナ構造
の割合 %(tri) = 付加的N-アセチルラクトサミンユニットのな
いトリアンテナ構造の割合 %(tetra) = 付加的N-アセチルラクトサミンユニットの
ないテトラアンテナ構造の割合 %(tri + 1r) = 1つの付加的N-アセチルラクトサミンユ
ニットを持つトリアンテナ構造の割合 %(tetra + 1r) = 1つの付加的N-アセチルラクトサミン
ユニットを持つテトラアンテナ構造の割合 %(tri + 2r) = 2つの付加的N-アセチルラクトサミンユ
ニットを持つトリアンテナ構造の割合 %(tetra + 2r) = 2つの付加的N-アセチルラクトサミン
ユニットを持つテトラアンテナ構造の割合
【００４１】さらなる重要なパラメーターは、いわゆる
リピートとしてコアの炭水化物鎖に結合できるN-アセチ
ルラクトサミンユニットの量である。リピートの含有量
は、炭水化物構造の合計（bi + tri + tetra = 100%）
に対する繰り返しを含む炭水化物構造の割合として記述
できる。このリピートの割合は、CHO細胞およびヒト細
胞由来のEPO試料において異なる可能性がある。
【００４２】実施例5 要求にしたがった調節されたフ
ィーディングのEPOの生物活性への影響 要求に応じたフィーディングを行うリピートバッチプロ
セス（リピート・フェッド・バッチ）によって36.5℃で
培養を行った。この無血清・低蛋白質培地は撹拌発酵槽
（総作業容積10L）に入れ、接種培養液で1度接種した。
接種後の細胞密度は、3±1 x 105生細胞/mlの範囲だっ
た。
【００４３】144±24時間の増殖期の後、培養液の一部
を回収した。残りの培養液は発酵槽に残し、次の増殖期
の接種材料とした。そのために、発酵槽を再び新しい培
地で作業容積まで充填した。
【００４４】EPOを含む培養上清は、発酵培養液の遠心
によって得られた。
【００４５】増殖期の間、栄養溶液は連続的に培養液に
添加された。そのために、栄養溶液を入れた保存容器が
発酵槽に取り付けられた。栄養溶液には、アミノ酸、ビ
タミン、インスリン、微量元素、塩、グルタミン、およ
び炭水化物が含まれていた。2つの発酵は、以下のよう
に行われた。
【００４６】発酵Aでは、栄養溶液には糖としてD-(+)-
グルコースが含まれており、発酵Bでは、糖はD-(+)-グ
ルコース、D-(+)-ガラクトースおよびD-(+)-マンノース
が含まれていた。発酵Bでは、グルタミンと糖の質量比
は、1:2.2:3.6:6だった。栄養溶液中の各糖の濃度は、
7.2〜18 g/lの間だった。
【００４７】発酵Bにおける培養液中のグルタミン濃度
は定時的に分析され、消費量が計算された。栄養溶液の
瞬間流量は、細胞の栄養要求量と一致させた。発酵Aで
は、グルタミン濃度は調節変数として使用されなかっ
た。発酵Bの栄養溶液には、D-(+)-グルコース、D-(+)-
ガラクトースおよびD-(+)-マンノースが2:3:5の質量比
で含まれていた。発酵槽のすべての糖の濃度は、対応す
るフィーディングによって培養期間を通して2〜6 g/lの
範囲に維持された。
【００４８】細胞密度は、回収時には20 x 105細胞/ml
以上、典型的には30±10 x 105細胞/mlにまで増殖中に
変化した。
【００４９】回収した培養液中のヒトエリスロポエチン
の濃度は、たとえばELISAによって決定した。この蛋白
質のアイソフォームの分布比率は、たとえばキャピラリ
ーゾーン電気泳動法(CZE)による分離によって決定し
た。
【００５０】表1は、グルコースを含む栄養溶液をフィ
ーディングした発酵Aと、グルコース、マンノース、お
よびガラクトースを含む栄養溶液を要求に応じて調節し
てフィーディングした発酵Bとの、EPOアイソフォームの
分布を比較したものである。発酵BにおけるEPOアイソフ
ォームの含有量は、発酵Aの対応するアイソフォームに
対する割合として計算した。後者は、各々100％に標準
化した。このデータは、発酵Aと比較して、発酵中にか
なり高い割合で、グリコシル化レベルの高い望ましいEP
Oアイソフォーム2〜4が得られることを示す。
【００５１】
【表１】 n.d. = 検出限界以下なので測定不可能
【００５２】フィーディングによって得られたアイソフ
ォームパターンは、栄養溶液を要求に応じて調節してフ
ィーディングした発酵からの連続する4回の回収で再現
可能であった。
【００５３】実施例6 培養温度の変化のEPOの生物活性
への影響 手順は、温度が36.5℃の代わりに35.0℃で、発酵が1000
lで行われたという以外は、実施例5（発酵B）において
要求に応じた調節されたフィーディングを行うフェッド
・バッチ分割プロセスで説明されている。
【００５４】表2は、それぞれに栄養溶液を調節してフ
ィーディングした36.5℃の発酵Cと35.0℃の発酵DとのEP
Oアイソフォームの分布を比較したものである。発酵Dの
EPOアイソフォームの含有量は、発酵Cの対応するアイソ
フォームに対する割合として計算した。後者は、各々10
0％に標準化した。このデータは、温度を低下させるこ
とにより、酸性のEPOアイソフォーム2〜4をかなり増加
できることを示す。
【００５５】
【表２】 n.d. = 検出限界以下なので測定不可能
【００５６】実施例7 培地の炭水化物組成の変化のEPO
生物活性への影響 以下に説明する過程は、フィーディング培地中の炭水化
物供給を変化させることにより、ヒトエリスロポエチン
の性質を変化させることが可能であることを示す。
【００５７】上記の過程において、用いる培地の組成が
異なる２つの変法を示す（以下に示す発酵Eおよび発酵
F）。
【００５８】いずれの調製物でも、培地の調製は改変eR
DF培地に基づいている。血清は使用されなかったが、組
換えインスリン（唯一の蛋白質添加物）、および無血清
培地または無蛋白質培地で通常使用される他の添加物
（例えば、亜セレン酸塩、プトレッシン、ハイドロコル
チゾン、硫酸鉄）が使用された。
【００５９】フィーディング栄養溶液も、改変eRDF培地
に基づくが、KCl、Na2HPO4、およびNaClの塩を含まな
い。
【００６０】発酵EとFとの差は、フィーディング培地に
種々の単糖類を添加する点が主に異なる。
【００６１】発酵E：発酵Eには、通常の糖D-(+)-グルコ
ースが使用された。最初の濃度は3 g/lだった。グルコ
ースを含む栄養溶液を適切にフィーディングすることに
より、培養液中のグルコース濃度は培養期間全体に渡っ
て3±0.5 g/lに維持された。
【００６２】培養期間は通常100±20時間だった。回収
時のEPOの濃度は、通常40±10 mg/lだった。
【００６３】発酵F：D-(+)-グルコースに加えて、糖D-
(+)-ガラクトースおよびD-(+)-マンノースも、発酵Fの
フィーディング培地におよそ1:2:3の質量比で添加され
た。培養中は、適切なフィーディングによりすべての糖
の濃度は0.25 g/lと3.5 g/lの間に維持された。
【００６４】培養期間は通常100±20時間だった。回収
時のEPOの濃度は、通常40±10 mg/lだった。
【００６５】培養上清からエリスロポエチンが精製され
た。精製手順は、糖蛋白質の関連するアイソフォームの
分布が影響を受けないようにデザインした。
【００６６】精製エリスロポエチンのアイソフォームの
分布は、前記のようにして決定された。ヒトエリスロポ
エチンのアイソフォームの炭水化物構造および回収した
培養上清におけるアイソフォームの分布は、発酵Eと発
酵Fで異なっていた。発酵Fのほうが、発酵Eに比べてア
イソフォーム2、3、および4の比率がかなり高かった。
この差は、単糖類のマンノースとガラクトースをフィー
ディングしたことによる（図1参照）。
【００６７】正常マウステスト（実施例1）によって決
定された生物活性は、EPOアイソフォームの分布および
炭水化物構造とに相関している（図2）。培養上清Eおよ
びFから得られたEPO試料の炭水化物構造は、CZEおよびH
PAEC分析で解析された。
【００６８】2つのEPO試料についてアンテナ構造（バイ
アンテナ構造、トリアンテナ構造、およびテトラアンテ
ナ構造の含有量）、N-アセチルラクトサミンユニットの
含有量（LE）、シアル酸含有量（SA）ならびにLEおよび
SAの積が表3に示されている。
【００６９】
【表３】
【００７０】
【図面の簡単な説明】
【図１】 個々のEPOアイソフォームの相対比率が、培
地に添加する炭水化物に依存することを示す。
【図２】 EPO試料の生物活性が、培地に添加する炭水
化物に依存することを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エベルハルツ ホルスト ドイツ国 ゴーティンゲン フェリックス −クライン−ストラッセ ７ (72)発明者 ウォーレリウス クラウス ドイツ国 ペンツベルグ クルフールスト −マックス−シエドルング 19 Ｆターム(参考） 4B064 AG18 CA10 CC04 CC06 CD09 CD13 CD20

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 真核細胞が適当な培地で培養され、所望
    のポリペプチドが細胞または/および培養上清から単離
    される、真核細胞からのグリコシル化ポリペプチドの単
    離方法であって、培養培地に少なくとも2つの炭水化物
    の混合物が添加される方法。
  2. 【請求項2】 グルコース、マンノース、または/および
    ガラクトースを含む炭水化物混合物が使用される、請求
    項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 炭水化物が細胞のそれぞれの要求に応じ
    て添加される請求項1または2記載の方法。
  4. 【請求項4】 真核細胞が適当な培地で培養され、所望
    のポリペプチドが細胞または/および培養上清から単離
    される、真核細胞からのグリコシル化ポリペプチドの単
    離方法であって、培養中に、細胞のそれぞれの要求に応
    じて、少なくとも1つの必須アミノ酸または/および少な
    くとも1つの炭水化物を含む栄養素の調節された添加が
    行われる方法。
  5. 【請求項5】 少なくとも1つの必須アミノ酸および少な
    くとも1つの炭水化物の需要に応じた調節された添加が
    行われる、請求項4記載の方法。
  6. 【請求項6】 栄養素および代謝産物から選択されるパ
    ラメーターにおける濃度の測定によって、細胞の要求が
    決定される、請求項4または5記載の方法。
  7. 【請求項7】 調節される変数としてグルタミン濃度が
    決定される、請求項6記載の方法。
  8. 【請求項8】 栄養素が非必須アミノ酸、ビタミン、微
    量元素、塩または/およびたとえばインスリンのような
    増殖因子をさらに含む、請求項4から7のいずれか一項記
    載の方法。
  9. 【請求項9】 栄養素が少なくとも2つの炭水化物の混合
    物を含む、請求項4から8のいずれか一項記載の方法。
  10. 【請求項10】 グリコシル化ポリペプチドがEPOであ
    る、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
  11. 【請求項11】 培養が≦35.5℃の温度で行われる、前記
    請求項のいずれか一項記載の方法。
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