JPS63269987A - ヒトインターフェロンベータを生産する動物細胞の作成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の概要） 動物宿主細胞にてＩＦＮベータを生産する方法を開示す
る。比較的高収量で細胞分泌物から単離されたＩＦＮベ
ータは約３．８×１０８１２／Ｉｔｇ蛋白質の比活性を
有する。生物学的および免疫学的試験により、この単離
されたＩＦ・Ｎベータは天然ＩＦＮベータとほぼ完全に
同一であることが示された。開示する方法で生産された
ＩＦＮベータは９５％まで配糖化されており、この配糖
化は構造および配列の点で天然ＩＦＮベータと実質的に
一致し、なおその同一性が失われることはない〔従来の
技術〕 インターフェロンは有効な抗ウイルスポリペプチドの一
群を構成し、これは、外来誘導物質（例えばウィルス、
核酸、特定の抗原）と接触した後の誘発細胞を培養する
ことにより生成する。小群の１つがベータインターフェ
ロン（ＩＦＮベータ）を構成するが、これは主として繊
維芽ｌｌｌ胞を培養することにより生成する（バーベル
（Ｈａｖｅｌｌ）ら（１９７２）およびステワード（Ｓ
ｔｅｗａｒｔ）　Ｉｆ　（１９７９））　。従来、２種
のベータインターフェロンが知られていたが、それぞれ
の免疫学的特徴は互いに類似し、生成し得る単離された
モノクロナール、中和抗体は両方のインターフェロンを
共に不活性化する（チルベルスタイン（Ｚｉ　１ｂｅｒ
ｓｔｅｉｎ）ら（１９８５））。しかしながら、ＲＮ△
ゲルブｌコツトハイブリダイゼーション実験においてＩ
ＦＮベータ１　　ｃＯＮＡプローブに対しＩＦＮベータ
２ｍＲＮＡがクロスハイブリダ。　イズしたことは皆無
であり、その逆も皆無である（セーガル（ｓｅｈｇａ　
＋　）ら（１９８０）　）。

以後ＩＦＮベータというヒト２倍体繊維芽細胞（ＦＳ−
４）に由来するＩＦＮベータ１は、かなり長い間臨床的
応用に用いられた。

これは１９８３年に連邦厚生局により重篤で生命を脅か
サウイルス感染の処置に対し調製が許可された。その有
効性の理由および欠点に起因し、広範な他の有効なウィ
ルス抑制剤が多くの場合選択手段として示された。

しかしながら、通常の形質転換されていない２倍体繊維
芽細胞を基礎として生産を行うと、貴重で高価な原料を
使用するばかりでなくコストのかかる細胞基材の使用が
必要となると共に手順遂行の合理化が狭い範囲に止まり
、臨床的に使用する薬剤の高価格を苔しく限定する。

このような状況によりずっと早くから代替調製手段の探
索が行われ、一般に最新の遺伝子工学的手法の開発の重
要な刺激となった。

異種宿主細胞系内にヒトＩＦＮベータの遺伝子を導入す
ることは、古典的な好適手段に対する１つの真の代替手
段を示唆し、生理学的バリヤを越えた狭い境界領域へ至
る成功への道程を照らすものである。

宿主細胞系、原核生物、下等おにび高等真核生物につき
処理に対し原則的に存在する３群では、技術水準に基け
ば、細菌の宿主系である大腸菌（イー・コリ）は一般に
低い生産コストの点で、−ａ的に利点を与え得る。

・期待は高いにも拘らず、技術的観点から見ればこれら
の生産系においてはこの方法論による多量の原体ＩＦＮ
ベータ生産には成功していないに止まる（タニグチ（Ｔ
ａｎｉｇｕｃｈｉ）ら（１９８０）およびゴーデル（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ）（１９８０）　）　。

この困難性の主要な原因は、宿主細胞内で変性型の原体
材料が合胞体として存在する点にある。実際、増殖する
宿主細胞の一部から有効に分離することは可能であるが
、種々の点く低い溶解性、処置による誤ったイオウ部分
結合形成）に問題があり、臨床的に利用可能な材料の収
率は極めて低い。

有効性に部分的欠点があるのは、変性または正しく構成
されない内部イオウ結合部分によると推定され（ローン
（Ｌａｗｎ）ら（１９８１））、天然に認められる形態
と対比すると生産物が配糖化されていないことに起因す
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

このような背景の結果、真核生物の発現系の開発を現実
のものとし、これにより異種遺伝子産物の複合構造が正
確な「プロセシング」を経て標準的に広く認められた形
態として生産されることを可能にする必要性が増大する
。

現在、この技術の系は一連の著者により白熱して著述さ
れているところである（レエス（Ｒｅｙｅｓ）ら（１９
８２）、ミトラニーロゼンバウム（Ｈｉｔｒａｎｉ−Ｒ
ｏｓｅｎｂａｕｍ）ら（１９８３）、スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）ら（１９８３）、７１−ミック（ＨＣＣＯｒｍｉＣ
ｋ）ら（１９８４）、チェルナヨフスキイ（Ｃｈｅｒｎ
ａｊｏｖｓｋｙ）ら（１９８４）、フクナガ（Ｆｕｋｕ
ｎａｃ＋ａ）ら（１９８４）、パージ（Ｐａｇｅ）ら（
１９８５））。

〔課題を解決するための手段） 構成原理 以下に遺伝子工学的技術を応用した新）ｌ：ｌな細胞ラ
インＢＩＣの構成を記載する。従来技術と比較すると、
実質的に天然物質と同定された未変性産物を大量にかつ
実質的に低コストで生産することができる。

宿主細胞ライン 宿主細胞として、ウルラウブ（ＵｒｌａＬＩｂＪら（１
９８０）に記載された完全ＣＨ○ライン（チ１アイニー
ズハムスタ卵）のＤ　ＨＦ　Ｒ−変異株を選ぶ。

ベクタ インターフェロン遺伝子 出発材料としてプラスミドベクタｐＢＲ１３を用い、こ
れにゲノミツクＩＦＮベータ遺伝子を含有せしめる。こ
のゲノミツクＤＮＡの特定の断片をマニアナイス （Ｈａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）に記載された方法
により切断調製し、既に公知のベクタ（ｐｓＶｄ２−３
）と組換える。

プロモータ 一般に重要な点は、発現を制御する適切なプロモータを
選択することである。誘導的プロモータを配置する際の
可能性（ハウザ（ｌｌａｕｓｅｒ）ら（１９８２）およ
びプリンスタ（ＢｒｉｎＳｔＯｒ）ら（１９８２）に対
し、モスタ’７　（Ｈｏｓｔｈａｒ）ら（１９８５）に
記載されたＳＶ４０の強力な構成的プロモータには利点
があり、これはさらにエンハンサ領域を含む。可能性と
並んで誘導依存性の生産方法を用いる特に不利な経験（
ネガティブフィードバック、細胞毒性）が一方であり、
使方では完全な発酵方法でも細胞培養の付着は避けられ
ず、このような結論となる。詳細に記載した構成の下で
、これを一般に ｐＳＶＩＦＮＡｓｎと命名する。

選択 選択および増幅を遂行するに際し、高発現細胞を用いＤ
ＨＦＲｉ伝子を別に第２のプラスミドｐＡｄＤ２６３Ｖ
（Ａ）−３に導入する。

独特なアデノプロモータとＳＶ４０プロモータのエンハ
ンサ領域（Ｓ、○、）との相互作用を介してＩＦＮベー
タ発現の選択が最終的に可能となる。予期した通り前記
した構成で、共感染ＤＮＡが近接して組込まれる。

前記発現ベクタ、制御配列並びに構造遺伝子を含み細胞
ラインの欠損を回復する選択プラスミドをリン酸カルシ
ウム沈殿法により実験的に決定した所定の至適混合比で
相互感染させる。

増幅、クローン化並びにセルバンク 感染付着したものからインターフェロンを発現するクロ
ーンを、カウフマン（ＫａｕｆｍａｎＪら（１９８５）
により最初に記載された方法をメソトレザツｔ−（Ｈｅ
ｔｈｏｔｒｅｘａｔ）　’７度を越える程度で高生産コ
ロニの二段選別を行わずに用いて増幅させ、連結クロー
ン化すると共に一連の過程において十分な細胞数を確保
し、上記の方法により液体窒素中のスタムセルバンクと
して保存する。

結果 原体生産 記載する方法により得られる実験記号 Ｂ　Ｉ　Ｃ８６２２（ＢＩＣ，ＰＩＩＬＳ受領Ｎｏ、　
８７０４０３０１　）の細胞ラインを操作の後に分離し
、この際、マルチトレイ（ＮＩＩＮＣ）中の定常培養で
１〜５％ＮＣ８ｂＺＷ、Ｆｅ２を補填した通常の細胞培
養培地（イーレの塩を用いて改変したイーグルのＭＥＭ
）を用いる。マイクロ支持台上のフェルメンタ（シドデ
ックス■、ファルマシア）で、１リツトルの培養物当り
１日につぎ０．４〜１．６Ｘ１０９の国際単位のＩＦＮ
ベータが構成的に生産される。

捌し スルホプロピル陽イオン交換体への吸着およびそれに続
く抗ＩＦＮベータセファ０−ス（ｔルテック、スロー）
への免疫吸着の結果濃縮が起こる。これらの免疫吸着マ
トリックスは未変性繊維芽細胞インターフェロンに対す
るモノクロナール抗体を含有し、製造元による免疫結合
反応の至適条件下における吸着および脱着は合成分子の
同一性により一方向であり、同等の抗体を擁して行うＥ
ＬＩＳＡを併用して定量化し得る。さらに洗浄工程を行
いＦＰＬＧ−ゲルろ過をもって終了すれば低分子ｍおよ
び高分子量の不純物が除去される。

特徴 生物学的効果： ＦＳ−４細胞由来の天然型ＩＦＮベータの検出を行うバ
イオアッセイは、抗ウィルス活性を利用し、指示細胞（
ＦＳ−４）を用いムリネム・エンセファロミオ力ルディ
ティス・ウィルス（ＦＨＣＶ）に対する細胞病原性効果
の阻害を定量化するもので、バーベル（Ｈａｖｅｌｌ）
ら（１９７２）の改変であり、ＢＩＣｌ［Ｉ胞由来のＩ
ＦＮベータを検定するに際し何ら制限なく使用し得る。

この試験とローリ（ｔｏｗｒｙ）ら（１９５１）の蛋白
質定量法とを用いて測定した比活性は、ＦＳ−４インタ
ーフエロンについての測定データと正確性の制限におい
て２〜３Ｘ１０８１Ｅをもって対応する。

免疫学的特徴： ＢＩＣ由来のＩＦＮベータを濃縮する免疫アフイニティ
クロマトグラフと並んで、新しく開発されたＥＬＩＳＡ
および免疫プロット技術を補助的に用いて天然型おＪ：
び組換えＩＦＮベータの分子的特性の広範な相関の検定
を行う。抗体を用いるに際し、マウスハイブリドーマ（
）ＩＡＫ　ＢＯ−２，セルデック）由来のモノクローナ
ルおよびヤギのボリク［１−ナルＩＣＩＧ（レガ・イン
ステイテユート、ロイベン）が肝要である。

蛋白質化学的特徴ニ アミノ酸分析およびＮ末端の１５のアミノ酸配列決定に
より免疫学的手法で測定したデータを補完する。これに
よりフナイト（にｎｉｇｈｔ）ら（１９８０）の天然型
と組換えＩＦＮベータとの間には全く相違はないことが
示される。組換えＩＦＮベータについて炭水化物部分を
調べることにより、天然型ＩＦＮベータが炭水化物の不
均質性を示すのに対し、極めて均質に配糖化されている
ことが示される。

（実施例） 材料： イー・コリＫ　１２　　Ｄ　ｌ−１１（ＤＳＨ４０７９
）ＣＨＯＤＵＫ　ＤｔｌＦＲ−ＢＦ（ＰＨＬＳ　Ｎｏ、
８７０４１４０１）これらのセルラインは、ラインＣＩ
−１０−Ｋ　１　（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）よりジヒドロ
葉酸レダクターゼ非存在下で変異および選抜を経て誘導
されたものである（ウルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら（１
９８０）　）。

ｐＢ’Ｒ１３（ＤＳ）４４０７４）　　：このプラスミ
ドはボリバ（Ｂｏｌ　１ｖａｒ）ら（１９７７）のクロ
ーン化プラスミドｐＢＲ３２５の誘導体である点で肝要
であり、この唯一のＥＣＯＲＩ切断部位に１．８３ｋｂ
の長さのＤＮＡ断片が挿入される。この断片はコスミド
ｐｃｏｓｌＦＮベータ中に含まれ（グロス（Ｇｒｏｓｓ
）ら、１９８１）　、少なくともヒト胎盤ＤＮＡのコス
ミドバンクの一部である。

Ｔ；）　Ｓ　Ｖ　ｄ　２−３　（ＤＳＨ４０７５Ｐ）　
：このプラスミドはクローン化ベクタｐＡＴ１５３の誘
導体であり、真核ＤＮΔウィルスＳＶ４０由来の配列（
フイールス（Ｆｉｅｒｓ）ら（１９７８）　）を含む。

対応するベクタープラスミドを構成する特定のプラスミ
ドは、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼの発現につい
て構成したものである（スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎ
ｉ　）ら（１９８１））　、発現ベクタｐＳＶにつき用
いた改変は、ベルン・ディ・フイレブロエク博士によっ
てなされ、必須であるとしテフランセン（Ｆｒａｎｓｅ
ｎ）ら（１９８５）の研究において記載されたものであ
る。

ｐ　Ａ　ｄ　Ｄ　２６　Ｓ　Ｖ　（Ａ）　−３（ＤＳＨ
４０７６Ｐ）　：り１］−ン化ベクタｐＢＲ３２２由来
で１．１ｋｂの長さのＤＮＡ断片を欠損させて作成され
たプラスミド誘導体である（ルスギ（Ｌｕｓｋｙ）ら（
１９８１））　。さらに、このプラスミドにはマウス由
来のジヒドｌコ葉酸レダクターゼ遺伝子のｃＤＮＡのみ
ならず真核ＤＮＡウィルスアゾン２由来の翻訳開始シグ
ナル（アデノウィルス主要後期プロモータ）も含まれて
いる。ポリアデニル化シグナルおよびＳＶ４０由来の転
写開始部を伴う２０ｏｂｐの長さの断片である（カウフ
マン（にａｕｆｍａｎ）ら、１９８２ａ　）。

発現系 使用した発現系は矩形チャイニーズハムスタ（ＣＨＯ，
ＡＴＣＣＣＣＬ６１　ＣＨＯ−に１）の保存株細胞由来
のセルラインによるものであり、変異により酵素ジヒド
ロ葉酸脱水素酵素を欠損するものとして作成されたくウ
ルラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）ら（１９８０））。インキュ
ベートの過程でＤＮＡとこの細胞とによりリン酸カルシ
ウム沈澱が生成し得、極めて低頻度であるが細胞内への
ＤＮＡの導入が起こる（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（
１９７３）　）。細胞内で開裂したＤＮＡは大部分が連
結され、係属する細胞に組込まれる。そこでそれは、細
胞のＤＮＡ複製過程で、または細胞染色体における組換
え過程で特異的に増加または変化し、細胞遺伝子の組込
み天然型構成成分を包含する。特定の場合、ヒトＩＦＮ
ベータ遺伝子を発現させる発現プラスミドは、またＣｌ
−１０細胞内でマウス由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ
遺伝子ＣＤＮＡを発現させるプラスミドを併用して用い
るに際し開裂される。発現プラスミドの状態はいわゆる
サザンプロット技術を用いて検出する。細胞ＤＮＡを制
限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、電界中でアガロ
ースゲル電気泳動を行う。ＤＮＡ切断生成物は、その後
ナイロンフィルタ膜に結合させ、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブ
リダイゼーションにより放射能活性マーカプラスミドＤ
ＮＡを用いて検出する。

インターフェロンベータ遺伝子の単離 ＤＮＡ制限断片を単離する出発プラスミドとしてＩＦＮ
ベータ遺伝子と共にプラスミドｐＢＲ１３を用いた。こ
のプラスミドを調製するに際し、まずＦＳ４＄１ｆｔ芽
細胞由来のＩＦＮベータをコードするｍＲＮＡを ｃＤＮＡ中で交叉させ、ハイブリダイゼーションにより
相補的染色体ＤＮＡを用いてＩＦＮベータ遺伝子を含む
コスミドｐｃＯ８ＩＦＮベータを遺伝子バンク（ヒト胎
盤）から単離した。次にプラスミドｐＢＲ１３を制限エ
ンドヌクレアーゼＥＣ０ＲＩで切断するに際し、ｐＣｏ
ｓＩＦＮベータ由来のＩＦＮベータ遺伝子を用いて断片
を処理し、続いて広範な制限酵素旧ｎｄＩ［、ｂｚｗ、
　ＮｃＯＩ並びにＨｉｎｄｌＩ［を用いＩＦＮベータ遺
伝子を備える短いＤＮＡ小片を単離して得た。

発現プラスミドの構成 ヒトＩＦＮベータを発現させるプラスミドを構成するた
めｐＳＶｄ２−３と呼ばれる発現ベクタを用いた。この
ベクタの機能的構成部分がイー・コリ内での自動的ＤＮ
Ａ複製を保証するのみならず、イー・コリ細胞のアンピ
シリン培地での選択を可能にする（転移陰性プラスミド
ｐＡＴ１５３およびβ−ラクタマーゼ遺伝子の複製の開
始）。真核細胞を特定する機能についての構成部分はウ
ィルスＳＶ４０の初期遺伝子のプロモーターエンハンサ
領域から付加遺伝子の転写開始部まで存在し、さらにＳ
Ｖ４０ウィルスがポリＡ配列を転写ｍＲＮＡに付加する
ポリアデニル化シグナル部分は挿入遺伝子を欠落しこの
種のシグナル配列は存在すべきでない。翻訳開始のシグ
ナルとポリアデニル化配列との間にさらに合成的に生成
せしめた制限エンドヌクレアーゼ認識および切断配列を
存在させて発現すべきＤＮＡを挿入した。メクレアーゼ
Ｘｂａ工の切断部位をこのベクタ内にヒトＩＦＮベータ
ＤＮＡをクローン化すべく設けた。よってベクタをＸｂ
ａＩで切断する。次にプラスミドｐＢＲ１３からＩＦＮ
ベータ遺伝子を有するＥＣ０ＲＩ断片を、およびさらに
これからＩＦＮベータ遺伝子を有するｓｃｏ■−Ｈｌｎ
ｄＩ［［小断片を単離する。制限エンドヌクレアーゼを
用いる切断により得られた突出する一本鎖ＤＮＡ末端部
をヌクレオチド三リン酸およびイー・コリ由来のＤＮＡ
ポリメラーゼとインキュベートすることにより埋めた。

このように作成した断片のＤＮＡ平滑末端を次に制限エ
ンドヌクレアーゼＸｂａＩの認識配列を有する合成的に
￥［１したオリゴヌクレオチドと連結したヌクレアーゼ
ＸｂａＩとのインキュベートにより過剰のオリゴヌクレ
オチドを除去し、同時にベクタＤＮＡに相補的な突出す
る一本鎖部分を生成せしめた。ベクタＤＮＡとＩＦＮベ
ータＤＮＡとを酵素的に連結しイー・コリ細胞に導入し
た。ＩＦＮベータＤＮＡを有する細胞をＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリダイゼーションにより同定１）精製を行うべく
多量のプラスミドＤＮＡを調製した。種々の制限エンド
ヌクレアーゼを用いる切断によりこのプラスミドＤＮＡ
の特徴を調べ、さらなる実験に備えてプラスミドを選択
し、ｐＳ　Ｖ　　Ｉ　Ｆ　Ｎ　　Ｎ　ｃ　ｏ　（ＤＳ８
４０７７Ｐ）と命名したものが予定したものと一致した
。次いでこのプラスミドｐｓｖ　　ＩＦＮ　　Ｎｃｏを
酵素ｘｂａ工で部分的に切断し、切断断片をゲル電気泳
動により分離した。線状プラスミドに対応するバンドを
、蛍光色素エチジウムブロミドを用いる染色の後にＵＶ
ライトの下で目視可能にして切り出しＤＮＡを単離した
。単離したＤＮＡをヌクレアーゼＡＳｕ■と共にインキ
ュベートした後酵素的に閉環した。このような手順によ
り、もとの発現プラスミドｐｓｖ　　ＩＦＮ　　Ｎｃｏ
からＸｂａＩ−ＡＳＬＪＩ［断片が欠落したものが結果
的に得られた。このように調製した発現プラスミドをｐ
ＳＶ　　ＩＦＮ　　Ａｓｎ（ＤＳ８４０７８Ｐ）と命名
し、ジヒドロＷ＝Ｍレダクターゼを欠損するＣ　Ｉ−（
○セルラインの細胞に挿入感染させるべく、これにこの
発現プラスミドρＳＶ　　ＩＦＮＡＳＩＪを用いて感染
さぜそのＤＮＡを細胞ゲノムに組込ませ、ｍＲＮＡ形成
を図るが、これはＳＶ４０の特定配列由来の６０ヌクレ
オチド長い断片であり、このように連結してほぼ標準的
なＩＦＮベータｍＲＮＡを実現した。

このｍＲＮＡを細胞の蛋白質合成装置でＩＦＮベータ蛋
白質に翻訳する。そのアミノ末端領域およびアミノ酸組
成はヒト繊維芽細胞由来の天然型ＩＦＮベータ蛋白質と
一致しイー・コリが生産した蛋白質とは具なり配糖化さ
れている。

ＤＮＡ種の挿入により、また発現プラスミドｐｓｖ　　
ＩＦＮ　　Ａｓｕ構成手段によッテ、ｍＲＮＡの一次構
造が転化するが、これは真核生物細胞内でこのプラスミ
ドが染色体に組込まれて形成される。相対的切断部位の
詳細な表示と共に発現プラスミドの構造を第２図に示す
。遺伝子コードによりヌクレオチド配列を翻訳したアミ
ノ酸配列は、ヒト細胞由来の標準ＩＦＮベータ（タベル
ニル（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ）ら（１９８４））の−次構
造を与える。

感染 発現ベクタＤＮＡのＣＨ○セルラインへの導入は、主と
して、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（１９γ３）により
記載されビグラ（す１ｇ１ｅｒ）（１９７９）により改
変された方法で行った。原則的にこの方法で細胞ＤＮＡ
を処理し、ＣａＰＯ４を用いる手法により共沈殿を生成
させた。その後ファゴサイトシスによりこのＤＮＡが導
入され大部分が共に未解明の鍬構で細胞のゲノムに組込
まれると推定される。このプロセスはＤＮＡの真核細胞
に対する感染と呼ばれるものである。酵素ジヒドロ葉酸
レダクターゼを発現させるベクタを特定の発現ベクタと
共に通常に沈澱させ感染過程の後にジヒドロ葉酸欠損Ｃ
ＨＯ細胞を利用することによりこの種の細胞を選択する
ことができるが、これはＤＮＡが導入され染色体に組込
まれているものである。これは、所定の細胞培養培地で
細胞を培養することにより生起し、核酸合成酵素形成を
低下させる。

増幅および選択 このように形質転換し選択した細胞の培養分泌物につい
てベータインターフェロン活性を調べた。この試験で陽
性のクローンに所定の処理を施し、細胞内で導入したＤ
ＮＡが選択的に増加すると共にインターフェロン遺伝子
のコピー数増加によりベータインターフェロン生産が増
加するとの結果を得た。これは基本的にはジーンドーセ
ジ効果の後に可能である。この目的のために適用する方
法は、酵素阻害剤（＋）アメトブテリンを含有する培養
培地でベータインターフェロンを生産する細胞の選択を
実現する。この阻害剤により、ＣＨＯＩ胞内に感染によ
って遺伝子を導入した酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ濃
度に依存して保持される。この阻害によりこの種の細胞
は優勢な増殖を示し、これにより対応するＤＮＡの増加
によるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子のジーンドーセ
ジが起こる。ここでこの種のＤＮＡ複製過程では、最も
大きな断片が組込まれ細胞の染色体中で最も近接した感
染ＤＮＡ種が組込まれるが、これと同時にベータインタ
ーフェロン遺伝子のジーンドーセジが起こる。培養培地
中の（＋）アメトブテリン濃度の段階的増加および中間
選択並びに拡大過程により一定の細胞混合物が生成し、
これにより培養培地中に大量のベータインタ−フエロン
が与えられる。この混合物から培養器内での細胞の希釈
接種および単離により金属製シリンダ状の正常な細胞用
ラインを用いて細胞コロニを生産し、これによっても同
様に培養培地中に大量のベータインターフェロンが与え
られる。

これによりｒＢＩｃＪ細胞と命名したクローンとして適
切な方針に適合する生産細胞バンク（製造用細胞バンク
）を確立し、この細胞の一部を［公共健康研究サービス
、動物細胞培養ヨーロッパコレクション（Ｐｕｂｌｉｃ
Ｈｅａｌｔｈ　ＬａｂＯｒａｔＯｒＶ　５ｅｒＶｉＣｅ
、ＥＵｒＯ１］ｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ
ｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ（ＰＨＬＣ）
）　Ｊに受領Ｎｏ、８７０４０３０１をもって寄託した
。

濃縮 製造用細胞バンクに由来するＢＩＧの合一定常培養から
、２４時間周期で１５１の培養分泌物を平均インターフ
ェロン含量で２２５０００Ｉ　Ｅ　／　ｔｎｅ蓄積する
ものとして繰り返し回収し、陽イオン交換（スルホプロ
ピル）を併用して行った。１７５ｄの溶液に３Ｘ１０９
　ＩＥが含有され、８３％の収率が得られた。続くＢＥ
ＴＡ　　ＲＥＳＯＬＵＴＥ（Ｒ）（セルチック）に対す
る免疫吸着により溶出容積１１２−が得られ、２．２Ｘ
　１０９Ｉ　Ｅ（７）ナオ７２％のインターフェロンが
比活性３．８×１０日　■Ｅ／■蛋白質を有するものと
して含有されていた。最後のゲルろ過により総収量４８
％を得た。

沃逝 生物学的および免疫学的特徴 組換えＢＩＣベータＩＦＮおよび天然型ＦＳ４ベータＩ
ＦＮの高度精製調製物を抗ウイルスバイオアッセイにお
けるインターフェロン含量につき調べた。これに並行し
てローリによる蛋白質足金を行った。ミリグラム蛋白質
当り天然型材料について比活性的２．７〜３Ｘ１０Ｂ国
際単位（ＩＥ）および組換え材料について活性３〜４Ｘ
１０８１Ｅ／■が得られた。この値は、天然型インター
フェロンについての文献公知データと一致する。バイオ
アッセイは比較的不正確であるため比活性の正確な測定
は現在の技術の段階では困難である。

出発材料並びに精製および高度精製画分を用い酵素共役
免疫試験（ＥＬＩＳＡ）による抗ウイルスバイオアッセ
イを行った。

この試験に際しミクロタイタブレートのプラスチック表
面をヤギのポリクローナル抗ＩＦＮベータ抗体で処理し
た。続いて測定するサンプルの希釈を行った。ベータＩ
ＦＮは次いで固定化抗体に結合する。次の工程でこの複
合体をマウスのモノクロナール抗ＩＦＮベータ抗体の手
法を用いて反応させる。さらに生成する総合複合体を西
洋ワサビペルオキシダーゼとあらかじめ共役させた抗マ
ウスＩｙＧ抗体ど共にインキュベートする。未結合抗体
を除去した後、発色反応により結合したペルオキシダー
ゼの聞およびこれにより結合したベータＩＦＮの足を測
定する。

この試験によりＦＳ４繊維芽細胞より得ら−れた天然型
ベータＩＦＮを評価した。これにより既知インターフェ
ロン含ωの希釈系列サンプルを国際ベータＩＦＮ標準品
（ＮＩＨ，Ｇ−０２３−９０２−５２７）の一部と共に
調べた。バイオアッセイとＥＬＩＳＡとの間には強い相
関が認められた。

ＢＩＧ細胞の培養分泌物から得られ、濃縮されざらに高
度に濃縮されたＩＦＮ調製物についてのＥＬＩＳＡでの
値は、並行して行った抗ウイルスバイオアッセイのもの
と同量とてして対応しつつ測定された。標準化するため
に全ての場合につき国際標準品または検覆した調製物の
一部を用いた。これにより天然型および組換えベータＩ
ＦＮの間の ＥＬＩＳＡに相関する抗原特性が同一であることも示し
得る。

配列／アミノ酸組成 前期した方法によって生産１ノ′ＶＪ製した１「Ｎベー
タを用いそのアミンＭＨＩ成およびそのアミン末端配列
について解析した。

１５番目までのアミノ酸の部分配列をエドマン分解によ
り自動気相配列決定装置（エフニー・アブリード・ビオ
システム、タイプ４７０Ａ）を用いて行った。これによ
り結果的に得られるフェニルヒダントイン誘導体をＰＴ
Ｈ−０１８−マトリックス上で分離した後に検出する。

結果は、ローン（Ｌａｗｎ）ら（１９８１）、オーツ（
ＯｈｎＯ）ら（１９８１）並びにプリンク（Ｄｅｒｙｎ
ｃｋ）ら（１９８０）により公表されたデータと一致し
た。アミノ酸組成の分析に際し、加水分解後のＰＴＨア
ミノ酸につき同じ分離手法を施すことによりクニヒト（
Ｋｎｉｇｈｔ）ら（１９８０）によるＦＳ−４について
測定する値およびＣＨＯ由来のＩＦＮベータについて確
認し得る。

配糖化 脱配糖化またはツニカマイシンを用いる配糖化阻害によ
り得られたポリペプチドは、同様にしてＦＳ−４から得
られたＩＦＮベータと同じく、変性および未変性条件下
で同一の電気泳動的特性を示す。グリコペブヂダーゼ下
により遊離したオリゴ糖を用いエクソグリコシダーゼに
よる段階的分解の後メチル化分析およびＦＡＢマススペ
クトロメトリを行った。これにより炭水化物側鎖の９５
±５％が２本のアンテナ状複合体型であり、次に示す構
造であることが確認された。

Ｎ５ｕＡｅａ２−３ＧａＪＪｌ−４Ｃ；ｌｃＮＡｃＪｌ
−２ＭｍａｌＮ５ｕＡｅａ２−３Ｇａｌｊｌ−４ＧＩｅ
ＮＡｃ１９１−２Ｍｍａｌなお、明細書中に記載した文
献を整理すると次の通りである。

輝 Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　　Ｈ，Ｃ，＋１９８３１　　Ａ　
ｒａｐｉｄ　　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎ　ｍｅセｈｏｄ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅｘｓｏｌａｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ、　　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　Ｚｏｏ、　　２４３
−２５５゜Ｂｏｌｉｖａｒ、　　Ｆ、　　＋１９Ｖ８１
：　　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｎｅｗｃｌｏ
ｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ、　　ＩＩＸ、　　Ｄ＠ｒ
ｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＢＲ３２
２ｃａｒｒｙ−ｉｎｇ　ｕｎｉｑｕｅ　Ｅｃｏ　ＲＩ　
５ｉｔｅｓ　ｆｏｒ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｃ
ｏ　Ｒ工ｇｅｎｅｒａｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　
ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｇｅｎｅ　　４．　１２
１−１３４゜Ｂｏｌｉｖａｒ、ｒ、、Ｒｏｄｒｉｇｕｅ
ｚ、Ｒ，Ｌ、、Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ、Ｊ、、Ｂｅｔｌａｃ
ｈ、Ｍ、Ｃ，、Ｈｅｙｎｅ−ｋｅｒ、＋（、Ｌ、、Ｂｏ
ｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、＋１９７７１．Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ−ｚａ？、＋ｏｎ
　ｏｆ　ｎｅｗ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ、
Ｉｌ、Ａ　ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏＳｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ
ｓｙｓｔｅｍ、　　Ｇｅｎｅ　　２．　９５−１１３゜
Ｂｒ１ｎＳｔｅｒ、　Ｒ，Ｌ、ＩＣｈｅｎ、　Ｈ，Ｙ、
＋　　Ｗａｒｒｅｎ、　Ｒ，、５ａｒｔｈｙ、　Ａ、＋
　　　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ。

Ｒ，Ｄ、　　＋１９８２１＋　　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
　　ｏｆ　　ｍｅｔａｌｌｏセｈｉｏｎｅｉｎ−ヒｈｙ
ｍｉｄｉｎｅ　　ｋｉｎａｓｅｆｕｓｉｏｎ　　ｐｌａ
ｓｍｉｄｓ　　１ｎｊｅｃセｅｄ　　１ｎｔｏ　　ｍｏ
ｕｓｅ　　ｅ９９ｓ、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２９６．　
３９−４２゜Ｃｈｅｒｎ＆］０ＶＳｋ　ｙｒ　　Ｙ　、
＋　　ＭＱｒ　ｙｒ　　Ｙ　、ｒ　　Ｃｈｅｎ＋　　Ｌ
　、、　　ＭａｆｋＳ＋　　　Ｚ−ｒ　　Ｎ０ＶＩＣｋ
　＋　　　Ｄ　、ＴＲｕｂｉｎＳｔｅｉｎ、　　Ｍ、、
　　Ｒｅｖｅｌ、　　Ｍ、　　＋１９８４１＋　　Ｅｆ
ｆｉｃｉｅｎセ　ｃｏｎｓｔｎｕｔｔｖｅｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｈｕｍａｎ　　ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔ　　ｉｒ＋ｔｅｒｆｅｒｏｎ　　ｂｙ　　ｈａｍｓ
：ｅｒ　　ｃｅｌｌｓしｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｗｉｔ
ｈセｈｅ　ｒＦＮ　ｂｅｔａ　ｌ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｅ
ｄ　ｔｏ　ａｎ　ＳＶ　４０　ｅａｒｌｙｐｒｏｍｐｔ
ｅｒ、　　ＤＮＡ　３．　２９７−３０８゜Ｄｅｒｙｎ
ｃｋ、Ｒ，、Ｃｏｎｔｅｎｔ、ｚ、、Ｃ１ｅｒｃｑ、Ｅ
、ｄｅ、ＶＯＩＣｋａｅｒｔｌ　Ｇ、、ＴａＶｅｒｎｉ
ｅｒｌＪ、、　　Ｄｅｖｏｓ、　　Ｒ，、Ｆｉｅｒｓ、
　　ｗ、　　（１９８０１：　　ｆｆ５ｏｌａｔｉｏｎ
　　ａｎｄ　　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　　ｏｆａ　　ｈｕ
ｍａｎ　　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　１ｎセｅｒｆｅｒｏ
ｎ　　ｑｅｎｅ、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２８５．　５４
２−５４７゜ＤｒｅｔＺｌ！Ｉ’Ｌ　ｃ、、Ｂｅ１ｌａ
ｒｄｌ　Ｍ、、５ａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ＋　ｐ、、
Ｃｈａｍｂｏｎ、ｐ、＋１９８１１：Ａ　　ｒｅｌｉａ
ｂｌｅ　　ｍｅｔ、ｈｏｄ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　　ｒ
ｅｃｏｖｅｒｙ　　ｏｆ　　ＤＮＡ　　ｆｒａｇｍｅｎ
ｔｓ　　ｆｒｏｍａｇａｒｏｓｅ　　ａｎｄ　　ａｃｒ
ｙｌａｍｉｄｅ　　ｇｅｌｓ、　　Ａｎａｌ、　　Ｂユ
ｏｅｈｅｍ、　　１１２．　２９５−２９８゜Ｆｉｅｒ
ｓ、Ｗ、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ、Ｒ，、Ｈａｅｑｅｍａｎ
、Ｇ、、Ｒｏｇｉｅｒｓ、Ｒ，、ｖａｎ　　ｄｅｒＶＯ
（ｌｒ６ｅｒ　　Ａ、ｇ　　Ｖａｎ　　）ｌｅｕｖＩ！
ｒｓＷｙｎ＋　　Ｈ−ｇ　　ｖａｎ　　Ｈｅｒ【ｅｗｅ
ｇｈｅ、Ｊ−ｒ　　Ｖｏｌ−ｅｋａｅｒｔ、　　Ｇ、、
　　Ｙｓｅｂａｅｒｔ、　　Ｍ、　　１１９７８１．　
　Ｔｈｅ　　ｃｏｍｐｌｅセｅ　　　ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　　ｏｆ　　ＳＶ　　４０　　Ｄ
ＮＡ、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２７３．　　ユ１３−１２
０゜Ｆｌａｖｅｌｌ、　　Ｒ，Ａ、、　　Ｍｏｏｔ＠ｒ
、　　Ｊ、Ｍ、、　　Ｄｅ　Ｂｏｅｒ、　　Ｅ、、　　
Ｌｉヒｔｉｅ、　　Ｐ、Ｆ、Ｒ，、Ｗｉｌ−１ｉａｍｓ
ｏｎ、　Ｒ，１９７Ｂ、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆセｈ
ｅ　ト＋ｊｅｌｔａ　−ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ　１ｏ
ｃｉｉｎ　　ｎｏｒｍａｌ　　ａｎｄ　　）Ｉｂ　　Ｌ
ｅｐｏｒｅ　　ＤＮＡ：　　Ｄｉｒｅｃｔ　　ｄｅセｅ
ｒｍ１ｎａｔｔｏｎ　　ｏｒ　　ｇｅｎｅｌｉｎｋａｇ
ｅ　ａｎｄ　　ｉｎｔｅｒｇｅｎｅ　ｄｉｓｔａｎｃｅ
、　　Ｃｑｌｌ　　Ｉｓ、　　２５−４１．１Ｆｒａｎ
ｓｅｎ、Ｌ、、Ｍｉｉｌｌｅｒ、Ｒ，、Ｍａｒｍｅｎｏ
ｕｔ、Ａ、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ、Ｊ、ｖａｎ　　ｄｅｒ
Ｈｅｙｄｅｎ、　　Ｊ、Ｉ　　Ｋａｗａｓｈｉｍａ、　
　Ｅ、ｇ　　ＣｈｏｌｌｅＪ　　Ａ、ｒ　　Ｔｉｚａｒ
ｄ、　　Ｒｏｒ　　ｖａｎｏｅｕｖｅｒｓｗｙｎ、肌、
　Ｖａｎ　Ｖｌｉｅｔ、　Ａ、、　Ｒｕｙ９Ｂｅ？１ａ
ｅｌｔ＋　Ｍ、Ｒ，、Ｆｉｅｒｓ、　Ｗ。

１１９８５１：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｅｌｏｎｉｎｇ
　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｈｕｍｏｕｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ
　ｆａｃｔｏｒｃＤＮＡ　　ａｎｄ　　ｉｔｓ　　ｅｕ
ｋａｔｙｏｔｉｃ　　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　　Ｎｕ
ｃｌ、　　八Ｃｉｄ、　　Ｒｅｓ、　　１３゜４４１７
−４４２９゜ Ｆｕｋｕｎａｑａｒ　　Ｒｌｒ　　ＳＯｋａＷａｇ　　
Ｙ−ｒ　　Ｎａｇａｔａ、　　Ｓ−（１９８４１＋　　
Ｃｏｎ５セ１セｕｔｉｖｅ　　ｐｒｏｃｌｕｃ−ｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｎセｅｒｆｅｒｏｎｓ　ｂｙ
　ｍｏｕｓｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｂｏｖｉｎｅ　
ｐａｐｉｌ−１ｏｍａ　ｖｉｒｕｓ　ａｓ　ａ　ｖｅｃ
ｔｏｒ、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌ
ｌｓｊ＋　８１．５０８６−５０９０゜ Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、、５ｈｅｐｈａｒｄ、）１．
Ｍ、、ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ、Ｅ、、Ｌｅｕｎｇ、Ｄ、、
Ｃｒｅａ。

Ｒ，、Ｓｌｏｍａ、　　Ａ、、　　Ｐｅｓセｋａ、　　
Ｓ、　　＋１９８０１：　　Ｓｙｎ仁ｈｅｓｉｓ　　ｏ
ｆ　　セｈｅ　　ｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　　
１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｂｙ　ｉｎ　Ｅｇｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、８．
４０５７−４０７４゜ Ｇｒａｈａｍ、ｒ、Ｌ、、ｖａｎ　ｄｅｒ　　εｂ、　
　Ａ、Ｊ、　　１１９７３１：　　Ａ　ｎｅｗ　ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅａｓｓａｙ　ｏｆ　
１ｎｆｅｃｔ１ｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ａｄｅｎ
ｏｖｉｒｕｓ　５　ＤＮＡ、　ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２
゜４５６−４６７゜ Ｇｒｏｓｓ、　　ｃ、、　　Ｍａｙｒ、　　Ｕ、、　　
Ｂｒｕｎｓ、　　ｗ、、　　Ｇｒｏｓｖｅｌｄ、　　Ｆ
、、　　Ｄａｈｌ、　　Ｈ，Ｈ，Ｍ、。

Ｃｏ１１ｉｎｓ、Ｊ、＋１９８１）：　Ｔｈｅ　５ｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ　ｔｈｉｒｔｙ−ｓｉｘ　ｋｉ
ｌｏｂａｓｅｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　セｈｅ　ｈｕｍａｎ
　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ＠ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　　ｔｈｅ
　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ＞ｎｔｅ【ｆｅｒｏｎ　ｇｅｎ
ｅ　ＩｒＮ　ｂｅｔａ、　Ｎｕｃｌ、　ＡＣｌｄＳ　Ｒ
ｅＳ、Ｌ　　２４９５−２５０７゜Ｇｒｏｓｖｅｌｄ、
　　Ｆ、Ｇ、ｌ　　Ｄａｈｌ、　　Ｈ，−ＬＭ、、　　
Ｂｏｅｒ、　　Ｅ、ｄｅ、　　Ｆｌａｖｅｌｌ、　　Ｒ
，八、　　Ｄ９８１１゜ｒｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂ
ｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　
　ｆｒｏｍ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｓｍｉｄｌｉｂｒａ
ｒｙ、　　Ｇｅｎｅ　　１３．　２２７−２３７゜Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、、　　Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、
　　（１９７５１：　Ｃｏ１ｏｎｙ　ｈｙｂｒｉｄｉｚ
ａｅｉｏｎ：　Ａ　ｍｅｔｈｏｄｆｏｒ　　ｔｈｅ　　
１ｓｏｌａｅｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ＤＮＡ５　
　ｔｈａｔ　ｃｏｎｔａｉｎ　　ａ　　ｓｐｅｃｉｆｌ
ｃｇｅｎｅ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
ｓｅｔ、　７２．３９６１−３９６５゜ＨａｕＳｅ【、
　　＋１．、　　Ｇｒｏｓｓ＋　　Ｇ、ｒ　　Ｂｒｕｎ
ｓ、　　Ｗ−ｒ　　Ｈｏｃｈｋｅｐｐｅｌ、　　Ｈ−に
、Ｔ　　Ｍａｙｔ、　　ＩＪ−ＨＣｏｌｌｉｎｓ、　Ｊ
、　＋１９８２１＋釦ｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｈ
ｕｍａｎ　ｂｅｔａ−１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇｅｎｅ　
ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　Ｌ−ｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅｓ、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　２９７．　６５０−６５４゜Ｈａｖｅｌｌ
、　　Ｅ、Ａ、、　　Ｖｉｌｅｅｋ、　　Ｊ、　　＋１
９７２１＋　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　Ｏｆ　　ｈｉ
９ｈ　　セｉｔｅｒｅｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｉｎｃｕ
ｌｔｕｒｅｓｏｆｈｕｍａｎｄｉｐｌｏｉｄｃｅｌｌｓ
、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ。

Ａｇｅｎｔｓ　　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　　２．　４７
６−４１１４゜ＫａＯ，Ｆ、Ｔ、、　　Ｐｕｃｋ、　　
Ｔ、？、　　（１９６８１：　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏ
ｆ　ｓｏｍａｔｉｃ　ｍａｍｍａＨａｎｃｅｌｌｓ、　
　Ｖ工１．　　Ｉｎｄｕｅｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　ｌ５
ｏｌａｔｉｏｎ　　Ｏｆ　　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　
　ｍｕｔａｎｔｓｉｎ　　ｃｈｉｎｅｓｓ　　ｈａｍｓ
セｓｒ　　ｃｅｌｌｓ、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、
　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　６０＋）２
７５−１２８１゜ Ｋａｕｆｍａｎ、Ｒ，Ｊ、、５ｈａｒｐ、Ｐ、Ａ、＋１
９８２ａｌ＋　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　
ｅｘｐｒｅｓｓｓｉｏｎｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｃ
ｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｄｕｌ
ａｒ　ｄｉｈｙｄｔｏｆｏｌａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ
　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　ｇａｎｇ、Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１５９，６０１−６２１゜ Ｋａｕｆｍａｎ、ＲＪ、Ｔ　　５１１ａｒｐ＋　　Ｐ、
Ａ−（１９８２ｂｌ＋　　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　
ｏｆ　ａ　　ｍｏｄｕｌａｆｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔ
ｅ　　ｒｅｄｕｃヒａｓｅ　　ｃＤＮ八　９ｅｎｅ＋　
　Ａｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　ｓｉｇｎａｌｓ　　ｕ
ｔｉ−１ｉｚｅｄ　ｆｏｒ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２．
１３０４−１３１９゜ Ｋａｕｆｍａｎ、　　Ｒ，Ｊ、、　　５ｈａｒｐ、　　
Ｐ、Ａ、、　　Ｌａｔｔ、　　Ｓ、Ａ、　　　＋１９８
３１：　　Ｅｖｏｌｕセｉｏｎ　　ｏｆｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｍａｌ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｃｏｎセａｉｎｉｎｇ　ｔ
ｔａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄｄ
ｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　　ｒｅｄｕｅｔａｓｅ　　
５ｅｑｕ＠ｎｃｅｓ、　　Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　
Ｂｉｏｌ、　　３．　６９９−７１１゜ にａｕｆｍａｎ、　　Ｒ，Ｊ、、　　　Ｗａｓｌｅｙ、
　　Ｌ、Ｃ，、５ｐｉｌｉｏｔｅｓ＋　　八、Ｊ、、　
　Ｇｏｓｓｅｌｓ、　　Ｓ、Ｄ。

Ｌａｔｔ、Ｓ、Ａ、ｌ　　Ｌａｒｓｅｎ、Ｇ、Ｒ，、Ｍ
ａｙ、Ｒ，Ｍ、［１９８５１：　Ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎａｎｄ　ｃｏｅｘｐ【ｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　
ｈｕｍａｎ　　ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ　ｐｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ　　ａｃｔｉｖａｔｏｒａｎｄ　　ｍｕｒｉ
ｎｅ　　ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔ、ｅ　　ｒｅｄｕｃ
ｔａｓｅ　　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　　ｉｎ　　ｃｈｉｎ
ｅｓｅｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　ｃｅｌｌｓ、　　
Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、　　５．　１７
５０−１７５９゜Ｘｎｉｇｈｔ＋　　Ｅ、ｊｒ、、　　
）Ｉｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　　Ｍ、ＩＬ、　　Ｋｏｒ
ａｎｔ、　　Ｂ、Ｄ、、　　）ｌａｒｄｙ、　　Ｒ，Ｗ
、Ｆ、。

Ｈｏｏｄ、Ｌ、Ｅ、＋１９８０１＋　　）Ｉｕｍａｎ　
　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　　ｉｎセｅｒｆｅｒｏｎ：　
　ａｍｌｎｏ　　ａｃｉｄδｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　
ａｍｉｎｏ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
　５ｅｑｕｅｎｃｅ、５ｃｉｅｎｃｅ２０７、　５２５
−５２６゜ Ｌａｅｍｍｌｉ、　　ｔｌＪ、　　＋１９７０１＋　　
Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　　ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　　ｊｈｅａｓｓｅｍｂ
ｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｐｈａｇｅ　Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ　２２７，６８０−
６８５゜ Ｌａｗｎ、　　Ｒ，Ｍ、、ＪＭｌｅｌｍａｎ、　　Ｊ、
、　　Ｆｒａｎｋｅ、　　Ａ、Ｅ、、　　Ｈｏｕｃｋ、
　　Ｃ，Ｍ、、　　Ｇｔｏｓｓ、　　Ｍ、。

Ｎａｊａｒｉａｎ、Ｒ，、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ、　
　（１９８１１＋　　Ｈｕｍａｎ　　Ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔ　　１ｎｔｅｒ−ｆｅｒｏｎ　ｇｅｎｅ　　１ａｃ
ｋｓ　　１ｎｔｅｏｎｓ、　　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　　９．　１０４５−１０５２゜Ｌｏｗｒｙ
、Ｏ，Ｈ，、ＲｏｓｅｂｒＯｕｑｈ、Ｎ、Ｊ、、Ｆａｒ
ｒ、Ａ、Ｌ、、Ｒａｎｄａｌｌ、Ｒ，Ｊ、ｆｉ９５１）
＋Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　　ｗｉ
ｔｈ　　ｔｈｅ　　Ｆｏｌｉｎ　Ｐｈｅｎｏｌ　　Ｒｅ
ａｇｅｎｔ、Ｊ、Ｅｌｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、１９３．　２６５−２７５゜Ｌｕ５ｋｙＴ　
Ｍ、Ｉ　Ｂｏｔｃｈａｎ、　Ｍ−１１９８１１＋　Ｉｎ
ｈｌｂｉｔｌＯｎ　ｏｆ　ＳＶ　４０　ｒｅｐＨｃａｔ
ｌｏｎ　ｉｎｓｉｍｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　５ｐｅ
ｃｉｆｉｃ　ｐＢＲ−３２２ＤＮＡ　　５ｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２９３゜７９−８１゜ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、ｒ、、Ｔｒａｈｅｙ、　　Ｍ、、
Ｉｎｎ１Ｓ＋　Ｍ−ｒ　Ｄｌｅｃｋｍａｎｎ、ｋ　Ｒ１
ｎ９０１（１＋　Ｇ−＋１９８４１＋　　ｒｎｄｕｃｉ
ｂｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｐｌｉｆｉ
ｅｄ　　ｈｕｍａｎ　　ｂｅｔａ　　１ｎｔｅｒ−ｆｅ
ｒｏｎ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ＣＨＯｃｅｌｌｓ、Ｍｏ１
．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、Ｃ１６６−１７２゜Ｍａｎｄｅ
ｌ、　　Ｍ、ａｎｄ　）Ｉｉｇａ、　　Ａ、　　＋１９
７０］＋　　Ｃａｌｃｉｕｍ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　　
ｂａｃｔｅｒｉｏ−ｐｈａｇｅｏＮＡ　　１ｎｆｅｃｔ
ｊｏｎ、Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、５３，１５９−１６
２゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　Ｔ、、　　Ｆｒｉセｓｃｈ
、　　Ｅ、Ｆ、、　　Ｓａｍｂｒｏｏｋｒ　　Ｊ、　　
（１９８２１＋　　Ｉｎ：　　ＭｏユｅｃｕｌａｒＣ１
ｏｎｉｎｇ　−ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｒ＋ｕ
ａ１．　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１４ａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｙ・ Ｍａｘａｍ、Ａ、Ｍ、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ、＋
１９８０１＋　　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｅｎｄ−１ａ
ｂｅｌｅｄ　ＤＮＡｗｉｔｈ　ｂａｇＩＩ−ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ　　ｃｈｅｍｉｃａｌ　　ｃｌｅａｖａｇｅｓ、
　　Ｍｅセｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

６５、　４９９−５６０゜ Ｍｉｔｒａｎｉ−Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ、　　Ｓ、、　　
Ｍａｒｏセ＠ａｕｘ、　　Ｌ、、　　Ｍｏｒｙ、　　Ｙ
、、　　Ｒｅｖｅｌ、　　Ｍ、、Ｈｏｗ−１ｅｙ、　Ｐ
、Ｍ、　　（１９８３１：　　Ｉｎｄｕｅｉｂｌｅ　ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　　１
ｎｔｅｒｆｅ−ｒｏｎ　　ｂｅｔａ　　１　　ｇｅｎｅ
　　１ｉｎｋｅ＋５　　ｔｏ　　ａ　　ｂｏｖｉｎｅ　
　ｐａｐｉｌｌｏｍａ　　ｖｉｒｕｓ　　ＤＮＡｖｅｃ
ｔｏｒ　ａｎｄ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄｅｘｔｒａｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｃｅｌｌ
ｓ。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３，２３３−２４０゜Ｍ
ｏ５ｔｈａｆ、　　Ｌ、、　　Ｐａｗｌｉｔａ、　　Ｍ
、、　　Ｇｒｕｓｓ、　　Ｐ、　　＋１９８５１＋　　
Ａ　　ｖｉｒａｌ　　ｅｎｈａｎｃｅｒｅｌｅｍｅｎｔ
　　５ｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　　ａｃｔｉｖｅ　　ｉ
ｎ　　ｈｕｍａｎ　　ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅセｉｃ　
　ｃｅｌｌｓ。

Ｎａｔｕｒｅ　　３１５．　５９７−６００゜０ｈｎｏ
、　Ｓ、、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、（１９８１１：　
　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ａｌ　ｇｅｎｅｆｏｒ　　ｈｕｍａｎ　　１ｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎ　　ｂｅｔａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ｔｌｓＡ　　Ｖ８゜５３０５−５３０９゜ Ｐａｇｅ、Ｍ、Ｊ、　　＋１９８ｓｌ＋　　Ｐ、ｘｐｆ
ｅｓｓｉｏｎ　　ｏｆ　　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　　ｈｕ
ｍａｎ　　ｂｅｔａ　　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇｅｎｅ
ｓ　ｕｓｉｎｇ　ｈｅａｖｙ　ｍｅｔａｌ　ｉｒ＋＋ｊ
ｕｃｔｉｏｎ　　ｉｎ　ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅ
ｒ　ｏνａｒｙｃｅｌｌｓ、Ｇｅｎｅ　　３７．　１３
９−１４４、Ｒｅｙｅｓ＋　　Ｇ、Ｒ，、Ｇａｖｉｓ、
Ｅ、Ｒ，、Ｂｕｃｈａｎ、Ａ、＋　　Ｒａｊ、Ｎ、Ｂ、
に、、）Ｉａｙｗａｒｄ、Ｇ、Ｓ、。

Ｐｉｔｈａ、　Ｐ、Ｍ、　　（１９Ｂ２１：　　Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｅｔａ　　１ｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｃＤＮＡｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏ
ｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａ
ｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｒｏｍ　ｈｅｒｐｅｓｓｉ
ｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ、　　Ｎａｔｕｒｅ　２９７．
　５’ｌ−６０１゜Ｒｉｇｂｙ、Ｐ、Ｗｊ、、Ｄｉｅｃ
ｋｍａｎｎ、Ｍ、、Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ，、Ｂｅｒｇ、Ｐ
、　　（１９７７１：　　Ｌａｂｅ−１ｉｎｑ　　ｄｅ
ｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　　ａｃｉｄ　　セｏ　
　ｈｉｇｈ　　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　ａｃｔｉｖｉｔｙ
　　１ｎｖｉｔｒｏ　　ｂｙ　　ｎ１ｃｋ　　ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎ　　ｗｉセｈ　　ＤＮＡ　　Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ　　１．　　Ｊ、　　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、１１３，２３７−２５１゜ Ｓｃｈｉｍｋｅ、Ｒ，Ｔ、、Ｋａｕｆｍａｎ、　　Ｒ，
Ｊ、、Ａｌｔ、Ｆ、Ｗ、、Ｋｅｌｌｅｍｓ、Ｒ，Ｆ、　
　＋１９７８１ＦＧｅｎｅ　　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ　　ａｎｄ　　ｄｒｕｇ　　ｔｅｓｉａｅａｎｃｅ
　　ｉｎ　　ｃｕｌセｕｒｅｃｌ　　ｍｕｒｉｎｅｃｅ
ｌｌｓ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　　２０２．　１０５１−
１０５５゜Ｓｅｈｇａｌ、Ｐ、Ｂ、、５ａｑａｒ、Ａ、
Ｄ、（１９８０１＋　　Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　
ｏｆ　ｐｏｌｙ（Ｉｌ、ｐｏｌｙ（Ｃ１−１ｎｄｕｃｅ
ｄ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　　１ｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ　ｍＲＮＡ　５ｐｅｃｉｅｓ、Ｎａセｕｒｅ
２１１８．９５−９７゜ ５ｈｅｐａｒｄ、Ｈ，Ｍ、Ｉ　　Ｌｅｕｎｇ、Ｄ、ｒ　
　Ｓセｅｂｂｉｎｇ、Ｎ、、Ｇｏｅ＋５ｄｅｌ、Ｄ、Ｖ
、＋１９８１１：　　Ａｓｉｎｇｌｅ　ａｍｉｎｏ　ａ
ｃｉｄ　ｃｈａｎｇｅ　　ｉｎ　ＩＦＮ−ｂｅｔａ　ｌ
　ａｂｏｌｉｓｈｅｓ　ｉｔｓ　ａｎｔｉｖｉ−ｒａｌ
　ａｃｔｉｖｔｔｙ、Ｎａｔｕ【ｅ　　２９４１　５６
３−５６５゜Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｅ、、Ｓｕｍｍｅｒｓ、
Ｍ、Ｄ、、Ｆｒａｓｅｒ、Ｍ、Ｊ、　　（１９８３１：
　　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　　ｏｆｈｕｍａｎ　　ｂｅ
ｔａ　　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　ｉｎ　　１ｎｓｅｃ
ｔ　　ｃｅｌｌｓ　　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　　
ａ　　ｂａｃｕ−１ｏｖｉｒｕ＋＋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎｖｅｃｔｏｒ、Ｍａｙ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３．２
１５６−２１６５゜５ｏｕｔｈｅｔｎ　　Ｅ、（１９８
０１：　　Ｇｅｌ　　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
　ｏｆ　　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　　ｆｒａｇｍｅｎ
ｔｓ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８，１５
２−１７６゜Ｓｔｅｗａｒｔ　ＩＬ　Ｗ、Ｅ、　（１９
８１１Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓ
七ｅｍ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｓｐｒｉｎ−ｇｅｒ　Ｖｅ
ｒｌａｇ　Ｗｉｅｎ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｓ、、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，、
Ｂｅｒｇ、Ｐ、＋１９８１１＋　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ　ｏｆ　　セｈｅｍｏｕｓｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌ
ａｔｅ　ｒｅｄｕｃ乞ａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｒｎｅｎｔ
ａｒｙ　ｏｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｌｄ　
　ｉｎ　　５１ｍ１ａｎ　　Ｖｉｒｕｓ　　４０　　ｖ
ｅｃｔｏｒｓ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、ｌ、　　
８５４−８６４゜ Ｔａｎ１９ｕｅｈｌｌ　Ｔ、Ｉ　Ｇｕａｒｅｎｔｅ、Ｌ
、Ｉ　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｔ、Ｍ、、Ｋｘｍｅｌｍａｎ
、Ｄ、、ＤｏｕｈａｎＸｌｌ、Ｊ、、Ｐｔａｓｈｎｅ、
Ｍ、＋１９８０１：　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏ−ｂｌａｓｔ　　１ｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎ　　ｇｅｎｅ　　ｉｎ　　Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７．５２３０−５２３３゜Ｔａｖｅ
ｒｎｉｅｒ、　　Ｊ、、　　Ｆｉｅｒｓ、　　Ｗ、　　
＋１９［１４１＋　　Ｔｈｓ　　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　　
ｏｆ　　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｇｉｏｎｓ　ｂｅｔ
ｗｅｅｎ　　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　　５ｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ、　　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒ，４９，３５９−３
６４゜ Ｔｈｏｍａｓ、　　Ｐ、Ｓ、　　１１９８０１＋　　）
Ｉｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎａｔｕｒｅ
ｄ　ＲＮＡ　ａｎｄ　　ｓｍａｌｌ　　ＤＮＡｆｒａｇ
ｍｅｎｔｓ　　ｔｔａｎｓｆｅｒｔｅｄ　　セｏ　　ｎ
１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、　　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　ｔｌｓＡ　　７７．５２０１−５２０５゜
Ｔｗｉｇｇ、　　Ａ、Ｊ、、　　５ｈｅｒ【ａｔ、　　
Ｄ、　　（１９８０１＋　　Ｔｒａｎｓ−ｅｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔａｂｌｅ　ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒｍｕｔａｎ
ｔｓ　　ｏｆ　　ｐｌａｓｍｉｄ　　ｃｏｉｅｌ、　　
Ｎａｔｕｒｅ　　２８３．　２１６−２１８゜ｔｌｒｌ
ａｕｂ、Ｃ０ｇ　　Ｃｈａｓｉｎ＋　　Ｔ−０Ａ、　ｆ
１９８０１＋　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｃｈ
ｉｎａｓｅ　　ｈａｍｓｔｅｒｃｅｌｌ　　ｍｕｔａｎ
ｔｓ　　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　　ｉｎ　　ｄｉｈｙｄｒ
ｏｆｏｌａｔｅ　　ｒｅｄｕｃｔａａｅ　　ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌｓＡ　７
７．４２１６−４２２０゜１ＩＩｉｑｌｅｒ、　Ｍ、、
　Ｓｗｅｅｔ、　　Ｒ，Ｔ　　Ｓｉｇｎ、　ＧＪ、、　
　Ｗｏｌｄ、　　Ｂ、、　　Ｐｅ１ｌｉＣｅｒｌ　Ａ、
ｌ　　ＬａＣｙ＋Ｅ、、　Ｍ＆ｎ１ａｔｉｓ＋　Ｔ、、
５ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、ｓ、、ＡＸｅｌｌ　Ｒ，＋１
９７９１：　ＴｒａｎｓｆＯ−ｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　
ｍａｍｍδ１ｉａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ
ｓ　　ｆｒｏｍ　　ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ　ａｎｄｅ
ｕｋａｒｙｏ虹ａｓ、Ｃｅ１ｌ　　１６，７７７−７８
５゜Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ、　　Ａ、、　　Ｒｕｇｇ
ｉｅｒｉ、Ｒ，、Ｒｅｖｅｌ、　　Ｍ、　　（１９８５
１：　　Ｈｕｍａｎ　　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｂｅｔ
ａ−２＋　　ｉｓ　　ｉｔ　　ａｎ　　１ｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ−ｉｎｄｕｅｅｒ？　　Ｉｎ＋　　Ｔｈｅ　　Ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｙｓセ！ｍ＋　　５ｅｔＯｎＯＳ
ｙｍｐ０５１＆　　２４ｒ　　ｅｄ、Ｇ、Ｂ、Ｒｏｇｓ
ｉ＋　　Ｅ−Ｄｉａｎｚａｎｌ、１３−８３゜

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドベクタｐＢＲ１３、ＩＦＮβ遺伝子
並びにｐＢＲ３２５の説明図、第２図は本発明による ｐｓｖ　ｔＳＳ−Ｎｃｏ　Ｉ　ＦＮおよびｐｓｖ　ｔＳ
Ｓ−Ａｓｕ　Ｉ　ＦＮの構成を示す説明図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＤＮＡ配列のクローン化に使用する組換えＤＮＡ
   分子であって、少なくとも前記組換えＤＮＡ分子がＩＦ
   Ｎベータ１遺伝子および前記遺伝子の保存（ｆｒａｎｋ
   ｉｅｒｅｎｄｅｎ）配列または配列を有し、これに対し
   ＩＦＮベータ１遺伝子および保存配列から作成する断片
   がハイブリダイズし、さらにベクタｐＳＶｄ２−３の一
   部を含むことを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
2. （２）ゲノミックインターフェロンベータ１遺伝子断片
   が制限切断部位ＮｃｏおよびＨｉｎｄIIIにより特定さ
   れる請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
3. （３）ゲノミックインターフェロンベータ１遺伝子断片
   が制限切断部位ＡｓｕIIおよびＨｉｎｄIIIにより特定
   される請求項１または２記載の組換えＤＮＡ分子。
4. （４）エンハンサ領域を備えるＳＶ４０初期プロモータ
   を含む請求項１〜３いずれかに記載の組換えＤＮＡ分子
   。
5. （５）請求項１〜４記載のベクタの１つとベクタｐＡｄ
   Ｄ２６ＳＶ（Ａ）−３とを細胞ラインＣＨＯ　ＤＵＫ　
   ＤＨＦＲ＾−ＢＦに共感染させて得られる組換え細胞ラ
   イン。
6. （６）ＳＶ４０プロモータのエンハンサ領域をｐＡｄＤ
   ２６ＳＶ（Ａ）−３のアデノウィルス由来のプロモータ
   と相互作用させてＩＦＮベータ発現の選択が行われた請
   求項５記載の組換え細胞ライン。
7. （７）ヒトＩＦＮベータを構成的に生産させるに際し、
   請求項１〜４記載のベクタの１つを用い、その状態でヒ
   トＩＦＮベータの遺伝子を発現、構成し、これを用いさ
   らに感染に際し選択および増幅についてより広範囲のプ
   ラスミドを用いて組換え宿主細胞ラインを作成して所定
   の条件下に維持し、これによりベクタにコードされたプ
   ラスミドの発現を可能にし、これにより組換え宿主細胞
   がヒトＩＦＮベータを生産し、これを公知方法と組合せ
   て細胞分泌物を単離するヒトＩＦＮベータの構成的生産
   方法。
8. （８）感染と増幅とを組合せて行い組換え宿主細胞ライ
   ンの発現を増強する請求項７記載の方法。
9. （９）請求項７および８記載の方法により得られること
   を特徴とするヒトＩＦＮベータであって、 （ａ）均質形態で実質的に均質に配糖化され、（ｂ）比
   活性約３．８×１０＾８単位／ｍｇ、（ｃ）ドデシル硫
   酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動上での分
   子量約 ２３５００ダルトン、 （ｄ）炭水化物側鎖が双頭アンテナ状複合体型に属し、
   ９５±５％均質であり、次の配列 と構造とを有し、 【アミノ酸配列があります】 （ｅ）マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−
   グルコサミン並びにフコースにつ いての分子比が３．１：２：３．４：１で あり、 （ｆ）Ｎ末端のアミノ酸部分配列 【アミノ酸配列があります】 （ｇ）６ＮＨｃｌ中、１１０℃で２２時間加水分解した
   相対アミノ酸組成（＋１０％） （ただし、＊については特定せず） ＡＳＸ　１７．２　　ＣＹＳ　　＊　　　　ＴＹＲ　　
   ８．４ＴＨＲ　　７．６　　ＶＡＬ　　５．３　　ＰＨ
   Ｅ　　９．３ＳＥＲ　　８．４　　ＭＥＴ　　＊　　　
   　ＨＩＳ　　５．０ＧＬＵ　２４．６　　ＩＬＥ　　９
   ．６　　ＬＹＳ　１０．９ＧＬＹ　　７．６　　ＬＥＵ
   　２５．１　　ＴＲＰ　　＊ＡＬＡ　　７．２　　ＰＲ
   Ｏ　　１．６　　ＡＲＧ　１０．４を特徴とするヒトＩ
   ＦＮベータ。
10. （１０）請求項７および８記載の方法で得られるヒトＩ
    ＦＮベータを含有する薬剤調製物。