CN102094034A - 一种重组人Fc融合长效干扰素的纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Fc融合蛋白的纯化工艺。本发明涉及的Fc融合蛋白包括但不限于重组人Fc融合长效干扰素(Fc-IFN)。该纯化工艺结合Fc融合蛋白的特性、纯化样品纯度得率要求、后期纯化工艺放大以及制剂配方要求等各方面因素。经过实验室研究、中试放大研究,确定了一条适合于产业化生产的纯化工艺路线。该工艺路线包括离心预处理,ProteinA SepharoseFF层析的粗纯,Q-Sepharose FF和G25 Sephadex层析的精纯。纯化得目的蛋白纯度高达95%以上、蛋白纯化得率高达40%以上,提高了目的蛋白纯度、得率。研究结果证实:该纯化工艺简便、具有较高目的蛋白纯度、得率,且适于实现产业化放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及纯化工艺领域。具体地说,本发明涉及一种适合于重组人Fc融合长效干扰素(Fc-IFN)的纯化工艺,根据目的融合蛋白特性优化纯化工艺、提高目的蛋白的纯度和得率。
背景技术
干扰素(IFN)是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂的蛋白质。这种蛋白具有多种生物活性,包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。
天然或基因重组的干扰素在体内的半衰期(half-life,t1/2)短,仅2h左右。为了维持其有效血药浓度,达到治疗目的,需要长期多次给药。因此,干扰素治疗方案一般是大剂量、频繁注射。这不仅给患者带来巨大的生理和精神痛苦、经济损失,而且大大限制了该产品的应用和推广。
长效干扰素可在不影响甚至增加治疗效果的情况下,大大降低注射剂量和次数。其主要优点如下:1.注射周期长,如本专利的Fc-IFN每月只需注射2次,较大程度地减少了病人的痛苦;2.体内血药浓度曲线平稳,疗效好,副作用少;3.治疗费用低,价格仅是天然干扰素的1/10左右等等。如此简便、快速、经济的疗法,大大减少了患者心理和生理的痛苦,从而创造良好的社会、经济效益。
目前,长效细胞因子的研究途径主要有三种:PEG修饰、脂质体包封和融合蛋白Fc技术。PEG修饰技术简单,但是产率低、半衰期短、蛋白与受体的结合活性就较低。脂质体包封技术复杂,且脂质体到达体内靶区或受体时无法出现高浓度的富集,影响疗效。Fc融合蛋白技术是利用基因工程和蛋白质工程技术,融合表达细胞因子-Fc片段(IgG4)。IgG4通过Fc片段与其受体结合,配体-受体复合物在体内可维持20天不被分解。利用此融合表达技术,延长细胞因子的半衰期。此技术构建复杂,产率高,半衰期长,疗效好,是长效细胞因子的发展方向。
本发明团队已完成Fc-IFN基因的构建。然而,Fc-IFN的纯化并非简单。国内有相关融合干扰素纯化相关的专利,如人血清白蛋白-干扰素融合蛋白及编码基因与应用(专利号:200910076241.3)。该专利中融合干扰素纯化工艺复杂(纯化步骤包括:离心、阳离子层析、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析等)、回收率较低(33%)。纯化工艺复杂、回收率 低、不易放大是融合蛋白纯化的主要问题。纯化工艺的优劣直接影响到目的蛋白的纯度和得率,直接影响到产品成本,是生物药品成本控制的关键点。本专利就纯化工艺中样品预处理工艺的选择、优化,粗纯工艺的选择、优化,精纯工艺的选择,层析柱介质的选择,层析条件的优化等各方面优化了融合蛋白的纯化工艺。
发明内容
本发明目的是提供一种较优的Fc融合蛋白(包括但不限于Fc-IFN)纯化工艺,以提高目的蛋白的纯化得率与纯度,降低生产成本。
在本发明涉及一种Fc-IFN基因是利用分子生物学和蛋白质工程技术,连接天然人干扰素和人IgG4的Fc基因片段构建而成。由Fc-IFN基因转染并筛选的获得Fc-IFN高效表达株。Fc-IFN是由干扰素与免疫球蛋白Fc区通过免疫惰性肽连接链连接的融合蛋白。
关于重组人Fc-IFN的纯化工艺,工艺结合Fc融合蛋白的特性、纯化样品纯度得率要求、后期纯化工艺放大以及制剂配方要求等各方面因素。该工艺简便、易于实现产业化生产,且提高了目的蛋白纯度、得率。
附图说明
图1.Fc-IFN基因构建图。
图2.Fc-IFN纯化工艺流程图。
图3.ProteinA层析图谱(实验批号:090712)
图4.Q柱层析图谱(实验批号:090712)
图5.G-25层析图谱(实验批号:090712)
图6.纯化样品电泳图谱(实验批号:090712)
图7.Protein A层析图谱(实验批号:090728)
图8.Q层析图谱(实验批号:090728)
图9.G-25层析图谱(实验批号:090728)
图10.纯化样品电泳图谱(实验批号:090728)1.Marker,2.细胞培养液,3.G-25层析洗脱
图11.Protein A层析图谱(实验批号:090814)
图12.Q层析图谱(实验批号:090814)
图13.G-25层析图谱(实验批号:090814)
图14.030814电泳图谱(实验批号:090814)1.Marker,2.G-25层析洗脱
本发明团队通过Fc-IFN实验室和中试纯化研究,摸索出一条适合于产业化生产的纯化工艺路线,在确保目的蛋白Fc-IFN纯度的基础上,提高了蛋白得率。
本发明涉及的Fc融合蛋白基因及其编码的免疫融合蛋白结构可参见图1。Fc融合蛋白及选择性标记蛋白的DNA序列于相应的起始和终止子之间;已知基因表达必需的调控因子,未在图中表示。总之,除所示序列外,本发明中的多核苷酸结构还可以进一步包括其他任何可提高蛋白表达量、保留生物活性、降低筛选及纯化难度等的调控及非调控序列。
本发明的重组Fc-IFN基因可以克隆到一个DNA表达载体中,继而转染到相应的宿主细胞,并筛选获得免疫融合蛋白的表达株。细胞转化包括但不限于磷酸钙法、电穿孔法、病毒、脂质体等。宿主细胞包括但不限于CHO、BHK、NS/O、293等。工程细胞可以培养在各种不同的有利于融合蛋白表达的条件下。细胞的培养条件包括但不限于培养基、空气中氧气和二氧化碳浓度、温度、pH值缓冲液等等,这些条件的选择亦属常规。
本发明涉及的Fc融合蛋白包括但不限于Fc-IFN。Fc融合蛋白包括:免疫球蛋白Fc区、免疫惰性肽连接链和目的蛋白三部分。免疫球蛋白Fc区为来自IgG4的免疫球蛋白重链C末端不变区的氨基酸序列。IgG4通过Fc片段与其受体蛋白结合,以延长Fc-目的蛋 白复合物的半衰期。免疫惰性肽连接链可增加Fc、目的蛋白的灵活性,从而有助于保留蛋白的天然构型和生物活性。
Fc-IFN基因工程细胞的构建已完成。然而,如何在Fc-IFN高效表达的基础上简化纯化工艺、提高了目的蛋白纯度和得率、实现纯化工艺的产业化放大?为解决上述问题,本发明通过Fc融合蛋白的实验室和中试纯化研究,摸索出一条适合于产业化生产的纯化工艺路线。具体的研究方案如下:
Fc-IFN实验室纯化工艺研究
缓冲液的选择:结合干扰素的制剂配方以及纯化工艺要求,选择了磷酸和枸橼酸缓冲体系。
样品预处理方法的确定:为防止培养液中的菌体、悬浮杂质损伤层析柱,采用离心的方式对培养液进行处理,离心转速为4000×g、温度为4℃、时间15min。离心后,取上清,可以直接上样。
Fc-IFN粗纯的研究:结合Fc-IFN蛋白特性,选择亲和层析柱。并在此基础上,考察了不同NaCl浓度对目的蛋白及其他杂蛋白吸附的影响,确定上样及洗脱条件;摸索了最佳流速及柱载量。研究结果显示:Protein A Sepharose FF作为层析介质,目的蛋白纯度已达85%以上,为较理想的粗纯介质;20mM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠(pH7.5)+0.1M NaCl作为上样缓冲液,20mM枸橼酸/枸橼酸钠(pH3.5)作为洗脱液;上样流速为30cm/h最佳。
表1:Fc-IFN粗纯工艺操作参数
超滤脱盐的研究:粗纯后样品盐浓度太高,且样品的缓冲体系并不适合进行离子交换层析,所以必须首先要脱盐。实验室规模首选应当是Sephadex G-25脱盐,但作为产业化放大,超滤脱盐是首选。研究结果表明10KD超滤膜块(Millipore公司产品)进行超滤除盐为最优。具体工艺操作参数表2所示:
Fc-IFN离子交换层析的研究:经过Protein A Sepharose FF亲和层析和超滤浓缩后,目标蛋白的电泳纯度已达到90%左右,但核酸、内毒素等杂质还是难以除去干净,不能达到药用基因工程产品标准。为了更好地去除这类杂质,我们考虑到的是利用离子交换层析。 研究结果证明:Q Sepharose层析介质能够很有效的对样品进一步纯化,样品纯度已经达到95%以上;对内毒素较好的分离效果,保证了样品内毒素的合格。
表2:Fc-IFN超滤工艺操作参数
表3:Fc-IFN离子交换层析工艺操作参数
Fc-IFN原液缓冲体系的替换:根据制剂的要求,采用G-25对样品溶液的缓冲体系进行替换,替换Fc-IFN样品溶液的缓冲体系为0.15M NaCl的10mM CH3COONH4。SephadexG25能够很好的替换样品溶液的缓冲体系为制剂所需要的缓冲体系,层析后样品能够达到原液的质量标准,可以直接进入制剂。
表4:Fc-IFN原液缓冲体系的替换工艺操作参数
Fc-IFN中试纯化研究
借鉴实验室研究结果,进行层析条件的放大及进一步优化,确定最终Fc-IFN纯化工艺路线。工艺步骤具体如下:
1.预处理工艺
由于在培养液中含有一些菌体以及一些悬浮物等杂质,如直接上样会损伤层析柱,因此采用离心的方式对培养液进行处理。取10L的细胞培养液用高速冷冻离心机在转速为8900rpm、温度为4℃时离心20min后备用,经离心后,收集离心上清,取上清即可进入下一步纯化工序。
2.粗纯工艺
Protein A Sepharose FF(2.6cm×15cm,CV=80ml)层析粗纯。在一定的上样缓冲体系(如:20mM pH7.5磷酸二氢钠/磷酸氢二钠,加入0.1M NaCl)中,用20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0),直接洗脱,其纯度可达85%以上。但是由于在酸性溶液中Fc-IFN的稳定性较差,因此应及时采用碱溶液将pH调节至中性环境,然后再进行后续操作。
3.精纯工艺
第一步Q Sepharose FF(2.6cm×10cm,CV=70ml)层析精纯。因为Fc-IFN的等电点为pH5.5左右,我们采用离子交换层析介质Q Sepharose Fast Flow(强阴离子介质,简称Q)。由于Protein A Sepharose FF洗脱样品为pH3.0,因此用Q上样缓冲液(20mM PB,pH7.5)对样品进行10倍稀释后上样,采用合适的盐浓度可以将目的蛋白洗脱下来,既能够进一步纯化目的蛋白,又能够达到去除内毒素的目的。
第二步G-25 Sephadex(2.6cm×35cm,CV=175ml)层析精纯。第二步精纯能够很好的替换样品溶液的缓冲体系为制剂所需要的缓冲体系,样品经检测后可直接进入后期制剂阶段。上样缓冲液为10mM CH3COONH4+0.15M NaCl,洗脱缓冲液为10mM CH3COONH4+0.15MNaCl,层析流速为30cm/h时,层析效果较好。经过此步层析后,样品能够达到原液的质量标准,可以直接进入制剂工艺阶段。
表5:Fc-IFN优化纯化工艺路线
具体实施方式
实施例1.Fc-IFN中试纯化研究(实验批号:090712)
1.实验目的:在纯化实验室小试条件基础上,进行中试整合与优化。
2.层析条件:参见表5。
3.实验材料:
Protein A Sepharose FF(2.6cm×15cm);
Q Sepharose FF(2.6cm×10cm);
10K超滤模块;
Solution A:20mM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠(pH7.5)+0.1M NaCl;
Solution B:20mM枸橼酸-枸橼酸三钠(pH3.5);
Solution C:20mM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠(pH7.5);
Solution D:20mM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠(pH7.5)+1M NaCl;
Solution E:10mM CH3COONH4+0.15M NaCl。
4.结果与分析:
层析及电泳结果见图3、4、5、6和表6。
图6.纯化样品电泳图谱(实验批号:090712)
1.Marker,2.细胞培养液,3.细胞培养液上清4.ProteinA层析洗脱,5.G-25层析洗脱
表6:Fc-IFN中试纯化研究结果分析(实验批号:090712)
实施例2.Fc-IFN中试纯化研究(实验批号:090728)
1.实验目的:在纯化实验室小试条件基础上,进行中试整合与优化。
2.层析条件:参见表5。
3.实验材料:参见实施例1。
层析及电泳结果见图7、8、9、10和表7。
图10.纯化样品电泳图谱(实验批号:090728)
1.Marker,2.细胞培养液,3.G-25层析洗脱
表7:Fc-IFN中试纯化研究结果分析(实验批号:090728)
实施例3.Fc-IFN中试纯化研究(实验批号:090814)
1.实验目的:在纯化实验室小试条件基础上,进行中试整合与优化。
2.层析条件:参见表5。
3.实验材料:参见实施例1。
层析及电泳结果见图11、12、13、14和表8。
图14.030814电泳图谱(实验批号:090814)
1.Marker,2.G-25层析洗脱
表8:Fc-IFN中试纯化研究结果分析(实验批号:090814)
Claims (11)
1.一种Fc融合蛋白基因,其特征在于,是利用分子生物学和蛋白质工程技术,由免疫惰性肽连接链连接目的蛋白和IgG4的Fc基因片段构建而成。
2.如权利要求1所述的一种Fc融合蛋白基因,其特征在于,Fc融合蛋白基因包括但不限于干扰素,还可为生长激素等生物活性蛋白。
3.一株Fc融合蛋白的高效表达工程细胞,其特征在于,它是转染Fc融合蛋白基因到相应的宿主细胞,并筛选获得的免疫融合蛋白的高效表达株。
4.如权利要求3所述的转染方法,其特征在于,包括但不限于磷酸钙法、电穿孔法、病毒、脂质体等转染技术。
5.如权利要求3所述的宿主细胞,其特征在于,包括但不限于CHO、BHK、NS/O、293等宿主细胞。
6.一种Fc融合蛋白,其特征在于,是由免疫惰性肽链、目的蛋白、免疫球蛋白的Fc区三部分组成。
7.如权利要求6所述的Fc融合蛋白,其特征在于,是由免疫惰性肽链连接目的蛋白、免疫球蛋白的Fc区构成。Fc融合蛋白包括但不限于干扰素、生长激素等。
8.一条适合于产业化生产的纯化工艺路线,其特征在于,纯化工艺包括预处理、粗纯、精纯工艺。纯化得目的蛋白纯度高达95%以上、蛋白纯化得率高达40%以上。该纯化工艺具有工艺简便、高纯度、高得率,适于产业化放大生产等优点。
9.如权利要求8所述的预处理,其特征在于,目的为防止培养液中的菌体、悬浮杂质等损伤层析柱,采用离心的方式对培养液进行预处理。离心条件为:离心体积为10L,温度为4℃,转速为8900rpm,时间为20min。
10.如权利要求8所述的粗纯,其特征在于,结合融合蛋白特性选择亲和层析法进行初步纯化,粗纯得目的蛋白纯度已高达85%以上。粗纯条件为:层析柱为Protein A SepharoseFF(2.6cm×15cm,CV=80ml),上样缓冲液为20mM柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.0)。
11.如权利要求8所述的精纯,其特征在于,精纯工艺分为两步:
精纯第一步采用离子交换层析法,达到了进一步纯化的目的,同时又去除了内毒素。具体纯化条件为:层析柱为Q Sepharose FF(2.6cm×10cm,CV=70ml),上样缓冲液为20mM PB(pH7.5)。
精纯第二步采用体积排阻层析法分离目的蛋白,并将缓冲体系替换为制剂所需的缓冲体系。具体纯化条件为:层析柱为G-25Sephadex(2.6cm×35cm,CV=175ml),上样缓冲液为10mM CH3COONH4+0.15M NaCl,洗脱缓冲液为10mM CH3COONH4+0.15M NaCl,层析流速为30cm/h。
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CN2009102317759A CN102094034A (zh) | 2009-12-09 | 2009-12-09 | 一种重组人Fc融合长效干扰素的纯化工艺 |
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Cited By (2)
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CN103665166A (zh) * | 2012-09-03 | 2014-03-26 | 福又达生物科技股份有限公司 | 犬融合干扰素 |
CN107163101A (zh) * | 2011-11-02 | 2017-09-15 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 超载和洗脱层析 |
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- 2009-12-09 CN CN2009102317759A patent/CN102094034A/zh active Pending
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