JP2006525239A - 核酸を抽出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)カリウムイオン、ここで上記酸性水溶液中のカリウムイオンの最終濃度は、0.3Mから飽和濃度の範囲内である;および
b)上記酸性水溶液のpHを2.0〜4.0の範囲内に調整するための酸。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で7本、1〜7の番号を付した)に入れ、30秒間、12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)250μlの溶液Cを添加し、管を逆さにして上下させることにより(3)と充分に混合した。次いで、この混合物を4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)次いで、450μlの溶液Dをカラムに添加し、この溶液Dを含むカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離し、プラスミドDNAを溶液E中に溶出した。
溶液Aは、20μg/ml RNase A、50mM Tris-HCl(pH8.0)、および10mM EDTA(pH8.0)を含有する;
溶液Bは、0.2M NaOHおよび1%SDSを含有する;
溶液Cは、2.5M KClおよび酢酸(HAC)を含有する。溶液C中の種々のHAC濃度を表1に示す;
溶液Dは、70%エタノールである;そして
溶液Eは、10mM Tris-HClおよび5mM EDTA、pH8.0を含有する。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で7本、1〜7の番号を付した)に入れ、30秒間、12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)250μlの溶液Cを添加し、管を逆さにして上下させることにより(3)と充分に混合した。次いで、この混合物を4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離し、プラスミドDNAを溶液E中に溶出した。
溶液A、B、D、およびEは実施例1と同様である。溶液Cは、2M HACおよび種々の濃度のKClを含有する。溶液C中の種々のKCl濃度を表2に示す。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で3本、1〜3の番号を付した)に入れ、30秒間12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)それぞれ500μlの溶液C1、C2、C3を添加し、管を逆さにして上下させることにより(3)と充分に混合した。次いで、この混合物を4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離した。プラスミドDNAは、カラムから溶液E中に溶出された。
溶液A、B、D、およびEは実施例1と同様である。溶液C1、C2、およびC3は、2M HACと、(C1の場合)K2SO4、(C2の場合)KNO3、または(C3の場合)KClとを含有する。K2SO4、KNO3、およびKClの濃度を表3に示す。
手順:
1)7μgのDNAを含有する200μlの水溶液を移した;
2)100μlの溶液Cを添加し、管を逆さにして上下させることにより(1)と混合した;
3)(1)と(2)との混合溶液をカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。混合溶液を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
4)450μlの溶液Dをカラムに添加し、次いで、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
5)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
6)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離した。DNAは、水溶液から溶液E中に溶出された;そして
7)カラムから溶出されたDNAの収量は、5.1μgであった(260nmで測定)。
溶液DおよびEは実施例1と同様である。溶液Cは、1M HACおよび2.5M KClを含有する。
手順−大腸菌からのプラスミドDNAの抽出および精製
1)1.5mlの大腸菌(HB101、pUC19を含む)の終夜培養物を1.5ml遠心分離管(全部で4本、1〜4の番号を付した)に入れ、30秒間、12,000gで遠心分離した。上清は廃棄した;
2)沈殿した細菌ペレットに200μlの溶液Aを添加し、充分に再懸濁した;
3)200μlの溶液Bを添加し、管を逆さにして上下させることにより(2)と充分に混合した。この混合物を室温で3分間静置した;
4)それぞれ500μlの溶液C1、C2、C3、C4を添加し、A、B、およびCの混合溶液のpHを3.1にした。A、B、およびCの混合溶液を、管を逆さにして上下させることにより充分に混合し、4℃で10分間、15,000gで遠心分離した;
5)上清を注意深くカラムに移した。このカラムには、50mgのガラス粉末またはガラス繊維を添加しておいた。上清を入れたカラムを2ml回収管に挿入し、1分間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
6)450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムを30秒間、15,000gで遠心分離した。回収管中のフロースルーは廃棄した;
7)さらに450μlの溶液Dをカラムに添加し、このカラムをさらに2分間、15,000gで遠心分離した;
8)カラムを2ml回収管から注意深く取り出し、次いで、カラムをクリーンな1.5ml遠心分離管に移し、100μlの溶液Eをこのカラムに添加した。室温で1〜2分間静置した後、次いで、カラムを1分間、15,000gで遠心分離した。プラスミドDNAは、カラムから溶液E中に溶出された。
溶液A、B、D、およびEは実施例1と同様である。溶液C1は、0.2M HClおよび2.5M KClを含有する。溶液C2は、0.2M HNO3および2.5M KClを含有する。溶液C3は、0.1M H2SO4および2.5M KClを含有する。溶液C4は、4M HACおよび2.5M KClを含有する(表4)。
Claims (10)
- カリウムイオンを含有する酸性水溶液であって、該溶液は、
(1)該カリウムイオンの濃度が0.3Mから飽和濃度までの範囲内であり;
(2)pHが2.0〜4.0の範囲内である、
溶液。 - 前記カリウムイオンが、カリウム塩の溶解から生じ、該カリウム塩が、K2SO4、KNO3、KCl、酢酸カリウム、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の溶液。
- 前記pHが酸により調整され、該酸が、酢酸、プロピオン酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の溶液。
- DNAの単離および精製における請求項1に記載の水溶液の使用。
- 前記水溶液が珪素含有材料とDNAとの結合を促進する、請求項4に記載の溶液。
- 生体物質を分離および精製するための方法であって、
(1)請求項1、2、もしくは3に記載の溶液またはこれらの溶質の適切な量を、標的生体物質を含む原料の生物材料に添加する工程;
(2)珪素含有材料を該得られた溶液に添加して、該標的生体物質を該珪素含有材料に結合させる工程;
(3)珪素含有材料に結合された標的生体物質を溶出し、そして該標的生体物質を得る工程、
を含む、方法。 - 前記標的生体物質が核酸である、請求項6に記載の方法。
- 前記核酸がDNAである、請求項7に記載の方法。
- 請求項6から8に記載の方法であって、前記標的生体物質を含む生物材料に添加した後、前記溶液またはその溶質の量が、
(1)カリウムイオンの濃度が0.3Mから飽和濃度までの範囲内であり;
(2)pHが2.0〜4.0の範囲内である、
ようにする、方法。 - DNAの分離および精製のために使用されるキットであって、本発明の溶液またはその溶質、ならびにDNAの分離および精製のために必要な他の試薬または物質を備える、キット。
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