CN1548447A - 钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒 - Google Patents

钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN1548447A
CN1548447A CNA031223966A CN03122396A CN1548447A CN 1548447 A CN1548447 A CN 1548447A CN A031223966 A CNA031223966 A CN A031223966A CN 03122396 A CN03122396 A CN 03122396A CN 1548447 A CN1548447 A CN 1548447A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
dna
acid
present
potassium ion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA031223966A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100395257C (zh
Inventor
陈辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZHONGDING BIOTECHNOLOGY CO Ltd CIXI
Original Assignee
ZHONGDING BIOTECHNOLOGY CO Ltd CIXI
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZHONGDING BIOTECHNOLOGY CO Ltd CIXI filed Critical ZHONGDING BIOTECHNOLOGY CO Ltd CIXI
Priority to CNB031223966A priority Critical patent/CN100395257C/zh
Priority to EP04717542A priority patent/EP1627060A4/en
Priority to US10/555,798 priority patent/US20060134626A1/en
Priority to JP2006504197A priority patent/JP5101102B2/ja
Priority to PCT/CN2004/000177 priority patent/WO2004099409A1/zh
Publication of CN1548447A publication Critical patent/CN1548447A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100395257C publication Critical patent/CN100395257C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种从其它物质中分离生物材料的方法，特别是核酸，例如DNA或者RNA或者DNA和RNA的杂交分子。本发明还提供了一种从生物材料中纯化核酸的方法，特别是DNA的方法。该方法使用了一种含硅材料，并结合使用一种新颖的溶液制备高纯度的生物材料，特别是DNA。其中含硅材料是吸附目标材料的载体，发明的新颖溶液的作用在于促进目标物质与含硅材料的结合，特别是促进DNA与含硅材料的结合。该溶液是酸性的含钾离子水溶液。本发明进一步提供了利用这种方法的试剂盒，其中包括适量的含硅材料和这种溶液，以及其它需要的试剂或者溶液。本发明进一步提供了利用这种方法制备的DNA。由于在制备过程中没有使用离液剂和其它有毒的、或者昂贵的试剂，这种DNA制备物可以用于多种应用中，特别是用于制备食品或者制药工业中。

Description

钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的DNA提取方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域。特别来说，本发明涉及一种用于生物材料提取和纯化的溶液以及使用了这种溶液的用于生物材料提取和纯化的方法。尤其是，本发明涉及DNA的提取方法，该方法是利用在含有钾离子的酸性水溶液存在的情况下，使含硅材料与一种含有目标生物材料，例如DNA作用，将DNA吸附到含硅材料上；然后通过进一步处理制备高纯度的DNA。
背景技术
从各种生物材料中分离和制备高纯度的目标物质是很重要的技术。因为生物材料，不论是天然的生物材料，例如组织细胞、血液，还是人工制备的生物材料，例如多聚酶链式反应的产物，都是复杂的混合物。在研究和应用中，常常有必要对这些材料进行处理，以便分离和纯化目标物质。比如天然的脱氧核糖核酸，即DNA，依据其来源不同，常常是以混合物的形式与多种其它物质共同存在，例如蛋白质、脂类、和其它成分。如果要研究某个基因，就要获得该基因的DNA分子。所以分离和纯化质粒DNA、噬菌体DNA、染色体DNA的方法在分子生物学领域、基因治疗领域和制药工业有非常重要的应用。
DNA的纯化方式分为二类：一类是构建物DNA的纯化，如重组质粒或噬菌体在宿主中繁殖后的纯化，这一技术是分子克隆及分子生物学实验常用技术的基础。第二类在从原核或真核生物中纯化染色体基因组DNA，该技术的应用使得复杂基因的研究更加容易、简便，特别使得代表不同种类的基因组DNA库的构建成为可能。
随着分子生物学和其它领域的快速研究进展，需要更加安全、有效甚至能够实现工业化和自动化的新方法。其中引人注目的是利用含硅材料的吸附性能，在结合剂(binding agent)，也叫结合增强剂(bindingenhencer)的存在下，使其与含有目标物质的材料作用，发生吸附作用；去除其它物质，对吸附有目标物质的含硅材料洗脱获得目标物质。在在1998年6月25日提出申请的美国专利6,218,531中公开了使用二氧化硅基质，从添加了离液剂的裂解的生物材料中分离RNA。
含硅材料对于核酸，包括DNA、RNA和DNA与RNA的杂交分子，具有的可逆性吸附作用是这种分离方法的基础。在结合剂中，最重要的是离液剂(chaotrope，chaotropic agent)，包括离液盐(chaotropicsalt)。常用的离液剂包括碘化钠(NaI)、尿素、盐酸胍(Gu·HCl)、高氯酸钠(NaClO4)和溴化钾(KBr)。也有使用醇类作为结合剂的，例如100％的乙醇，参见欧洲专利申请0 512 676 A1，或者参见美国专利5,783,686的背景技术部分。
但是已知的作为结合剂的化合物多数是有毒的，具有危害性，所以已经有不少研究试图减少或者不使用上述的结合剂。例如参见美国专利5,342,931(申请日为1993年4月23日)；美国专利5,503,816(申请日为1993年9月27日)；美国专利5,693,785(申请日为1994年11月17日)；和美国专利5,674,997(申请日为1995年5月10日)。
在美国专利5,342,931中，公开了一种DNA纯化方法，其中使用了水合二氧化硅。该方法是在水或者生理缓冲溶液中，将DNA结合到水合二氧化硅上；分离和洗涤结合了DNA的水合二氧化硅；在热的生理缓冲溶液中或者在热水中，从水合二氧化硅上洗脱DNA。
在美国专利5,503,816中，公开了多种具有亲水性和正电性的含硅材料，优选的含硅材料包括硅酸硼、硅酸铝、磷酸硅酸、羰基硅、磺基硅和膦酰基硅。其中一些材料可以在不使用离液剂，仅仅使用水的情况下回收DNA。但是所有这些材料要在特定的条件下制备。
在美国专利5,693,785中，公开了分离或者纯化DNA的组合物和方法。该组合物是羟化二氧化硅聚合物，是用二氧化硅与碱性溶液反应，然后经过酸化制备。用这种方法产生的羟化二氧化硅聚合物可以在水溶液中结合DNA，不需使用结合剂，例如醇类或者离液剂。被结合的DNA可以从溶液中分离，并通过加热洗脱到水中或者缓冲液中。
在美国专利5,674,997中，公开了纯化DNA的方法。其中所用的几种含硅材料具有在只使用水的情况下结合和洗脱DNA的能力，这些材料是硅酸硼、硅酸铝、磷酸硅酸和膦酰基硅。但是这些材料要在特定条件下形成。
在上述这些美国专利5,342,931，5,503,816，5,693,785和5,674,997中，公开了减少或者不使用结合剂的DNA分离或者纯化方法，但是都涉及对含硅材料的特殊处理，即修饰改性，或者要求在特定的条件下用特定反应制备，所以不便于方便应用和降低成本。
因此，在使用含硅材料通过可逆的吸附作用分离和纯化生物物质，特别是DNA时，传统的结合剂，特别是离液剂应该予以减少或者避免。特别是离液剂或者离液盐被禁止应用于制药工业。因为即使是微量的离液剂或者离液盐的残留也是对人体有害。但是，迄今为止的努力没有很好的解决这个问题，现有技术将注意力放在了寻求含硅材料的特定制备方法和修饰改性上。这就限制了这种分离和纯化方法的应用范围，需要对特定材料进行性质研究，无疑带来了种种不便，而且增加了成本。
本发明的目的就是针对上述问题，在使用普通常见的含硅材料作为吸附载体的前提下，寻找新颖的结合剂。
发明简述
第一个方面，本发明涉及一种溶含有钾离子的酸性水溶液，其具有如下特征：
1.K+离子浓度范围是0.3M-饱和；
2.pH2.0-4.0
其中K+离子来源于钾盐溶解，合适的钾盐有，但不仅限于，K2SO4、KNO3、KCl、醋酸钾等，也可以是钾盐的任意混合物。无论使用何种钾盐或者钾盐混合物，条件是钾离子的浓度只要满足大于或者等于0.3M；同时用酸将含有钾离子溶液的酸度进行调节，使其pH在2.0到4.0之间。酸可以是弱酸或者强酸。优选弱酸，例如醋酸。为了叙述的方便，下文有时称本发明的溶液为溶液C，必要时编号为C1、C2、C3、C4、C5等。
第二个方面，本发明涉及该溶液的用途。发明人发现该溶液可以用于生物物质的分离和纯化，例如核酸的分离和纯化，包括DNA和RNA。例如，将这种溶液适量加入含有DNA的混合物中，可以促进含硅材料吸附其中的DNA；除去未吸附的其它物质，洗脱吸附有DNA的含硅材料就可以实现DNA的分离和纯化。必要时，也可以加入一定量的该溶液的溶质促进含硅材料吸附其中的DNA。
第三个方面，本发明涉及生物物质的分离和纯化方法，该方法包括在含有目标生物物质的生物材料中加入适量本发明的溶液，以及使用含硅材料吸附上述所得溶液中的目标生物物质，经过洗脱得到目标生物物质。
第四个方面，本发明涉及核酸的分离和纯化方法，该方法包括在含有目标核酸的生物材料中加入本发明的溶液，以及使用含硅材料吸附其中的目标核酸，洗脱得到目标核酸。
第五个方面，本发明涉及DNA的分离和纯化方法，该方法包括在含有目标DNA的生物材料中加入本发明的溶液，以及使用含硅材料结合其中的目标DNA，洗脱得到目标DNA。
第六个方面，本发明涉及DNA的分离和纯化试剂盒，该试剂盒包括本发明的溶液，或者适量钾盐或者钾盐混合物和适量的某种酸的溶液，以及其它DNA分离和纯化过程中需要的试剂或者物质。该试剂盒可以包括所有需要用到的试剂和物质，也可以包括主要的试剂和物质，其余则由使用者自己提供。试剂盒中进一步可以包括试剂盒使用说明书。
第七个方面，本发明涉及用本发明所述方法制备的DNA。该DNA纯度高，不含有结合剂残留，例如有毒的离液剂残留，可以应用于多个方面。例如，用于制药工业，作为食品添加剂，作为化妆品的添加剂等。
发明详述
采用吸附介质对于生物材料中的目标物质进行可以吸附和解吸附的可逆过程可以进行目标物质的分离和纯化。含硅材料具有这种吸附和解吸附的特性，所以在DNA分离和纯化中广泛用到含硅材料。例如含硅材料，象二氧化硅、玻璃粉、玻璃、硅藻土等，一般需要高浓度的离液剂或者醇类，才能实现在其表面结合水溶液中的DNA。但是离液剂等传统结合剂会带来种种不利因素，所以尽量要少用或者不用这些结合剂。一种已知的解决办法是对含硅材料本身进行化学修饰或者化学改性，另一种方法是采用特定条件制备具有特殊性能的含硅材料。总之这增加了操作的复杂性，并且对于吸附基质具有严格的限制。本发明提供的溶液不仅避免了使用传统的结合剂，而且可以使用各种含硅材料。本发明的溶液不含有对人体有害的物质，克服了传统结合剂的缺点，而且成本低廉，取材广泛，配制方便，可以看作新颖的结合剂，是传统结合剂的替代物。
本发明的溶液是含有钾离子的酸性水溶液，其中K+离子浓度范围至少为0.3M，pH为2.0-4.0。典型地，这种酸性水溶液是用醋酸调节的氯化钾溶液，其中氯化钾的浓度为0.3/L-饱和：醋酸的浓度为1-7mol/L。合适的钾盐还有K2SO4、KNO3、醋酸钾。也可以使用几种钾盐任意混合物，例如氯化钾和硫酸钾。可以使用的酸包括弱酸和强酸，优选弱酸。弱酸选自醋酸、丙酸等，强酸选自盐酸、硫酸、硝酸或磷酸等。由于在用强酸调节pH值时操作比较困难，所以优选弱酸，尤其优选醋酸。
其中钾离子浓度和pH值是最为关键的技术特征。
对于不同钾盐，其在水中的饱和度不同，所以本发明所述钾盐溶液的浓度的上限是各种钾盐在水中达到饱和。但是饱和度是随着温度变化而变化的，所以在加热的情况下，饱和度会有所变化。本发明虽然是在室温下讨论钾盐的饱和度的，但是并不意味着本发明不可以在其它温度下进行。实际上，在特定的温度下进行本发明也是可以。在此情况下，钾盐的饱和度自然有所变化。所以，钾盐溶液中的钾盐在加热等条件下的变化也包含在本发明的范围之内。
钾盐在水中溶解，形成了钾离子。钾离子的来源既可以是一种钾盐溶解，也可以是两种或者更多种钾盐溶解。所以本发明所述含有钾离子的水溶液的溶质可以是一种钾盐，也可以是多种钾盐的混合物。溶液中的钾离子浓度是其中溶质溶解形成的钾离子的总浓度。钾离子的浓度至少为0.3mol/L，可以高至该盐的溶解达到饱和。如前所述，这里的讨论是指室温条件下。但是也可以在加热等条件下进行，钾盐的溶解饱和度可以预见会有所变化。
适用于本发明的钾盐包括KCl、K2SO4、KNO3、醋酸钾等，以及它们的任意混合物。优选在水中饱和度较大的钾盐。在本发明中优选氯化钾。
本发明的钾盐溶液是酸性的水溶液，是用酸调节其酸度的。合适的酸是醋酸、硫酸、硝酸、磷酸等。注意这里的例举并非穷尽，只要能够实现本发明的目的，任何调节酸度的物质都是可以使用的。这些酸可以分为弱酸和强酸。优选弱酸，这是因为操作上的便利。在调节pH值时，使用弱酸容易达到目标酸度范围。在弱酸中，最优选醋酸。
在本发明的一个实施方案中，钾盐是氯化钾，酸是醋酸。典型地，醋酸调节的氯化钾溶液中的氯化钾的浓度为0.3-2.5mol/L：醋酸的浓度为1-7mol/L。优选氯化钾的浓度为1.5-2.5mol/L：醋酸的浓度为3-5mol/L；更优选氯化钾的浓度为2-2.5mol/L：醋酸的浓度为3-4mol/L。
本发明使用的含硅材料可以是任何一种含硅材料。实例包括，但不限于二氧化硅、玻璃、硅藻土。它们可以具有多种形态，例如玻璃可以是玻璃粉、玻璃纤维等，只要它们具有一定的表面积，满足吸附DNA等目标物质的需要即可。优选的含硅材料具有足够的亲水性和正电性的含硅材料，如玻璃粉或者玻璃纤维、硅藻土等。当然，本发明也可以使用美国专利5,342,931，5,503,816，5,693,785和5,674,997中公开的特殊的含硅材料。在本发明的实施中，含硅材料可以是粉末形式，通过在溶液中吸附目标生物物质，从溶液中分离和纯化目标生物物质，例如DNA。也可以将含硅材料装柱使用，通过吸附柱分离和纯化目标生物物质。
实验表明本发明的含有钾离子的酸性水溶液可以促进目标生物材料，特别是DNA与各种含硅材料结合。分离或者纯化的效果良好，所得产品可以满足多种需要，尤其可以应用于制药工业中。在本发明的分离和纯化中，对于含硅材料没有特殊要求，可以使用各种含硅材料，包括未经修饰或者改性的含硅材料，也包括经过修饰或者改性的含硅材料，以及用特殊方法制备的含硅材料。在此所用，“含硅材料”是指所有的含硅材料，例如二氧化硅、玻璃、硅藻土等以及水合二氧化硅等材料。由于修饰或者改性对本发明的含硅材料不是必需的，为了叙述的方便，在本发明中对于吸附载体，即各种含硅材料不加详细区分，通称为含硅材料。
本发明的分离和纯化方法的特点在于本发明的溶液的使用免除了对含硅材料的特殊性能要求，避免了离液剂等结合剂的使用。对于从溶液中提取目标物质，本发明分离和纯化方法的大致过程包括：在含有目标生物物质的混合物中加入适量本发明所述溶液，混合均匀；然后，向其中加入含硅材料，使目标生物物质结合在含硅材料上；分离出吸附有目标物质的含硅材料。该方法可以进一步包括对吸附有吸附有目标物质的含硅材料的洗涤和洗脱过程。在此所用，目标生物物质可以是蛋白质、核酸等，其中核酸是指DNA、RNA以及它们的杂交体，前提是加入适量的本发明的溶液时，混合物中的目标物质可以选择性地与含硅材料结合。本发明优选用于DNA的分离和纯化。本发明人发现在含有DNA的溶液中加入适量的本发明的溶液，含硅材料能选择性可逆地吸附DNA。在本发明的方法中，优选加入含有钾离子的酸性水溶液，这是出于方便和操作的考虑；必要时，也可以加入该溶液的适量溶质。发明人发现含硅材料也可以在钾盐溶解达到饱和的条件下，吸附目标生物物质，特别是DNA。
通常，“分离”是指从目标物质所存在的原始混合物中提取目标物质。对于分离质粒DNA来说，就是经过菌体培养、质粒扩增和收集菌体后，从菌体中提取质粒的DNA分子。“纯化”是指将所得纯度不符合要求的目标物质进一步处理，使其纯度得以提高。由于两个过程的区分仅仅是起始材料不同，其本质是得到某种目标物质，实现物质由混合态向单一态的转化，有时两个过程具有重叠。所以，在本申请中，对于“分离”和“纯化”不加严格区分，一般写为“分离和纯化”，它们也可以相当于“提取”，“制备”等词语的涵义。
用本发明的方法提取质粒DNA时，先从菌体培养物中分离出细胞；用碱变性裂解法，采用NaOH-SDS裂解细胞；加入适量的本发明的溶液，混匀；加入含硅材料，进行吸附；分离吸附了质粒DNA的含硅材料；洗涤除去其它物质；洗脱吸附了质粒DNA的含硅材料，得到DNA。
在这个提取过程中，改进体现在：加入适量的本发明的溶液到含有DNA的裂解液中；含硅材料在本发明的溶液存在的情况下有选择地吸附DNA。
换句话说，在这个提取过程中，改进体现在：加入适量含钾离子的酸性水溶液到含有DNA的裂解液中；含硅材料在钾离子和酸性条件下有选择地吸附DNA。
含钾离子的酸性水溶液的作用在于创造一个促进目标生物物质，特别是DNA与含硅材料的结合条件。所以它是在含硅材料吸附DNA等目标物质之前加入混合物溶液中的，其添加量，例如添加体积，和浓度除了取决于该溶液本身的浓度和酸度以外，在具体应用中还应该根据起始混合物的原始酸度和其中是否已经含有钾离子以及所含钾离子的浓度进行相应的调整。所以当本发明的溶液使用于具体的目标生物物质的分离和纯化时，依据具体情况该溶液的浓度和pH值可以有所不同，这些改变也是没有背离本发明的精神和宗旨，属于本发明的范围之内。在这一点上，为了清楚起见，有关本发明的溶液在目标生物物质的分离和纯化中使用时的技术指标是使用以下指标：就是在添加了本发明的溶液后，在与含硅材料作用之前，含有目标物质的溶液中钾离子浓度和溶液的pH值。必要时，可以添加本发明溶液的溶质满足上述的条件。实际上，本发明从另外一个方面而言，就是有关含有目标物质的溶液究竟在什么样的条件下可以与含硅材料作用，发生目标物质的吸附，从而实现一定的分离纯化目的。
对于从溶液混合物中分离和纯化DNA而言，在与含硅材料作用之前，使用含有钾离子的酸性水溶液调节时应该满足：在调节后的溶液混合物中，钾离子的终浓度大于等于0.3mol/L，pH值在2.0-4.0之间。由于发明人还发现在吸附作用发生之前，含有DNA的溶液混合物中的钾离子可以很浓，直至达到相应钾盐的饱和度。所以这里所述条件的上限是相应钾盐的饱和。也就是，在本发明的方法中可以加入相应钾盐的溶质。考虑到方便性，优选使用含钾离子的酸性水溶液。
因此，本发明的一个方面就是提供了含硅材料吸附目标生物物质的条件，也即，含有目标生物物质的混合物溶液中的钾离子浓度大于等于0.3mol/L，pH值在2.0-4.0之间时，会发生含硅材料选择性吸附目标生物物质，特别是DNA。
本发明的方法包括在使所述样品溶液与含硅材料作用之前，调节样品溶液中的钾离子浓度和酸度。合适的做法是添加一定量的含有钾离子的酸性水溶液。但是可以对于这种调节方式有各种变通，比如原料物质本身的钾离子浓度和酸度满足了上述条件，那么就可以略去本步骤。本发明的核心在于使用上述条件使含硅材料吸附目标生物物质，特别是DNA。所以，任何实质上使用了上述条件和含硅材料的方法均是本发明的变通，自然包括在本发明的范围之内。
换言之，本发明的方法是利用含硅材料吸附钾离子浓度大于等于0.3mol/L，pH值在2.0-4.0之间的溶液混合物中的目标生物物质，特别是DNA。
具体而言，在本发明的一个实施方案中，从大肠杆菌中分离了质粒DNA。先从菌体培养物中分离出细胞；采用NaOH-SDS裂解细胞；调节含有目标物质的混合物溶液中的钾离子浓度和酸度，达到本发明所述吸附条件；加入含硅材料，进行吸附；分离吸附了质粒DNA的含硅材料。本方案中，还可以进一步包括洗涤除去其它物质；洗脱吸附了质粒DNA的含硅材料，得到质粒DNA；以及冻干等步骤。
在另一个实施方案中，本发明从DNA水溶液中回收了其中的DNA。是在DNA水溶液中加入适量本发明的含有钾离子的酸性溶液，调节至本发明所述吸附条件；加入含硅材料，进行吸附；离心获得吸附了质粒DNA的含硅材料；再通过洗涤和洗脱，回收到DNA分子。
为了得到纯度更高的DNA分子，可以重复本发明的方法。例如，用含有钾离子的酸性溶液调节待分离溶液，吸附，分离吸附有DNA分子的含硅材料；洗涤和洗脱。再将洗脱得到的DNA溶液重复上述步骤，直到需要的纯度。
如前所述，本发明首先是提供了一种特殊的溶液，即酸性含钾离子的水溶液。这种溶液配制简单，材料容易获得，价格低廉，并且这种溶液的成分不含有对人体有害的成分。该溶液的使用使目标生物分子和含硅材料可以结合，并且对于含硅材料可以没有特殊的要求。使用本发明的溶液进行分离和纯化方法包括如下步骤：在含有DNA的材料中加入适量发明溶液，有时需要离心取出上清；将溶液或者上清与含硅材料作用；然后将吸附有DNA的含硅材料洗脱获得DNA溶液。
如前所述，本发明其次是提供了一种分离和纯化方法，该方法包括在含有目标生物物质的混合物溶液中的钾离子浓度大于等于0.3mol/L，pH值在2.0-4.0之间时，用含硅材料选择性吸附目标生物物质，特别是DNA。在本发明的方法中，如果必要，钾离子浓度和pH值的调节都是简便易行的。并且上述方法所得产品可以满足制药工业的需要。
本发明的方法不需使用特殊的含硅材料，所以基质取材更加广泛；而且这些含硅材料相对于改性含硅材料更加稳定，吸附和解吸附特性不易受环境和分离材料中的杂质成分的影响；另外本发明所述溶液所含化学试剂对人体无害，价格相对便宜；所以适用于大规模提取DNA。
本发明的再一个优点在于分离纯化效率高，对于原材料中的目标物质的损失较小。
本发明的溶液的溶质可以以混合物的形式做成小分装的产品，提供使用者使用。由使用者用水溶解，并用醋酸等酸调节溶解后溶液的pH值，用于分离纯化过程。也可以与相关试剂和物质制成DNA提取或者其它用途的试剂盒。也可以将本发明的溶液组合进现有的试剂盒中，形成新的试剂盒，它们也在本发明的范围之内。比如一种试剂盒，用于大肠杆菌中质粒的分离和纯化，其中包括：碱裂解试剂，本发明的溶液，以及其它必要的试剂。当然视情况而言，它们可以分别装入小瓶或者其它容器中，也可以进行适当的合并。在试剂盒中，可以进一步包括使用说明书等。
本发明的溶液，本发明的含硅材料的吸附条件可以进一步与已有的仪器整合，这些整合也是在本发明的范围之内。
通过本发明所述方法制备的DNA或者其它满足纯度要求的物质，由于不含有被禁止应用于制药工业的离液剂残留，所以可以在多种应用中予以应用。广泛应用于生物学实验，制药工业，食品、化妆品、营养品等方面。
具体实施方式
以下为本发明所述方法的具体实施方案，主要是例举性说明本发明的溶液、所述分离和纯化方法以及所述试剂盒。正如本技术领域的技术人员所理解的那样，这里的描述仅仅是例举性的，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
实施例1 pH值对于分离纯化的影响
大肠杆菌中质粒DNA的提取纯化：
1)取1.5ml大肠杆菌(HB101，含pUC19质粒)过夜培养液于1.5ml离心管(共7管编号1-7)。12000g离心30秒，丢弃上清液；
2)向沉淀物加入溶液A 200μl，充分混悬细胞；
3)加入溶液B 200μl，上下颠倒试管，使之充分混匀，室温静置3分钟；
4)加入溶液C 250μl，上下颠倒试管，使之混匀，4℃，15000g离心10分钟；
5)小心吸取上清液至一底部放有50mg玻璃粉(或玻璃纤维)的离心柱，将离心柱放入2ml离心管中，15000g离心1分钟，弃去离心管中溶液；
6)吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心30秒，弃去离心管中溶液；
7)再吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心2分钟；
8)将离心柱小心从2ml离心管中取出，放入一洁净1.5ml离心管中，加入100μl溶液E，放置1-2分钟，15000g离心1分钟。质粒DNA即被洗脱。
其中
溶液A：20μg/ml RNase A，50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)
溶液B：0.2M NaOH，1％SDS
溶液C：2.5M KCl，HAC浓度见下表1
溶液D：70％乙醇
溶液E：10mM Tris-HCl，5mM EDTA，pH8.0
                             表1
样品编号   溶液C中HAC浓度(M) 溶液C中KCl浓度(M) 溶液A，B，C混合后体系pH DNA得率(μg)
1   1 2.5 3.9 10.0
2   2 2.5 3.6 15.9
    3     3     2.5     3.3     27.1
    4     4     2.5     3.1     33.8
    5     5     2.5     3.0     29.1
    6     6     2.5     2.8     25.3
    7     7     2.5     2.6     20.2
备注：溶液A，B，C混合后体系pH是指在添加了本发明的溶液后，在与含硅材料作用之前，含有目标物质的溶液中的pH值。
表1说明在钾离子浓度不变的情况下，溶液C中的醋酸含量的变化导致吸附作用前溶液中的pH值的改变。这种改变对于DNA的得率有显著影响。上述实验结果表明在溶液C中的K离子浓度为2.5M，醋酸含量为4M时，可以得到较高的提取量；对应地，当吸附前含有DNA的溶液中的K离子浓度为0.89M，pH为3.1时，有较高的DNA的得率。
实施例2 钾离子浓度对于分离纯化的影响
大肠杆菌中质粒DNA的提取纯化：
1)取1.5ml大肠杆菌(HB101，含pUCl9质粒)过夜培养液于1.5ml离心管(共7管编号1-7)。12000g离心30秒，丢弃上清液；
2)向沉淀物加入溶液A 200μl，充分混悬细胞；
3)加入溶液B 200μl，上下颠倒试管，使之充分混匀，室温静置3分钟；
4)加入溶液C 500μl，上下颠倒试管，使之混匀，4℃，15000g离心10分钟；
5)小心吸取上清液至一底部放有50mg玻璃粉(或玻璃纤维)的离心柱，将离心柱放入2ml离心管中，15000g离心1分钟，弃去离心管中溶液；
6)吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心30秒，弃去离心管中溶液；
7)再吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心2分钟；
8)将离心柱小心从2ml离心管中取出，放入一洁净1.5ml离心管中，加入100μl溶液E，放置1-2分钟，15000g离心1分钟。质粒DNA即被洗脱。
其中：溶液A、溶液B、溶液D和溶液E同实施例1；
溶液C：2M HAC(醋酸)，KCl浓度见下表2推算
                           表2
编号 溶液A、B、C混合后体系pH 溶液A、B、C混合后体系KCl浓度(M) DNA得率(μg)
  1 3.1 0.25 9.0
  2 3.1 0.50 13.2
  3 3.1 0.75 22.3
  4 3.1 1.00 32.1
  5 3.1 1.25 33.4
  6* 3.1 1.75 32.7
  7* 3.1 2.5 33.1
*6、7中需加入固体氯化钾才能使溶液A、B、C混合后体系KCl浓度分别达到1.75M和2.5M。
表2说明在pH值保持不变的情况下，溶液C中的K离子含量的变化导致吸附作用前溶液中的K离子含量的改变。这种改变对于DNA的得率有显著影响。上述实验结果表明当吸附前含有DNA的溶液中的pH被调节为3.1时，K离子含量大于等于1M时，有较高的DNA的得率，而且得率不随K离子浓度升高有显著的变化，所以较佳的K离子浓度为1M。根据混合后体系中的K离子浓度可以容易计算出溶液C中的浓度，在此就不给出。
实施例3 钾盐种类对于分离纯化的影响
大肠杆菌中质粒DNA的提取纯化：
1)取1.5ml大肠杆菌(HB101，含pUC19质粒)过夜培养液于1.5ml离心管(共3管编号1-3)。12000g离心30秒，丢弃上清液；
2)向沉淀物加入溶液A 200μl，充分混悬细胞；
3)加入溶液B 200μl，上下颠倒试管，使之充分混匀，室温静置3分钟；
4)加入溶液C1、C2、C3各500μl，上下颠倒试管，使之混匀，4℃，15000g离心10分钟；
5)小心吸取上清液至一底部放有50mg玻璃粉(或玻璃纤维)的离心柱，将离心柱放入2ml离心管中，15000g离心1分钟，弃去离心管中溶液；
6)吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心30秒，弃去离心管中溶液；
7)再吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心2分钟；
8)将离心柱小心从2ml离心管中取出，放入一洁净1.5ml离心管中，加入100μl溶液E，放置1-2分钟，15000g离心1分钟。质粒DNA即被洗脱。
其中：溶液A、溶液B、溶液D和溶液E同实施例1；
溶液C1、C2、C3：HAC 2M，K2SO4、KNO3、KCl浓度见下表3
                        表3
                    溶液C   DNA得率
编号  HAC     钾盐 K+离子浓度(M)
C1  HAC 2M     K2SO4 1.4   21.5
C2  HAC 2M     KNO3 1.4   22.4
C3  HAC 2M     KCl 1.4   20.9
从表3可以看出，来自不同钾盐的钾离子，在形成酸性钾离子水溶液时，其中钾盐种类，或者钾盐溶解产生的其它离子对于DNA的得率没有显著影响。所以钾离子浓度是本发明的溶液和分离纯化方法的关键所在。
实施例4水溶液中DNA回收
1)取含7μg DNA水溶液200μl；
2)加入溶液C 100μl，上下颠倒试管，使之混匀；
3)将溶液移至一底部放有50mg玻璃粉(或玻璃纤维)的离心柱，将离心柱放入2ml离心管中，15000g离心1分钟，弃去离心管中溶液；
4)吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心30秒，弃去离心管中溶液；
5)再吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心2分钟；
6)将离心柱小心从2ml离心管中取出，放入一洁净1.5ml离心管中，加入100μl溶液E，放置1-2分钟，15000g离心1分钟。DNA即被洗脱；
7)260nm测定DNA回收量为5.1μg。
其中：溶液D和溶液E同实施例1；
溶液C：1M HAC，2.5M KCl
本实施例表明回收率达到了73％。且所使用的溶液C中两种成分的含量并非最优选的形式，参见实施例1和表1。所以，这说明本发明的方法在分离和纯化DNA时，对于原始物质中的DNA能够较好的予以回收。这对于提取混合物中微量DNA而言，十分重要。也说明本发明的又一优点，即原材料中DNA损失较小。
实施例5使用不同酸调节含钾离子的水溶液对于分离纯化的影响
大肠杆菌中质粒DNA的提取纯化：
1)取1.5ml大肠杆菌(HB101，含pUC19质粒)过夜培养液于1.5ml离心管(共4管编号1-4)。12000g离心30秒，丢弃上清液；
2)向沉淀物加入溶液A 200μl，充分混悬细胞；
3)加入溶液B 200μl，上下颠倒试管，使之充分混匀，室温静置3分钟；
4)加入溶液C1、C2、C3、C4各200μl左右(使溶液A、B、C混合后pH为3.1)，上下颠倒试管，使之混匀，4℃，15000g离心10分钟；
5)小心吸取上清液至一底部放有50mg玻璃粉(或玻璃纤维)的离心柱，将离心柱放入2ml离心管中，15000g离心1分钟，弃去离心管中溶液；
6)吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心30秒，弃去离心管中溶液；
7)再吸取450μl溶液D于离心柱，15000g离心2分钟；
8)将离心柱小心从2ml离心管中取出，放入一洁净1.5ml离心管中，加入100μl溶液E，放置1-2分钟，15000g离心1分钟。质粒DNA即被洗脱。
其中：溶液A、溶液B、溶液D和溶液E同实施例1；
溶液C1：0.2M HCl，2.5M KCl；C2：0.2M HNO3，2.5M KCl；C3：0.1MH2SO4，2.5M KCl；C4：4M HAC 2.5M KCl
结果：
    溶液C编号     酸   DNA得率(μg)
    C1     HCl   26.5
    C2     HNO3   28.1
    C3     H2SO4   24.9
    C4     HAC   26.9
本实施例表明溶液C中的酸的作用是调节含钾离子水溶液的pH值，它们的种类对于本发明所述方法的效果没有很大的影响。这一点特别在使用强酸盐酸、硝酸和硫酸时，十分明显。可以看出只要使用的H+当量浓度相当，实验效果差异不大。所以在本发明的溶液中，两种成分中的酸主要在于提供氢离子，使参与吸附作用的溶液在吸附前达到一定的酸度。

Claims (10)

1.一种含钾离子的酸性水溶液，其特征在于：
(1)钾离子的浓度范围是0.3M-饱和；
(2)pH值为2.0-4.0。
2.如权利要求1所述的溶液，其中所述的钾离子来自于钾盐的溶解，其中钾盐选自K2SO4、KNO3、KCl、醋酸钾和它们的任意混合物。
3.如权利要求1所述的溶液，其中所述pH值是用酸调节的，所述酸选自醋酸、丙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸和它们的任意混合物。
4.如权利要求1所述的水溶液在DNA分离和纯化中的用途。
5.如权利要求4所述的水溶液能够促进含硅材料吸附DNA分子。
6.一种生物物质的分离和纯化方法，该方法包括：
(1)在含有目标生物物质的生物材料中加入适量如权利要求1，2或3中所述的溶液或其溶质，混合均匀；
(2)向步骤(1)所得溶液中加入含硅材料，使所述目标生物物质吸附于所述含硅材料；
(3)洗脱步骤(2)中的吸附有目标生物物质的含硅材料，得到所述目标生物物质。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述目标物质是核酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述核酸是DNA。
9.如权利要求6-8所述的方法，其中所述溶液或其溶质的用量是在其加入到含有目标生物物质的生物材料之后，能使该溶液满足下述条件：(1)钾离子的浓度范围是0.3M-饱和；(2)pH值为2.0-4.0。
10.一种DNA的分离和纯化试剂盒，该试剂盒包括本发明的溶液或其溶质，以及其它DNA分离和纯化过程中需要的试剂或者物质。
CNB031223966A 2003-05-06 2003-05-08 钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒 Expired - Fee Related CN100395257C (zh)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB031223966A CN100395257C (zh) 2003-05-08 2003-05-08 钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒
EP04717542A EP1627060A4 (en) 2003-05-08 2004-03-05 PROCESS FOR NUCLEIC ACID EXTRACTION
US10/555,798 US20060134626A1 (en) 2003-05-06 2004-03-05 Process for extracting nucleic acid
JP2006504197A JP5101102B2 (ja) 2003-05-08 2004-03-05 核酸を抽出するための方法
PCT/CN2004/000177 WO2004099409A1 (en) 2003-05-08 2004-03-05 Process for extracting nucleic acid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB031223966A CN100395257C (zh) 2003-05-08 2003-05-08 钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1548447A true CN1548447A (zh) 2004-11-24
CN100395257C CN100395257C (zh) 2008-06-18

Family

ID=33426293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB031223966A Expired - Fee Related CN100395257C (zh) 2003-05-06 2003-05-08 钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20060134626A1 (zh)
EP (1) EP1627060A4 (zh)
JP (1) JP5101102B2 (zh)
CN (1) CN100395257C (zh)
WO (1) WO2004099409A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102822340A (zh) * 2010-04-08 2012-12-12 恰根有限公司 分离和纯化核酸的色谱设备和方法
CN102925429A (zh) * 2012-11-19 2013-02-13 南京师范大学 一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA05001815A (es) * 2004-02-20 2005-08-24 Hoffmann La Roche Adsorcion de acidos nucleicos a una fase solida.
US20090088560A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-02 Hong Shen Process for Nucleic Acid Purification

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6027750A (en) * 1986-09-04 2000-02-22 Gautsch; James Systems and methods for the rapid isolation of nucleic acids
US5075430A (en) * 1988-12-12 1991-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth
US5234809A (en) * 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
CA2067711C (en) * 1991-05-03 2000-08-08 Daniel Lee Woodard Solid phase extraction purification of dna
US5155018A (en) * 1991-07-10 1992-10-13 Hahnemann University Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources
EP0555798B1 (en) * 1992-02-13 1999-05-06 Becton, Dickinson and Company Hydrated celite and purification of DNA
CA2102264C (en) * 1992-11-13 2000-08-01 Daniel Lee Woodard Boron silicates, aluminum silicates, phosphosilicates and purification of dna
US5386024A (en) * 1993-02-10 1995-01-31 Gen-Probe Incorporated Method to prepare nucleic acids from a biological sample using low pH and acid protease
DE4321904B4 (de) * 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
EP0723549B1 (en) * 1993-08-30 2003-12-17 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
US5503816A (en) * 1993-09-27 1996-04-02 Becton Dickinson And Company Silicate compounds for DNA purification
WO1995034569A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien
JPH09327291A (ja) * 1996-06-11 1997-12-22 Toyobo Co Ltd Ｒｎａの抽出精製方法
CN1187538A (zh) * 1996-06-18 1998-07-15 理化学研究所 Dna的回收方法
JP3082908B2 (ja) * 1996-07-12 2000-09-04 東洋紡績株式会社 リボ核酸の単離方法
AU745185B2 (en) * 1997-06-25 2002-03-14 Promega Corporation Method of isolating RNA
JP2004501054A (ja) * 1997-12-06 2004-01-15 ディーエヌエイ　リサーチ　イノベイションズ　リミテッド 核酸の単離
DE19856064C2 (de) * 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
DE19903507A1 (de) * 1999-01-29 2000-08-10 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung endotoxinfreier oder an Endotoxin abgereicherter Nukleinsäuren und deren Verwendung
JP2001139593A (ja) * 1999-11-12 2001-05-22 Toyobo Co Ltd 粒子担体を使用する改良された核酸の抽出方法
US20020068280A1 (en) * 2000-12-06 2002-06-06 Jeff Fairman Compositions and methods for DNA purification from whole blood

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102822340A (zh) * 2010-04-08 2012-12-12 恰根有限公司 分离和纯化核酸的色谱设备和方法
CN102925429A (zh) * 2012-11-19 2013-02-13 南京师范大学 一种聚合酶链式反应产物纯化试剂盒及纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004099409A1 (en) 2004-11-18
EP1627060A1 (en) 2006-02-22
JP5101102B2 (ja) 2012-12-19
CN100395257C (zh) 2008-06-18
EP1627060A4 (en) 2007-07-11
US20060134626A1 (en) 2006-06-22
JP2006525239A (ja) 2006-11-09
WO2004099409A8 (fr) 2005-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1922319A (zh) 质粒纯化
CN1332798A (zh) 从任意复杂起始材料中分离核酸的制剂和方法以及接下来的染色体组基因分析
CN1563090A (zh) 一种高效快速纯化制备片段抗体的方法
KR20140039221A (ko) 생물학적 물질로부터 순수 rna 분리법
WO2009155128A1 (en) Method for separation of double-stranded and single-stranded nucleic acids from the same sample
CN101063169A (zh) 一种检测山羊催乳素基因单核苷酸多态性的pcr－rflp方法
CN107475250A (zh) 一种肠道内容物宏基因组dna提取的前处理方法
CN1548447A (zh) 钾离子酸性水溶液和利用这种溶液的dna提取方法和试剂盒
CN1861580A (zh) 从植物中提取石杉碱甲的工艺
CN1244403C (zh) 层析材料以及使用该材料的方法
CN1283625C (zh) 纯化的lasofoxifene及通过重结晶纯化外消旋lasofoxifene的方法
CN113846088B (zh) 一种提取质粒dna的试剂盒及方法
TW416867B (en) Separation apparatus, separation method, nucleic acid separation purification method, nucleic acid separation purification kit
CN1177055C (zh) 家蝇抗菌肽基因及其克隆方法
CN1132211A (zh) 纯化包含preS2肽的乙型肝炎病毒表面抗原的方法
CN106834274B (zh) 一种回收片段化降解dna的方法
CN1349966A (zh) 大黄总蒽醌的提取纯化方法及其在制备治疗肾衰药品中的应用
CN1526720A (zh) 核酸回收方法
CN1157477C (zh) 含有大鳞大马哈鱼生长因子的大肠杆菌
CN101058815A (zh) 一组乙肝HBx基因的缺失突变体及其应用
CN1140632C (zh) Dna扩增方法及其试剂盒
CN1241933C (zh) 相分离法纯化质粒dna方法
CN1664110A (zh) Pcr扩增引物,及试剂盒和在哺乳动物性别鉴别上的应用
CN101475958B (zh) 增强体外基因转录翻译效率的方法
CN113817721A (zh) 从多孔吸附材料中提取微生物dna的试剂盒及提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080618

Termination date: 20160508