CN101063169A - 一种检测山羊催乳素基因单核苷酸多态性的pcr－rflp方法 - Google Patents
一种检测山羊催乳素基因单核苷酸多态性的pcr－rflp方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速检测山羊催乳素(PRL)基因单核苷酸多态性(SNP)的PCR－RFLP(聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性)方法，该方法是以山羊基因组DNA或包含PRL基因的DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg++、dNTPs存在的情况下，利用1对PCR(聚合酶链式反应)引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用限制性内切酶对其进行酶切，再根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其单核苷酸多态性。该方法操作简单、快速，成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测山羊催乳素(PRL)基因单核苷酸多态性(SNP)的PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)方法，该方法利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。
背景技术
所谓单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换(以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)以及颠换(嘌呤与嘧啶互换)所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在外显子内的变异率仅占周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即指碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响，为此，对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。
由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，其中DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，现有方法不是一种检测具有限制性酶切位点SNP的理想的遗传标记方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测山羊催乳素(PRL)基因单核苷酸多态性(SNP)的PCR-RFLP方法。该方法利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。
为了实现上述发明目的，本发明采取如下的技术方案：
一种检测山羊催乳素(PRL)基因SNP的PCR-RFLP方法，其特征在于，该方法以山羊基因组DNA或包含PRL基因DNA序列的DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、Buffer(缓冲环境)、Mg++、dNTPs存在的情况下，利用一对PCR(聚合酶链式反应)引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再通过电泳检测即可鉴定山羊PRL基因SNP。
所述的1对PCR引物包括：
上游引物Forward primer：5′-ATTCCTGGAGCCAAAGAG-3′；
下游引物Reverse primer：5′-TGTGGGCTTAGCAGTTGT-3′；
所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系包括1U Taq DNA聚合酶(MBI，Fermentas)，10×Buffer 2.5μL(MBI，Fermentas)，25mol/L MgCl21.5μL(MBI，Fermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，100ng山羊基因组DNA或含PRL基因序列的DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.25μL和灭菌超纯水15.0μL；
PCR反应程序为：95℃预变性4-5min，30-35个循环(94℃ 30s，58.5℃30s，72℃ 30s)，最后72℃延伸10min，4℃保存。
所述的PRL基因SNP位点为山羊PRL基因第5外显子的X76049：g.576C＞A变异；
所述的限制性内切酶为Eco24I；
25.0-30.0μL Eco24I酶切体系为：10-15μL中的PCR扩增产物，2.5-3.0μL 10×缓冲液(含BSA)，1.0-1.5μL浓度10U/μL的Eco24I限制性内切酶，11.5-16.5.0μL灭菌纯水(H2O)，酶切消化条件：37℃恒温水浴摇床中消化5-8h左右。
所述的电泳检测是用2.0-4.0％琼脂糖凝胶电泳分析限制性内切酶Eco24I消化PCR扩增产物(片段)，C突变表现为196bp，A突变表现为：170bp和26bp，相应地，CC型表现为：170bp，26bp；CA型表现为：196bp，170bp，26bp；AA型表现为：196bp。
催乳素(PRL)是脊椎动物腺垂体分泌的单链多肽类激素，属于生长激素/催乳素家族，具有促进乳腺发育、启动泌乳和维持泌乳的功能，是繁殖成功所必需的垂体前叶肽类激素，同时，它还可以直接或间接影响毛皮动物毛的生长、脱落以及替换周期、刺激哺乳动物角质化细胞的生长、增加培养皮肤细胞的成活率，毛发生长的季节性周期中起到重要作用。为此，PRL基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对泌乳性状、生长发育、繁殖和产绒性状具有重要的作用。关于动物PRL基因遗传变异的研究国内外多见于鸡、牛等动物，而未见山羊PRL基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前中国山羊PRL基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如：泌乳、生长发育、繁殖和产绒等性状)关联的研究成为空白。而本发明所述的方法为检测中国山羊PRL基因遗传变异提供了技术支持；同时，由于本发明所述方法检测的中国山羊PRL基因第5外显子SNP位点为错义突变(X76049：g.576C＞A突变导致第176位氨基酸由Pro变成Thr)，可能影响具有重要生理功能的PRL蛋白的功能，为此，利用本方法检测的SNP位点为研究PRL功能及PRL SNP与泌乳、生长发育、繁殖和产绒性状关系提供科学数据，为山羊遗传育种领域标记辅助选择(MAS)在早期泌乳、生长发育、繁殖和产绒性状的运用提供宝贵资料。
PCR-RFLP方法作为一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后利用廉价限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶分析后，就能准确地鉴别SNP位点。不仅具有DNA测序列法的准确性，又克服了费用昂贵的缺点；不仅具有操作简单的自身特点，又克服了PCR-SSCP与测序结合法的繁琐操作、假阴性缺点；不仅具有AS-PCR方便易行的特点，又克服了特殊性的缺点；不仅具有引物延伸法和寡核苷酸连接反应检测的高通量性的特点，不需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，又克服分子实验室可行性差的缺点。因此，PCR-RFLP方法是一种检测具有限制性酶切位点SNP的非常理想的遗传标记方法。
附图说明
图1为山羊血样基因组DNA电泳检测图；
图2为山羊组织样品基因组DNA检测电泳图；
图3为山羊PRL基因PCR产物电泳；
图4为山羊PRL基因第5外显子196bp PCR产物的Eco24I酶切电泳分析(2.0-4.0％琼脂糖凝胶电泳)；其中，泳道1：未进行酶切消化的PCR产物(196bp)；泳道2：CA基因型个体(196bp，170bp，26bp)；泳道3：CC基因型个体(170bp，26bp)；M：Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)另外，由于26bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不可见，但196bp和170bp片段能鉴别CC型和CA型。
图5为山羊PRL基因第5外显子不同基因型SNP位点测序图；
图6为Eco24I PCR-RFLP方法检测山羊PRL基因第5外显子SNP(X76049：g.576C＞A)分析；
下面结合附图说明和发明人给出的最佳实施方式对本发明做进一步的详细说明，以使公众对发明内容从整体上得到充分的理解，而并非对本发明保护范围的限定。
具体实施方式
以下实施例中所用的主要试剂来源：
(一)实验药品与试剂
1.生化试剂与生物学试剂：
①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；
②限制性内切酶Eco24I(购自MBI公司)；
③蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；
④PBR322 DNA/MspI和λDNA/EcoRI+HindIII DNA Marker购自上海生工生物工程有限公司和华美生物工程公司；
⑤Marker I：购自北京天为时代科技有限公司；
⑥dNTPs：购自北京鼎国生物工程有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司。
2.普通试剂：
普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。
3.溶液与缓冲液
所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×105Pa)，25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。
(1)样品采样所用溶液：
抗凝剂ACD：柠檬酸0.48g；柠檬酸钠1.32g；葡萄糖1.47g。把它们定容于100mL水中，高压灭菌。每6mL新鲜血液中加入1mL的ACD液。这一抗凝剂优于EDTA，在血液贮存过程中能更好地保存高分子的DNA。经其抗凝的血液可以在0℃保存数天或-70℃长期保存。
(2)血样基因组DNA分离所用溶液：
①PBS缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加超纯水至1000mL，调pH至7.4，高压灭菌。
②10％ SDS：10g SDS溶解于90mL的超纯水中，68℃水浴溶解，用HCl调pH至7.2，定容至100mL。
③0.5mol/L EDTA：EDTA 186.1g，溶于800mL的超纯水中，用NaOH调pH至8.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。
④1mol/L Tris·Cl：121.14g Tris，溶于800mL超纯水中，HCl调节pH至8.0，定容至1000mL。高压灭菌，4℃保存。
⑤5mol/L NaCl：NaCl 292.2g溶于1000mL超纯水中。
⑥DNA抽提缓冲液：取0.5mmol/L EDTA 40mL，1mmol/L Tris·Cl 10mL，
⑦5mmol/L NaCl 4mL，10％SDS 10mL定容至100mL。实际浓度为200mmol/L EDTA，pH8.0：100mmol/L Tris·HCl，pH8.0，200mmol/L NaCl，2％ SDS。RNase 20μg/mL。
⑧NaAc缓冲液：NaAc·3H2O 20.4g；超纯水40mL；稀HAc调pH至7.4；定容至50mL。
⑨TE缓冲液：Tris·Cl缓冲液(pH8.0)10mmol/L，EDTA缓冲液(pH8.0)0.1mmol/L，高压灭菌，4℃保存。
⑩蛋白酶K：用超纯水配成20mg/mL，-20℃保存。
(3)提取组织样DNA所用溶液：
除了基因组DNA提取时的公用溶液外，还配置以下试剂：
①2mol/L NaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。
②组织DNA提取液(100mL)：1mol/L Tris-Cl(pH8.0)1mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。
(4)琼脂糖电泳分析所用溶液
①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。
②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40.0％(w/v)蔗糖水溶液。
实施例1：山羊样本采集及基因组DNA提取、检测、纯化与浓度分析
A、实验动物的采集
8个山羊品种(见表1)：内蒙古白绒山羊(847)、陕西西农萨能奶山羊(74)、关中奶山羊(62)、山东崂山奶山羊(80)、贵州黑山羊(21)、贵州白山羊(34)、四川板角山羊(25)、湖北马头山羊(22)。
表1样品来源表
| 品种 | 样品 | 样品名称 | 样品来源 | 采样方式 | 采样时间 |
| 内蒙古白绒山羊(IMWC) | 847 | 耳组织样与血样 | 内蒙古鄂尔多斯市额托克旗内蒙古阿尔巴斯型白绒山羊种羊场 | 随机采样 | 2006.4.24-2006.5.4；2006.10-2006.11月 |
| 西农萨能奶山羊(Sa) | 74 | 血样 | 陕西千阳西农萨能奶山羊种羊场核心群 | 随机采样 | 2001.7-9月 |
| 关中奶山羊(GZ) | 62 | 血样与组织样品 | 学校动物实验中心；陕西丹凤种羊场；关中地区屠宰场；关中地区屠宰场 | 随机采样；不同系谱随机采样； | 2003.5月；1998-1999年；2002.1-2月 |
| 崂山奶山羊(LS) | 80 | 组织样 | 山东绿绵公司 | 随机采样 | 2006年 |
| 贵州黑山羊(GB) | 21 | 组织样 | 贵州 | 随机采样 | 2004-2005年 |
| 贵州白山羊(GW) | 31 | 组织样 | 贵州 | 随机采样 | 2004-2005年 |
| 板角山羊(BJ) | 25 | 组织样 | 四川 | 随机采样 | 2004-2005年 |
| 马头山羊(MT) | 22 | 组织样 | 湖北 | 随机采样 | 2004-2005年 |
B、血样基因组DNA的分离
血样基因组DNA的分离，具体操作如下：
(1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清夜透明、沉淀呈淡黄色。
(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。
(3)加蛋白酶K至30μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加10μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清。
(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。
(5)加氯仿500mL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。
(6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500mL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。
(7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。
(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
(9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。
(10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。
C、组织样品DNA的提取与分离
(1)取耳组织样约10mg的组织样品，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。
(2)加入600μL组织提取液，10％SDS至终浓度为1％，蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜，最好保证组织样较均匀地分布在组织提取液中。
(3)将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。
(4)取上清液，加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。
(5)取上清液，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。
(6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮DNA。
(7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。
(8)再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。
(9)待干燥后，加入60μL灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。
D、琼脂糖凝胶电泳检测DNA
(1)将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。
(2)称取0.24g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×TAE 30mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出。
(3)迅速向另一个三角瓶加入EB溶液至终浓度为0.5μg/mL，然后快速将琼脂糖溶液导入，轻微摇动，防止出现气泡。
(4)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。
(5)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中。
(6)向电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。
(7)取DNA样品2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，统一上样(注意枪头的顺序应前后对应)，并将DNA Marker加在一边。
(8)80V电压电泳2h。
(9)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解不能用，需重新提取相应样品的DNA。
E、DNA的纯化
(1)500μL的DNA溶液中加入10％ SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。
(2)5℃保温10h左右。
(3)等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次。
(4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。
(5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。
(6)倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。
F、分光光度法检测DNA
用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD260/OD280的比值。如OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。
DNA浓度(ng)＝50×OD260值×稀释倍数
DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。
结果：
山羊血样基因组DNA、组织样基因组DNA的检测结果分别见图1和图2，图1中1-10为山羊血样基因组DNA，M：λDNA/EcoRI+HindIII，图2中1-8为不同山羊DNA；M：λDNA/EcoRI+HindIII，从图中表明山羊基因组DNA的质量非常高。
实施例2：山羊PRL基因第5外显子的PCR扩增
A、山羊PRL基因第5外显子196bp片段PCR引物的设计
以山羊X76049序列为参考，利用Primer 5.0设计山羊PRL基因第5外显子196bp片段的PCR引物，其引物序列如下：
上游引物(Forward primer：5’-ATTCCTGGAGCCAAAGAG-3’)；
下游引物(Reverse primer：5’-TGTGGGCTTAGCAGTTGT-3’)；
该引物扩增了山羊PRL基因第5外显子区域(以X76049序列为参考，在552-747区域)
B、PCR反应条件
反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个Eppendorf管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。PCR反应体系见表2：
表2 PCR反应体系
| 灭菌超纯水(H2O) | 15.0μL |
| 10×PCR缓冲液(MBI，Fermentas) | 2.5μL |
| MgCl2(25mmol/L) | 1.5μL |
| dNTPs(2.5mmol/L) | 2.5μL |
| 上游引物(10pmol/L) | 0.25μL |
| 下游引物(10pmol/L) | 0.25μL |
| Taq DNA聚合酶(0.5U/μL) | 2.0μL |
| DNA模板(100ng/μL) | 1.0μL |
| 总体积 | 25μL |
25μL反应体系包括1 U Taq DNA聚合酶(MBI，Fermentas)，10×Buffer 2.5μL(MBI，Fermentas)，25mol/L MgCl2 1.5μL(MBI，Fermentas)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，100ng山羊基因组DNA或含PRL基因序列的DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.25μL；
C、PCR反应的程序见表3：
表3 PCR反应程序
D、琼脂糖凝胶电泳检测及Kada120系统的成像分析
(1)制作2.0-4.0％的琼脂糖凝胶，100V电压电泳0.5～1h，EB染色。
(2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在Kodak DC 120凝胶成像系统成像。
(3)根据图像判断基因的PCR效果。
结果：
PCR扩增结果见图3，图中泳道1为PCR产物(196bp)；M为MaekerI(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)
表明：PCR片段的大小为196bp，与理论设计的大小完全一致。故此，成功扩增出山羊PRL基因第5外显子区域DNA片段。
实施例3：山羊PRL基因DNA片段的Eco24I PCR-RFLP分析
利用实施例2中的山羊PRL基因第5外显子的196bp片段的PCR引物和PCR扩增条件，对实施例1中8个山羊品种的1000多份基因组DNA(已经DNA检测、纯化和浓度测定分析)进行PCR扩增，获得1000多个体的山羊PRL基因中包含SNP位点的DNA片段，然后利用如下方法进行Eco24I的PCR-RFLP分析，具体方法如下：
A、Eco24I酶切反应的消化体系
Eco24I酶切体系(25-30μL)：10-15μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5-3.0μL，Eco24I(10U/μL)为1.0-1.5μL，11.5-16.5.0μL灭菌纯水(H2O)。
B、酶切消化条件
37℃恒温水浴摇床中消化5-8h。
C、Eco24I消化PCR产物后的图象分析
用Kodak DC 120凝胶成像分析系统照相分析，并人工进行判型；
D、不同基因型个体PCR产物的测序验证
利用ABI 377和ABI 3730测序仪对代表性的不同基因型个体PCR分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置进行分析。
E、山羊PRL基因SNP位点的频率统计分析
(1)基因和基因型频率
基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。PCR-RFLP、PCR-SSCP及微卫星等其检测结果是共显性等位基因，故表型频率和基因型频率一致。
PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+NAa4+......+NAan)/2N
式中，PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。
结论：
利用2.0％-4.0％琼脂糖凝胶电泳分析Eco24I限制性内切酶消化196bp的PCR扩增片段结果见图4，图中泳1为未进行酶切消化的PCR产物(196bp)，泳道2为CA基因型个体(196bp，170bp，26bp)，泳道3为CC基因型个体(170bp，26bp)，M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。由于26bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不可见，但196bp和170bp片段能鉴别CC型和CA型。表明：C碱基突变表现：170bp和26bp条带，A突变表现为：196bp条带，相应地，CC型表现：170bp和26bp条带；CA型表现：196bp，170bp，26bp条带；AA型表现：170bp和26bp条带。不同基因型个体的DNA正、反双向DNA测序结果见图5，图中CC基因型表现X76019：g.576C突变，CA基因型表现X76019：g.576C＞A突变。经过分析，发现Eco24I PCR-RFLP检测的SNP的位置如图6所示，X76019：g.576C＞A，对应于X76049序列的第576位置(即PRL基因CDS区第526位核苷酸位置)，导致第176位氨基酸密码子由CCC＞ACC，从而形成错义突变176Pro＞176Thr，同时，该位点能形成Eco24I(GRGCYC)多态，是Eco24I PCR-RFLP方法能检测该SNP的分子机理。等位基因在不同山羊品种PRL基因SNP的C等位基因频率变化幅度为在78.60-93.50％，A等位基因频率变化幅度在6.5-21.4％之间(见表4)。由于SNP位点的等位基因要求大于1.0％，因此，本实施例中利用Eco24I PCR-RFLP检测PRL基因第5外显子的SNP位点(X76019：g.576C＞A)。
表4 山羊PRL基因SNP位点的Eco24I PCR-RFLP的频率分布表
| 山羊品种 | 基因型的观测数目 | 总计 | 等位基因频率 | |||
| CC | CA | AA | C | A | ||
| 内蒙古白绒山羊 | 674 | 173 | 0 | 847 | 0.898 | 0.102 |
| 西农萨能奶山羊 | 53 | 21 | 0 | 74 | 0.858 | 0.142 |
| 崂山奶山羊 | 62 | 18 | 0 | 80 | 0.888 | 0.113 |
| 关中奶山羊 | 54 | 8 | 0 | 62 | 0.935 | 0.065 |
| 贵州黑山羊 | 12 | 9 | 0 | 21 | 0.786 | 0.214 |
| 马头山羊 | 16 | 6 | 0 | 22 | 0.864 | 0.136 |
| 板角山羊 | 16 | 9 | 0 | 25 | 0.820 | 0.180 |
| 贵州白山羊 | 19 | 12 | 0 | 31 | 0.806 | 0.194 |
Claims (7)
1.一种检测山羊催乳素基因单核苷酸多态性的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，其特征在于，以山羊基因组DNA或包含PRL基因的DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg++、dNTPs存在的情况下，利用一对聚合酶链式反应引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，再通过电泳检测即可鉴定山羊催乳素基因单核苷酸多态性；
所述的聚合酶链式反应引物包括：
上游引物：Forward primer：5′-ATTCCTGGAGCCAAAGAG-3′；
下游引物：Reverse primer：5′-TGTGGGCTTAGCAGTTGT-3′。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括1U Taq DNA聚合酶，10×Buffer 2.5μL，25mol/LMgCl2 1.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，100ng山羊基因组DNA或含催乳素基因序列的DNA，10pmol/μL，上、下游引物各0.25μL，灭菌超纯水15.0μL；
PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，58.5℃30s，72℃30s共30～35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的催乳素基因单核苷酸多态性位点为山羊催乳素基因第5外显子的X76049：g.576C＞A变异位点。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的限制性内切酶为Eco24I；
25-30μL Eco24I酶切体系为：10-15μL的PCR扩增产物，2.5-3.0μL10×缓冲液，其中含BSA，1.0-1.5μL的浓度10U/μL的Eco24I限制性内切酶，11.5-16.5μL灭菌纯水H2O，酶切消化条件：37℃恒温水浴摇床中消化5-8h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的限制性内切酶为能切割该位点的相应的限制型内切酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的电泳检测是用2.0-4.0％琼脂糖凝胶电泳分析限制性内切酶Eco24I消化PCR扩增片段，C突变表现为196bp，A突变表现为：170bp和26bp，相应地，CC型表现为：170bp，26bp；CA型表现为：196bp，170bp，26bp；AA型表现为：196bp。
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