CN101921853A - 一种快速检测山羊Lhx3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测山羊Lhx3基因单核苷酸多态性(SNP)的PCR-RFLP方法，其基因多态性为：在山羊Lhx3基因第5557位T或C的碱基多态性。上述山羊Lhx3基因的单核苷酸多态性的检测方法为：以包含Lhx3基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊Lhx3基因；用限制性内切酶消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊第5557位的单核苷酸多态性。该方法操作简单，快速，成本低，而且检测的精确度高，便于推广应用。

Description

一种快速检测山羊Lhx3基因单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测山羊Lhx3基因单核苷酸多态性(SNP)的PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA中单个核苷酸变异引起的一种二等位基因，或二态的遗传变异，即在该位置上存在两种不同的碱基。其核苷酸的变异形式有转换、颠换、插入、缺失等，而且其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％。研究表明，单碱基的突变，尤其是编码区的单碱基突变，会影响个体的表型，因此，基于SNP的分子标记技术可以用于家畜优良品种的选育。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。

目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，其中DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。综上所述，以上现有方法不是一种检测具有限制性酶切位点SNP的理想的遗传标记方法。

然而，PCR-RFLP方法是一种检测影响限制性酶切位点的SNP的有效技术，在发现SNP位点后利用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

LIM同源框基因(LIM homeobox gene)，属于同源框基因(homeobox gene)家族。LIM同源框基因的蛋白质翻译产物不仅具有同源框结构域(homeodomain，HD)，而且含有2个富含半胱氨酸和组氨酸的LIM结构域(LIMdomain)。LIM同源框基因的蛋白质翻译产物LIM同源框转录因子(LIMhomeodomain transcription factor，LIM-HD)，作为一类家族性转录因子调控体内一些基因的表达，决定了组织和细胞的特异性分化。同源盒基因3(LIM-homeo box 3，Lhx3)，属于LIM同源框基因家族，在垂体以及神经系统发育过程中发挥重要作用，是一个非常重要的转录调控因子。由于Lhx3基因及其表达产物在垂体早期发育以及垂体激素分泌过程中发挥关键作用，尤其是对于催乳素以及生长激素的调控，揭示了该基因对于山羊的泌乳以及生长发育等方面可能发挥重要作用。已有研究报道，人Lhx3基因突变包括：Y116C，23bp缺失，第159位T碱基缺失，A210V，E173X，W224X，K50X和内含子3的突变，这些均引起了催乳素(PRL)和生长激素(GH)等分泌的不足(Davis et al.，2010；Bhangoo et al.，2006；Ellsworth et al.，2008)。在家畜中，仅见Jing等(2008)首次揭示中国黄牛Lhx3基因外显子2及其侧翼区存在3处SNP，其中有一处为同义突变。

目前，关于山羊Lhx3基因多态性及其检测方法的研究尚未见报道。因此，本发明利用PCR-RFLP对山羊Lhx3基因一个SNP，为分析该基因遗传变异与经济性状的关联奠定基础，有利于该基因作为山羊标记辅助选择(MAS)应用于山羊遗传育种实践。

参考文献

Bhangoo AP，Hunter CS，Savage JJ，Anhalt H，Pavlakis S，Walvoord EC，Ten S，Rhodes SJ，2006.Clinical case seminar：a novel LHX3 mutation presenting as combined pituitaryhormonal deficiency.J.Clin.Endocrinol.Metab.91，747-753

Davis SW，Castinetti F，Carvalho LR，Ellsworth BS，Potok MA，Lyons RH，Brinkmeier ML，Raetzman LT，Carninci P，Mortensen AH，Hayashizaki Y，Arnhold IJP，Mendon BB，Brue T，Camper SA.Molecular mechanisms of pituitary organogenesis：In search ofnovel regulatory genes.Molecular and Cellular Endocrinology 323(2010)4-19.

Ellsworth BS，Butts DL，Camper SA，2008.Mechanisms underlying pituitary hypoplasia andfailed cell specification in Lhx3-deficient mice.Dev.Biol.313，118-129.

Jing Yongjie，Xianyong Lan，Chen Hong，Liangzhi Zhang，Chunlei Zhang，Chuanying Pan，Mijie Li，Gang Ren，Tianbao Wei，Miao Zhao.Three novel single nucleotidepolymorphisms(SNPs)of the LHX3 gene in bovine.Journal of Biosciences，2008，33(5)：673-679.

Sambrock J，Fritsch EF and Maniatis T(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.3rdedition.Cold Spring Harbor，New York.

发明内容

本发明的目的是提供一种检测山羊Lhx3基因单核苷酸多态性(SNP)的PCR-RFLP方法。该方法利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种快速检测山羊Lhx3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，以山羊基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg⁺⁺、dNTPs存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用特定的限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定山羊Lhx3基因第5557位单核苷酸多态性；

所述的聚合酶链式反应引物对P包括：

上游引物F：5′-GCCCCTCCTATCCAGCTT-3′，共18个核苷酸(nt)；

下游引物R：5′-AGAACTGAGCGTGGTCC-3′，共17个核苷酸(nt)。

所述的PCR-RFLP方法，所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 12.5μL<内含Mg⁺⁺、dNTPs等>，0.45μL山羊基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL；

PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，60.8℃30s，72℃15s共33个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

所述的PCR-RFLP方法，用于检测山羊Lhx3基因第5557位单核苷酸多态性的限制性内切酶为MspI；酶切体系为20μL，包括：1μL(10U/μL)限制性内切酶，10μL PCR产物，2μL酶切Buffer，7μL灭菌蒸馏水。

所述的PCR-RFLP方法，山羊Lhx3基因的多态性为：基因组第5557位外显子6的T＞C突变。

所述的PCR-RFLP方法，所述的琼脂糖凝胶浓度为2.5％。

所述的PCR-RFLP方法，通过电泳判定山羊Lhx3基因第5557位的碱基多态性为：TT基因型表现为166和34bp条带；TC基因型表现为166，90，76和34bp条带；CC基因型表现为90，76和34bp条带。

与现有技术相比，本发明把DNA池测序筛查SNP与PCR-RFLP结合起来解决了SSCP的不稳定性和测序技术的昂贵性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测遗传标记，有利于山羊的分子标记辅助选择(MAS)数据库的建立和分子育种。

本发明根据Lhx3基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序后得到如HM446543的山羊的Lhx3基因的部分序列。其中，在HM446543中：1-200位均是外显子6。在第124位存在SNP多态性。

针对上述SNP多态性，本发明公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增特定的限制性内切酶RFLP鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

附图说明

图1是本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计和扩增产物中SNP位点突变的示意图，其中方框中表示突变位点；

图2是本发明多态性检测的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中琼脂糖凝胶浓度为1.0％；

图3是本发明中山羊Lhx3基因第5557位的MspI-RFLP的三种基因型电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为2.5％；

图4是本发明中PCR克隆筛选到的山羊Lhx3基因的5557位T-C突变的SNP多态性测序结果图。

具体实施方式

本发明根据Lhx3基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序后得到如HM446543的山羊的Lhx3基因的部分序列。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

I、山羊Lhx3基因部分DNA序列的克隆与DNA测序

1、山羊血样的采集及处理

取山羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了4种山羊品种共计1073个个体，包括2个奶山羊品种，1个绒山羊品种和1个肉用山羊品种，具体为：(1)关中山羊血样229份采自陕西省西安市三原塔南保种场；(2)萨能山羊血样197份采自陕西省宝鸡市千阳县萨能山羊繁育中心；(3)内蒙古白绒山羊血样366份采自内蒙古鄂尔多斯市额托克旗内蒙古阿尔巴斯型白绒山羊种羊场；(4)海南黑山羊血样281份采自海南省。

2、血样基因组DNA的提取

参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从关中奶山羊品种30个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；按照同样的方法也构建萨能奶山羊、内蒙古白绒山羊和海南黑山羊品种DNA池。

4、扩增引物设计

由于山羊Lhx3基因的序列至今未知，故从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得同源动物牛的GenBank登录号为：No.AY923832和NC_007309的Lhx3基因DNA序列，以该基因序列的保守区序列为参考，利用Primer 5.0设计山羊Lhx3基因外显子的PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物F：5′-GCCCCTCCTATCCAGCTT-3′，共18个核苷酸(nt)；

下游引物R：5′-AGAACTGAGCGTGGTCC-3′，共17个核苷酸(nt)。

5、PCR克隆山羊的Lhx3基因

分别以4个山羊品种的DNA池为模板，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL<内含Mg⁺⁺、dNTPs等>(北京天根科技有限公司Mix)，0.45μL山羊基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL；

PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，60.8℃30s，72℃15s共33个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作。

把以四个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。山羊Lhx3基因目的片段200bp测序结果如HM446543所示。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图4中TC型左起第10个位点为发生了单核苷酸的突变，出现了C、T两种检测结果，即本发明筛查到了山羊Lhx3基因的SNP多态性，在山羊Lhx3基因第5557位(HM446543第124位)为T或C的碱基多态性.

II、山羊Lhx3基因T＞C突变多态性的PCR-RFLP检测

1、多态位点分析

当第5557位点发生T＞C突变时，即T突变为C，原来CTGG序列相应地变成CCGG，从而形成了MspI限制性内切酶识别序列。

2、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面所述，PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2所示，可以清晰的看到200bp的条带。

3、PCR产物酶切及RFLP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别进行MspI酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

20μL的MspI酶切体系为：10μL PCR产物，10×Buffer(含BSA)2.0μL，TaqI(10U/μL)1.0μL，7.0μL灭菌双蒸水。将样品混匀后离心，37℃恒温培养箱中消化5～10h，2.5％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1h，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC 120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。由于扩增的200bp片段中第33-36为含有一个MspI的酶切位点，故多态位点含有“T”的个体的PCR产物会被MspI切成两段(166bp和34bp)；含有“C”的个体的PCR产物会被MspI切成三段(90bp、76bp和34bp)。

由于山羊为二倍体动物，当发生T＞C突变时，可形成不同的基因型，分别为CC、TC和TT；可以通过其酶切后的电泳图来进行判别，如图3所示，其中各个泳道从左到右依次为TT、TC、TT、CC、DNA Maker(其条带分布由上到下依次为600、500、400、300、200、100bp)。根据条带的个数和条带的大小，如图3，就能够判定第5557位的碱基类型，从而检测其SNP。

III、本发明制备的分子标记在不同山羊群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对DNA样品(关中山羊229份、萨能山羊197份、内蒙古白绒山羊366份和海南黑山羊281)分别进行MspI-RFLP(图3)的基因型的鉴定。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有A_ai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表1。

表1四个山羊品种中Lhx3基因MspI位点的基因型和等位基因频率

从表1可以看出，乳用品种(莎能山羊和关中山羊)、肉用品种(海南黑山羊)和绒用品种(内蒙古白绒山羊)的T和C等位基因频率均大于1％，符合SNP的定义标准。

因此，本发明首次成功利用MspI PCR-RFLP方法检测了山羊Lhx3基因的SNP位点。

Claims (6)

1.一种快速检测山羊Lhx3基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP方法，其特征在于，以山羊基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg⁺⁺、dNTPs存在的情况下，利用聚合酶链式反应引物，在PCR条件下进行扩增，然后利用特定的限制性内切酶对其进行酶切，再通过电泳检测即可准确鉴定山羊Lhx3基因第5557位单核苷酸多态性；

所述的聚合酶链式反应引物对P包括：

上游引物F：5′-GCCCCTCCTATCCAGCTT-3′，共18个核苷酸(nt)；

下游引物R：5′-AGAACTGAGCGTGGTCC-3′，共17个核苷酸(nt)。

2.根据权利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的PCR扩增的条件是：25μL反应体系，包括0.625U Taq DNA聚合酶，2×Buffer 12.5μL<内含Mg⁺⁺、dNTPs等>，0.45μL山羊基因组DNA，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL和灭菌超纯水10.8μL；

PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，60.8℃30s，72℃15s共33个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

3.根据权利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，用于检测山羊Lhx3基因第5557位单核苷酸多态性的限制性内切酶为MspI；酶切体系为20μL，包括：1μL(10U/μL)限制性内切酶，10μLPCR产物，2μL酶切Buffer，7μL灭菌蒸馏水。

4.根据权利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，山羊Lhx3基因的多态性为：基因组第5557位外显子6的T＞C突变。

5.根据权利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶浓度为2.5％。

6.根据权利要求1所述的PCR-RFLP方法，其特征在于，通过电泳判定山羊Lhx3基因第5557位的碱基多态性为：TT基因型表现为166和34bp条带；TC基因型表现为166，90，76和34bp条带；CC基因型表现为90，76和34bp条带。

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