CN101871006B - 一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因多态性包括：在奶山羊的weaver基因第99045位为T或C的碱基多态性；在奶山羊的weaver基因第99116位为T或C的碱基多态性。上述奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性为：以包含weaver基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊weaver基因；用限制性内切酶消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的单核苷酸多态性。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的分子遗传标记，可用于奶山羊的分子育种。

Description

一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性及其检测方法

技术领域

本发明生物技术领域，涉及奶山羊单核苷酸多态性(SNP)分子标记的筛查和检测，特别涉及一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性及其检测方法。

背景技术

羊奶具有很高的营养价值，不含过敏原，营养成分均衡，易消化吸收，与人乳蛋白质组成相似，在国际营养界被誉为“奶中之王”。但是，我国羊奶的生产同发达国家相比差距巨大，主要是因为我国优秀奶山羊品种种源不足和种群遗传品质较差。

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的产奶量和改善乳品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记，其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；直接测序技术成本较高。

在哺乳动物中，weaver基因编码G蛋白偶联内向整流钾通道蛋白的亚单元，属于内向整流钾通道四个亚家族中的一员，在各种组织中广泛分布，特别在中枢神经系统中与多种受体偶联。Weaver基因在脑、心、肾和分泌细胞功能执行过程中扮演着非常重要的角色，同时它也间接地调控生长激素和胰岛素的分泌。

奶牛的weaver综合症是奶牛品种中存的一种常染色体单隐性基因控制的遗传缺陷。但一些研究表明，weaver基因与奶牛产奶性状存在显著的相关。Hoeschele和Meinert报道携带weaver症状的母牛的平均产奶量较正常纯合子高673.6Kg，乳脂率高26.0Kg(Hoeschele I，Meinert TR.Association of geneticdefects with yield and type traits：The weaver locus effect on yield.J Dairy Sci，1990，73：2503-2515.)。单雪松等研究表明，该基因的BMS2321和TGLA116微卫星位点对乳蛋白量、乳蛋白率的影响分别达到0.01的极显著水平和0.05的显著水平(单雪松，张沅，李宁.奶牛微卫星基因座与产奶性能关系的研究.2002，29(5)：430-433.)。

而对同源动物奶山羊的产奶性状的基因研究来说，奶山羊weaver基因的分子遗传变异特性的基础研究，不仅有利于遗传缺陷的控制，还有助于探明奶山羊产奶性状的遗传基础，从而进一步探寻应用分子遗传标记辅助选择来提高奶山羊生产性能的方法。但至今，weaver综合症的分子遗传机制在奶山羊中的研究国内外都没有报道。

发明内容

本发明解决的问题在于利用DNA池测序的方法筛查奶山羊weaver基因的目的DNA序列的多态性，寻找与奶山羊泌乳性状相关的SNP作为分子标记，提供一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性及其检测方法，以此作为奶山羊分子育种和标记辅助选择的分子遗传标记，加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性，其基因多态性包括：

在奶山羊的weaver基因第99045位为T或C的碱基多态性；

在奶山羊的weaver基因第99116位为T或C的碱基多态性。

上述奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性的检测方法为：以包含weaver基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊weaver基因；

所述的引物对P为：

正向引物：gcatccaaga gtttccctg            19；

反向引物：cttcacctca cctgggtcct gtaagc    26；

用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的weaver基因第99045位的碱基多态性；

用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的weaver基因第99116位的碱基多态性。

所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0％。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的weaver基因第99045位的碱基多态性为：TT基因型表现为173bp条带；TC基因型表现为173，98和75bp条带；CC基因型表现为98和75bp条带。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊的weaver基因第99116位的碱基多态性为：TT基因型表现为173bp条带；TC基因型表现为173，148和25bp条带；CC基因型表现为148和25bp条带。

与现有技术相比，本发明把DNA池测序筛查SNP与CRS-RFLP结合起来解决了SSCP的不稳定性和普通RFLP的局限性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记，可用于奶山羊的分子育种。

本发明根据weaver基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序后得到如SEQ ID NO.1的奶山羊的weaver基因的部分序列。其中，在SEQ ID NO.1中：1-172位是部分内含子4；173-498位是外显子5；498-1212位是3端侧翼区。在第912位、第983位存在SNP多态性。

针对上述两个SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增特定的限制性内切酶RFLP鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对上述两个SNP进行了与产奶量的关联分析，对2个奶山羊品种和2个绒山羊样品的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，结果表明两个位点联合检测能够成为绒山羊与奶山羊的区分特征；

对TaqI和HhaI多态位点与莎能奶山羊各胎泌乳量之间的方差分析表明，TaqI识别的SNP位点能够成为提高奶山羊第一胎产奶量的分子标记。

附图说明

图1是本发明的技术流程示意图；

图2是本发明中PCR克隆筛选到的奶山羊weaver基因的99045位C-T突变的SNP多态性测序结果图；

图3是本发明中PCR克隆筛选到的奶山羊weaver基因的99116位C-T突变的SNP多态性测序结果图；

图4是本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计和扩增产物中SNP位点突变的示意图，其中方框中表示突变位点、带波浪下划线为内切酶识别序列，小写“g”是引入的错配碱基；

图5是本发明多态性检测的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中琼脂糖凝胶浓度为1.0％；

图6是本发明中奶山羊weaver基因第99045位的TaqI-RFLP的三种基因型电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为3.0％；其中，T₁T₂基因型表现为173，98和75bp条带，T₁T₁基因型表现为98和75bp条带，T₂T₂基因型表现为173bp条带；

图7是本发明中奶山羊weaver基因3端侧翼区的HhaI-CRS-RFLP的三种基因型电泳结果，琼脂糖凝胶浓度3.0％；其中，H₁H₂基因型表现173，148和25bp条带，H₁H₁基因型表现为148和25bp条带，H₂H₂基因型表现为173bp条带；由于25bp较小，故在琼脂糖电泳分析中看不到，但不影响判别基因型。

具体实施方式

本发明根据weaver基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序后得到如SEQ ID NO.1的奶山羊的weaver基因的部分序列。其中，在SEQ ID NO.1中：1-172位是部分内含子4；173-498位是外显子5；498-1212是3端侧翼区。在第912位、第983位存在SNP多态性。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、山羊weaver基因部分DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、山羊血样的采集及处理

取山羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了4种山羊品种，包括2中奶山羊和绒山羊，具体为：

1)关中奶山羊血样440份采自陕西省西安市三原塔南保种场；

2)萨能奶山羊血样268份采自陕西省宝鸡市千阳县萨能奶山羊繁育中心(201份)和西北农林科技大学奶山羊场(67份)；

3)陕北白绒山羊血样192份采自陕西省横山县陕北白绒山羊种羊场；

4)新疆白绒山羊血样119份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；

2、血样基因组DNA的提取

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0。4℃保存备用。

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

3、DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从关中奶山羊品种30个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；

按照同样的方法也构建萨能奶山羊、陕北白绒山羊、新疆白绒山羊品种DNA池。

4、扩增引物设计

由于山羊weaver基因的序列至今未知，故从NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得同源动物牛的GenBank登录号为：NW_001493808的weaver基因DNA序列，以该基因序列保守区序列为参考利用Primer 5.0设计山羊weaver基因3端侧翼区1212bp片段的PCR引物对，其引物对序列如下：

正向引物：tctgttcctc cctgttac    18；

反向引物：tcagaacaga aatgcctact  20。

5、PCR克隆山羊的weaver基因

分别以4个山羊品种的DNA池为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为25μL，见表1；PCR总反程序，见表2。

表1本发明的PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		10×PCR缓冲液(MBI)	2.5
MgCl2(25mmol/L)	1.5
		dNTPs(2.5mmol/L)	2.5
上游引物(10pmol/L)	0.25
		下游引物(10pmol/L)	0.25
Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)	2.0
		DNA模板(50ng/μL)	1.0
灭菌超纯水(H2O)	15.0
		总体积	25.0

表2PCR反应程序

6、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以四个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。山羊weaver基因目的片段1212bp的测序结果如SEQ ID NO.1所示。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图2左起第4个位点、图3所左起第4个位点均为发生了单核苷酸的突变，出现了C、T两种检测结果，即本发明筛查到了奶山羊weaver基因的2个SNP多态性，分别为：在奶山羊的weaver基因第99045位(SEQ IDNO.1第912位)为T或C的碱基多态性，在第99116位(SEQ ID NO.1第983位)为T或C的碱基多态性。

奶山羊weaver基因第99045位点由C突变为T，称为T₁＞T₂突变；第99116位点由C突变为T，称为H₁＞H₂突变。

b、奶山羊weaver基因T₁＞T₂突变和H₁＞H₂突变多态性的PCR-RFLP检测

当第99045位点发生T₁＞T₂突变时，即C突变为T，原来的TaqI限制性内切酶识别序列TCGA也相应地变成TTGA，从而破坏了TaqI限制性内切酶识别序列；在99116位点无论发生H₁＞H₂突变与否，与周围的其他序列都不能形成内切酶识别序列，这时需要通过引物引入错配，使得引物3端和此处的突变型“H1”即“C”在PCR扩增后形成一个HhaI限制性内切酶识别序列GCGC，这样当第99116位点发生H₁＞H₂突变时，即C突变为T，内切酶识别序列GCGC相应变成GTGC，从而破坏了HhaI限制性内切酶识别序列。

1、RFLP-PCR引物设计

针对SEQ ID NO.1包含的第912位的T₁＞T₂突变，利用Primer 5.0进行发计引物，引物设计如图4所示，上游的正向引物设计为：

gcatccaaga gtttccctg    19；

针对SEQ ID NO.1包含的第983位的H₁＞H₂突变，利用引入酶切位点在线设计软件(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行设计引物，引物设计如图4所示，下游的反向引物设计为：

cttcacctca cctgggtcct gtaaGc    26；

G为引入错配的碱基，它与突变型“C”形成HhaI内切酶识别序列；

上述引物能够扩增了山羊weaver基因3端侧翼区173bp片段，其扩增的序列如图4所示，其中画框表明的两处“C＞T”即为SNP多态性位点。

2、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面表1和表2所述，PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图谱如图5所示，可以清晰的看到173bp的条带。

3、PCR产物酶切及RFLP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别进行TaqI酶切和HhaI酶切，然后根据电泳结果判定其SNP多态性。

20μL的TaqI酶切体系为：10μL PCR产物，10×Buffer(含BSA)2.0μL，TaqI(10U/μL)1.0μL，8.0μL灭菌双蒸水。将样品混匀后离心，65℃水浴5小时，3.0％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1.5小时，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC 120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；由于PCR扩增的173bp片段中不包含其它的TaqI酶切识别位点，因此与突变型“C”形成的酶切位点后，酶会将PCR扩增片段切为两个片段。

20μL的HhaI酶切体系为：10μL PCR产物，10×Buffer(含BSA)2.0μL，HhaI(10U/μL)为1.0μL，8.0μL灭菌双蒸水。将样品混匀后离心，37℃水浴5小时，3.0％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1.5小时，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC 120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；由于PCR扩增的173bp片段中不包含其它的TaqI酶切识别位点，因此突变型“C”形成的酶切位点后，酶会将PCR扩增片段切为两个片段。

由于山羊为二倍体动物，当发生T₁＞T₂突变时，可形成不同的基因型，分别为T₁T₁、T₁T₂、T₂T₂(CC、TC、TT)；可以通过其酶切后的电泳图来进行判别，如图6所示，其中各个泳道从左到右依次为DNAMaker(其条带分布由上到下依次为600、500、400、300、200、100bp)、T₂T₂、T₁T₂、T₁T₂、T₁T₁、T₁T₂、T₁T₁，其中纯合子T₂T₂的两条DNA链均不能被酶切，所以表现为173bp的条带；发生突变后的纯合子T₁T₁的两条链均能被酶切，所以表现为98bp和75bp的条带；杂合子T₁T₂的两条链中的一条能够被识别而另一条不能被识别，所以表现为173、98和75bp三条带；但是根据条带的个数和条带的大小，根据图6能够判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

当发生H₁＞H₂突变时，可能形成不同的基因型，分别为H₁H₁、H₁H₂、H₂H₂(CC、TC、TT)，可以通过其酶切后的电泳图来进行识别，如图7所示，其中各个泳道从左到右依次为DNA Maker(其条带分布由上到下依次为600、500、400、300、200、100bp)、H₂H₂、H₁H₁、H₁H₁、H₁H₂、H₁H₂、H₂H₂，其中纯合子H₂H₂的两条DNA链均不能被酶切，所以表现为173bp的条带；发生突变后的纯合子H₁H₁的两条链均能被酶切，所以表现为148和25bp的条带，但是由于25bp条带太小在电泳成像上没有显示；杂合子H₁H₂的两条链中的一条能够被识别而另一条不能被识别，所以表现为173、148和25bp三条带，其中25bp的条带在图7没有显示；但是根据条带的个数和条带的大小，根据图7能够判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

c、本发明制备的分子标记在不同山羊群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对萨能奶山羊268份DNA样品、关中奶山羊440份DNA样品、陕北白绒山羊192份样品和新疆白绒山羊119份分别进行TaqI-RFLP(图6)和HhaI-CRS-RFLP(图7)的基因型的鉴定。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+......+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3四个山羊品种中weaver基因两个多态位点的基因型和等位基因频率

从表3可以看出：乳用品种(莎能奶山羊和关中奶山羊)的T₂和H₂等位基因频率较绒用品种(内蒙古白绒山羊和陕北白绒山羊)高，这表明等位基因T₂、H₂可能与泌乳性状相关。在绒用品种(内蒙古白绒山羊和陕北白绒山羊)中不存在T₂T₂和H₂H₂基因型，这表明T₂T₂和H₂H₂基因型可以作为绒山羊与奶山羊区分特征。

3、基因效应的关联分析

基因型数据：TaqI识别的基因型(T₁T₁、T₁T₂和T₂T₂)

HhaI识别的基因型(H₁H、H₁H₂和H₂H₂)

生产数据：胎次(第一胎、第二胎和第三胎)和年产奶量

关联分析模型：

利用SPSS(16.0)软件分析基因位点、公畜、产羔季节、年龄和胎次因素与泌乳性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn＝μ+Genotype_i+S_j+LS_k+LN_l+Age_m+Xn+e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；LN_l胎次效应；S_j为种公畜效应；LS_k：产羔季节效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应，如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差；运用SPSS(16.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间产奶量指标进行差异显著性检验。

结果表明(见表4)：在HhaI可识别的SNP位点，三种基因型对这三胎的泌乳量影响均不显著(P＞0.05)；在TaqI可识别的SNP位点，对于第一胎T₂T₂和T₁T₂基因型个体的泌乳量高于T₁T₁基因型个体且差异显著(P＜0.05)。三种基因型对第二、三胎的泌乳量影响差异不显著(P＞0.05)，但T₂T₂和T₁T₂基因型个体的泌乳量略高于T₁T₁基因型个体的泌乳量。说明T₂T₂基因型可以成为一个提高奶山羊产奶量的分子遗传标记。

表4TaqI和HhaI多态位点与莎能奶山羊各胎泌乳量之间的方差分析(kg)

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

核苷酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性及其检测方法

<210>1

<211>1212

<212>DNA

<213>奶山羊(Capra hircus)

<220>

<221>y

<222>(912，983)

<400>1

tctgttcctc cctgttacaa cagcctatgc aggtcacagt ctcaacacta cacgcagcag     60

tactgcccag ctccctgagc ccccagtcag tgggaagcct gcacgtacgc acgtgtgcac    120

acacacacac acacacacac acgcactaat ccttctactc tcctctctgc agggatgacg    180

tgccaagctc gaagctccta catcaccagt gagatcctct gggggtaccg attcacgcct    240

gtcctgacgc tggaggacgg gttctacgaa gttgactaca acagcttcca tgagacctac    300

gagaccagca ccccatctct cagcgccaaa gagctggccg agttagccag cagggccgag    360

ctgcccctga gctggtctgt ctccagtaaa ctcaaccaac acgcagaact ggagactgag    420

gaggaggaaa agaaccctga ggagcagacg gagagaaatg gtgacgtggc aaacctagag    480

aatgaatcca aagtttagtc cccgggcccg gggccgcccc ttctcctctc caacccccac    540

cccccacccc cgcaaccctg ccttgtctct cattctcttt cttgtctgtc tgttactctg    600

ttctttcctt atatttcagt ttggcattac caggaaacaa atcttcaagg tgtaaaatat    660

ctacctgccc tctcagttag ttcagattga cgaggtagct tgcagattgg gttaaggcgt    720

catatgccct cttttgtggt cccagcgtgg tctcctcccg ggatagagca catctgacta    780

gagatttacg ctactccctt gcatgtgttg taaaatagca gatcgctcaa aagggtgcat    840

ccaagagttt ccctgggatg tgacgaggaa ggtctctggt gcctattcat tcacgcagtg    900

agacatggag tygagccctc tgttttacac atctcaataa atttcatcca cggggcgagg    960

tgcttgccct ctgtgggcat tgyggttaca ggacccaggt gaggtgaaga caaaaccctg   1020

tacatatata tgccttatgt aattatcttc ttttgcagtt agtaacgaaa cccagcatgt   1080

acaaaagtgc tgtagaacac aactgctaaa tactgtacat aggtgtaaga tcaatgtagg   1140

tttagatata taactagaaa taagatcgac gaaaaaatga tccccaaagt acagtaggca   1200

tttctgttct ga                                                       1212

Claims (3)

1.一种奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

以包含weaver基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊weaver基因的部分序列；

所述的引物对P为：

正向引物：gcatccaaga gtttccctg          19；

反向引物：cttcacctca cctgggtcct gtaagc  26；

用限制性内切酶TaqI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定SEQ ID NO.1所示的关中奶山羊或萨能奶山羊的weaver基因片段中第912位的碱基多态性：

TT基因型表现为173bp条带；TC基因型表现为173，98和75bp条带；CC基因型表现为98和75bp条带；

用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定SEQ ID NO.1所示的关中奶山羊或萨能奶山羊的weaver基因片段中第983位的碱基多态性：

TT基因型表现为173bp条带；TC基因型表现为173，148和25bp条带；CC基因型表现为148和25bp条带。

2.如权利要求1所述的奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的奶山羊weaver基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%。

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