CN104450933A - 山羊lyrm1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
山羊lyrm1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104450933A CN104450933A CN201410812129.2A CN201410812129A CN104450933A CN 104450933 A CN104450933 A CN 104450933A CN 201410812129 A CN201410812129 A CN 201410812129A CN 104450933 A CN104450933 A CN 104450933A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- goat
- lyrm1
- gene
- site
- detection method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000283707 Capra Species 0.000 title claims abstract description 61
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 13
- 102100032135 LYR motif-containing protein 1 Human genes 0.000 title abstract description 7
- 101710196457 LYR motif containing protein 1 Proteins 0.000 title abstract 4
- 101150072871 lyrm1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 10
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 10
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 4
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001065536 Homo sapiens LYR motif-containing protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102100025087 Insulin receptor substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710201824 Insulin receptor substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005765 Proto-Oncogene Proteins c-akt Human genes 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000013070 direct material Substances 0.000 description 1
- 230000000550 effect on aging Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 methane amide Chemical class 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒，以包含LYRM1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，PCR扩增山羊LYRM1基因部分序列，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定山羊LYRM1基因第8793位为G或T的碱基多态性。本发明提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的检测方法，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种。
Description
技术领域
本发明涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种：一种是同义突变多态性，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义突变多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。
近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)和直接测序技术等。SSCP可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90％可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。
胰岛素是能量代谢中的一种合成代谢激素，在调节糖类平衡方面具有重要作用。胰岛素可以促进葡萄糖转运。肥胖往往伴随着胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是在胰岛素起作用的目标组织(例如肝脏、骨骼肌以及脂肪组织)中胰岛素作用减弱的一种病理学状态。胰岛素和胰岛素受体(IR)结合，催化细胞内底物如IRS蛋白发生酪氨酰基磷酸化。IRS-1蛋白在胰岛素代谢中具有重要作用。胰岛素受体介导的IRS磷酸化激活两种信号通路来抑制葡萄糖转运。PI3K-蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/Akt)信号通路对于控制葡萄糖摄取的胰岛素活性以及抑制葡萄糖异生起重要作用。LYRM1基因是与人类肥胖相关的易感基因，其编码的蛋白在N端临近区域存在一高度保守的三肽基序——LYR结构域，属于NADH复合物元件。LYRM1通过降低PI3K和Akt的磷酸化水平来降低胰岛素刺激状态下的葡萄糖的摄取。LYRM1基因分布较广泛，在各种组织中都有发现。肥胖群体的网膜脂肪组织中LYRM1基因高丰度表达，在骨骼肌中的表达量也很高，研究表明该基因能够促进前体脂肪细胞的分化，并且抑制其细胞编程性死亡，并且可能参与线粒体的功能以及能量代谢。因此，研究哺乳动物LYRM1基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。
目前，对于LYRM1基因遗传变异的研究较少，着重在小鼠和人类肥胖症上。国内外关于家畜LYRM1基因遗传变异的研究，目前在山羊中还未见相关报道。由于LYRM1基因对于维持正常体重，胰岛素敏感性以及葡萄糖代谢所必需，目前亟需提供一种检测方法为LYRM1基因SNP与体尺性状关系的建立奠定基础，以便用于山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的山羊种群。
发明内容
本发明目的在于提供一种山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒，以加快良种选育速度和提高种群品质。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，包括以下步骤：
(1)以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊LYRM1基因部分序列；
所述的引物对P为：
上游引物(SEQ.ID.NO.1):5’ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3’
下游引物(SEQ.ID.NO.2):5’TTCAGTCTTCTGCCCACA 3’
(2)对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定多态性位点的基因型，所述多态性位点为：
在山羊的LYRM1基因第8793位为G或T的碱基多态性位点，表现为GG、GT以及TT三种基因型。
所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，58℃退火50s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10％的聚丙烯酰胺凝胶。
山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，包括引物对P，所述的引物对P为：
上游引物(SEQ.ID.NO.1):5’ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3’
下游引物(SEQ.ID.NO.2):5’TTCAGTCTTCTGCCCACA 3’
与现有技术相比，本发明提供了一种简单、快速、低成本、精确度高的山羊LYRM1基因多态性位点检测方法，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种，以加快良种选育速度和提高种群品质。
附图说明
图1是引物对P扩增不同山羊个体PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊LYRM1基因序列第8793位G-T突变测序结果图；
图3是本发明山羊LYRM1基因第8793位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明首先根据LYRM1基因的保守序列设计引物，分别以4个山羊群体的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和体尺性状的关联分析，筛选出与山羊体尺性状密切相关的分子标记。本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检。
(一)、山羊LYRM1基因部分DNA序列的扩增及其多态性的检测
1、山羊样品的采集及处理
本发明采用了4种山羊品种共计315个个体，具体为：(1)波尔山羊血液样品72份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场；(2)徐淮白山羊血液样品81份，采自江苏省徐州市铜山县吕梁乡；(3)海门山羊血液样品116份，采自江苏省南通海门；(4)波尔山羊×徐淮白山羊耳组织样品46份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场。取山羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。取耳组织样，在70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室，-80℃保存备用。
2、基因组DNA的提取
(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。
(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。
(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。
(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。
(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。
(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。
(7)4℃，12000r/min离心10min，弃上清，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
(8)4℃，12000r/min离心10min，弃上清，室温下使乙醇挥发干净。
(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。
耳组织DNA的提取参考文献Sambrock et al(2002)方法。
3、扩增引物设计
由于GenBank中没有山羊LYRM1基因序列，所以，本发明以牛(GenBank：NC_007326.5)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含山羊LYRM1基因第3外显子的PCR引物。
扩增第3外显子的引物为：
上游引物:5’ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3’
下游引物:5’TTCAGTCTTCTGCCCACA 3’
以上述引物对扩增了山羊LYRM1基因第3外显子部分区域及一部分内含子区域。
4、PCR扩增
分别以4个山羊品种的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为15μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。
表1本发明的PCR反应体系
表2PCR反应程序
5、PCR产物纯化和测序
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，图1中M为Mark-D2000，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，将含目的片段的凝胶放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：
1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。
3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。
7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。
8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。
把以上4个品种PCR扩增产物混合送上海生物工程有限公司进行正向测序。对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图2中的GT双峰位于：在山羊LYRM1基因第8793位。
(二)、山羊LYRM1基因多态性的PCR-SSCP检测
1、PCR反应条件
PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面表1和表2所述，PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图谱如图1所示，图中M为Mark-D2000，后续泳道可以清晰的看到491bp的条带。
2、PCR-SSCP检测
对于PCR扩增后的产物首先分别用变性剂(如甲酰胺、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)、甘油、0.025％二甲苯青或0.025％溴酚蓝等)进行变性处理(取4μL PCR产物与6μL SSCP变性剂混合，98℃变性10min，再冰浴5min)，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性。
130V电压电泳15h，银染检测电泳结果，用Bio-RAD凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。
参见图3，由于山羊为二倍体动物，当发生突变时，可形成三种不同的基因型，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图来进行判别，根据条带的个数能够判定是否发生了点突变，将不同基因型区分开，再结合DNA测序结果，显示出现三种不同的基因型(GG、GT、TT)，从而检测其SNP多态性。
(三)、本发明制备的分子标记在不同山羊群体多态性中的诊断应用
1、群体多态性中的诊断
利用上述的SNP多态性检测方法对波尔山羊72份DNA样品、徐淮白山羊81份DNA样品、海门山羊116份DNA样品、波尔山羊×徐淮白山羊46份的DNA样品基因型分别进行检测。
2、SNP位点的频率统计分析
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+……+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。
表3四个山羊品种中LYRM1基因两个多态位点的基因型和等位基因频率
3、基因效应的关联分析
采用SPSS 17.0(Statistical Product and Service Solutions,Version 17.0Edition)统计软件，对四个山羊品种的不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验(见表4)。
1)测定的主要性状包括：体高，体长，胸围，管围。
2)测定的群体：四个山羊品种共315只。
3)关联分析一般线性的模型：调用SPSS 17.0软件一般线性模型GLM(general linear models procedure)对各基因型对体尺性状的影响进行显著性检验。依据本实验的具体情况建立如下统计模型：
Yijk＝μ+Ai+Gj+Eijk
其中：Yijk：个体表型记录；μ：总体均数；Ai：年龄效应；Gj：基因型效应；Eijk：随即误差。
结果见表4：从表4可以看出四个山羊品种中所有个体第8793位基因型TT的体高显著高于另外两种基因型GG、GT(P<0.05或P<0.01)。
因此，在今后的育种工作中，应当选择山羊LYRM1基因突变的个体，加快具有优质经济性状山羊种群的建立。
表4四个山羊品种中LYRM1基因突变多态性与体尺性状的关联分析
注：具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。
Claims (4)
1.山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增山羊LYRM1基因部分序列；
所述的引物对P为：
上游引物:5’ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3’
下游引物:5’TTCAGTCTTCTGCCCACA 3’
(2)对PCR扩增产物进行SSCP检测：PCR扩增产物经变性剂变性处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果结合测序判定多态性位点的基因型，所述多态性位点为：
在山羊的LYRM1基因第8793位为G或T的碱基多态性位点，表现为GG、GT以及TT三种基因型。
2.如权利要求1所述的山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，58℃退火50s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸10min。
3.如权利要求1所述的山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于：所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10％的聚丙烯酰胺凝胶。
4.山羊LYRM1基因单核苷酸多态性位点的检测试剂盒，其特征在于：包括引物对P，所述的引物对P为：
上游引物:5’ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3’
下游引物:5’TTCAGTCTTCTGCCCACA 3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410812129.2A CN104450933B (zh) | 2014-12-22 | 2014-12-22 | 山羊lyrm1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410812129.2A CN104450933B (zh) | 2014-12-22 | 2014-12-22 | 山羊lyrm1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104450933A true CN104450933A (zh) | 2015-03-25 |
| CN104450933B CN104450933B (zh) | 2018-02-16 |
Family
ID=52897678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410812129.2A Expired - Fee Related CN104450933B (zh) | 2014-12-22 | 2014-12-22 | 山羊lyrm1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104450933B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105002164A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-10-28 | 贵州大学 | 一种克隆猪lyrm1基因cds区序列的方法 |
| CN108192985A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-06-22 | 西北农林科技大学 | 一种山羊ctnnb1基因插入/缺失的检测方法及其应用 |
-
2014
- 2014-12-22 CN CN201410812129.2A patent/CN104450933B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘凯等: "山羊重要基因的多态分析及与部分体尺性状的相关性", 《遗传育种》 * |
| 吴丹等: "鸡体质量性状基因的全基因组关联研究", 《畜牧兽医学报》 * |
| 苏杰: "7个微卫星标记与波尔山羊生长性状的关联分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105002164A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-10-28 | 贵州大学 | 一种克隆猪lyrm1基因cds区序列的方法 |
| CN108192985A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-06-22 | 西北农林科技大学 | 一种山羊ctnnb1基因插入/缺失的检测方法及其应用 |
| CN108192985B (zh) * | 2018-03-07 | 2020-02-21 | 西北农林科技大学 | 一种山羊ctnnb1基因插入/缺失的检测方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104450933B (zh) | 2018-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106498078B (zh) | 一种检测绵羊kitlg基因的单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN108998541B (zh) | 一种与苏淮猪腿臀围性状相关的snp标记引物对及其应用 | |
| Zhang et al. | Whole-genome resequencing from bulked-segregant analysis reveals gene set based association analyses for the Vibrio anguillarum resistance of turbot (Scophthalmus maximus) | |
| CN110643716A (zh) | 一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用 | |
| CN103866032B (zh) | 一种检测山羊stat3基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN106755371A (zh) | 利用pcr‑rflp检测绵羊pcnp基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN102703440B (zh) | 山羊sh2b1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法 | |
| CN101921852B (zh) | 一种检测黄牛AdPLA基因单核苷酸多态性的方法 | |
| CN101921857B (zh) | 一种中国地方黄牛Pax7基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法 | |
| CN104131097B (zh) | 一种检测肉牛ucp3基因单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN104450933A (zh) | 山羊lyrm1基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒 | |
| CN103233001A (zh) | 秦川牛FoxO1基因单核苷酸多态性分子标记的检测方法与应用 | |
| CN110484629B (zh) | 一种与三疣梭子蟹生长性状相关的微卫星标记、其引物及应用 | |
| CN101906480B (zh) | 利用神经内分泌因子基因选择山羊产羔性状的分子标记方法 | |
| CN101899500B (zh) | 一种黄牛klf7基因的单核苷酸多态性检测方法 | |
| CN104498610B (zh) | 检测黄牛 mef2c 基因 snp 位点的 rflp 方法及试剂盒 | |
| CN104450934A (zh) | 山羊 lmcd1 基因单核苷酸多态性位点的检测方法及检测试剂盒 | |
| Chang et al. | Genetic diversity of wild quail in China ascertained with microsatellite DNA markers | |
| CN102816759A (zh) | 北京鸭stmn1基因单核苷酸多态性及其分子标记的检测方法 | |
| CN102839170B (zh) | 奶山羊泌乳量相关microRNA-431基因单核苷酸多态性及其检测和应用 | |
| CN102031304B (zh) | 一种黄牛add1基因单核苷酸多态性及其检测方法 | |
| CN103695416A (zh) | 一种检测秦川牛cfl2基因的单核苷酸多态性的方法及其应用 | |
| CN101875977B (zh) | 一种检测黄牛SREBP1c基因单核苷酸多态性的方法 | |
| CN108841971B (zh) | 一种检测黄牛sh3pxd2b基因插入/缺失标记的方法 | |
| CN101671725B (zh) | 一种黄牛npm1基因插入突变多态性的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190905 Address after: 223600 South Building, Gaochuang Garden, Shuyang County, Suqian City, Jiangsu Province Patentee after: JIANGSU MAIDEKE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 221116 Shanghai Road, Copper Mt. New District, Jiangsu, No. 101, No. Patentee before: Jiangsu Normal University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220920 Address after: 3rd Floor, Building A, Dongshou Software Industrial Park, Yingbin Avenue, Shuyang County, Suqian City, Jiangsu Province 223600 Patentee after: Jiangsu Shenzhong Technology Group Co.,Ltd. Address before: 3rd Floor, South Building, Gao Chuang Park, Shuyang County, Suqian City, Jiangsu Province 223600 Patentee before: JIANGSU MAIDEKE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180216 |