CN102703440B - 山羊sh2b1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法，以包含SH2B1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2为引物，PCR扩增山羊SH2B1基因，然后进行SSCP多态性的检测。其基因多态性位点包括：在山羊的SH2B1基因第4356位为T或C的碱基多态性；在山羊的SH2B1基因第6033位为G或A的碱基多态性。本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR‑SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种。

Description

山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点及其检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种：一种是同义突变多态性，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义突变多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等。SSCP可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。Takao经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90％可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来。另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器。

胰岛素通过促进骨骼肌和脂肪组织对于葡萄糖的摄取以及抑制肝脏葡萄糖的生成以降低血糖。胰岛素与胰岛素受体结合并使其活化。胰岛素受体酪氨酰(基)使胰岛素受体底物(IRS-1，-2，-3，以及-4)磷酸化。IRS蛋白，特别是IRS-1和IRS-2，可以启动和协调多个下游途径，包括磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号途径。Src同源区2(SH2)B接头蛋白1(SH2B1；原名SH2-B)是接头蛋白家族的一个成员。SH2B1是一组对于许多种信号通路起作用的衔接子，涉及关于一些受体酪氨酸激酶，包括胰岛素受体的信号转导途径。SH2B1是一个异常的内源性胰岛素致敏物，它能够直接同时与胰岛素，IRS-1以及IRS-2相结合，从而通过促进胰岛素受体催化活性和抑制IRS蛋白的酪氨酸脱磷酸作用来增强胰岛素敏感性。在肌肉，肝脏，脂肪组织中，SH2B1形成二聚体，SH2B1二聚体中的每一个SH2B1分子可同时与胰岛素受体以及IRS-1(或IRS-2)结合，介导复合体的形成，从而保护IRS蛋白免于酪氨酸脱磷酸化，并刺激胰岛素受体的催化活性，从而在整体上激活胰岛素受体的下游通路。因此，研究哺乳动物SH2B1基因遗传变异和分子遗传特征具有重要理论和实践意义。

目前，对于SH2B1基因遗传变异的研究较少，着重在小鼠和人类肥胖症上。国内外关于家畜SH2B1基因遗传变异的研究，除了最近SH2B1基因SNP与中国黄牛生长性状之外，目前在山羊中还未见相关报道。由于SH2B1基因对于维持正常体重，胰岛素敏感性以及葡萄糖代谢所必需，本发明提供的检测方法为SH2B1基因SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国山羊生长性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的山羊种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR产物混合测序的方法筛查山羊SH2B1基因的多态性位点，提供了一种山羊SH2B1基因SNP的筛查和检测方法。通过关联分析寻找与山羊体尺性状相关的SNP作为分子标记，以功能SNP作为山羊分子育种和辅助选择的标记，加快良种选育速度和提高种群品质。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明根据SH2B1基因的外显子设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物混合并纯化，测序后得到山羊SH2B1基因的部分序列。

一种山羊SH2B1基因的单核苷酸多态性，其基因多态性包括：在山羊的SH2B1基因第4356位为T或C的碱基多态性；在山羊的SH2B1基因第6033位为G或A的碱基多态性。

上述山羊SH2B1基因的单核苷酸多态性的检测方法为：以包含SH2B1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2为引物，PCR扩增山羊SH2B1基因；

所述的引物对P1为：

上游引物：5’GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’

下游引物：5’CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’

所述的引物对P2为：

上游引物：5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’

下游引物：5’GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’

所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4min；94℃变性45s，58℃退火50s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物片段大小，所用的琼脂糖凝胶的质量浓度为1.0％。

用变性剂对PCR扩增产物进行变性处理，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定山羊SH2B1基因是否有多态。

所述的聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％。

所述的根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定山羊SH2B1基因存在多态性，第7内含子4356位点有三种带型，分别为：TT，TC，CC，第9外显子6033位点有两种带型，分别为：GG，GA。

本发明对4个山羊品种上述两个SNP进行了基因分型和基因频率分析，同时也对SSCP多态位点与山羊体尺性状之间进行了关联分析。

与现有技术相比，本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与山羊生长性状密切相关的遗传标记，可用于山羊的辅助选择和分子育种。

附图说明

1、图1是引物P1扩增不同山羊个体(山羊SH2B1基因第4356位多态位点)PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

2、图2是引物P2扩增不同山羊个体(山羊SH2B1基因第6033位多态位点)PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

3、图3是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊SH2B1基因序列第4356位T-C突变测序结果图；

4、图4是本发明中PCR产物混合测序筛查到的山羊SH2B1基因序列第6033位G-A突变测序结果图；

5、图5是本发明山羊SH2B1基因第4356位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

6、图6是本发明山羊SH2B1基因第6033位多态位点聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明根据SH2B1基因的保守序列设计引物，分别以4个山羊群体的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和体尺性状的关联分析，筛选出与山羊体尺性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、山羊SH2B1基因部分DNA序列的扩增及其多态性的检测

1、山羊样品的采集及处理

本发明采用了4个山羊群体共计315个个体，具体为：(1)波尔山羊血液样品72份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场；(2)徐淮白山羊血液样品81份，采自江苏省徐州市铜山县吕梁乡；(3)海门山羊血液样品65份，采自江苏省南通海门；(4)波尔山羊×徐淮白山羊耳组织样品46份，采自江苏省徐州市丰县梁寨合作种羊场。取山羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。取耳组织样，在70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室，-80℃保存备用。

2、基因组DNA的提取

(1)、将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)、在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH值至8.0，4℃保存备用。

(3)、加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)、将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)、加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)、加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)、4℃，12000r/min离心10min，弃上清，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)、4℃，12000r/min离心10min，弃上清，室温下使乙醇挥发干净。

(9)、干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

耳组织DNA的提取参考文献Sambrock et al(2002)方法。

3、扩增引物设计

由于GenBank中没有山羊SH2B1基因序列，所以，本发明以牛(GenBank：NC_007326.5)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含山羊SH2B1基因第7内含子和第9外显子的PCR引物；

扩增第7内含子的引物为：

上游引物：5’GGCTCAGGCATTCTTGGA 3’

下游引物：5’CCTTGCTCCTGTTAGGGTTG 3’

扩增第9外显子的引物为：

上游引物：5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’

下游引物：5’GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’

以上述引物对扩增了山羊SH2B1基因第7内含子，第9外显子部分区域及一部分内含子区域。

4、PCR扩增

分别以4个山羊品种的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为15μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。

表1 本发明的PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		PCR缓冲液	1.50
dNTP(2mmol/L)	0.30
		上游引物(10pmol/μL)	0.30
下游引物(10pmol/μL)	0.30
		TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)	0.30
DNA模板(50ng/μL)	1.00
		灭菌超纯水(H2O)	11.30
总体积	15.00

表2 PCR反应程序

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，如图1和图2所示，其中图1中M为Mark--D2000，后续泳道1-12代表引物P1扩增不同个体产物片段；图2中M为Mark--D2000，后续泳道1-12代表引物P2扩增不同个体产物片段，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，将含目的片段的凝胶放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)、首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

(3)、向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)、将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(5)、向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

(6)、向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

(7)、将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

(8)、为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

把以上4个品种PCR扩增产物混合送上海生物工程有限公司进行正向测序。对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图3中的TC双峰、图4所出现的GA双峰是筛查到了山羊SH2B1基因的2个SNP，分别位于：在山羊SH2B1基因第4356位和第6033位。

二、山羊SH2B1基因多态性的PCR-SSCP检测

1、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面表1和表2所述，PCR扩增产物的1.0％琼脂糖凝胶电泳图谱如图1和图2所示，其中图1中M为Mark--D2000，后续泳道1-12代表引物P1扩增不同个体产物片段；图2中M为Mark--D2000，后续泳道1-12代表引物P2扩增不同个体产物片段，可以清晰的看到162bp和161bp的条带。

2、PCR-SSCP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别用变性剂(如甲酰胺、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)、甘油、0.025％二甲苯青或0.025％溴酚蓝等)进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性。

130V电压电泳15h，银染检测电泳结果，用Bio-RAD凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。

由于山羊为二倍体动物，当发生突变时，可形成不同的基因型，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图来进行判别，根据条带的个数能够判定是否发生了点突变，将不同基因型区分开，从而检测其SNP多态性。结果显示，在第4356位出现三种不同的基因型(TT，TC，CC)，在第6033位出现两种基因型(GG，GA)，如图5和图6所示。

三、本发明制备的分子标记在不同山羊群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对波尔山羊72份DNA样品、徐淮白山羊81份DNA样品、海门山羊116份DNA样品、波尔山羊×徐淮白山羊46份的DNA样品基因型分别进行丙烯酰胺凝胶电泳。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3 四个山羊品种中SH2B1基因两个多态位点的基因型和等位基因频率

3、基因效应的关联分析

采用SPSS 17.0(Statistical Product and Service Solutions，Version 17.0Edition)统计软件，对四个山羊群体的不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验(见表4)。

1)测定的主要性状包括：体高，体长，胸围，管围。

2)测定的群体：四个山羊群体共315只。

3)关联分析一般线性的模型：调用SPSS 17.0软件一般线性模型GLM(generallinear models procedure)对各基因型对体尺性状的影响进行显著性检验。依据本实验的具体情况建立如下统计模型：

Y_ijk＝μ+A_i+G_j+E_ijk，

其中：Y_ijk：个体表型记录；μ：总体均数；A_i：年龄效应；G_j：基因型效应；E_ijk：随即误差。

结果见表4：从表4可以看出四个山羊群体中除了徐淮白山羊第4356位基因型CC或TC的体高显著高于纯合基因型TT(P＜0.05或P＜0.01)。所有品种的个体第6033位基因型GA的体长显著高于纯合基因型GG(P＜0.05)。

因此，在今后的育种工作中，应当选择山羊SH2B1基因突变的个体，加快具有优质经济性状山羊种群的建立。由于两个位点的杂合也都比纯合的表现优越，可以通过此法检测建立两个不同纯合的优质群体，然后合成生产出优质经济性状的商品代，以促进养羊业的发展。

表4 四个山羊群体中SH2B1基因突变多态性与体尺性状的关联分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种检测山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、以包含SH2B1基因的待测山羊全基因组DNA为模板，以引物对P2为引物，PCR扩增山羊SH2B1基因；

所述的引物对P2为：

上游引物:5’CCTCCGCTTCAAAGTGCTG 3’

下游引物:5’GCGGGAGTTCTGCGAGTC 3’

(2)、对步骤(1)的扩增产物进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序；

(3)、对步骤(2)的纯化产物进行PCR-SSCP检测：首先对纯化的PCR产物分别用变性剂进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性位点的基因型，所述多态性位点包括：

在山羊的SH2B1基因第6033位为G或A的碱基多态性位点，表现为GG，GA两种基因型，所述第6033位为G或A的碱基多态性位点是指扩增产物5’CTCGGCAA 3’序列段中第4位为G或A的碱基多态性位点，基因型GA的体长显著高于纯合基因型GG。

2.如权利要求1所述的检测山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：95℃预变性4min；94℃变性45s，58℃退火50s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

3.如权利要求1所述的检测山羊SH2B1基因单核苷酸多态性位点的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用10％的聚丙烯酰胺凝胶。