CN102660540B - 黄牛I‑mfa基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄牛I‑mfa基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因单核苷酸多态性包括：以包含I‑mfa基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛I‑mfa基因，对扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；根据电泳结果鉴定黄牛I‑mfa基因第12284位为A或G的碱基多态性；在黄牛的I‑mfa基因第12331位为T或C的碱基多态性；这两个位点完全连锁。本发明是一种在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的分子遗传标记，为利用杂种优势进行黄牛杂交育种提供了分子依据。

Description

黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以黄牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法。

背景技术

黄牛是我国的主要的家畜之一，但是现在面临着优秀黄牛品种种源不足和种群遗传品质较差的压力。传统的育种方法应用测试动物的表现型和其亲代、祖代及其它亲属在小动物模型中的遗传信息，设想性状受到许多基因遗传差异的影响，每个基因对性状有相对较小的贡献，因此对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快的领域之一，新的方法正在不断涌现，已定位的标记基因数目与日俱增。这将为数量遗传学提供了分子水平信息，家畜育种也将跨入分子育种阶段。应用分子遗传标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加黄牛的产肉量和改善肉品质的先进的有效的方法。

分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNP约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。

目前，主要采用几种不同的方法来发现SNPs：DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技术与分子信标(molecular beacons)等。在这些SNP检测技术中，(1)DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；(2)PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；(3)AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；(4)TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons)都是在荧光能量转移(fluorescence resornance energ transfer，FRET)基础上建立起来的，利用荧光标记及仪器达到检测目的。焦磷酸测序(pyrosequencing)则是利用测序过程中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光，是不依赖平板胶或毛细管电泳、不依赖DNA的荧光标记技术，很可能成为未来的主流技术。(5)RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

I-mf(inhibitor of MyoD family)是一种生肌因子MyoD家族的抑制物，又称MDFI(MyoD family inhibitor)，它能直接与MyoD家族成员相互作用，如MyoD，myf5，myogeninand MRF4。I-mf基因最早是1996年由C.-M.Amy Chen等在小鼠胚胎的实验中发现并分离的。和MyoD家族成员主要存在于生肌节不同，I-mfa主要在生骨节高度表达。I-mf基因位于人6号染色体短臂上，全长15kb，有5个外显子和4个内含子，编码246个氨基酸。小鼠I-mf基因定位于17号染色体上，全长19kb，有5个外显子和4个内含子。cDNA编码三种蛋白质，I-mfa，I-mfb和I-mfc。牛的I-mf基因位于23号染色体上，全长17kb，具有5个外显子和4个内含子，编码247个氨基酸。转录产物也有三种亚型：I-mfa，I-mfb和I-mfc。它们具有相同的氨基末端，在羧基端却有很大差异，致使只有I-mfa能与MyoD家族相互作用。I-mfa通过独特的羧基末端直接和MyoD家族成员共有的bHLH域结合，从而阻止MyoD家族成员与相关DNA结合，并I-mfa通过掩盖MyoD家族成员的核定位信号进而达到抑制MyoD家族转录活性的作用。近几年一些研究人员发现，I-mfa不仅可以抑制与肌形成相关的MyoD家族成员的转录活性，其对一些和骨骼形成相关的蛋白也有影响，如Zic家族蛋白。I-mfa的生理功能主要体现在对骨骼和肌肉形成的抑制作用上，对于它的作用机制，近年来也有进展。I-mfa与TRPC1结合，作为分子开关抑制依赖电流的TRPC1通道；此外，通过参与Wnt信号通路达到抑制肌肉形成分化的目的。2006年，Pan等发现I-mfa介导的对LEF-1的抑制作用能够被β-连环蛋白解除，这为其作用机制提供有力的证明。2008年Kim等发现对于调节肌肉发育的Wnt信号通路来说，β-连环蛋白是必需的，可与MyoD直接结合并增加它的活性。这些表明I-mfa在参与Wnt信号途径中和MyoD及β-连环蛋白起着相互调控的作用，这为正常进行肌肉分化提供了基础。我们可以预见，如果I-mfa基因发生突变，将有可能对I-mfa的结构产生影响从而影响其生理活性，解除对MyoD的抑制作用，促进肌肉的生长发育。

关于动物I-mfa基因的研究国内外多见于人、鼠等动物，对黄牛I-mfa基因遗传变异或SNP研究的报道还未见报道。由于目前黄牛I-mfa基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如：生长发育性状)关联的研究成为空白。

发明内容

本发明解决的问题在于提供黄牛I-mfa基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，寻找与黄牛经济性状相关的SNP作为分子标记，加快黄牛良种繁育速度。

本发明通过以下技术方案来实现：

黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点，其中，该基因单核苷酸多态性位点包括：

黄牛I-mfa基因第12284位为A或G的单核苷酸多态性位点；和

黄牛I-mfa基因第12331位为T或C的单核苷酸多态性位点。

黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，包括以下步骤：

(1)、以包含I-mfa基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛I-mfa基因；

所述的引物对P为：

上游引物P1：TTCTCCTCCATCGCCCTTTTC；

下游引物P2：ATGCTGCTGCCGCTCCCT；

(2)、对步骤(1)的扩增产物进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序；

(3)、对步骤(2)的纯化产物进行PCR-SSCP检测：首先对纯化的PCR产物用变性剂进行变性处理，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定其多态性位点。

如上述技术方案所述的黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，步骤(2)中PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；94℃变性45s，62.8℃退火1min，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸10min。

如上述技术方案所述的黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，步骤(3)中聚丙烯酰胺凝胶的浓度为10％。

如上述技术方案所述的黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其中，步骤(3)中根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛I-mfa基因的多态性位点，所述多态性位点包括：黄牛I-mfa基因第12284位为A或G的碱基多态性位点和第12331位为T或C的碱基多态性位点，表现为AATT、AGTC、GGCC三种基因型。

本发明中第12284位和第12331位两个位点为完全连锁，所以用突变位点碱基来表示，12284位有AA、AG、GG三种基因型，12331位有TT、TC、CC三种基因型，由于完全连锁，所以表示为AATT、AGTC、GGCC三种基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)、本发明公开了与黄牛生长发育相关的功能基因I-mfa的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

(2)、本发明对I-mfa基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与三种黄牛体尺性状之间进行了性状关联分析；结果显示I-mfa基因的核苷酸多态位点能够为黄牛杂交育种提供帮助。

(3)、本发明提供的检测方法为I-mfa基因的SNP与体尺性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

(4)、本发明把PCR产物混合测序筛查SNP与PCR-SSCP结合起来解决了SSCP的不稳定性，以防突变位点的漏检，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与黄牛生长性状密切相关的遗传标记，可在以后的肉牛养殖中建立相应的纯合配套系用于杂交育种获得优良性状的子代。

附图说明

1、图1是本发明的技术流程示意图；

2、图2是本发明中PCR产物混合测序筛查到的黄牛I-mfa基因序列12284位A-G突变测序结果图；

3、图3是本发明中PCR产物混合测序筛查到的黄牛I-mfa基因序列12331位为T或C突变测序结果图；

4、图4是本发明用来检测PCR产物片段大小的琼脂糖凝胶电泳；

5、图5是本发明用来检测各样本突变情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明以I-mfa基因保守序列设计引物，分别以3种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，混合PCR产物并对其纯化，测序。然后，进行测序图分析和序列比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的PCR-SSCP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与黄牛生长性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、地方黄牛品种I-mfa基因部分DNA序列的克隆

1、血样的采集及处理

取血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本研究所用黄牛血样总数541份，具体为：

(1)、郏县红牛368份血样采自河南省平顶山市郏县红牛保种区；

(2)、秦川牛血样113份采自陕西省秦川牛场；

(3)、鲁西牛血样60份，采自山东鲁西牛原种场。

2、血样基因组DNA的提取

(1)、将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)、在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)、加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

(4)、将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)、加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)、加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)、4℃，12000r/min离心10min，弃上清，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)、4℃，12000r/min离心10min，弃上清，室温下使乙醇挥发干净。

(9)、干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

3、扩增引物设计

根据NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)牛的GenBank登录号为：NC_007324.4的I-mfa基因的外显子3DNA序列，以该基因序列保守区序列为参考利用Primer5.0设计PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物P1：TTCTCCTCCA TCGCCCTTTTC 21；

下游引物P2：ATGCTGCTGC CGCTCCCT 18。

该引物扩增了黄牛I-mfa基因第3外显子区域及一部分内含子区域。

4、PCR扩增I-mfa基因外显子3

分别以3个黄牛品种的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为15μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。

表1 本发明的PCR反应体系

体系成分

体积(μL)

PCR缓冲液	1.50
		dNTP(2mmol/L)	0.30
上游引物(10pmol/μL)	0.30
		下游引物(10pmol/μL)	0.30
TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)	0.30
		DNA模板(50ng/μL)	1.00
灭菌超纯水(H2O)	11.30
		总体积	15.00

表2 PCR反应程序

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)、首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(2)、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；

(3)、向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(4)、将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(5)、向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；

(6)、向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干；

(7)、将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2min。12000r/min离心1min收集DNA溶液；

(8)、为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤(7)。

把以上3个品种PCR扩增产物混合送上海生物工程有限公司进行正向测序。对测序峰图进行分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图2中的AG双峰、图3所出现的TC双峰是筛查到了黄牛I-mfa基因的2个SNP多态性，分别位于：在黄牛I-mfa基因第12284位和第12331位。

二、黄牛I-mfa基因多态性的PCR-SSCP检测

1、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面表1和表2所述，PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳图谱如图4所示，图4中M是Marker，从上往下分别为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp；1-8泳道表示扩增不同个体I-mfa基因外显子3片段的产物，长度为331bp，可以清晰的看到331bp的条带。

2、PCR-SSCP检测

对于PCR扩增后的产物首先分别用变性剂(如甲酰胺、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)、甘油、0.025％二甲苯青或0.025％溴酚蓝等)进行变性处理，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果判定其多态性，聚丙烯酰胺凝胶的浓度为10％。

150V电压电泳13h，银染检测电泳结果，用Bio-RAD凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型。

由于黄牛为二倍体动物，当发生突变时，可形成三种不同的基因型(AATT，AGTC，GGCC)，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图来进行判别，如图5所示，将三种基因型区分开，根据条带的个数能够判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

三、本发明制备的分子标记在不同黄牛群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断

利用上述的SNP多态性检测方法对鲁西牛60份DNA样品、秦川牛113份DNA样品、郏县红牛368份DNA样品的基因型分别进行丙烯酰胺凝胶电泳。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3 三个黄牛品种中I-mfa基因两个多态位点的基因型和等位基因频率

3、基因效应的关联分析

采用SPSS 17.0(Statistical Product and Service Solutions，Version 17.0Edition)统计软件，对其中主要性状记录比较全面的秦川牛的不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验(见表4)。

1)测定的主要性状包括：体高，体长，体重，胸围，管围，坐骨端宽，胸宽。

2)测定的群体：秦川牛群体一共113头，样品和数据资料都来自陕西省秦川牛场。

3)关联分析一般线性的模型：调用SPSS 17.0软件一般线性模型GLM(generallinear models procedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。依据本实验的具体情况建立如下统计模型：

Y_ijk＝μ+A_i+G_j+E_ijk，

其中：Y_ijk：个体表型记录；μ：总体均数；A_i：年龄效应；G_j：基因型效应；E_ijk：随即误差。

结果见表4：从表4可以看出基因型AB的体重显著高于纯合基因型AA和BB(P＜0.05)。

在这几项指标中，AB基因型的体重值和胸宽值显著高于AA型，因此，在今后的育种工作中，应当培育两个I-mfa基因纯合的黄牛品系，然后进行杂交选育具有杂合优势的杂合子一代，为畜牧业获得更高经济效益提供帮助。

表4 秦川牛I-mfa基因突变多态性与生长性状的关联分析

注：字母不同表示差异显著(P＜0.05)

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (3)

1.黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、以包含I-mfa基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增黄牛I-mfa基因；

所述的引物对P为：

上游引物P1：TTCTCCTCCATCGCCCTTTTC；

下游引物P2：ATGCTGCTGCCGCTCCCT；

(2)、对步骤(1)的扩增产物进行PCR产物的切胶回收及纯化、测序；

(3)、对步骤(2)的纯化产物进行PCR-SSCP检测：首先对纯化的PCR产物用变性剂进行变性处理，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定其多态性位点的基因型；

步骤(3)中根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定黄牛I-mfa基因的多态性位点的基因型，所述多态性位点为：黄牛I-mfa基因第12284位为A或G的碱基多态性位点和黄牛I-mfa基因第12331位为T或C的碱基多态性位点，表现为AATT、AGTC、GGCC三种基因型；所述第12284位为A或G的碱基多态性位点是指扩增产物5’GGCGGCGCCAGGCGG 3’序列段中第4位为A或G的碱基多态性位点，所述第12331位为T或C的碱基多态性位点是指扩增产物5’CCAAGGCCCATCG3’序列段中第11位为T或C的碱基多态性位点，AGTC基因型的体重值和胸宽显著高于纯合的黄牛品系。

2.如权利要求1所述的黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，62.8℃退火1min，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点的检测方法，其特征在于，步骤(3)中聚丙烯酰胺凝胶的浓度为10％。