CN102839171A - 奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用，其基因单核苷酸多态性包括：在如SEQ ID No.1所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位为C或T的单核苷酸多态性。RFLP多态性与泌乳量关联分析证实：HinfI多态位点与泌乳量之间有显著相关，基因型为CT的第二胎和第三胎泌乳量显著高于基因型为CC和TT个体的，此外TT个体的体高显著高于基因型CC和CT个体的。本发明提供的检测方法可以用于西农萨能奶山羊泌乳性状的标记辅助选择(MAS)，快速建立遗传资源优良的奶山羊种群。

Description

奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于奶山羊选育技术领域，涉及奶山羊泌乳量相关miR-196a基因的单核苷酸多态性及其检测和其作为辅助选择标记在奶山羊育种中的应用。

背景技术

我国山羊品种资源丰富，养羊业的历史悠久，羊的存栏数量占世界前列。在广大的农村、牧区及城市郊区发展养羊业有巨大的潜力。山羊业为我们的生活提供了奶、肉、羊毛、绒及皮革等多种生活产品。其中，奶山羊业，投资小，易饲养，见效快，被称为“农家的奶牛”（赵有璋2002）。羊奶具有很高的营养价值，不含过敏原，营养成分均衡，易消化吸收，与人乳蛋白质组成相似，特别适宜于病人、婴幼儿及老年人饮用，因此山羊奶是最符合人类需求的功能性保健食品（Haenlein,2004）。

然而，在我国与其它养殖业相比，奶山羊养殖规模和方式相对落后。近年来，我国奶山羊存栏总数为580万只左右，发展非常缓慢，年产商品奶约占全国总奶量的3%。因此，利用分子育种技术加快良种选育从而发展和提高奶山羊业，这是我国未来奶业发展的重点内容之一，尤其是在“三聚氰胺事件”后对牛奶产业的发展产生严重的负面影响，山羊奶则越来越受到人们的重视。

应用分子标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加奶山羊的泌乳量和改善乳品质的先进的有效的方法。应用分子标记育种首先是在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记；其次是建立其基因多态性的快速检测方法；然后实现遗传标记辅助选择和实现早期诊断选择。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术（SSCP）、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；直接测序技术成本较高。

MicroRNA(miRNA)在转录后水平对基因表达扮演着极其重要的角色。miRNA是一类小的单链内源性非编码RNA，能够与靶mRNA的特定序列结合，通过降解靶mRNA或抑制翻译发挥其重要调控作用(Bartel,2004)。目前研究已经发现miRNA在细胞分化与凋亡、生长发育、糖脂代谢、炎症、免疫应答以及肿瘤发生等多个生理和病理过程中均扮演着关键角色，己有实验证据表明一些miRNAs在乳腺上皮细胞的分化增殖过程中发挥重要的调控作用。

Stefanie等（Stefanie et al.,2009）应用高能量测序的方法研究产后母小鼠乳腺发育相关的miRNA表达变化规律，结果显示miR-196a参考了小鼠产后腺发育的调控。但miR-196a在奶山羊上的研究目前还未见报道。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种奶山羊泌乳相关miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法及其应用，该基因的单核苷酸多态性其检测方便，可以作为辅助选择标记在奶山羊育种中应用，加快良种选育速度和提高种群品质。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括：

在如SEQ ID No.1所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位为C或T的单核苷酸多态性。

一种奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

1）以包含miR-196a基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊miR-196a基因；

所述的引物对P为：

正向引物：CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA；

反向引物：GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT；

2）用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的单核苷酸多态性：

CC基因型表现为265bp条带；CT基因型表现为265，241和24bp条带；TT基因型表现为241和24bp条带。

所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

所述琼脂糖凝胶电泳为1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

所述将奶山羊miR-196a基因第340位SNP位点的CT基因型作为有效DNA标记。

所述的有效DNA标记为：

CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。

所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在奶山羊标记辅助选择中的应用。

所述奶山羊miR-196a基因第340位的单核苷酸多态性中的CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。

所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。

所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性，利用DNA池测序的方法筛查奶山羊miR-196a基因的多态性位点，结果表明该基因第340位为C或T的碱基多态性，而且进一步表明该基因与奶山羊的泌乳量相关，多态性可作为辅助选择标记在奶山羊育种中应用，从而加快良种选育速度和提高种群品质。

本发明提供的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，针对其多态性的特性，设计了特定的PCR引物扩增，用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定SNP多态性，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明提供的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性，对2个奶山羊品种和2个绒山羊样品的上述SNP进行了基因分型和基因频率分析，结果表明这个位点检测能够成为绒山羊与奶山羊的区分特征；同时也对HinfI多态位点与莎能奶山羊各胎年泌乳量之间进行了关联分析。方差分析结果表明，HinfI多态位点能够成为提高奶山羊第二胎和第三胎泌乳量的分子标记。

本发明提供的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性，提供了一种用简单、快速、低成本、精确度高的，便于推广应用的在DNA水平上筛查和检测与奶山羊泌乳性状密切相关的遗传标记，可用于奶山羊的辅助选择和分子育种。

附图说明

图1是本发明的流程示意图；

图2是本发明中PCR克隆筛查到的奶山羊miR-196a第340位C-T突变的SNP多态性测序结果图；

图3是本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计和扩增产物中SNP位点突变的示意图，其中方框中表示突变位点、带下划线为内切酶识别序列，小写“g”是引入的错配碱基；

图4是本发明多态性检测的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱，其中琼脂糖凝胶浓度为1.5%；

图5是本发明中奶山羊miR-196a基因第340位的HinfI-RFLP的三种基因型电泳结果，琼脂糖凝胶浓度为2.5%；其中，TT基因型表现为355bp条带，TC基因型表现为355，334和21bp条带，CC基因型表现为334和21bp条带；由于21bp较小，故在琼脂糖电泳中看不到，但不影响判别基因型。

具体实施方式

本发明首先根据miR-196a基因的保守序列设计引物，分别以4种山羊品种的基因组DNA池为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物纯化，测序。然后，进行测序图的分析和序列的比对筛查出SNP位点；其次，对待测群体进行多态位点的HinfI-RFLP检测；最后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和泌乳量的关联分析，筛选出与奶山羊泌乳性状密切相关的分子标记。下面对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、山羊miR-196a基因DNA序列的克隆及其多态性的检测

1、山羊血样的采集及处理

取山羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本发明采用了4种山羊品种，包括2中奶山羊和绒山羊，具体为：

1）关中奶山羊血样440份采自陕西省西安市三原塔南保种场；

2）萨能奶山羊血样268份采自陕西省宝鸡市千阳县萨能奶山羊繁育中心（201份）和西北农林科技大学奶山羊场（67份）；

3）南疆白绒山羊血样230份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；

4）新疆白绒山羊血样119份采自新疆维吾尔自治区乌鲁木齐地区；

2、血样基因组DNA的提取

1）将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用。

3）加蛋白酶K3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清。

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

6）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

7）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

8）4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

9）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

3、DNA池的构建

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度（ng）=50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从关中奶山羊品种30个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合构建成品种DNA池；按照同样的方法也构建萨能奶山羊、南疆绒山羊、新疆绒山羊品种DNA池。

4、扩增引物设计

由于山羊pri-miR-196a序列至今未知，故从NCBI数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得同源动物牛的GenBank登录号为：AC_000162.1的pri-miR-196a DNA序列，以该基因序列同源保守区序列为参考用Primer5.0设计山羊pri-miR-196a的测序PCR引物对，扩增片段总长度为578bp。

其测序引物对序列如下：

正向引物：5’-GGTTTGGCGGCTTGAGGT-3’    18bp；

反向引物：5’-GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT-3’    22bp；

5、PCR克隆山羊的pri-miRNA-196a DNA序列

分别以4个山羊品种的DNA池为模版，用相应的引物对进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，见表1；PCR反应程序，见表2。

表1PCR反应体系

体系成分	体积（μL）
		2×PCR缓冲液（MBI）	12.5
上游引物（10pmol/L）	0.7
		下游引物（10pmol/L）	0.7
Taq DNA聚合酶（0.5U/μL）	0.4
		DNA模板（50ng/μL）	1.0
灭菌超纯水（ddH2O）	9.7
		总体积	25.0

表2PCR反应程序

6、PCR产物测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒（北京天根生物公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

1）首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3）向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5）向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

6）向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

7）将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000rpm离心1分钟收集DNA溶液。

8）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

最后，把以四个品种DNA池为模板的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。山羊pri-miR-196a序列目的片段578bp的测序结果如核苷酸序列表SEQ ID No.1所示。其中，SEQ ID No.1的第1位为GenBank登录号：AC_000162.1的第168位。

对测序峰图进行分析和序列比对分析，其中在同一位点有两个不同峰的是发生了单核苷酸突变；如图2左起第4个位点发生了单核苷酸的突变，出现了C、T两种检测结果，即筛查到了奶山羊miR-196a基因的1个SNP多态性，为pri-miR-196a序列表SEQ ID No.1第340位为C或T的碱基多态性。

b、奶山羊pri-miRNA-196a序列C>T突变多态性的PCR-RFLP检测

在340位点无论发生C>T突变与否，与周围的其他序列都不能形成内切酶识别序列。这时需要通过引物引入错配，使得引物3’端和此处的突变型“T”，即“T”在PCR扩增后形成一个HinfI限制性内切酶识别序列GAATC（见图4）。当第340位点发生T>C突变时，即T突变为C，原来的HinfI限制性内切酶识别序列GAATC也相应地变成GAACC，从而破坏了HinfI限制性内切酶识别序列；

1、RFLP-PCR引物设计

针对SEQ ID No.1包含的第340位的C>T突变，利用引入酶切位点在线设计软件（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）进行设计引物，引物设计如图3所示，上游的引物设计为：

5’-CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA-3’    26bp

G为引入错配的碱基，它与突变型“T”形成HinfI内切酶识别序列。

上述引物能够扩增山羊miR-196a基因265bp，其扩增的序列如图4所示，其中画框表明的两处“C>T”即为SNP多态性位点。

2、PCR反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如前面表1和表2所述，PCR扩增产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱如图5所示，可以清晰的看到265bp的条带。

3、PCR产物酶切及电泳检测

对PCR扩增后的产物首先分别进行HinfI酶切，然后根据琼脂糖凝胶电泳结果判定其SNP多态性。

10μL的HinfI酶切体系为：6μL PCR产物，10×Buffer（含BSA）1.0μL，HinfI（10U/μL）0.2μL，2.8μL灭菌双蒸水。将样品混匀后离心，37℃恒温箱中12小时，2.5%的琼脂糖凝胶，120V电压电泳1.5小时，EB染色检测酶切结果，用Kodak DC120凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；由于PCR扩增的355bp片段中不包含其它的HinfI酶切识别位点，因此与突变型“T”形成的酶切位点后，酶会将PCR扩增片段切为两个片段。

由于山羊为二倍体动物，当发生C>T突变时，可形成不同的基因型，分别为CC、CT、TT；可以通过酶切后的电泳图来进行判别，如图5所示，其中各个泳道从左到右依次为CC、CC、TT、CC、CT、CT和DNA Maker（其条带分布由上到下依次为600、500、400、300、200bp），其中纯合子CC的两条DNA链均不能被酶切，所以表现为265bp的条带；发生突变后的纯合子TT的两条链均能被酶切，所以表现为241p和224bp的条带；杂合子TC的两条链中的一条能够被酶切而另一条不能，所以表现为265、241和24bp三条带。根据条带的个数、条带的大小在图5中能够判定是否发生了点突变，将三种基因型区分开，从而检测其SNP多态性。

c、本发明制备的分子标记在不同山羊群体多态性中的诊断应用

利用上述的SNP多态性检测方法对萨能奶山羊268份DNA样品、关中奶山羊440份DNA样品、南疆白绒山羊230份样品和新疆白绒山羊119份分别进行HinfI-RFLP（图5）基因型的鉴定。

2、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋……N_Aan）/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3四个山羊品种中miRNA-196a基因基因一个多态位点的基因型和等位基因频率

注：具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），字母不同表示差异显著（P<0.05）。

从表3可以看出:从表3可以看出:乳用品种（莎能奶山羊和关中奶山羊）的T等位基因频率较绒用品种（内蒙古白绒山羊和陕北白绒山羊）高，这表明等位基因T可能与泌乳性状相关。在绒用品种（内蒙古白绒山羊和陕北白绒山羊）中不存在TT基因型，这表明TT基因型可以作为绒山羊与奶山羊区分特征。

3、基因效应的关联分析

基因型数据：HinfI（CC、CT和TT）

生产数据：胎次（第一胎、第二胎和第三胎）、年泌乳量、体高、体长和胸围。

关联分析样本：有完整泌乳记录的萨能奶山羊201只。

关联分析模型：

利用SPSS（20.0）软件分析基因位点、公畜、产羔季节、年龄和胎次因素与泌乳性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘法分析对数据校正；根据数据特征，利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下：

y_ijklmn=μ+Genotype_i+S_j+LS_k+LN_l+Age_m＋Xn＋e_ijklmn

其中：y_ijklm为个体表型记录；μ为总体均值；Genotype为基因型效应；S_j为种公畜效应；LS_k为产羔季节效应；LN_l为胎次效应；Age_m为年龄效应；Xn为各种二级和二级以上互作效应,如：Age×Genotype，S_j×Genotype等；e_ijklmn为随机误差。运用SPSS（20.0）软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间与泌乳量指标进行差异显著性检验。

结果表明（见表4）：在HinfI可识别的SNP位点，对于第二、三胎的CT基因型个体的泌乳量高于CC和TT基因型个体的且差异显著（P<0.05），三种基因型对第一胎的泌乳量影响差异不显著（P>0.05）。说明CT基因型可以成为一个提高奶山羊泌乳量的分子遗传标记。

表4miR-196a多态位点与莎能奶山羊经济性状之间的方差分析

注：具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），字母不同表示差异显著（P<0.05）。

综上，上述奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在奶山羊标记辅助选择中的应用，具体的奶山羊miR-196a基因第340位的单核苷酸多态性中的CT基因型作为CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。

Claims (9)

1.一种奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性，其特征在于，其基因单核苷酸多态性包括：

在如SEQ ID No.1所示的奶山羊miR-196a基因序列中，其第340位为C或T的单核苷酸多态性。

2.一种奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以包含miR-196a基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增奶山羊miR-196a基因；

所述的引物对P为：

正向引物：CAGTCGGTTATCGTCGAGGGCCCGAA；

反向引物：GACCTCCTTTGTCTGTCTCCAT；

2）用限制性内切酶HinfI消化PCR扩增产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定奶山羊miR-196a基因序列中第340位的单核苷酸多态性：

CC基因型表现为265bp条带；CT基因型表现为265，241和24bp条带；TT基因型表现为241和24bp条带。

3.如权利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。

4.如权利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳为1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

5.如权利要求2所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，将奶山羊miR-196a基因第340位SNP位点的CT基因型作为有效DNA标记。

6.如权利要求5所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的有效DNA标记为：

CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。

7.权利要求1所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在奶山羊标记辅助选择中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，奶山羊miR-196a基因第340位的单核苷酸多态性中的CT基因型作为奶山羊泌乳性状的标记辅助选择育种中提高奶山羊第二、三胎泌乳量的分子遗传标记。

9.权利要求1所述的奶山羊miR-196a基因的单核苷酸多态性在区分绒山羊与奶山羊的分子遗传标记中的应用。

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