CN116606937A - 一种基于osbpl8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用 - Google Patents

一种基于osbpl8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其中,所述核苷酸序列的第391位碱基为T或A。本发明利用酶切分型的方法来检测OSBPL8基因的突变,根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择,建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法,该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器,适合实验的需要。

Description

一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其 鉴定方法和应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域,具体涉及一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用。
背景技术
剩余采食量(Residual Feed Intake,RFI)被定义为在给定体重和体增重的情况下,动物实际饲料摄入量和预期饲料摄入量之间的差值,因此RFI的数值越大,相对的饲料效率也越低,近些年,越来越多的育种工作者开始采用RFI作为衡量饲料效率的主要指标,并且随着时代发展,这种趋势越来越明显,这是因为使用RFI来进行选育不仅能考虑到日增重和代谢体重,而且对于上市体重等重要经济性状的影响也比较微弱,并且RFI的遗传力在0.2~0.4(Freetly H C,Kuehn L A,Thallman R M,et al.Heritability an d geneticcorrelations of feed intake,body weight gain,residual gain,and residual fee dintake of beef cattle as heifers and cows[J].J Anim Sci,2020,98(1):1-6;ZhangY,Guo Z B,Xie M,et al.Genetic parameters for residual feed intake in a randompop ulation of Pekin duck[J].Asian-Australas J Anim Sci,2017,30(2):167-170.),属于中等遗传力性状,因此可以使用RFI作为育种时的饲料效率衡量指标。
氧化固醇结合蛋白8(Oxysterol binding protein like 8,OSBPL8)是OSBP基因家族的成员之一,OSBP是一种胞质蛋白,对许多氧固醇具有亲和力,鸭OSBPL8基因定位于1号染色体,编码区长度为2673bp,OSBP蛋白是结合胆固醇、氧化甾醇和阳离子磷脂的脂质转运蛋白,研究发现,OSBPL8基因主要影响体脂平衡、胰岛素信号转导以及囊泡运输等,并且可能参与能量代谢的调节,Iung等研究发现,Nellore牛OSBPL8基因可能参与调控新陈代谢和脂质的动态平衡(Iung L H S,Mulder H A,Neves H HR,et al.Genomic regionsunderlying uniformity of yearling weight in Nellore cattle evaluated underdifferent response variables[J].BMC Genomics,2018,19(1):619-621.);Zhou等研究发现,小鼠肝脏中OSBPL8过表达时可导致血浆和肝脏组织中的胆固醇和甘油三脂含量降低(Zhou T,Li S,Zhong W,et al.OSBP-related protein 8(ORP 8)regulates plasma andliver tissue lipid levels and interacts with the nucleoporin Nu p62[J].PLoSOne,2011,6(6):e21078.),综上可知,OSBPL8基因的功能主要是调控脂质代谢、运输和动态平衡。
“强英鸭”属于白羽肉鸭,历经10年自主培育而成,促进了我国肉鸭品种国产化,“强英鸭”商品代鸭早期生长速度快、饲料转化率高、成活率高,基于上述内容,提出一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记及其鉴定方法和应用,针对与鸭的饲料利用率性状相关的候选基因的SNP(单核苷酸多态性)分子标记,以解决常规表型育种选育进展缓慢,实现早期鉴定饲料利用率性状这一难题。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的:
一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,即所述OSBPL8基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,所述分子标记为T或A,所述分子标记位于所述核苷酸序列的第391位。
一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。
一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法,包括以下步骤:
(1)提取鸭翅静脉血液总DNA;
(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物,以所述总DNA为模板,利用特异性扩增引物进行PCR扩增,获得扩增产物;
(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序,获得待测鸭的分子标记类型;
(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状。
作为本发明的进一步优化方案,所述特异性扩增引物的序列为:
SEQ ID NO.2:Forward primer:GAGTGCTGGAATGCTTATAC;
SEQ ID NO.3:Reverse primer:CCTAATCCTGGCTTCTAAT。
作为本发明的进一步优化方案,所述基因分型检测方法为通过酶切扩增产物获得酶切产物,利用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测,根据图像进行基因分型,若酶切产物:
包含1条条带,则为AA型;
包含2条条带,则为TT型;
包含3条条带,则为TA型。
作为本发明的进一步优化方案,若待测鸭分子标记类型为AA型,该鸭饲料利用率性状较差;若待测鸭分子标记类型为TT型,该鸭饲料利用率性状最好;若待测鸭分子标记类型为TA型,该鸭饲料利用率性状中等。
作为本发明的进一步优化方案,利用1.5%-2.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测。
本发明提具有如下有益效果:
本发明利用酶切分型的方法来检测OSBPL8基因的突变,根据基因型对鸭的饲料利用率性状进行选择,建立了一种家禽饲料利用率早期选择的育种方法,该法简单、快速、低成本、不需要特殊的仪器,适合实验的需要。
附图说明
图1为部分样品PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图;
图2为部分样品PCR扩增产物经酶切获得的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图;
图3为鸭OSBPL8基因中T40194710A位点(为SEQ ID NO.1中第391位点)基因型验证测序结果。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述,有必要在此指出的是,以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明,不能理解为对本申请保护范围的限制,该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法,所用的试剂等材料,如无特别说明,均为市售购买产品。
2、方法
2.1引物设计
从鸭基因组数据库中找到如SEQ ID NO.1所示的OSBPL8基因对应的DNA序列,并以OSBPL8基因DNA部分序列(分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列)为模板,设计特异性扩增引物,特异性扩增引物序列如下所示:
SEQ ID NO.2:Forward primer:GAGTGCTGGAATGCTTATAC;
SEQ ID NO.3:Reverse primer:CCTAATCCTGGCTTCTAAT。
该引物的可扩增区域的长度为647bp,序列如SEQ ID NO.4所示,其中包含T40194710A位点(为SEQ ID NO.1中第391位点)T/A突变的分子标记。
2.2提取血液总DNA
选取强英鸭505只,进行翅静脉采血,提取血液总DNA,利用天根生物科技有限公司生产的血液DNA提取试剂盒提取鸭翅静脉血样中总DNA,提取步骤按照试剂盒说明书进行即可。
2.3PCR扩增
利用上海翊圣生物公司生产的Mix,通过已合成的测序特异性引物对OSBPL8基因的目的片段,进行PCR扩增反应,PCR扩增体系如表1所示:
表1 PCR扩增体系
组分 用量
DNA模板 1μL
Forward primer 1μL
Reveres primer 1μL
Mix 10μL
ddH2O 7μL
总计 20μL
PCR反应条件为:95℃预变性5min;第一步95℃变性45s;第二步64.8℃退火45s(退火温度根据引物而设定);第三步72℃延伸30s,其中第二步到第三步循环34次,共35个循环;72℃延伸10min。
2.4PCR扩增产物检测与测序
利用2%质量比的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,如图1所示,在凝胶成像仪成像后获得获得一条长度近似647bp的条带,与预测的长度一致,说明获得了目的片段,将PCR产物送到北京擎科生物科技有限公司(南京),序列如SEQ ID NO.4所示,与预测结果一致。
2.5基因分型
2.5.1配置如表2所示的酶切体系,酶切条件为37℃水浴1小时,利用NEB公司PvuII限制性内切酶酶切PCR扩增产物;
表2酶切体系
组分 用量
PCR扩增产物 0.4μL
Pvu II 0.4μL(5U/μL)
buffer 2μL
ddH2O 7.2μL
总计 10μL
2.5.2利用1.5%质量比低电压琼脂糖凝胶电泳检测,获得如图2所示的结果(部分结果);其中,若酶切产物:包含1条条带,为AA型;包含2条条带,为TT型;包含3条条带,为TA型。
2.6酶切测序验证
将基因酶切分型琼脂糖凝胶电泳图进行统计,获得AA、TA、TT三种分型,对这三种分型分别挑选一个个体进行测序比对,测序比对图如图3所示,测序结果中T突变成A,箭头标出了突变位置,与酶切分型结果一致。
2.7效果验证
为确定鸭OSBPL8基因T40194710A位点的T/A多态性与鸭重要表型性状关联性,以2.2中的505只强英鸭为试验材料,统计21~42日龄采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、代谢体增重(MBW0.75)、料重比(FCR)、剩余采食量(RFI),采用2.5基因分型方法,对505只强英鸭,进行基因分型,结果如表3所示:
表3不同表型个体基因型检测结果
实验结论:卡方检验结果显示,试验鸭群体基因型处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。
2.8统计分析
用SAS9.4软件中最小二乘分析法分析三种基因型与鸭饲料利用率性状之间的关联性,不同基因型与各性状间的关联分析结果见如表4所示:
表4鸭OSBPL8基因型与鸭饲料利用率性状关联分析
注:同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05),同一行不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
实验结论:从表4中可以看出,对于OSBPL8基因T40194710A位点而言,AA型个体的剩余采食量(RFI)和料重比(FCR)显著高于TT型个体,AA型和TA型个体的剩余采食量(RFI)显著高于TT型个体,三种基因型个体在平均日增重(ADG)和代谢体增重(MBW0.75)方面无显著差异,由此可得出,TT基因型个体饲料利用率性状最好,TA基因型个体饲料利用率性状中等,AA基因型个体饲料利用率性状较差。
上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于OSBPL8基因鉴定鸭饲料利用率性状的分子标记,其特征在于,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其中,所述核苷酸序列的第391位碱基为T或A。
2.一种如权利要求1所述的分子标记在鉴定鸭饲料利用率性状中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述的分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取鸭翅静脉血液总DNA;
(2)以所述分子标记所在位点及其上下游碱基组成的序列为目标序列设计特异性扩增引物,以所述总DNA为模板,利用特异性扩增引物进行PCR扩增,获得扩增产物;
(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序,获得待测鸭的分子标记类型;
(4)根据分子标记类型判断鸭饲料利用率性状。
4.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法,其特征在于,所述特异性扩增引物的序列为:
SEQ ID NO.2:Forward primer:GAGTGCTGGAATGCTTATAC;
SEQ ID NO.3:Reverse primer:CCTAATCCTGGCTTCTAAT。
5.根据权利要求3所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法,其特征在于,所述基因分型检测方法为通过酶切扩增产物获得酶切产物,利用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测,根据图像进行基因分型,若酶切产物:
包含1条条带,则为AA型;
包含2条条带,则为TT型;
包含3条条带,则为TA型。
6.根据权利要求5所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法,其特征在于,
若待测鸭分子标记类型为AA型,该鸭饲料利用率性状较差;
若待测鸭分子标记类型为TT型,该鸭饲料利用率性状最好;
若待测鸭分子标记类型为TA型,该鸭饲料利用率性状中等。
7.根据权利要求5所述的一种利用分子标记鉴定鸭饲料利用率性状的方法,其特征在于,利用1.5%-2.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测。
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