CN103243155B

CN103243155B - 黄牛cidec基因单核苷酸多态性位点的快速检测方法与应用

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Publication number: CN103243155B
Application number: CN201310003906.4A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 王璟; 曹修凯; 潘虹; 滑留帅; 蓝贤勇; 胡沈荣; 雷初超
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2013-01-06
Filing date: 2013-01-06
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-01-06
Also published as: CN103243155A

Abstract

本发明公开了一种检测黄牛CIDEC基因5’调控区多个单核苷酸多态性的方法，以包含CIDEC基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P（P1、P2、P3）为引物，PCR扩增黄牛CIDEC基因；用限制性内切酶HaeIII、AccI、HaeIII分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛CIDEC基因第‑974位、第‑956位、第‑501位的单核苷酸多态性，因为完全连锁，第‑956位的多态性也代表了第‑841,‑763,‑727和‑546位的多态性、第‑501位的多态性也代表了第‑643位的单核苷酸多态性，这样检测三个位点的多态性就可以得到九个位点的多态信息。本发明提供的检测方法为CIDEC基因的单核苷酸多态性与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛肉用生长性状的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性位点的快速检测方法与应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因单核苷酸多态性（SNP）的检测，特别涉及一种检测黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性的方法与应用。

背景技术

利用DNA分子标记，可进行家畜基因图谱的构建，标记辅助保护遗传资源，预测家畜杂种优势、鉴定个体或品种遗传分化和亲缘关系的分析等研究。随着家畜基因组计划的深入发展，家畜分子标记育种已经成为家畜遗传育种的主要工具并带来巨大的经济价值。

标记辅助选择经历了三个发展阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质（酶）标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标，这称为分子标记辅助选择。单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism，SNP）是指基因组DNA中单个核苷酸变异引起的一种二等位基因，或二态的遗传变异，即在该位置上存在两种不同的碱基。其核苷酸的变异形式有转换、颠换、插入、缺失等，而且其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1%。SNP作为遗传标记有很多优势：首先SNP数量多，分布广泛，其次SNP适于快速、规模化筛选，SNP等位基因频率容易估计，SNP易于基因分型，最后SNP标记密度高。

牛肉蛋白质含量丰富，脂肪含量低，氨基酸组成比猪肉更接近人体需要，同时还具有较多的维生素和微量元素，是一种营养价值较高的肉食品，能提高机体抗病能力。随着人们生活水平的提高，对牛肉的需求量也日益增加，这对我国肉牛产业的发展有很大的推动作用。

我国有着丰富的牛种资源，秦川牛为我国五大优良地方品种之一，具有风味浓郁、细嫩多汁的特点。缺点主要表现在后躯不发达，产肉少，育肥增重速度赶不上国外的专门化肉牛品种，优质高档肉块产量少。提高高档优质肉块的产量，也就是平时所说的雪花牛肉产量，主要涉及提高牛肉的肌间脂肪含量，在分子育种水平，可以通过提高影响脂肪代谢，脂质沉积的基因表达量来实现这样的目标。作为影响脂质沉积的关键调控因子CIDEC基因可以作为一个重要的候选基因。

诱导细胞凋亡的DFF45样效应因子（Cell death-inducingDFF45-like effector）家族有三个成员，CIDEA，CIDEB和CIDEC。这些家族成员具有很高的序列同源性：它们均含有特殊的CIDE氮端和CIDE碳端，其中CIDE氮端与DFF碎片因子氮端高度同源。起初，研究集中在它们的促进凋亡作用，但是近期研究发现这三个成员也是重要的调控因子，能够参与很多代谢调控过程。Hall等研究发现，在肥胖的模型小鼠中，这三个成员（CIDEA，CIDEB和CIDEC）在肝细胞中表达明显增加。

1998年，首次在TA1脂肪生成中鉴定出上调的CIDEC，在啮齿类动物中这个基因也叫脂肪特异蛋白27（Fsp27），在人类研究中该基因被称为CIDE3。有报道称，由于卡路里摄入量的降低能够诱导CIDE3基因的下调。一个女性病人CIDE3基因位于CIDE碳端的第186位氨基酸的突变（E186X）表现出部分脂肪代谢障碍，白色脂肪细胞有多房性脂滴，还表现出胰岛素抵抗型糖尿病。这些研究证明CIDEC对于单房脂滴的形成以及人体脂肪组织最佳能量储存有着非常重要的意义。肥胖群体肝脏中CIDEC的表达明显上升，而且随着体重降低肝脏CIDEC的表达也随之降低。

李等研究发现CIDEC是一个调控脂肪细胞分化，减少脂肪细胞团的靶基因。在人泡沫细胞中，CIDEC对细胞中脂滴的形成，分解以及动脉粥样硬化过程很重要。也有结果表明，在人体脂肪细胞中，胰岛素通过P13K调控CIDEC的表达。

Fsp27/CIDEC敲除小鼠表现出较瘦的表型，因为高能量消耗到指定脂肪组织萎缩，说明Fsp27/CIDEC与线粒体功能相关。这个敲除小鼠也受到抵抗饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗。在二型糖尿病模型小鼠肝脏中也检测到Fsp27/CIDEC的表达，在脂肪组织和肝脏中的生理作用证明了Fsp27/CIDEC参与代谢紊乱的发展。在TAK1（/）小鼠的脂肪组织中，肝脏和原发性肝细胞中CIDEA和CIDEC显著降低，这些小鼠表现出明显的肝脏甘油三酯的降低和脂质堆积的减少。在ROR alpha(sg/sg)小鼠肝脏中，CIDEC和CIDEA表达水平也降低了很多。还有研究表明Ad-36能够诱导骨骼肌细胞中的脂滴形成，这个过程可能是由促进Fsp27/CIDEC的表达介导的。Kim等提出再脂肪细胞分化过程中，PPARg对于CIDEC的转录活性很重要，这个结果有助于了解脂肪细胞脂滴形成的分子机制。

关于牛CIDEC基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因的功能研究及其遗传变异与经济性状（如：体重和日增重等性状）关联的研究仍是空白。本发明提供的检测方法为CIDEC基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择（MAS），快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用Forced-PCR-RFLP方法检测黄牛CIDEC基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性的方法，以包含CIDEC基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛CIDEC基因；用限制性内切酶HaeIII、AccI、HaeIII分别消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛CIDEC基因第-974位、第-956位、第-501位的单核苷酸多态性，

所述的引物对P1为：

上游引物：agctgtgctgcccaggatggctgccagcgg 30bp；

下游引物：gggactttctaccatggtgggttctatatcc； 31bp。

所述的引物对P2为：

上游引物：ggcactgctggtggaggaactgacttcagg 30bp；

下游引物：cttattgaatgttaactggtttagatgtat； 30bp。

所述的引物对P3为：

上游引物：gactctgtccccaaggacagaaactagctgag 32bp；

下游引物：accaagttggagaccccctcagtacccaggctcggc； 36bp。

所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；30~34个循环94℃变性30s，62、60、58℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5%。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛CIDEC基因第-974位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为165bp条带和30bp条带；CT基因型表现为195bp、165bp和30bp条带；TT基因型表现为195bp。第-956位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为174bp条带；GA基因型表现为174bp、144bp和30bp条带；CC基因型表现为144bp和30bp。第-501位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为143bp条带和35bp；GA基因型表现为178bp、143bp和35bp条带；AA基因型表现为178bp。

本发明根据CIDEC基因的序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛CIDEC基因的部分序列。与NCBI公布的序列进行比较发现在存在第-974位、第-956位、第-841位，第-763位,第-727位，第-714位，第-643位，第-546位，第-501位十处SNP多态性。

针对上述十处SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状（体重和日增重等）进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。

附图说明

图1为检测黄牛CIDEC基因5端多态位点PCR产物电泳图；

图2为黄牛CIDEC基因酶切电泳结果图，其中图2a、2b、2c分别为黄牛CIDEC基因包含第-974位、第-956位、第-501位的多态位点PCR产物的酶切电泳结果；

图3为黄牛CIDEC基因SNP多态性测序结果图，其中图3a、3b、3c分别为黄牛CIDEC基因包含第-974位、第-956位、第-501位多态位点的测序结果图，曲线上方的“方框”包括的碱基为突变碱基；

图4是本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计和扩增产物中SNP位点突变的示意图，图4a、4b、4c分别检测是黄牛CIDEC基因包含第-974位、第-956位、第-501位多态位点的PCR引物设计，其中方框中表示突变位点、阴影部分为内切酶识别序列，小写是引入的错配碱基。

具体实施方式：

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛CIDEC基因第-974位、第-956位、第-501位的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛CIDEC基因含5端侧翼区PCR引物的设计

以NCBI所公布的牛(AC_000179.1)序列为参考，利用Primer5.0设计能够扩增包含黄牛CIDEC基因5端侧翼区的PCR引物。

扩增5端侧翼区的引物为：

上游引物：aggagaacatttcagggtg 19bp;

下游引物：gcagtggaagttgggag 17bp。

以上述引物对黄牛基因组扩增，扩增包含黄牛CIDEC基因5端侧翼区片段，对扩增的片段进行测序鉴定后，共发现十处突变位点：AC_000179.1:g.-501G>A;-546T>C;-643T>G;-714T>C;-727C>T;-762C>T;-763C>T;-841T>C;-956G>A;-974C>T。

经过分析，其中第-956位，第-841,-763,-727和-546位完全连锁，第-501位和第-643位完全连锁，所以检测第-974位、第-956位、第-501位的单核苷酸多态性即可代表这九处SNP的多态信息，而以上三处SNP均不存在天然酶切位点，因此，通过设计引物P（P1、P2、P3）分别对以上三处SNP引入HaeIII、AccI、HaeIII酶切位点（其中-714T>C突变位点和任何位点都没有连锁关系，而且在群体中的频率非常低，所以本实验后期多态检验并没有涉及该位点）。

b、以引物P进行PCR扩增待测黄牛的CIDEC基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以4个中国地方黄牛品种和1个中国培育品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：

表1黄牛样本的采集

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1）冷冻血样（主要为血细胞）室温解冻，转移500μL至1.5mLEppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min（4℃），弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2）在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3）加蛋白酶K至3μL（20mg/mL）并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4）将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5）加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，

将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6）加氯仿、异戊醇混合液（24：1）500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7）加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9）4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10）干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11）500μL的DNA溶液中加入10%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12）5℃保温10h左右；

13）等体积苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）和氯仿分别抽提一次；

14）12000r/mm离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15）加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16）倒掉液体，70%乙醇洗涤后晾干，加入50μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

25μL反应体系包括0.625U Taq DNA聚合酶（北京天根科技有限公司），2×Buffer12.5μL（内含Mg²⁺、dNTPs等）（北京天根科技有限公司Mix），50ng/μL含CIDEC基因的黄牛基因组DNA0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸10min；

对5个黄牛品种的1185个样本的基因组DNA进行PCR扩增，

分别获得1185个个体的黄牛CIDEC基因中包含SNP位点的DNA片段。

c、用限制性内切酶HaeIII、AccI、HaeIII分别酶切消化PCR扩增的CIDEC基因片段

1、酶切反应消化体系（25~30μL）：10~15μLPCR产物，10×缓冲液（含BSA）2.5~3.0μL，限制性内切酶（10U/μL）为1.0~1.5μL，灭菌纯水（H₂O）11.5~16.5μL；

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化8~12h。

d、限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1）制作3.5%的琼脂糖凝胶，点样后120V电压电泳1小时，EB染色检测酶切结果；

2）待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD GelDoc2000凝胶成像系统成像；

3）根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：CIDEC基因第-974位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为165bp条带和30bp条带；CT基因型表现为195bp、165bp和30bp条带；TT基因型表现为195bp。第-956位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为174bp条带；GA基因型表现为174bp、144bp和30bp条带；CC基因型表现为144bp和30bp。第-501位的单核苷酸多态性为：GG基因型表现为143bp条带和35bp；GA基因型表现为178bp、143bp和35bp条带；AA基因型表现为178bp。

e、黄牛CIDEC基因SNP位点的频率统计分析

1）基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A=（2N_AA＋N_Aa1＋N_Aa2＋N_Aa3＋N_Aa4＋……＋N_Aan）/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1－an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种CIDEC基因的SNP中，等位基因频率变化幅度如表3所示。

表3黄牛CIDEC基因SNP基因频率分布表

F、黄牛CIDEC基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：HaeIII识别的基因型（CC、CT和TT）、AccI识别的基因型（GG、GA和AA）、HaeIII识别的基因型（GG、GA和AA）。

生产数据：南阳牛6月、12月、18月和24月的体重和日增重数据。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SAS（9.1）软件的GLM过程分析基因型和瓶中对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl=μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl，

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明（见表4）：在第-974位，18月龄CC基因型的个体体重和平均日增重均高于CT、TT基因型个体且差异显著（P<0.01）；在第-956位,18月龄GA基因型的个体平均日增重均高于GG基因型个体且差异极显著（P<0.01）。在第-501位,18月龄TC基因型的个体体重和平均日增重均高于CC基因型个体且差异极显著（P<0.01）。说明第-974位的CC基因型，第-956位的GA基因型以及第-501位的TC基因型可以作做为一个提高黄牛体重和日增重的候选分子遗传标记。

表4CIDEC基因多态位点与南阳牛18月龄体重和日增重之间的方

差分析

注：具有相同字母表示差异不显著（P>0.05），字母不同表示差异显著（P<0.05）。

Claims

1.一种检测黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，以包含CIDEC基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，PCR扩增黄牛CIDEC基因；用限制性内切酶HaeIII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛CIDEC基因第-974位的单核苷酸多态性，

所述的引物对P1为：

上游引物：agctgtgctgcccaggatggctgccagcgg

下游引物：gggactttctaccatggtgggttctatatcc。

2.如权利要求1所述的检测黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：

94℃预变性5min；30～34个循环94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的检测黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

4.如权利要求1所述的检测黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛CIDEC基因第-974位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为165bp条带和30bp条带；CT基因型表现为195bp、165bp和30bp条带；TT基因型表现为195bp。

5.权利要求1至4中任意一项权利要求所述的检测黄牛CIDEC基因单核苷酸多态性的方法在鉴定不同黄牛群体多态性中的应用。