CN102296110B

CN102296110B - 一种检测黄牛fgf21基因单核苷酸多态性的方法

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Publication number: CN102296110B
Application number: CN201110201228.3A
Authority: CN
Inventors: 陈宏�; 孙晓梅; 李明勋; 马伟; 蓝贤勇; 王璟; 滑留帅
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2011-07-18
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2031-07-18
Also published as: CN102296110A

Abstract

本发明公开了一种快速检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含FGF21基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FGF21基因，发现4个SNP位点；针对这4个SNP位点分别设计引物对F159、F297、F940、F1151，依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，进行PCR扩增，用上述四种限制性内切酶分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的单核苷酸多态性。由于FGF21基因功能涉及体重等生长性状，本发明提供的检测方法为FGF21基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

Description

一种检测黄牛FGF21基因单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种快速检测成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)基因单核苷酸多态性(SNP)的RFLP(限制性片段长度多态性)方法，具体地说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析其片段大小，从而确定其SNP。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。

近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、直接测序技术和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术成本又较高。PCR-RFLP方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是一种主要的脂肪代谢调节因子，具有调控能量代谢的作用，在动物模型中作为一个代谢调控子的发现引起了研究者的关注。FGF21在肝脏中特异的表达，可通过作用于脂肪组织及胰腺来降低血糖和甘油三酯含量，从而预防饮食诱导的肥胖及胰岛素抵抗。对于黄牛育种来讲，分析FGF21基因在牛脂肪代谢及能量平衡中的机制，对于提高黄牛的育肥效率、提高肉品质具有重要的理论意义。

国内外未见关于FGF21基因遗传变异的研究，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：体重等)关联的研究仍是空白。由于FGF21基因功能涉及体重等生长性状，本发明提供的检测方法为FGF21基因的SNP与中国黄牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。

发明内容

本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测黄牛FGF21基因的多态性，并将其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种快速检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，以包含FGF21基因的待测黄牛全基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3为引物，PCR扩增黄牛FGF21基因(全长1459bp，含3个外显子和2个内含子)，发现4个SNP位点；针对这4个SNP位点分别设计引物对F159、F297、F940、F1151，依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，进行PCR扩增，用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分别酶切该四对引物的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的单核苷酸多态性。

所述的引物对P1为：

上游引物：5′ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC 3′，

下游引物：5′CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA 3′；

所述的引物对P2为：

上游引物：5′GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG 3′，

下游引物：5′CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG 3′；

所述的引物对P3为：

上游引物：5′CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG 3′，

下游引物：5′TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG 3′。

将该三对引物的PCR产物送测序，根据测序结果及突变情况，在黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第1151位处重新设计引物，并依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，以引物对F159、F297、F940、F1151为引物，PCR扩增黄牛FGF21基因：

所述的引物对F159为：

上游F159-SalI：5′CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA 3′，

下游R159：5′TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG 3′；

所述的引物对F297为：

上游F262-XhoI：5′CCTGAAGCAGTAGGGAATTGGGGCCTCG 3′，

下游R262：5′CACCGATCCGTACAGCTTCCCATCTGGC 3′；

所述的引物对F940为：

上游F940：5′CCTGGCTCATGCTGGGCGAAGGGTC 3′，

下游R940-XbaI：5′CGGAGGCAGGTCCCTCCTTAACCTCTAG 3′；

所述的引物对F1151为：

上游F1151：5′AGACCTAGACGATAAAGCTGAGAAAGGAGG 3′，

下游R1151-MspI：5′AAAGTGCAGCTGCGGGGATGAGAGCC 3′。

用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分别酶切上述四对引物的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定中国黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第1151位的单核苷酸多态性。

所述的PCR扩增反应程序为：

95℃预变性5min；30～34个循环94℃变性30s，66.8℃退火30s，72℃延伸40s；72℃延伸10min；4℃保存。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.5％。

所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为244bp条带；TC基因型表现为244bp、221bp和23bp条带；CC基因型表现为221bp和23bp条带。第297位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为205bp条带；CG基因型表现为205bp、180bp和25bp条带；GG基因型表现为180bp和25bp。第940位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为207bp条带；CT基因型表现为207bp、179bp和28bp条带；TT基因型表现为179bp和28bp。第1151位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为151bp和27bp条带；CT基因型表现为178bp、151bp和27bp条带；TT基因型表现为178bp。

本发明根据FGF21基因的序列设计引物，分别以5种黄牛品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，测序后得到黄牛FGF21基因的完整序列。与NCBI公布的序列进行比较，发现在第159位、第297位、第940位和第1151位存在SNP多态性。

针对上述4处SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增，特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。

本发明对5个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述SNP位点与黄牛部分生长性状(如体重等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生长性状的分子标记。

附图说明

图1为牛FGF21基因的结构图及突变位点所在的位置。

图2为黄牛FGF21基因SNP多态性测序图，其中图2a、2b、2c、2d中双峰分别为黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位SNP位点。

图3为黄牛FGF21基因包含F159位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图3a为PCR产物电泳图，3b为酶切结果图。

图4为黄牛FGF21基因包含F297位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图4a为PCR产物电泳图，4b为酶切结果图。

图5为黄牛FGF21基因包含F940位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图5a为PCR产物电泳图，5b为酶切结果图。

图6为黄牛FGF21基因包含F1151位点的PCR产物电泳图及酶切结果图，其中图6a为PCR产物电泳图，6b为酶切结果图。

图7为本发明用来检测SNP多态性的PCR引物设计示意图，图7a、7b、7c、7d分别检测是黄牛FGF21基因包含第159位、第297位、第940位、第1151位多态位点的PCR引物设计方案。其中大写部分为引物序列，斜体部分为引入突变，黑体加粗部分为SNP位点，方框部分为形成的酶切位点。

具体实施方式

本发明利用PCR-RFLP方法对黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

A、设计黄牛FGF21基因的PCR引物

黄牛FGF21基因全长1459bp，包含3个外显子和2个内含子。以NCBI所公布的牛(NC_007316)序列为参考，利用Primer 5.0设计3对引物将FGF21基因全长(含3个外显子和2个内含子，共11459bp)分3段扩增，引物如下：

所述的引物对P1为：

上游引物：5′ATGGGCTGGGACGAGGCCAAGTTC 3′，

下游引物：5′CAAACCAAGCCTGACCAACATCAAA 3′；

所述的引物对P2为：

上游引物：5′GGAAGCTGTACGGATCGGTGAG 3′，

下游引物：5′CTCCTTTCTCAGCTTTATCGTCTAGG 3′；

所述的引物对P3为：

上游引物：5′CCTGCCTCCGTGGTTTTGAG 3′，

下游引物：5′TCAAGAAGTGTAGCTGGGGCTTCG 3′。

以黄牛基因组为模板，用上述3对引物扩增牛FGF21基因的全长(含3个外显子和2个内含子，共1459bp)，将PCR产物送测序，结合测序结果和NCBI所公布的牛(NC_007316)序列发现4处突变：第一外显子存在一处同义突变(NC_007316：159T＞C)，第一内含子存在一处突变(NC_007316：297C＞G)，第二内含子存在二处突变(NC_007316：940C＞T，1151C＞T)。经过分析，以上4处SNP均不存在天然酶切位点，因此，通过设计引物对F159、F297、F940、F1151在四个SNP处依次人为引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点。

B、以引物对F159、F297、F940、F1151进行PCR扩增待测黄牛的FGF21基因片段

1、黄牛样本的采集

本发明具体以5个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：

表1黄牛样本的采集

2、血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，

将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存；

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

25μL反应体系包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer12.5μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含FGF21基因的黄牛基因组DNA 0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

72℃延伸5min；

对5个黄牛品种的1255个样本的基因组DNA进行PCR扩增，分别获得1255个个体的黄牛FGF21基因中包含SNP位点的DNA片段。

C、用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分别酶切消化PCR扩增的FGF21基因片段

1、酶切反应消化体系(25～30μL)：10～15μL PCR产物，10×缓冲液(含BSA)2.5～3.0μL，限制性内切酶(10U/μL)为1.0～1.5μL，灭菌纯水(H₂O)11.5～16.5μL；

2、酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化10h。

D、限制性内切酶消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作3.5％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸燃料)，点样后120V电压电泳40min；

2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性。

黄牛FGF21基因第159位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为244bp条带；TC基因型表现为244bp、221bp和23bp条带；CC基因型表现为221bp和23bp条带。第297位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为205bp条带；CG基因型表现为205bp、180bp和25bp条带；GG基因型表现为180bp和25bp。第940位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为207bp条带；CT基因型表现为207bp、179bp和28bp条带；TT基因型表现为179bp和28bp。第1151位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为151bp和27bp条带；CT基因型表现为178bp、151bp和27bp条带；TT基因型表现为178bp。

E、黄牛FGF21基因SNP位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+……+N_Aan)/2N，式中P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种FGF21基因的SNP中，等位基因频率变化如表3所示。

表3黄牛FGF21基因SNP基因频率分布表

F、黄牛FGF21基因SNP位点基因效应的关联分析

基因型数据：SalI识别的基因型(TT、TC和CC)、XhoI识别的基因型(CC、CG和GG)、XbaI识别的基因型(CC、CT和TT)、MspI识别的基因型((CC、CT和TT)。

生产数据：南阳牛6月、12月、18月和24月的体重、体高、体长、胸围和日增重数据。

关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS(19)软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：

Y_ijkl＝μ+BF_i+Month_j+G_k+e_ijkl，

其中：Y_ijkl为性状观察值，μ为总体均值，BF_i为第i个品种和农场的固定效，Month_j为第j个月观测的固定效应，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ijkl为随机误差。

结果表明(见表4)：第297位，18月龄GG基因型的个体体重高于CC、CG基因型个体，且差异显著(P＜0.05)；在第940位，18月龄TT基因型的个体体重高于CC、CT基因型个体，且差异极显著(P＜0.01)。而其他位点基因型与生长形状关系差异不显著。说明第297位的GG基因型以及第940位的TT基因型可以作做为一个提高黄牛体重的候选分子遗传标记。

表4FGF21基因第297位和第940位多态位点与

南阳牛18月龄体重之间的方差分析

注：具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

Claims

1.一种快速检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于：以包含FGF21基因的待测黄牛基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛FGF21基因，发现4个SNP位点；针对这4个SNP位点分别设计引物对F159、F297、F940、F1151，进行PCR扩增，用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，根据电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位、第1151位的单核苷酸多态性；

所述的引物对F159为：

上游F159-SalI：5’CCGCCAGCGGTACCTCTACACGGTCGA 3’，

下游R159：5’TCCAAGAGACCTGAGGGGAGAAAGTGGG 3’；

所述的引物对F297为：

上游F262-XhoI：5’CCTGAAGCAGTAGGGAATTGGGGCCTCG 3’，

下游R262：5’CACCGATCCGTACAGCTTCCCATCTGGC 3’；

所述的引物对F940为：

上游F940：5’CCTGGCTCATGCTGGGCGAAGGGTC 3’，

下游R940-XbaI：5’CGGAGGCAGGTCCCTCCTTAACCTCTAG 3’；

所述的引物对F1151为：

上游F1151：5’AGACCTAGACGATAAAGCTGAGAAAGGAGG 3’，

下游R1151-MspI：5’AAAGTGCAGCTGCGGGGATGAGAGCC 3’；

第159位的单核苷酸多态性为：TT基因型表现为244bp条带，TC基因型表现为244bp、221bp和23bp条带，CC基因型表现为221bp和23bp条带；第297位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为205bp，CG基因型表现为205bp、180bp和25bp条带，GG基因型表现为180bp和25bp；第940位的单核苷酸多态性表现为：CC基因型表现为207bp条带，CT基因型表现为207bp、179bp和28bp条带，TT基因型表现为179bp和28bp条带；第1151位的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为151bp和27bp条带，CT基因型表现为178bp、151bp和27bp条带，TT基因型表现为178bp。

2.如权利要求1所述的检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于，以包含FGF21基因的黄牛基因组DNA为模板，PCR扩增黄牛FGF21基因；将PCR产物送测序，根据突变情况重新设计引物对F159、F297、F940、F1151，依次引入SalI、XhoI、XbaI、MspI酶切位点，PCR扩增黄牛FGF21基因；

用限制性内切酶SalI、XhoI、XbaI、MspI分别酶切该四对引物的PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果鉴定黄牛FGF21基因第159位、第297位、第940位和第1151位的单核苷酸多态性。

3.如权利要求1所述的检测黄牛FGF21基因SNP的RFLP方法，其特征在于：所述的琼脂糖凝胶电泳的质量浓度为3.5％。