CN101679501A - 治疗、诊断和检测fgf21-相关疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗癌症和血管疾病的方法，治疗癌症和血管疾病的组合物，以及用于诊断和/或检测癌症和血管疾病的方法和组合物，以及其它。

Description

治疗、诊断和检测FGF21-相关疾病的方法
[0001]发明领域
[0002]本发明涉及FGF21-相关病症，包括癌症和血管疾病。更特别的，发明涉及治疗癌症和血管疾病的方法，治疗癌症和血管疾病的组合物，以及用于诊断和/或检测癌症和血管疾病的方法和组合物。
[0003]发明背景
[0004]成纤维细胞生长因子21(FGF21)是FGF蛋白质家族的成员(美国专利号6,716,626)。目前鉴定FGF蛋白属于信号分子家族，调节多种细胞类型的生长和分化。FGF蛋白对人生理学和病理学的重要性，部分的涉及它们在胚胎发生、血管发育和生长，以及骨骼生长中的作用。FGF家族的大多数成员与细胞活动相关，包括有丝分裂、发育、转化、血管发生和细胞存活。FGF家族的一些成员及其生物学作用描述在Crossley等人，Development 121：439-451(1995)；Ohuchi等人，Development 124：2235-2244(1997)；Gemel等人，Genomics 35：253-257(1996)；和Ghosh等人，CellGrowth and Differentiation 7：1425-1434(1996)。
[0005]FGF21表现出是脂肪细胞摄入葡萄糖的有效活化剂，当在转基因小鼠中过表达时，保护动物免受食物诱导的肥胖，当向糖尿病啮齿类动物治疗性的施用时，降低血糖和甘油三酯的水平(Kharitonenkov等人，Jour.ofClinical Invest.115：1627-1635，2005)。而且，观察到FGF21在3T3-L1脂肪细胞(Id)中刺激FGFR-1和FGFR-2的酪氨酸磷酸化。
[0006]血管发生，从已存在的血管形成新血管，对肿瘤生长和转移是关键的。肿瘤细胞分泌的生血管生长因子驱动肿瘤的血管发生。生长因子-碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素(Ang)-1和Ang-2已经在多种实验模型中表现出诱导血管发生(Eggert等人，Clin.Cancer Res.6：1900-1908，2000)。由于血管发生在肿瘤生长中扮演的角色，抑制上述生血管生长因子是治疗癌症的对策。
[0007]血管疾病影响循环系统，包括疾病例如冠状动脉病(CAD)和外周动脉病(PAD)。CAD是美国死亡的主要原因，研究将血管发生的缺陷与CAD的发展相联系(例如，Matsunaga等人，Am J Physiol Heart CircPhysiol 288：H2042-H2046，2005)。动物局部缺血模型中的研究表示，施用生血管生长因子可以增强新血管形成的营养灌流。在晚期CAD患者的治疗性血管发生的临床实验中，使用生长因子例如VEGF和FGF，显示了运动时间的增加和心绞痛症状的减轻。血管发生还表现出改善了心肌梗塞后的血流(Takeshita等人，J.Clin.Invest.93：662-670，1994)。因此，血生血管因子是治疗血管疾病的有希望的治疗剂。
[0008]然而，迄今为止，尚未完全阐述清楚FGF21在癌症和血管疾病中的角色。因此，需要鉴定调节FGF21的组合物和方法。本发明是针对上述以及其它重要的需要。
[0009]发明概述
[00010]在一些方面，本发明提供了在需要其的患者中治疗癌症或癌症症状的方法，包括向患者施用治疗有效量的FGF21抑制剂。
[00011]在一些方面，本发明提供了在患者中调节FGF21-相关活性的方法，包括向患者施用一定量的FGF21调节剂，所述量有效的调节FGF21-相关的生物学活性。
[00012]在一些方面，本发明提供了鉴定对FGF21疗法敏感的患者的方法，包括与对照细胞样品相比，检测来自患者的细胞样品FGF21过表达的证据。样品中存在FGF21过表达的证据表示患者是FGF21疗法的候选对象。样品中缺少FGF21过表达的证据表示患者不是FGF21疗法的候选对象。如果患者是FGF21疗法的候选对象，向患者施用治疗有效量的FGF21抑制剂。如果患者不是FGF21疗法的候选对象，则使用常规的癌症治疗方案。
[00013]在一些方面，本发明提供了调节表达FGF21的细胞中的一种或多种活性的方法，包括将细胞与有效调节一种或多种活性的量的FGF21抑制剂接触。
[00014]在一些方面，本发明提供了检测患者体内肿瘤的方法，包括向患者施用这样的组合物，所述组合物包含与显像剂相连接的FGF21抑制剂，并检测显像剂在患者体内的分布。
[00015]在一些方面，本发明提供了在患者或患者样品中抑制两个或多个表达FGF21的细胞的相互作用的方法，包括向患者施用治疗有效量的FGF21抑制剂。
[00016]在一些方面，本发明提供了在细胞中表达FGF21抗体的方法，其中，FGF21抗体特异性结合表位，所述表位包括选自SEQ ID NO：3-203的序列。方法包括在细胞表达编码FGF21抗体的核酸。
[00017]在一些方面，本发明提供了鉴定癌症抑制剂的方法，其中癌症的特征是与对照相比FGF21的差异表达。方法包括将表达FGF21的细胞与候选化合物接触，确定是否调节了FGF21-相关的活性。FGF21-相关活性的调节是癌症抑制剂的指标。
[00018]在一些方面，本发明提供了鉴定癌症抑制剂的方法，其中癌症的特征是与对照相比FGF21的差异表达。方法包括将表达FGF21的细胞与候选化合物接触，确定是否调节了FGF21下游标志物的活性。下游标志物的调节是癌症抑制剂的指标。
[00019]在一些方面，本发明提供了确定患者对FGF21抑制剂的易感度的方法，包括与对照样品相比，检测所述患者的癌症样品中FGF21过表达的证据。FGF21过表达的证据是患者对FGF21抑制剂的易感度的指标。
[00020]在一些方面，本发明提供了从样品中纯化FGF21蛋白的方法，包括(a)提供亲和基质，包括与固体支持物结合的抗-FGF21抗体；(b)将样品与亲和基质结合，形成亲和基质-FGF21蛋白复合体；(c)将亲和基质-FGF21蛋白复合体与样品剩余物分离；和(d)从亲和基质释放FGF21蛋白。
[00021]在一些方面，本发明提供了向表达FGF21的一个或多个细胞递送细胞毒性剂或诊断剂的方法。方法包括将表达FGF21的细胞暴露在与细胞毒性剂或诊断剂缀合的抗体下。
[00022]在一些方面，本发明提供了确定候选FGF21抑制剂的效果的方法。方法包括将表达FGF21的细胞与候选FGF21抑制剂接触，并确定是否调节了FGF21的下游标志物。下游标志物的调节表示候选FGF21抑制剂是有效的抗癌药物。
[00023]在一些方面，本发明提供了确定癌症是否是FGF21-相关癌症的方法，包括比较癌症和对照细胞中FGF21的表达。与对照细胞相比，癌细胞中FGF21表达的上调表示癌症是FGF21-相关的癌症。
[00024]在一些方面，本发明提供了确定癌症是否是FGF21-相关癌症的方法，包括将癌症样品与FGF21抑制剂接触，并测量癌症样品中FGF21下游标志物。与缺少抑制剂时的下游标志物相比，存在抑制剂时的下游标志物的调节表示癌症是FGF21-相关的癌症。
[00025]在一些方面，本发明提供了治疗癌症患者的方法，包括确定癌症是否是FGF21-相关的癌症，如果患者患有FGF21-相关的癌症，则向患者施用FGF21抑制剂，或者如果患者不患有FGF21-相关的癌症，则使用常规的癌症治疗方案治疗患者。
[00026]在一些方面，本发明提供了在需要其的患者中治疗血管疾病或血管疾病的症状的方法，包括向患者施用治疗有效量的FGF21活化剂。
[00027]在一些方面，本发明提供了诱导血管发生的方法，包括将细胞样品与一定量的FGF21活化剂接触，与对照细胞样品相比，所述量的FGF21活化剂有效的增加内皮细胞增殖至少30％。
[00028]在一些方面，本发明提供了鉴定血管疾病的抑制剂的方法。方法包括将表达FGF21的细胞样品与候选化合物接触，确定是否调节了FGF21-相关的活性。FGF21-相关活性的调节是血管疾病的抑制剂的指标。
[00029]在一些方面，本发明提供了鉴定血管疾病的抑制剂的方法，包括将表达FGF21的细胞与候选化合物接触，确定是否调节了FGF21的下游标志物。下游标志物的调节是血管疾病抑制剂的指标。
[00030]在一些方面，本发明提供了确定候选FGF21活化剂作为血管疾病药物的功效的方法，包括将细胞样品与候选FGF21活化剂接触，确定是否增加了下游FGF21标志物。与缺少候选活化剂时的下游标志物相比，存在候选活化剂时下游标志物的增加表示候选FGF21活化剂是有效的血管疾病药物。
[00031]在一些方面，本发明提供了包含成纤维细胞生长因子21(FGF21)调节剂和一种或多种可药用的载体的组合物。
[00032]在一些方面，本发明提供了包含FGF21调节剂和一种或多种可药用的载体的组合物，其中FGF21调节剂是分离的双链RNA(dsRNA)；分离的寡核苷酸，其包括SEQ ID NO：1的序列的至少10个连续的核苷酸；与FGF21的结构域中的表位结合的抗体，所述结构域选自信号肽结构域和FGF受体结合结构域；小分子；模拟物；可溶性受体；或诱饵。
[00033]在一些方面，本发明提供了与FGF21多肽的一个或多个表位特异性结合的纯化的抗体，其中表位是位于信号肽结构域或FGF受体结合结构域。
[00034]在一些方面，本发明提供了分离的dsRNA分子，包括第一链核苷酸和第二链核苷酸，所述第一链核苷酸包括SEQ ID NO：1序列的至少19个连续的核苷酸，第二链核苷酸包括与第一链核苷酸基本或完全互补的序列，其中dsRNA分子少于627个核苷酸长。
[00035]在一些方面，本发明提供了分离的核酸，其包括SEQ ID NO：1中所示序列的至少10个连续的核苷酸。
[00036]在一些方面，本发明提供了FGF21多肽的片段，包括SEQ IDNO：2的10个至209个连续的氨基酸残基，其中片段保留了FGF21多肽的活性。
[00037]在一些方面，本发明提供了包含FGF21受体抑制剂和一种或多种可药用的载体的组合物，其中抑制剂是分离的双链RNA(dsRNA)；分离的寡核苷酸，包括SEQ ID NO：1序列的至少10个连续的核苷酸；与FGF21受体的结构域中的表位结合的抗体；小分子；模拟物；可溶性受体；或诱饵。
[00038]在以下详细的发明说明中将阐述本发明的这些和其它方面。
[00039]附图说明
[00040]图1描述了FGF21对内皮细胞增殖的刺激。
[00041]图2描述了癌细胞内的FGF21mRNA的表达。
[00042]图3描述了正常细胞内的FGF21mRNA的表达。
[00043]图4描述了FGF19x和FGF21全长多肽之间的比对。
[00044]详细说明
[00045]本发明提供了治疗FGF21-相关病症，包括癌症和血管疾病的方法，用于治疗FGF21-相关病症的组合物，以及用于诊断和/或检测FGF21-相关病症的方法和组合物。
[00046]本申请的发明人发现，除了其它外，FGF21在结肠癌细胞中过表达，而在正常组织中具有受限的表达。发明人还发现FGF21刺激内皮细胞的细胞增殖。由于内皮细胞增殖是血管发生的关键步骤，FGF21还可用于促进新血管生长，这可用于治疗血管疾病，例如CAD和PAD。根据观察到的FGF21对细胞增殖的效果，和观察到的结肠癌细胞中FGF21的上调，FGF21可以是癌症治疗的有效靶。本申请中提供了本发明的这些和其它方面。
[00047]定义
[00048]本文件中使用了多种定义。大部分词语具有本领域技术人员所使用这些词语的本义。在下文或本文件其它地方特别定义的词语具有本发明上下文整体提供的含义，一般是本领域技术人员普遍理解的。
[00049]除非另外指出，本发明的实践可以使用本领域技术人员掌握的，化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。文献中详细的解释了此类技术。参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著，Academic Press，Inc.)；和Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编著，1986，Blackwell Scientific Publications)；和Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)。
[00050]如本文中使用的，单数形式“一”、“一个”和“这个”包括了复数指代，除非上下文另外清楚的指出。因此，例如“抗体”包括了两个或多个此类抗体的混合物。
[00051]如本文中使用的，术语“约”指+/-20％，+/-10％，或+/-5％的值。
[00052]如本文中使用的，术语“FGF21”指成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员。SEQ ID NO：1提出了FGF21的示例性mRNA序列(GenBank登录号NM_019113)，SEQ ID NO：2提出了FGF21的示例性氨基酸序列(GenBank登录号NP_061986)。
[00053]如本文中使用的，术语“FGF21受体”指FGF21的膜结合受体。FGF21与FGF21受体的结合导致细胞应答和/或活性，例如细胞信号事件。在一些实施方案中，FGF21受体是FGFR-1或FGFR-2。
[00054]术语“多肽”或“蛋白质”是可互换的使用的，指任何长度的氨基酸聚合体形式，可以包括编码的和非编码的氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽主链的多肽。术语包括融合蛋白，包括但不限于，具有异源性氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合体(具有或缺少N-末端甲硫氨酸残基)；免疫标记的蛋白质；等。
[00055]术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是可互换的使用的，指需要诊断、处理或治疗的任何受试者，特别是人。其它受试者可以包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。在一些优选的实施方案中，受试者是人。
[00056]如本文中使用的，“癌症”指原发性或转移性癌症、白血病或淋巴瘤。术语“癌细胞”指转化的细胞。可以从患有癌症的患者分离这些细胞，或者这些细胞是在体外转化成为癌性的细胞。癌细胞可以源自多种类型的样品，包括任何组织或细胞培养系。在一些实施方案中，癌细胞是超常增生、肿瘤细胞或赘生物。在一些实施方案中，癌细胞分离自结肠癌、肝癌、睾丸癌、胸腺癌、乳腺癌、皮肤癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑色素瘤。在一些实施方案中，癌细胞取自公众可获得的已经存在的细胞系。在一些实施方案中，癌细胞分离自已存在的患者样品，或分离自包含癌细胞的文库。在一些实施方案中，癌细胞是分离的，然后植入不同的宿主内，例如异种移植。在一些实施方案中，癌细胞是移植的，并用于SCID小鼠模型。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。如本文中使用的，术语“结肠癌”与“直肠癌”和“结肠直肠癌”是可互换的使用的，指源自结肠或直肠的癌症。
[00057]如本文中使用的，术语“转化的”指其后代稳定继承的细胞性质的任何改变。在一些实施方案中，“转化的”指正常细胞向癌性细胞的改变，所述癌性细胞例如能够导致肿瘤的细胞。在一些实施方案中，转化的细胞是永生的。转化可以由于多种因素导致，包括在缺少受体磷酸化下受体的过表达，病毒感染、癌基因和/或肿瘤抑制基因突变，和/或改变细胞的生长和/或永生化性质的任何其它技术。
[00058]“癌性表型”通常指是癌性细胞的特征的任何的多种生物学现象，所述现象可以随癌症类型而改变。通常通过异常来鉴定癌性表型，例如细胞生长或增殖(例如，不受控制的生长或增殖)、细胞周期调控、细胞移动性、细胞-细胞相互作用或转移等的异常。
[00059]如本文中使用的，术语“转移”指扩散到远离癌症发生(例如，原发性肿瘤)的位置的癌症。转移位点包括但不限于骨、淋巴结、肺、肝和脑。
[00060]如本文中使用的，术语“血管发生”指从已存在的血管生长出新的血管。
[00061]如本文中使用的，术语“临床终点”指作为癌症指标的可测量的事件。临床终点包括但不限于，到首次转移的时间、到继发性转移的时间、转移的大小和/或数量、肿瘤的大小和/或数量、肿瘤的位置、肿瘤的侵占性、生活质量、疼痛等。本领域技术人员确定和测量临床终点能力是可信的。测量临床终点的方法是本领域技术人员已知的。
[00062]如本文中使用的，术语“样品”指来自患者的生物学材料。本发明测定的样品不限于任何特定的类型。样品包括(作为非限制性实例)单细胞、多细胞、组织、肿瘤、生物学液体、生物学分子或任何上述的提取物或上清液。实例包括移除用于活组织检查的组织、在切除过程中移除的组织、血液、尿、淋巴组织、淋巴液、脑脊液、黏液和粪便样品。根据测定方式、检测方法和待测定的肿瘤、组织、细胞或提取物的性质，可以改变使用的样品。用于制备样品的方法是本领域普遍已知的，为了获得与所使用的方法相容的样品可以方便的调整。
[00063]如本文中使用的，术语“生物学分子”包括但不限于多肽、核酸和糖类。
[00064]如本文中使用的，术语“调节”指基因、蛋白或任何位于细胞内部、外部或表面的分子的质量或数量的改变。改变可以是分子的表达或水平的增加或降低。术语“调节”还包括生物学功能/活性的质量或数量的改变，包括但不限于，细胞增殖、生长、附着、凋亡、胞内信号传导、细胞-细胞信号传导等。
[00065]如本文中使用的，术语“调节剂”指调节与癌症或血管疾病相关的一种或多种生理学或生物化学事件的组合物。在一些实施方案中，调节剂抑制与癌症相关的一种或多种生物学活性。在一些实施方案中，调节剂增加一种或多种生物学活性，从而缓解了与血管疾病相关的症状。在一些实施方案中，调节剂是小分子、抗体、模拟物、诱饵或寡核苷酸。在一些实施方案中，调节剂通过阻断配体结合或竞争配体结合位点发挥作用。在一些实施方案中，调节剂独立于配体结合而发挥作用。在一些实施方案中，调节剂不竞争配体结合位点。在一些实施方案中，调节剂阻断涉及癌症或血管疾病的基因产物的表达。在一些实施方案中，调节剂阻断涉及癌症或血管疾病的两个或多个生物分子的物理相互作用。在一些实施方案中，发明的调节剂抑制一种或多种FGF21生物学活性，所述活性选自细胞增殖、血管发生、血管形成、细胞信号传导、激酶活性、脂肪细胞摄入葡萄糖、癌细胞存活和凋亡。在一些实施方案中，发明的调节剂增加一种或多种FGF21生物学活性，所述活性选自细胞增殖、血管发生、血管形成、细胞信号传导、激酶活性、脂肪细胞摄入葡萄糖，和凋亡。发明的调节剂还可以抑制FGF21和FGF21受体之间的相互作用，或FGF21受体的磷酸化。FGF21受体可以是例如FGFR-1或FGFR-2之一或两种。在一些实施方案中，发明的调节剂增加FGF21和FGF21受体之间的相互作用，或FGF21受体的磷酸化。在一些实施方案中，FGF21调节剂抑制FGF21表达。在一些实施方案中，FGF21调节剂增加FGF21表达。
[00066]“基因产物”是通过基因表达或产生的生物聚合产物。基因产物可以是例如未剪接的RNA、mRNA、剪接的变体mRNA、多肽、翻译后修饰的多肽、剪接变体多肽等。该术语还涵盖了利用RNA基因产物(即，RNA的cDNA)作为模板产生的生物聚合产物。基因产物可以是酶促的、重组的、化学的产生的，或在基因的天然细胞内产生的。在一些实施方案中，如果基因产物是蛋白质的，则表现出生物学活性。在一些实施方案中，如果基因产物是核酸，则可以翻译成表现生物学活性的蛋白质的基因产物。
[00067]本文中使用的“调节FGF21活性”指FGF21活性的增加或降低，其可以是以下因素的结果，例如活性剂与FGF21多核苷酸或多肽的相互作用，抑制FGF21转录和/或翻译(例如，通过反义或siRNA与FGF21基因或FGF21转录物的相互作用，通过调节有利于FGF21表达的转录因子)等。例如，生物学活性的调节指生物学活性的增加或降低。可以通过以下方式测定FGF21活性，包括但不限于，测定内皮细胞增殖、评估FGF21多肽水平或评估FGF21转录水平。FGF21活性的比较还可以通过以下方式来实现，所述方式是测量FGF21下游标志物的水平，测量FGF21信号传导的抑制，测量FGF21介导的细胞附着的抑制，测量FGF21介导的癌细胞凋亡的活化，测量癌细胞生长的抑制，测量肿瘤形成的抑制，和测量细胞周期蛋白生产的抑制。还可以通过测量血管发生、血管形成、细胞信号传导、激酶活性、脂肪细胞摄入葡萄糖、FGF21和FGF21受体之间的相互作用或FGF21受体磷酸化来评估FGF21活性。在一些实施方案中，FGF21受体是FGFR-1或FGFR-2，FGF21受体的磷酸化可以是酪氨酸磷酸化。在一些实施方案中，FGF21活性的调节可以导致FGF21-相关表型的调节。
[00068]如本文中使用的，术语“抑制”指活性或数量的降低、减少、失活或下调。例如，在本发明的上下文中，FGF21调节剂可以抑制一种或多种癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管发生、FGF21信号传导、FGF21-介导的细胞-细胞附着、细胞-细胞相互作用、FGF21-介导的细胞-细胞膜相互作用和FGF21表达。与对照相比，抑制可以是至少25％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％。
[00069]如本文中使用的，术语“癌细胞中的差异表达”和“在癌细胞中差异表达的多核苷酸”在本文中是可互换的使用的，指当与不是癌性的同一细胞类型的细胞相比时，代表基因或与基因相应的多核苷酸在癌性细胞中是差异表达的，例如，发现mRNA的水平至少约25％、至少约50％至约75％、至少约90％、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍，或至少约50倍或更多的不同(例如，更高或更低)。可以在组织中进行比较，例如利用原位杂交或另一种测定方法允许一定程度的区分组织中的细胞类型。还可以或可选的在从其组织来源移除的细胞之间进行比较，或者在一种原位的细胞和从其组织来源移除的第二种细胞之间进行比较。在一些实施方案中，与正常细胞相比，癌基因的基因是上调的。
[00070]如果缓解、结束、减慢或预防了癌症的至少一种症状或临床终点，则“抑制”了FGF21相关癌症。如本文中使用的，如果降低、减慢、延迟或预防了癌症的转移或复发，则也“抑制”了FGF21相关癌症。
[00071]如本文中使用的，词组“抑制FGF21介导的细胞附着”指在存在FGF21抑制剂的条件下，抑制或消除细胞间附着，其中至少一种细胞差异的表达FGF21。在上下文中，相对于缺少FGF21抑制剂条件下的FGF21介导的细胞附着，可以通过FGF21抑制剂降低FGF21介导的细胞附着至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％，直到100％。可以通过测量来实现对FGF21介导的细胞附着的比较，例如，通过标记目标细胞，将细胞与附着在底物上的未标记细胞群体孵育，洗涤从而将附着的和未附着的群体分离。在该方式中，通过测量底物上保持的标记的量确定细胞附着。测定系统的实例包括但不限于，用荧光探针(例如钙荧光素AM、CFMDA(5-氯甲基荧光素二乙酸酯)、5(6)-CFDA-SE[5-(and-6)-二醋酸羧基荧光素，琥珀酰亚胺酯])标记和在荧光平板读数器中或通过流式细胞仪测量荧光。
[00072]如本文中使用的，词组“增加癌细胞凋亡”指增加在存在FGF21抑制剂时差异表达FGF21的癌细胞的凋亡。在上下文中，相对于缺少FGF21抑制剂时的癌细胞凋亡，可以通过FGF21抑制剂增加癌细胞凋亡至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％，直到100％。可以通过测量下述实现癌细胞凋亡的比较，例如DNA片段化、胱天蛋白酶活性、线粒体膜电势的缺失、增加的活性氧类别(ROS)生产、胞内酸化、染色质凝聚、细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PS)水平，和增加的细胞膜渗透性。
[00073]可以测量DNA片段化，例如使用TUNEL测定(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记)。商业版的测定是普遍可获得的，例如APO-BrdUTM TUNEL测定试剂盒(Invitrogen)、APO-DIRECTTM试剂盒(BD Biosciences Pharmingen)和ApoAlertTM DNA Fragmentation测定试剂盒(Clontech，a Takara Bio Company)。
[00074]可以通过对特定胱天蛋白酶特异性的荧光、生色和发光底物监控胱天蛋白酶活性。至少胱天蛋白酶1、2、3、6、7、8和9的可商购的检测试剂盒是可获得的(参见例如，Invitrogen、Chemicon、CalBiochem、BioSource International、Biovision)。
[00075]可以用在健康的活性线粒体中差异积累的荧光染料测量线粒体膜电势的缺失。一个非限制性的实例是Invitrogen的MitoTracker Red系统。
[00076]可以用荧光染料测量活性氧类别(ROS)的产生，包括例如H2DCFDA(Invitrogen)。
[00077]可以用荧光或生色染料测量胞内酸化。
[00078]可以用荧光染料测量染色质凝聚，包括例如Hoechst 33342。
[00079]可以在细胞表面测量磷酯酰丝氨酸(PS)水平。例如Annexin V具有对PS的高亲和力。多种可商购的检测适合监控标记Annexin V与细胞表面的结合。
[00080]可以用染料，例如荧光染料YO-PRO-1(Invitrogen)测量细胞膜渗透性，所述YO-PRO-1可以进入凋亡的细胞，但不进入坏死的细胞。
[00081]如本文中使用的，词组“抑制癌细胞生长”指在存在FGF21抑制剂时抑制或消除癌细胞生长，其中所述细胞差异的表达FGF21。在上下文中，相对于缺少FGF21抑制剂时的癌细胞生长，可以通过FGF21抑制剂降低癌细胞生长至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％，直到100％。可以利用以下方式实现癌细胞生长的比较，例如MTT测定(例如，MTT细胞增殖检测试剂盒(Invitrogen))；BrdU整合(例如，Absolute-S SBIP测定(Invitrogen))；测量胞内ATP水平(例如利用ATPLiteTM-M，1000检测试剂盒(PerkinElmer)或ATP细胞活力检测试剂盒(BioVision))；DiOc18测定，膜可渗透染料(Invitrogen)；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性检测(例如，Vibrant细胞毒性测定(Invitrogen))；或测量细胞LDH活性。
[00082]如本文中使用的，词组“抑制肿瘤形成”指在存在FGF21抑制剂时抑制或消除肿瘤形成，其中所述肿瘤包含差异表达FGF21的细胞。在上下文中，相对于缺少FGF21抑制剂时的肿瘤形成，可以通过FGF21抑制剂降低肿瘤形成至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％，直到100％。可以利用以下方式实现肿瘤形成的比较，例如，基于细胞的测定(例如软琼脂中的结肠癌形成)；通常依靠将目标细胞注射到动物体内的肿瘤形成的体内模型(例如无胸腺小鼠或大鼠，放射的小鼠或大鼠；接种进入免疫特许(privileged)位点(例如脑、颊囊或眼)；同系动物的接种)，并在确定的时间段后监控团块(mass)的大小。
[00083]如本文中使用的，词组“抑制细胞周期蛋白D1”指抑制或消除FGF21介导的细胞周期蛋白生产。在上下文中，相对于缺少FGF21抑制剂时的FGF21介导的细胞周期蛋白生产，通过抑制剂降低FGF21介导的细胞周期蛋白生产至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％，直到100％。可以通过测量以下实现细胞周期蛋白生产的比较，例如，通过RT-PCR或Northern印迹的细胞周期蛋白mRNA水平；通过免疫印迹、免疫沉淀或ELISA的细胞周期蛋白多肽水平；或利用功能测定，包括免疫共沉淀测定来测量与细胞周期蛋白调节子(例如细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK))复合的细胞周期蛋白的水平，这是使用例如靶向CDK、p21WAF1、p27KIP-1的抗体；以及测量CDK对细胞周期蛋白的磷酸化，这可以通过放射性标记和免疫沉淀分析或基于FRET的方法进行测定，例如CDK2/细胞周期蛋白A检测试剂盒(Molecular Devices)。
[00084]如本文中使用的，词组“抑制FGF21受体磷酸化”指抑制或消除FGF21介导的FGF21受体磷酸化。在上下文中，相对于缺少FGF21抑制剂时的FGF21介导的FGF21受体磷酸化，通过抑制剂可以降低FGF21介导的FGF受体磷酸化至少25％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％，直到100％。可以通过本领域技术人员已知的磷酸化测定来检测磷酸化水平。FGFR-1和FGFR-2是示例性的FGF21受体。
[00085]如本文中使用的，词组“抑制细胞信号传导”指降低FGF21对包括FGF21的细胞信号级联放大的下游成员的影响。包括FGF21的细胞信号级联放大是通过FGF21和FGF21受体，例如FGFR-1或FGFR-2，之间的相互作用介导的。可以通过测量细胞信号传导通路的下游成员的多肽或多核苷酸水平来确定FGF21信号传导的抑制。例如，下游标志物可以是FGF21受体，例如FGFR-1或FGFR-2基因表达。本领域技术人员测量FGF21多肽和/或多核苷酸水平的能力是可信的。本领域技术人员还可以测量FGF21下游标志物的水平。
[00086]如本文中使用的，词组“抑制细胞-细胞相互作用”指降低或消除表达FGF21的两个或多个细胞之间的相互作用。在一些实施方案中，细胞之间的相互作用产生细胞信号。可以通过多种本领域技术人员已知的方法检测细胞-细胞相互作用，包括但不限于，观察共培养的、预标记的细胞之间的膜交换，所述标记使用了例如不同的荧光膜染料，包括PKH26和PKH67(Sigma)。
[00087]如本文中使用的，“FGF21下游标志物”是基因或基因产物，或可测量的基因或基因产物的指标。在一些实施方案中，作为FGF21下游标志物的基因或活性在癌组织或癌细胞(与其在正常或健康组织中的表达水平相比)或血管组织中表现出改变的表达水平。在一些实施方案中，在存在FGF21调节剂时下游标志物的活性被改变。在一些实施方案中，当用本发明的FGF21调节剂干扰时，下游标志物表现出改变的表达水平。FGF21下游标志物包括但不限于FGFR-1和FGFR-2。
[00088]如本文中使用的，术语“血管疾病”指循环系统的疾病。血管疾病包括动脉疾病，例如冠状动脉病(CAD)、外周动脉病(PAD)、腹主动脉瘤和静脉疾病，例如血块、深静脉血栓形成、静脉停滞病、静脉炎和静脉曲张。动脉粥样硬化是大部分血管疾病的潜在原因，因此具有动脉粥样硬化的受试者是用本文描述的组合物和方法治疗的候选。
[00089]如本文中使用的，术语“上调”指增加、活化或刺激活性或数量。相似的，FGF21“活化剂”是上调FGF21活性或数量的组合物。例如，在本发明的上下文中，FGF21调节剂可以增加FGF21受体的水平。在一个实施方案中，响应FGF21调节剂，可以上调FGFR-1或FGFR-2的一种或两种。上调还可以指FGF21-相关活性，例如细胞增殖、血管发生、血管形成、细胞信号传导、激酶活性、癌细胞存活、脂肪细胞摄入葡萄糖、FGF21与FGF21受体之间的相互作用，或FGF21受体的磷酸化。FGFR21受体可以是FGFR-1或FGFR-2的一种或两种。与对照相比，上调可以是至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少400％，或至少500％。FGF21调节剂可以增加FGF21受体的磷酸化或增加血管发生。
[00090]如本文中使用的，术语“N-末端”指蛋白质的至少前10个氨基酸。
[00091]如本文中使用的，术语“N-末端结构域”和“N-末端区域”是可互换的使用的，指这样的蛋白质片段，所述片段从蛋白质的第一个氨基酸开始，止于蛋白质N-末端一半的任何氨基酸。例如，FGF21的N-末端结构域可以包括SEQ ID NO：2的1号氨基酸至SEQ ID NO：2的大约第9号和209号氨基酸之间的任何氨基酸。
[00092]如本文中使用的，术语“C-末端”指蛋白质的至少最后10个氨基酸。
[00093]如本文中使用的，术语“C-末端结构域”和“C-末端区域”是可互换的使用的，指这样的蛋白质片段，所述片段从蛋白质C-末端一半的任何氨基酸开始，止于蛋白质的最后一个氨基酸。例如，FGF21的C-末端结构域开始于SEQ ID NO：2的105号氨基酸和约200号氨基酸之间的任何氨基酸，止于SEQ ID NO：2的209号氨基酸。
[00094]如本文中使用的，术语“结构域”指生物分子的结构部分，促进生物分子的已知的或疑似的功能。结构域可以与其区域或部分共同延伸，并且除全部或部分所述区域外，还可以整合不同于特定区域的生物分子的部分。
[00095]如本文中使用的，术语“信号结构域”(也称为“信号序列”或“信号肽”)指肽结构域，其位于前体蛋白质(通常是膜-结合或分泌蛋白)的N-末端区域的连续段的氨基酸序列，涉及翻译后蛋白质运输。在许多情况下，在完成了分选过程后，通过专一的信号肽酶从全长蛋白质上切除信号结构域。每个信号结构域为前体蛋白质在细胞内指示了特定的目的地。FGF21的示例性信号结构域由SEQ ID NO：2的氨基酸1-28表示(参见GenPept登录号NP_061986)。
[00096]如本文中使用的，术语“受体结合结构域”指蛋白质的任何部分或区域，其与膜-结合受体蛋白接触，导致细胞应答，例如信号传导事件。
[00097]如本文中使用的，术语“配体结合结构域”指蛋白质的任何部分或区域，保留了相应的天然FGF21序列的至少一种定量结合活性。
[00098]术语“区域”指生物分子的初级结构的物理学连续的部分。在蛋白质的情况下，通过该蛋白质的氨基酸序列的连续部分定义区域。在一些实施方案中，“区域”与生物分子的功能相关。
[00099]如本文中使用的，术语“片段”指生物分子的初级结构的物理学连续的部分。在蛋白质的情况下，通过该蛋白质的氨基酸序列的连续部分来定义部分，指至少3-5个氨基酸，至少8-10个氨基酸，至少11-15个氨基酸，至少17-24个氨基酸，至少25-30个氨基酸，和至少30-45个氨基酸。在寡核苷酸的情况下，通过寡核苷酸的核酸序列的连续部分来定义部分，指至少9-15个核苷酸，至少18-30个核苷酸，至少33-45个核苷酸，至少48-72个核苷酸，至少75-90个核苷酸，和至少90-130个核苷酸。在一些实施方案中，生物分子的部分具有生物学活性。在本发明的上下文中，FGF21多肽片段不包括SEQ ID NO：2提出的完整的FGF21多肽序列。
[000100]如本文中使用的，词组“FGF21-相关细胞/肿瘤/样品”等指细胞、样品、肿瘤或其它病状，其特征是相对于非癌性和/或非转移的细胞、样品、肿瘤或其它病状，具有FGF21的差异表达。在一些实施方案中，FGF21-相关细胞、样品、肿瘤或其它病状的特征是相对于非转移的细胞、样品、肿瘤或其它病状，具有FGF21表达增加的证据。
[000101]如本文中使用的，术语“抗体”指特异性针对靶蛋白或其片段的单克隆和多克隆抗体，单链抗体、嵌合抗体、双功能/双特异性抗体、人源化抗体、人抗体，和互补决定区(CDR)移植抗体。术语“抗体”还包括体内治疗性抗体基因转移。本发明还提供抗体片段，包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv和Fv。
[000102]如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从基本同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了小量存在的可能的天然发生突变外，包含群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原性位点。此外，与包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原的单个决定子。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于可以被合成而不被其它抗体污染。修饰语单克隆”表示抗体的特征，所述特征是从基本同质的抗体群体获得，而不认为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，可以通过杂交瘤方法制备根据本发明使用的单克隆抗体，所述方法首先描述在Kohler等人，Nature 256：495(1975)中，或者可以通过重组DNA方法生产(参见例如，美国专利号4,816,567)。还可以从噬菌体抗体文库中利用例如描述在Clackson等人，Nature352：624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中的技术分离“单克隆抗体”。
[000103]本文中的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体以及此类抗体的片段，只要其表现出理想的生物学活性，其中重链和/或轻链的一部分与抗体相应序列相同或同源，所述抗体源自特定物种或属于特定的抗体类或亚类，而剩余的链与下述抗体相应序列相同或同源，所述抗体源自另一种物种或属于另一种抗体类或亚类(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括“灵长源化的(primatized)”抗体，其包含源自非人灵长类的可变区结构域抗原结合序列(例如，旧大陆猴、类人猿等)和人的恒定区序列。
[000104]“抗体片段”包括完整抗体的部分，优选的包括它的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性化抗体(Zapata等人，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[000105]“完整的”抗体是包括抗原-结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的那种。恒定结构域可以是天然序列的恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些实施方案中，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。
[000106]抗体“效应子功能”指由于抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸序列变体Fc区域)产生的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；依赖于补体的细胞毒性；Fc受体结合；依赖抗体的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体；BCR)等。
[000107]“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”指细胞毒性的一种类型，其中分泌的Ig结合至位于一些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)的Fc受体(FcR)上，使这些细胞毒性效应细胞特异的结合负荷抗原的靶细胞，然后利用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”了细胞毒性细胞，是此类杀伤绝对必需的。介导ADCC的初级细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)的464页表3中概括了造血细胞上FcR表达。为了评估目标分子的ADCC活性，可以实施体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的。此类测定有效的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选的或此外，可以在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如Clynes等人，(USA)95：652-656(1998)中公开的。
[000108]“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤细胞(NK)、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可以分离自它的天然来源，例如如本文中描述的来自血液或PBMC。
[000109]术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区域结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的受体，包括受体FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类，其中包括这些受体的等位变体和可选剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化的受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要位于它们的胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述M.inDaron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR综述在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods4：25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文中的术语“FcR”涵盖了其它FcR，包括将来鉴定的那些。术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。
[000110]“依赖于补体的细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时，分子裂解靶标的能力。通过关联抗原复合的分子(例如，抗体)与补体系统的第一组分(C1q)结合，来起始补体活化通路。为了评估补体活化作用，可以实施CDC测定，例如描述在Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中。
[000111]如本文中使用的，术语“表位“指多肽的抗原决定簇。在一些实施方案中，表位可以包括3个或更多个氨基酸，所述氨基酸在表位特异的空间构象中。在一些实施方案中，表位是线性的或构象的表位。通常，表位由至少4个、至少6个、至少8个、至少10个和至少12个此类氨基酸组成，更常见的由8-10个此类氨基酸组成。确定氨基酸空间构象的方法是本领域已知的，包括例如x-射线晶体和2-维核磁共振。
[000112]如本文中使用的，术语“携带表位的片段”指包含一个或多个表位的片段。在一些实施方案中，携带表位的片段不是全长多肽。
[000113]词组“互补决定区”指这样的氨基酸序列，所述序列共同确定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性。参见例如，Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Kabat等人，U.S.Dept.ofHealth and Human Services NIH Publication No.91-3242(1991)。词组“恒定区”指产生效应子功能的抗体分子的部分。在本发明中，用人恒定区取代了小鼠恒定区。受试者的人源化抗体的恒定区源自人免疫球蛋白。重链恒定区可以选自五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。人源化抗体的一种方法包括比对非人重链和轻链序列与人重链和轻链序列，基于上述比对，选择并用人的构架替换非人的构架，分子建模预测人源化序列的构象，并与母本抗体的构象进行比较。在该过程之后，在CDR区对干扰CDR结构的残基重复进行回复突变，直到人源化序列模型的预测构象近似于母本非人抗体的非人CDR的构象。还可以进一步衍生此类人源化抗体，从而有利于摄入和清除，例如通过Ashwell受体。参见例如美国专利号5,530,101和5,585,089，其通过引用整合至本文中。
[000114]术语“拮抗剂”使用了最广的含义，包括部分或完全阻断、抑制或中和本文公开的肿瘤细胞抗原的生物学活性的任何分子。以相似的方式，术语“激动剂”使用了最广的含义，包括模拟本文公开的肿瘤细胞抗原的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子特别包括激动剂或拮抗剂抗体或抗体片段，肿瘤细胞抗原的片段或氨基酸序列变体，肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。鉴定肿瘤细胞抗原的激动剂或拮抗剂的方法可以包括将表达目标抗原的肿瘤细胞与候选激动剂或拮抗剂分子接触，测量通常与肿瘤细胞抗原相关的一种或多种生物学活性的可检测的改变。拮抗剂还可以是通过合理设计或噬菌体展示(参见例如，1998年8月13日发表的WO98/35036)产生的肽。在一些实施方案中，选择的分子可以是“CDR模拟物”或基于抗体的CDR设计的抗体类似物。虽然此类肽本身可以是拮抗性的，但肽也可以任选的融合细胞毒性剂从而添加或增强肽的拮抗性质。
[000115]如本文中使用的。术语“寡核苷酸”指一系列相连的核苷酸残基。寡核苷酸包括但不限于反义和siRNA寡核苷酸。寡核苷酸包含部分DNA序列，并具有至少约10个核苷酸和多至约500个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含从约10个核苷酸到约50个核苷酸，从约15个核苷酸至约30个核苷酸，从约20个核苷酸至约25个核苷酸。寡核苷酸可以是化学合成的，还可用作探针。在一些实施方案中，寡核苷酸是单链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一部分是双链。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施方案中，寡核苷酸是RNA干扰寡核苷酸(RNAi寡核苷酸)。
[000116]如本文中使用的，术语“反义寡核苷酸”指未修饰的或修饰的核酸，具有与FGF21多核苷酸序列互补的核苷酸序列，包括与FGF21的转录或翻译相关的多核苷酸序列(例如，FGF21多核苷酸的启动子)，其中反义多核苷酸能够与FGF21多核苷酸序列杂交。特别感兴趣的是能够在体外或体内抑制FGF21多肽-编码多核苷酸的转录和/或翻译的反义多核苷酸。
[000117]如本文中使用的，术语“siRNA寡核苷酸”、“RNAi寡核苷酸”、“短干扰RNA”或“siRNA”是可互换的使用的，指通过转录后基因沉默发挥作用的寡核苷酸，也称为RNA干扰(RNAi)。术语指能够RNA干扰“RNAi”的双链核酸分子，(参见Kreutzer等人，WO 00/44895；Zernicka-Goetz等人，WO 01/36646；Fire，WO 99/32619；Mello和Fire，WO01/29058)。SiRNA分子通常是RNA分子，但还涵盖了化学修饰的核苷酸和非核苷酸。已经通过瞬时的siRNA转移进入细胞实施了SiRNA基因靶向实验(通过此类经典方法实现，如脂质体-介导的转染、电穿孔或微注射)。SiRNA分子是21-23个核苷酸的RNA，具有特征化的2-3个核苷酸的3’-突出端，这类似长双链RNA(dsRNA)的RNA酶III加工产物的，其通常起始RNAi。
[000118]如本文中使用的，FGF21RNA的“靶区域”是寡核苷酸杂交的区域，例如ASO或siRNA。靶区域可以是与ASO或反义链或siRNA完全互补的，或者在靶区域和ASO或siRNA之间可以存在至少1、2、3或4个错配。
[000119]如本文中使用的，术语“诱饵”指包含能够结合FGF21受体的FGF21多肽的至少部分的多肽，所述FGF21受体例如FGFR-1或FGFR-2。在一些实施方案中，诱饵能够结合磷酸化的FGF21受体。
[000120]如本文中使用的，术语“单核苷酸多态性”(“SNP”)指核苷酸取代、核苷酸插入或核苷酸缺失，其中在插入和缺失的情况下，包括在基因的位置插入或缺失一个或多个核苷酸。
[000121]如本文中使用的，术语“治疗有效量”意指产生药用效果的药物的量，所述药用效果是如当向个体施用治疗有效量的药品时，在个体中观察到的一种或多种临床终点、癌细胞的生长和/或存活，或癌细胞转移的降低或逆转。通常通过与向相似状态的个体施用不含活性成分的组合物所观察到的效果相比时的效果来确定治疗有效量。对于受试者精确的有效量依赖于受试者的尺寸和健康，病况的性质和程度，以及选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合。然而，对于指定情况的有效量是通过常规实验确定的，并且在临床医师的判断范围内。
[000122]如本文中使用的，术语“组合”或“联合”指与其它治疗方案一起施用本发明的FGF21调节剂。
[000123]如本文中使用的，术语“易感的”指对于其而言FGF21疗法是可接受的治疗方法的患者，即，易于阳性应答的患者。相对于不易感FGF21疗法的患者，对FGF21疗法易感的癌症患者表达高水平的FGF21。不是FGF21疗法的好候选对象的癌症患者包括具有这样的肿瘤样品的患者，所述样品在其癌细胞内或上缺少或具有低水平FGF21。
[000124]如本文中使用的，术语“检测”意指建立、发现或确认活性(例如，基因表达)或生物分子(例如，多肽)的证据。
[000125]“天然序列”多肽是具有与来自天然的多肽相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可以从天然分离，或通过重组或合成的方式生产。因此，天然序列多肽可以具有天然存在的人多肽、小鼠多肽或来自任何其它哺乳动物物种的多肽的氨基酸序列。
[000126]术语“氨基酸序列变体”指具有的氨基酸序列与天然序列多肽具有一定程度差异的多肽。通常，氨基酸序列变体可以具有与天然配体的至少一个受体结合结构域，或与天然受体的至少一个配体结合结构域的至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的同源性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的一些位置上具有取代、缺失，和/或插入。
[000127]如本文中使用的，词组“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其变体，指在核苷酸水平或氨基酸水平以至少特定百分比的同源性表征的序列，与“序列同一性”可互换的使用。同源核苷酸序列包括编码蛋白质同工型的那些序列。此类同工型可以在同一生物体的不同组织中表达，作为例如RNA选择性剪接的结果。可选的，可以由不同的基因编码同工型。同源核苷酸序列包括编码人以外的物种的蛋白质的核苷酸序列，所述物种包括但不限于哺乳动物。同源核苷酸序列还包括但不限于，天然存在的等位变体和本文提出的核苷酸序列的突变。在一些实施方案中，同源核苷酸序列编码与野生型序列具有相同或相似结合特征和/或活性的多肽。同源氨基酸序列包括含有保守性氨基酸取代的那些氨基酸序列，其多肽具有与野生型序列具有相同或相似结合特征和/或活性。在一些实施方案中，如果具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，则核苷酸或氨基酸序列是同源的。在一些实施方案中，如果具有1-10、10-20、20-30、30-40、40-50或50-60个核苷酸/氨基酸取代、添加或缺失，则核苷酸或氨基酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源的氨基酸序列具有不超过5个或不超过3个保守性氨基酸取代。
[000128]可以通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析软件包，UNIX第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison WI)和使用缺省设定，来确定百分比同源性或同一性，所述程序使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)。在一些实施方案中，探针和靶之间的同源性在约75％至约85％之间。在一些实施方案中，核酸具有与SEQ ID NO：1或其部分至少约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约98％、约99％和约100％同源性的核苷酸。还提供了此类序列的互补序列。在一些实施方案中，互补序列是核苷酸序列的完整和完全互补序列。
[000129]同源性还可以在多肽水平。在一些实施方案中，多肽与SEQ IDNO：2或其部分至少约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约97％、约98％、约99％和约100％同源。在一些实施方案中，多肽具有多达5个、多达10个、多达15个、多达20个或多达30个氨基酸插入、缺失或取代。
[000130]如本文中使用的，术语“探针”指可变长度的核酸序列。在一些实施方案中，探针包括至少约10个和至多约6000个核苷酸。在一些实施方案中，探针包括至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少25、至少50或至少75个连续的核苷酸。探针用于检测相同的、相似的或互补的核酸序列。较长的探针通常获得自天然的或重组的来源，与靶序列具有高特异性，与寡聚物相比慢得多的与靶杂交。探针可以是单链或双链，设计为在PCR、基于膜的杂交、原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH)或ELISA-样技术中具有特异性。
[000131]如本文中使用的，术语“混合”指在相同区域组合一种或多种化合物、细胞、分子等在一起的过程。可以在例如试管、培养皿或任何容器中实施，所述容器允许一种或多种化合物、细胞或分子混合。
[000132]如本文中使用的，术语“分离的”指位于这样的环境中的多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞，所述环境不同于所述多核苷酸、多肽或抗体天然存在的环境。分离细胞的方法是本领域技术人员已知的。分离的多核苷酸、多肽或抗体通常是基本纯的。
[000133]如本文中使用的，术语“基本纯的”指这样的化合物(例如，多核苷酸或多肽或抗体)，其是从其天然环境中移出的，并且至少60％不含、至少75％不含和至少90％不含其天然相关的其它组分。
[000134]如本文中使用的，术语“结合”意指两个或多个生物分子或化合物之间的物理或化学相互作用。结合包括离子的、非离子的、氢键、范德华力、疏水性相互作用等。结合可以是直接的或间接的；间接的是通过或由于另一种生物分子或化合物的影响。直接结合指相互作用不通过或不由于另一种生物分子或化合物的影响而发生，相反不需要其它基本的化学媒介。
[000135]如本文中使用的，术语“接触”意指使一个分子直接或间接的与第二个分子进行物理接近。分子可以位于任意数量的缓冲液、盐或溶液等中。“接触”包括例如将多核苷酸置入烧杯、微量滴定板、细胞培养瓶或微阵列等中，后者含有核酸分子。接触还包括例如，将抗体置入烧杯、微量滴定板、细胞培养瓶或微阵列等中，后者含有多肽。接触可以在体内、离体或体外发生。
[000136]如本文中使用的，词组“严格杂交条件”或“严格条件”指在所述条件下探针、引物或寡核苷酸将与其靶序列杂交，但与最小量的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，随不同环境而不同。更长的序列在更高温度下特异性的与其适当的互补序列杂交。通常，严格条件选为在定义的离子强度和pH下，低于特定序列的热解链点(Tm)约5℃。Tm是50％的与靶序列互补的探针与靶序列杂交达到平衡的温度(在定义的离子强度、pH和核酸浓度下)。由于靶序列通常过量存在，在Tm时，50％的探针与其互补序列杂交达到平衡。通常，严格条件可以是这样的条件，其中盐浓度少于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子(或其他盐)，pH 7.0-8.3，并且对于短的探针、引物或寡核苷酸(例如，10-50个核苷酸)，温度是至少约30℃，对于更长的探针、引物或寡核苷酸，温度是至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。
[000137]如本文中使用的，术语“中度严格条件”指在所述条件下探针、引物或寡核苷酸可以与其靶序列杂交，但与有限量的其它序列杂交的条件。中度严格条件是序列依赖性的，随不同环境而不同。中度条件是本领域技术人员普遍已知的，特别描述在Maniatis等人(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory；第2版(1989年12月))等中。
[000138]本文中描述的核酸组合物可用于例如产生多肽，作为探针检测生物学样品(例如，人细胞的提取物)中的mRNA或此类样品中生产的cDNA，产生额外拷贝的多核苷酸，产生核酶或寡核苷酸(单链和双链)，并且作为单链DNA探针或三链形成寡核苷酸。本文描述的探针可用于例如确定样品中存在或缺少本文提供的多核苷酸。多肽可用于产生抗体，所述抗体特异性针对与癌症相关的多肽，该抗体依次用于诊断方法、预后方法等如本文中详细讨论的。多肽还可用作为用于治疗干扰的靶，如本文中详细讨论的。本发明的抗体还可用于例如纯化、检测和靶向本发明的多肽，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，抗体用于在免疫测定中有用，用于定量和定性的测量生物学样品中本发明的多肽水平。参见例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第2版，1988)。下文将更详细的描述上述这些和其它用途。
[000139]如本文中使用的，术语“显像剂”指与抗体、小分子或本发明的探针相连接的组合物，所述抗体小分子或本发明的探针可以利用本领域技术人员已知的的技术检测。如本文中使用的，术语“基因表达的证据”指基因表达的任何可测量的指标。
[000140]术语“可药用的载体”指用于治疗剂施用的载体，例如抗体或多肽、基因和其它治疗剂。术语指任何药物载体，所述载体本身不导致产生对接受组合物的个体有害的抗体，可以施用而不具有过分的毒性。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂集合物和灭活的病毒颗粒。此类载体是本领域普通技术人员普遍已知的。治疗组合物中的可药用的载体可以包括液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。此类载体中还可以存在辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲物质等。
[000141]通过本发明的方法和组合物可以治疗的癌症的特定实例包括但不限于，FGF21-相关癌症。如本文中使用的，“FGF21-相关癌症”指癌症的特征是相对于非癌性细胞，细胞差异的表达FGF21。本发明还可用于任何肿瘤细胞类型，其中FGF21在癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管发生、FGF21信号传导、FGF21-介导的细胞间附着、细胞-细胞相互作用和FGF21表达中发挥作用。在一些实施方案中，癌症是结肠癌、肝癌、睾丸癌、胸腺癌、乳腺癌、皮肤癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是结肠癌。在一些实施方案中，相对于对照，此类癌症表现出至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％或至少约300％的FGF21的差异表达。
[000142]本发明提供了方法和组合物，供治疗、抑制和管理与FGF21表达相关的疾病和病症，以及治疗、抑制和管理此类疾病和病症的症状。发明的一些实施方案涉及治疗、抑制或管理与FGF21过表达相关的疾病和病症的方法和组合物。例如，发明的一些实施方案涉及方法和组合物，所述组合物包括治疗、抑制或管理癌症的组合物，所述癌症包括但不限于癌症转移、癌细胞增殖、癌细胞生长和癌细胞侵入。发明的一些实施方案涉及方法和组合物，所述组合物包括治疗、抑制或管理得益于FGF21表达或过表达的疾病或病症的组合物。例如，发明的一些实施方案涉及治疗、抑制或管理血管疾病的方法和组合物，包括但不限于CAD和PAD。
[000143]治疗癌症
[000144]对于治疗与FGF21过表达相关的疾病和病症，例如癌症，本发明提供了方法，包括其他活性成分与本发明的FGF21调节剂组合。在一些实施方案中，方法还包括向患者施用一种或多种常规癌症治疗剂。在一些实施方案中，本发明的方法还包括用一种或多种化疗、放射治疗、激素消融或手术来治疗患者。
[000145]本发明还提供用于治疗、抑制和管理癌症或其它过增生细胞病症或疾病的方法和组合物，所述癌症、病症或疾病对于现有或标准的癌症治疗，例如手术、化疗、放射治疗、激素疗法和生物学疗法，已经部分或完全抗拒。
[000146]发明还提供了利用发明的FGF21调节剂诊断和/或成像的方法，来诊断癌症和/或预测癌症进展，所述调节剂特别是FGF21抗体。在一些实施方案中，发明的方法提供了肿瘤和/或转移灶的成像和定位的方法，以及诊断和预后的方法。在一些实施方案中，发明的方法提供了评估FGF21-相关疗法的适合度的方法。
[000147]治疗血管疾病
[000148]对于治疗得益于FGF21表达或过表达的疾病或病症，例如血管疾病，本发明提供了方法，包括其他活性成分与本发明的FGF21调节剂组合。在一些实施方案中，方法还包括向患者施用一种或多种常规癌症治疗剂。在一些实施方案中，本发明的方法还包括血管成形术、支架、动脉粥样斑块切除、心脏搭桥手术(bypass surgery)或施用药物，例如抗血小板剂、抗凝剂或溶栓剂。在一些实施方案中，本发明的方法还包括将患者置于特定饮食下，从而控制脂肪和胆固醇摄入，或置于特别的运动方案下。
[000149]本发明还提供用于治疗、抑制和管理血管病症或疾病的方法和组合物，所述病症或疾病对于现有的或标准治疗已经部分或完全抗拒。
[000150]发明还提供了利用发明的FGF21调节剂(特别是FGF21抗体)诊断和/或成像的方法，来诊断血管疾病和/或评估疾病进展。在一些实施方案中，发明的方法提供了对新血管生长成像的方法，例如监控治疗方案的发展。在一些实施方案中，发明的方法提供了评估FGF21-相关疗法的适合度的方法。
[000151]FGF21调节剂
[000152]本发明提供了FGF21调节剂，用于癌症的治疗、诊断、检测或成像等，或用于血管疾病的治疗、诊断、检测或成像等。FGF21调节剂还用于治疗癌症和血管疾病的药品制备。
[000153]在一些实施方案中，FGF21调节剂是寡核苷酸、小分子、模拟物、诱饵或抗体。在一些实施方案中，与对照相比，FGF21调节剂抑制FGF21生物学活性25％、50％、75％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，与对照相比，FGF21调节剂抑制FGF21表达至少25％、50％、75％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，与对照相比，FGF21调节剂上调FGF21生物学活性至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、400％或500％。在一些实施方案中，与对照相比，FGF21调节剂上调FGF21表达至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、400％或500％。
[000154]在一些实施方案中，调节的FGF21活性是一种或多种细胞增殖(例如，内皮细胞组织)、血管发生、血管形成、细胞信号传导、激酶活性、脂肪细胞摄入葡萄糖、癌细胞存活、FGF21和FGF21受体之间的相互作用、FGF21受体磷酸化、或凋亡。FGF21受体可以是例如FGFR-1或FGFR-2。FGF21受体的磷酸化可以是FGF21受体的酪氨酸磷酸化。
[000155]在一些实施方案中，FGF21调节剂包括FGF21多肽的抗原性区域或针对所述区域。FGF21的抗原性区域包括但不限于：
RQRYLYTDDAQQTEAHLEI(SEQ ID NO：204)；GAADQSPESLLQLKALKPGV(SEQ ID NO：205)；FLCQRPDGALYGSLHFDPE(SEQ ID NO：206)；QSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGL(SEQ ID NO：207)；和MVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO：208)
[000156]抗体
[000157]在一些实施方案中，FGF21调节剂是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体或Fab片段。抗体可以用例如酶、放射性同位素或荧光团标记。在一些实施方案中，抗体和FGF21以外的多肽的结合亲和力小于约1x105Ka。在一些实施方案中，FGF21调节剂是单克隆抗体，其与FGF21结合的亲和力为至少1x108Ka。
[000158]发明还提供了竞争性抑制抗体与发明的表位结合的抗体，通过本领域已知的确定竞争性结合的任何方法来确定，例如利用免疫测定。在一些实施方案中，抗体竞争性抑制与表位的结合至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％。
[000159]在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可以通过多种方法实现，包括例如：(1)将非人互补决定区(CDR)移植到人构架区和恒定区(本领域称为“人源化”的过程)，或可选的(2)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基用人-类似表面“隐匿(cloaking)”它们(本领域称为“镶嵌(veneering)”的过程)。在本发明中，人源化抗体可以包括“人源化的”和“镶嵌的”抗体。类似的，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来产生人抗体，例如，内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠。基于刺激，观察了人抗体生产，其在所有方面都严格模拟在人中观察的，包括基因重排、聚集和抗体谱。该方法描述在例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和下列科学出版物中：Marks等人，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyer等人，Science239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169-217(1994)；和Kettleborough，C.A.等人，Protein Eng.4(7)：773-83(1991)，其每个通过引用整合到本文中。
[000160]本发明的抗体可以通过不同的机制发挥作用。在一些实施方案中，抗体触发依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)，这是对抗体所靶向细胞的裂解攻击。在一些实施方案中，抗体具有多种治疗功能，包括例如抗原结合、诱导凋亡和依赖于补体的细胞毒性(CDC)。
[000161]在一些实施方案中，本发明的抗体可以作为本发明的多肽的激动剂或拮抗剂发挥作用。例如，在一些实施方案中，本发明提供了这样的抗体，其部分或完全破坏了具有本发明多肽的受体/配体的相互作用。在一些实施方案中，本发明的抗体与本文公开的表位或其部分结合。在一些实施方案中，与缺少抗体时的活性相比，提供的抗体调节配体活性或受体活性至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、或至少50％。
[000162]在一些实施方案中，FGF21抗体抑制FGF21与FGF21受体，例如FGFR-1或FGFR-2的相互作用，或抑制FGF21受体的磷酸化。在一些实施方案中，FGF21抗体抑制血管发生、细胞增殖、胞信号传导、激酶活性(例如酪氨酸激酶活性)、脂肪细胞摄入葡萄糖和癌细胞存活。在一些实施方案中，FGF21抗体增加凋亡。在一些实施方案中，与对照细胞群体相比，FGF21抗体导致细胞群体中至少30％的细胞凋亡。
[000163]在一些实施方案中，本发明提供了中和抗体。在一些实施方案中，中和抗体作为受体拮抗剂发挥作用，即，抑制配体-介导的受体活化的全部或部分的生物学活性。在一些实施方案中，抗体可以被指定为生物学活性的激动剂、拮抗剂或反相激动剂，所述生物学活性包括本文公开的发明的肽的特定生物学活性。
[000164]本发明的抗体可以单独使用或与其它组合物组合使用。抗体还可以在N-或C-末端重组融合异源多肽，或与多肽或其它组合物化学缀合(包括共价的和非共价的缀合)。例如，本发明的抗体可以重组的融合或缀合用作检测测定中的标记的分子和效应分子，例如异源多肽、药物、放射性核素或毒素。参见例如，PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995；和EP 396,387。
[000165]除了嵌合抗体和人源化抗体外，完全人抗体可以来自具有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中(参见例如，美国专利号6,075,181、6,091,001和6,114,598，其通过引用整合到本文中)，或从人免疫球蛋白基因的噬菌体展示文库中(参见例如，McCafferty等人，Nature，348：552 554(1990)。Clackson等人，Nature，352：624628(1991)，和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))。在一些实施方案中，可以通过scFv-噬菌体展示文库生产和鉴定抗体。抗体噬菌体展示文库技术从商业来源是可获得的，例如Xoma(Berkeley，CA)。
[000166]可以利用Kohler等人，(1975)Nature 256：495-496的方法，或其修饰制备单克隆抗体。通常，用含有抗原的溶液免疫小鼠。可以通过在盐水中混合或乳化含抗原溶液来实施免疫，优选的在佐剂中例如弗氏完全佐剂中，并将混合物或乳剂肠胃外注射。可以使用本领域已知的任何免疫方法获得发明的单克隆抗体。在免疫动物后，移除脾脏(任选的，一些大淋巴结)，分离成单细胞。通过将细胞悬液施于用目标抗原包被的平板或孔上，筛选脾细胞。表达针对抗原特异的膜结合免疫球蛋白的B细胞与平板结合，并不会被冲走。然后，将获得的B细胞或所有解离的脾细胞诱导与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤，并在选择性培养基中培养。通过系列或有限稀释，铺板获得的细胞，测定与目标抗原特异性结合的抗体(且不结合不相关抗原)的生产。然后，在体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(在小鼠腹水中)培养选定的分泌单克隆抗体(mAb)的杂交瘤。
[000167]作为利用杂交瘤表达的替代方案，可以在细胞系例如CHO或骨髓瘤细胞系中生产抗体，如美国专利号5,545,403；5,545,405和5,998,144中公开的；均通过引用整合到本文中。简而言之，用能够分别表达轻链和重链的载体转染细胞系。通过转染位于不同载体上的两种蛋白质，可以生产嵌合抗体。Immunol.147：8；Banchereau等人，(1991)Clin.Immunol.Spectrum 3：8；和Banchereau等人，(1991)Science 251：70；均通过引用整合到本文中。
[000168]可以利用本领域已知的技术生产人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等人，C.J.Mol.Biol.，222：581(1991))。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等人，J.Immunol.，147(1)：86 95(1991))。人源化抗体可以通过多种方法实现，包括例如：(1)将非人互补决定区(CDR)移植到人构架区和恒定区(本领域称为“人源化”的过程)，或可选的(2)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基用人-类似表面“隐匿(cloaking)”它们(本领域称为“镶嵌(veneering)”的过程)。在本发明中，人源化抗体可以包括“人源化的”和“镶嵌的”抗体。类似的，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来产生人抗体，例如，内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠。基于刺激，观察了人抗体生产，其在所有方面都严格模拟在人中观察的，包括基因重排、聚集和抗体谱。该方法描述在例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和下列科学出版物中：Marks等人，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368 856-859(1994)；Morrison，Nature 368，812-13(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.，81：6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)；Verhoeyer等人，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immunol.31(3)：169-217(1994)；和Kettleborough，C.A.等人，Protein Eng.4(7)：773-83(1991)，其通过引用整合到本文中。利用可商购来源例如Morphosys(Martinsried/Planegg，Germany)，可以在筛选测定中鉴定完全人源化的抗体。
[000169]还可以利用改造含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物生产人源化抗体。例如，WO98/24893公开了具有人Ig基因座的转基因动物，其中，由于内源重链和轻链基因座的失活，动物不产生功能性的内源免疫球蛋白。WO91/10741还公开了能够对免疫原产生免疫应答的转基因非灵长类哺乳动物宿主，其中抗体具有灵长类恒定区和/或可变区，并且其中编码内源性免疫球蛋白的基因座是取代了或失活的。WO96/30498公开了利用Cre/Lox系统修饰哺乳动物的免疫球蛋白基因座，例如替换全部或部分的恒定区或可变区，形成修饰的抗体分子。WO94/02602公开了具有失活的内源性Ig基因座和功能性人Ig基因座的非人哺乳动物宿主。美国专利号5,939,598公开了制造转基因小鼠的方法，其中小鼠缺失了内源性重链，表达包含一个或多个异种恒定区的外源免疫球蛋白基因座。还可以利用美国专利5,766,886中公开的人改造技术生产本发明的抗体，其通过引用整合到本文中。
[000170]利用上述转基因动物，可以产生针对选定抗原分子的免疫应答，并且可以从动物移除抗体生产细胞，并将其用于生产分泌人单克隆抗体的杂交瘤。免疫规程，佐剂等是本领域已知的，用于免疫例如WO96/33735中描述的转基因小鼠。可以测试单克隆抗体抑制或中和相应蛋白质的生物学活性或生理学效应的能力。
[000171]通过Fang等人，(2005)，Nat.Biotechnol.23，584-590讨论的体内治疗性抗体基因转移，可以向受试者施用本发明的抗体。例如，可以产生重组载体来递送多顺反子表达盒，所述表达盒包含介导对多肽进行不依赖酶的、共翻译自体切割的肽，所述多肽位于MAb重链和轻链编码序列之间。表达产生化学计量的量的两种MAb链。介导不依赖酶的、共翻译自体切割的肽的优选实例是口蹄疫衍生的2A肽。
[000172]在一些实施方案中，抗体片段保留了全长抗体的理想亲和力。因此，在一些实施方案中，抗-FGF21抗体的片段保留了结合FGF21的能力。此类片段的特征是与相应全长抗FGF21抗体相似的性质，即所述片段特异性结合在人细胞表面表达的人FGF21抗原。
[000173]在一些实施方案中，抗体结合FGF21胞外结构域的一个或多个表位。在一些实施方案中，抗体调节一种或多种FGF21-相关的生物学活性。在一些实施方案中，抗体抑制一种或多种癌细胞生长、肿瘤形成和癌细胞增殖。
[000174]在一些实施方案中，抗体是结合一个或多个FGF21表位的单克隆抗体，所述表位位于以下结构域中，所述结构域选自FGF21的N-末端信号肽结构域或FGF21受体结合结构域。
[000175]在一些实施方案中，单克隆抗体与FGF21的C-末端结构域中的FGF21表位结合。在一些实施方案中，单克隆抗体与FGF21的区域2或区域5中的FGF21表位结合，如实施例4所示(还参见图4)。
[000176]根据本发明的合适的抗体可以识别线性或构象的表位，或其组合。在一些实施方案中，本发明的抗体结合FGF21的抗原性区域的表位，其选自SEQ ID NO：3-203。在一些实施方案中，抗体特异性针对具有选自SEQ ID NO：117-203的序列的表位。在一些实施方案中，抗体特异性针对具有选自SEQ ID NO：186-203的序列的表位。可以理解，这些肽不必精确的定位一个表位，也可以含有非免疫原性的FGF21序列。
[000177]预测本发明抗体可以结合的其它潜在表位的方法是本领域技术人员普遍已知的，包括但不限于，Kyte-Doolittle分析(Kyte，J.和Dolittle，R.F.，J.Mol.Biol.(1982)157：105-132)，Hopp和Woods分析(Hopp，T.P.和Woods，K.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78：3824-3828；Hopp，T.J.和Woods，K.R.，Mol.Immunol.(1983)20：483-489；Hopp，T.J.，J.Immunol.Methods(1986)88：1-18.)，Jameson-Wolf分析(Jameson，B.A.和Wolf，H.，Comput.Appl.Biosci.(1988)4：181-186.)，和Emini分析(Emini，E.A.，Schlief，W.A.，Colonno，R.J.和Wimmer，E.，Virology(1985)140：13-20.)。
[000178]在一些实施方案中，通过确定理论的胞外结构域鉴定潜在的表位。可以使用分析算法例如Tmpred(参见K.Hofmann & W.Stoffel(1993)TMbase-A database of membrane spanning proteins segments Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374，166)或TMHMM(Krogh等人，Predictingtransmembrane protein topology with a hidden Markov model：Application to complete genomes.Journal of Molecular Biology，305：567-580，2001)进行此类预测。可以使用其它算法，例如SignalP 3.0(Bednsten等人，J Mol Biol.340：783-95，2004)预测信号肽的存在，并预测从全长蛋白质的哪个位置切除所述肽。位于细胞外侧的蛋白质部分可以作为抗体相互作用的靶。
[000179]如果1)抗体表现出阈值水平的结合活性，和/或2)与已知的相关多肽分子没有显著的交叉反应，则定义抗体是“特异结合的”。本领域技术人员可以方便的确定抗体的结合活性，例如通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)。在一些实施方案中，本发明的抗体与其靶表位或模拟诱饵的结合大于靶癌症相关多肽至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更多倍。
[000180]在一些实施方案中，抗体结合具有10-4M或更少，10-7M或更少，10-9M或更少的高亲和力，或亚纳摩尔级的亲和力(0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1nM或甚至更少)。在一些实施方案中，抗体对FGF21的结合亲和力是至少1x106Ka。在一些实施方案中，抗体对FGF21的结合亲和力是至少5x106Ka，至少1x107Ka，至少2x107Ka，至少1x108Ka，或更大。还可以根据它们与本发明的多肽的结合亲和力来描述或说明本发明的抗体。在一些实施方案中，结合亲和力包括具有Kd小于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x 10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M，或更少。
[000181]在一些实施方案中，本发明的抗体结合FGF21多肽，但不结合已知的FGF21相关家族成员。可以利用标准的Western印迹分析(Ausubel等人)测定抗体与FGF21和相关多肽的结合。已知的相关多肽的实例包括但不限于FGF蛋白家族的其它成员(例如，FGF19x(WO01/18209)等)。
[000182]在一些实施方案中，本发明的抗体结合FGF21的直向同源物、同源物、旁系同源物或变体，或其组合和亚组合。在一些实施方案中，本发明的抗体结合FGF21的直向同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合FGF21的同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合FGF21的旁系同源物。在一些实施方案中，本发明的抗体结合FGF21的变体。在一些实施方案中，本发明的抗体不结合FGF21的直向同源物、同源物、旁系同源物或变体，或其组合和亚组合。在一些实施方案中，本发明的抗体不特异的结合FGF19x。
[000183]在一些实施方案中，可以针对已知的相关多肽筛选抗体，分离特异性结合FGF21多肽的抗体群体。例如，在合适的缓冲液条件下，特异性针对人FGF21多肽的抗体可以流过包含在不溶性基质上附着了其它FGF蛋白质(FGF19x等)的柱。此类筛选允许分离与紧密相关的多肽不交叉反应的多克隆和单克隆抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane(编著)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；CurrentProtocols in Immunology，Cooligan等人(编著.)，National Institutes ofHealth，John Wiley和Sons，Inc.，1995)。特异性抗体的筛选和分离是本领域普遍已知的(参见Fundamental Immunology，Paul(编著)，Raven Press，1993；Getzoff等人，Adv.in Immunol.43：1-98，1988；MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Goding，J.W.(编著)，Academic PressLtd.，1996；Benjamin等人，Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984)。此类测定的代表性实例包括：并行免疫电泳(RIA)、放射性免疫测定(RIA)、放射性免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、点印迹(dot blot)或Western印迹测定、抑制或竞争测定和夹心测定(sandwich assay)。
[000184]在一些实施方案中，本发明的抗体不特异性结合由选自SEQ IDNO：3-111、SEQ ID NO：133-138或SEQ ID NO：160-164的序列组成的表位(表2)。在一些实施方案中，本发明的抗体不特异性结合由SEQ ID NO：2的残基1-49组成的表位。在一些实施方案中，抗体不结合FGF19x。
[000185]本发明还提供抗体，所述抗体是SMIP或特异针对靶蛋白质的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。这些构建体是单链多肽，其包含与执行抗体效应子功能必需的免疫球蛋白结构域融合的抗原结合结构域。参见例如WO03/041600，美国专利公开20030133939和美国专利公开20030118592。
[000186]在一些实施方案中，本发明的抗体是中和抗体。中和抗体结合感染剂，例如病毒或细菌，例如与癌症相关的病毒或细菌(例如，JC多瘤病毒、EB病毒或幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))。在一些实施方案中，中和抗体可以有效的作为受体拮抗剂作用，即，抑制配体-介导的受体活化的所有或一部分生物学活性。在一些实施方案中，抗体可以被指定为生物学活性的激动剂、拮抗剂或反相激动剂，所述活性包括本文公开的发明的肽的特定生物学活性。
[000187]可以筛选本发明的抗体的能力，所述能力是根据与讨论的肿瘤细胞抗原结合而快速内化的能力，或结合后保留在细胞表面上的能力。在一些实施方案中，例如构建一些类型的免疫缀合物中，如果释放毒素部分需要内化，则抗体内化的能力是理想的。可选的，如果抗体用于促进ADCC或CDC，则抗体保留在细胞表面是更理想的。筛选方法可用于区分这些类型的行为。例如，可以使用负荷肿瘤细胞抗原的细胞，其中细胞与人IgG1(对照抗体)或本发明的一种抗体在冰上(具有0.1％叠氮化钠阻断内化)或37℃(不加叠氮化钠)孵育3小时，浓度为大约1μg/mL。然后用冷的染色缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％叠氮化钠)洗涤细胞，在冰上用羊抗人IgG-FITC染色30分钟。通过FACS Calibur记录几何平均荧光强度(MFI)。如果在存在叠氮化钠、并用发明的抗体在冰上孵育的细胞，和在缺少叠氮化钠、37℃孵育的细胞之间没有观察到MFI的差异，则推测抗体是保留结合在细胞表面，而非内化的抗体。然而，如果在缺少叠氮化钠、37℃孵育的细胞中发现表面可染色的抗体减少，则推测抗体是能够内化的抗体。
[000188]抗体缀合物
[000189]在一些实施方案中，发明的抗体是缀合的。在一些实施方案中，缀合的抗体可用于癌症治疗、癌症诊断或癌性细胞成像。在一些实施方案中，缀合的抗体可用于血管疾病或病症的诊断或成像。
[000190]对于诊断应用，通常用可检测的部分标记抗体。可使用多种标记，其通常可被分组为以下类别：
(a)放射性核素，例如下文讨论的。例如可以用放射性同位素标记抗体，例如利用在Current Protocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等人编著，Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)中描述的技术，并可以利用闪烁计数测量放射性。
(b)荧光标记，例如稀土元素螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红是可用的。荧光标记可以利用例如上述Current Protocols in Immunology中公开的技术与抗体缀合。可以利用荧光仪定量荧光。
(c)可获得多种酶-底物标记，美国专利号4,275,149提供了相关综述。酶通常催化生色底物的化学改变，可以利用多种技术对其进行测量。例如，酶可以催化底物的颜色改变，其可以用分光光度计测量。可选的，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光改变的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应成为电子激发的，然后可以发射可以测量的光(例如，利用化学发光分析仪)或向荧光受体贡献能量。酶促标记的实例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利号4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶和微过氧化物酶等。酶与抗体缀合的技术描述在O′Sullivan等人，Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(J.Langone & H.Van Vunakis编著)，Academic press，New York，73：147-166(1981)中。
[000191]抗体还可用于体内诊断测定。在一些实施方案中，抗体是用放射性核素标记的，从而可以利用免疫闪烁照相(immunoscintiography)定位肿瘤。出于方便，可以在试剂盒中提供本发明的抗体，即预定量试剂和用于实施诊断测定的说明书的包装组合。当用酶标记抗体时，试剂盒可以包括底物和酶所需要的辅因子(例如，提供可检测的生色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。可以较大的改变不同试剂的相对量，来提供试剂溶液的浓度，所述浓度实质上优化测定的灵敏度。特别地，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时可以提供具有合适的浓度的试剂溶液。
[000192]在一些实施方案中，抗体与一种或多种美登素分子(例如，约1至约10个美登素分子/抗体分子)缀合。例如，可以将美登素转变为May-SS-Me，后者可以还原为May-SH3并与修饰的抗体反应(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992))，产生美登木素生物碱-抗体免疫缀合物。在一些实施方案中，缀合物可以是高效价的美登素衍生物DM1(N2’-脱乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)(参见例如，2002年12月12日公开的WO02/098883)，其具有IC50为约10-11M(综述，参见Payne(2003)Cancer Cell 3：207-212)或DM4(N2’-脱乙酰-N2’-(4-甲基--4-巯基-1-氧代戊基)-美登素)(参见例如，2004年12月2日公开的WO2004/103272)。
[000193]在一些实施方案中，抗体缀合物包含与一种或多种加利车霉素分子缀合的抗-肿瘤细胞抗原抗体。在亚皮摩尔浓度时，抗生素的加利车霉素家族能够产生双链DNA断裂。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI1(Hinman等人，CancerResearch 53：3336-3342(1993)和Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。还参见美国专利号5,714,586；5,712,374；5,264,586和5,773,001，均通过引用整合到本文中。
[000194]在一些实施方案中，抗体与前体药物缀合，通过许多癌症中过度产生的酶所述前体药物能够以其活性形式释放。例如，可以用阿霉素的前体药物形式制备抗体缀合物，其中通过纤溶酶从缀合物中释放活性组分。已知多种癌性组织中都过度产生纤溶酶(参见Decy等人，(2004)FASEBJournal 18(3)：565-567)。
[000195]在一些实施方案中，抗体与酶促活化的毒素和其片段缀合。在一些实施方案中，毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、假单胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、核糖核酸酶(Rnase)、脱氧核糖核酸酶(DNase)、美洲商陆抗病毒蛋白、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和单端孢霉烯族毒素类(tricothecenes)。参见例如，1993年10月28日公开的WO93/21232。在一些实施方案中，毒素具有低的内在免疫原性，并具有降低癌性细胞产生毒素抗性机会的作用机制(例如细胞毒性机制vs抑制细胞机制)。
[000196]在一些实施方案中，可以制备发明的抗体和免疫调节剂之间的缀合物。例如，在一些实施方案中，可以使用免疫刺激性寡核苷酸。这些分子是有效的免疫原，可以引发抗原-特异性抗体应答(参见Datta等人，(2003)Ann N.Y.Acad.Sci 1002：105-111)。其它的免疫调节化合物可以包括干细胞生长因子例如“S1因子”、淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白介素、集落刺激因子(CSF)例如粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、干扰素(IFN)例如干扰素α、β或γ、促红细胞生成素和血小板生成素。
[000197]在一些实施方案中，提供了放射性缀合的抗体。在一些实施方案中，可以利用32P，33P，47Sc，59Fe，64Cu，67Cu，75Se，77As，89Sr，90Y，99Mo，105Rh，109Pd，125I，131I，142Pr，143Pr，149Pm，153Sm，161Th，166Ho，169Er，177Lu，186Re，188Re，189Re，194Ir，198Au，199Au，211Pb，212Pb，213Bi，58Co，67Ga，80mBr，99mTc，103mRh，109Pt，161Ho，189mOs，192Ir，152Dy，211At，212Bi，223Ra，219Rn，215Po，211Bi，225Ac，221Fr，217At，213Bi，255Fm及其组合与亚组合制造此类抗体。在一些实施方案中，硼、钆或铀原子与抗体缀合。在一些实施方案中，硼原子是10B，钆原子是157Gd，铀原子是235U。
[000198]在一些实施方案中，放射性核素缀合物具有能量在20和10,000keV之间的放射性核素。放射性核素可以是Auger发射器(具有小于1000keV的能量)，P发射器(具有20和5000keV之间的能量)，或alpha或‘α’发射器(具有2000和10,000keV之间的能量)。
[000199]在一些实施方案中，提供了诊断性放射性缀合物，其包含的放射性核素是γ-、β-或正电子-发射的同位素。在一些实施方案中，放射性核素具有20和10,000keV之间的能量。在一些实施方案中，放射性核素选自18F、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、68Ga、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、89Zr、94mTc、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Ga、75Se、97Ru、99mTc、114mIn、123I、125I、13Li和197Hg。
[000200]在一些实施方案中，发明的抗体与诊断剂缀合，所述活性剂是光敏的或造影剂。光敏化合物可以包括这样的化合物，例如发色团或染料。造影剂可以是例如顺磁离子，其中离子包括选自铬(III)，锰(II)，铁(III)，铁(II)，钴(II)，镍(II)，铜(II)，钕(III)，钐(III)，镱(III)，钆(III)，钒(II)，铽(III)，镝(III)，钬(III)和铒(III)的金属。造影剂还可以是在X-射线技术或计算机层析X射线照相术中使用的不透射线的化合物，例如碘、铱、钡、镓和铊化合物。不透射线的化合物可以选自钡、泛影酸、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、碘磺拉胺(iogulamide)、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、碘琥酸(iosemetic acid)、碘酞硫、碘替酸、碘拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸盐、丙碘酮和氯化亚铊。在一些实施方案中，诊断免疫缀合物可以包含超声增强剂，例如与发明的抗体缀合的充气脂质体。诊断的免疫缀合物可以用于多种过程，包括但不限于肿瘤或癌症诊断和检测的手术、内窥镜或血管内方法。
[000201]在一些实施方案中，抗体缀合物是利用多种双官能蛋白质偶联剂制备的，所述偶联剂例如例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-联硫基吡啶)-丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化物、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如己二亚氨二盐酸二甲酯(dimethyl adipimidate HCl))、活化酯(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(例如，戊二醛(glutareldehyde))、双叠氮化合物(例如，双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮盐衍生物(例如，双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如，甲苯-2，6-二异氰酸盐)、双-活性氟化合物(例如，1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以根据Vitetta等人，Science238：1098(1987)中描述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的1-异氰硫基苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于缀合放射性核甘酸(radionucleotide)与抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是有利于在细胞内释放细胞毒性药物的“可剪切的接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、二甲基接头或含有二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992))。还可以通过碳水化合物部分将活性剂另外连接至发明的抗体上。
[000202]在一些实施方案中，可以制备包含发明的抗体和细胞毒性剂的融合蛋白，例如通过重组技术或肽合成。在一些实施方案中，向患者施用此类免疫缀合物，所述缀合物包含与细胞毒性剂缀合的抗-肿瘤抗原抗体。在一些实施方案中，免疫缀合物和/或其结合的肿瘤细胞抗原蛋白是被细胞内化的，导致增强了免疫缀合物杀伤其结合的癌细胞的治疗功效。在一些实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰癌细胞内的核酸。此类细胞毒性剂的实例包括美登木素生物碱、加利车霉素、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
[000203]在一些实施方案中，抗体与“受体”(例如链霉抗生物素蛋白)缀合，用于肿瘤预靶向，其中向患者施用抗体-受体缀合物，然后利用澄清剂从循环中去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
[000204]在一些实施方案中，抗体与在靶细胞溶酶体中释放的细胞毒性分子缀合。例如，药物单甲基auristatin E(MMAE)可以通过缬氨酸-瓜氨酸连接缀合，所述连接在抗体缀合物内化后通过蛋白水解的溶酶体(lysozomal)酶组织蛋白酶B被切割(参见例如2003年4月3日公开的WO03/026577)。在一些实施方案中，MMAE可以利用酸不稳定接头附着在抗体上，所述接头含有作为可切割部分的腙官能基(参见例如，2002年11月11日公开的WO02/088172)。
[000205]抗体依赖性酶介导的前体药物疗法(ADEPT)
[000206]在一些实施方案中，本发明的抗体可用于ADEPT，通过将抗体与前体药物活化的酶缀合，所述酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转化为活性抗癌药。参见例如，WO 88/07378和美国专利号4,975,278)。
[000207]在一些实施方案中，用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包括能够作用于前体药物的任何酶，所述酶的作用以使前体药物转化为它的更活化的、细胞毒性形式的方式。
[000208]用于ADEPT的酶包括但不限于：用于将含有磷酸的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸盐的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将含有肽的前体药物转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)；用于转化含有D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；切割碳水化合物的酶，例如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，用于将糖基化的前体药物转化为游离药物；用于将用β-内酰胺衍生的前体药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素酰胺酶V和青霉素酰胺酶G，分别用于将在其胺基氮用苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物。在一些实施方案中，具有酶促活性的抗体本领域也称为“抗体酶”，可用于将发明的前体药物转化为游离的活性药物(参见例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。可以如本文描述的制备抗体-抗体酶缀合物，用于向肿瘤细胞群体递送抗体酶。
[000209]在一些实施方案中，ADEPT酶可以通过本领域普遍已知的技术共价的结合抗体，例如使用上文讨论的异双官能交联试剂。在一些实施方案中，融合蛋白至少包含了发明的抗体的抗原结合区域，所述区域连接了发明的酶的至少功能性活性部分，所述融合蛋白可以利用本领域普遍已知的重组DNA技术构建(参见例如，Neuberger等人，Nature，312：604-608(1984))。
[000210]在一些实施方案中，通过测量所处理的靶细胞培养物相对于未处理的对照培养物的活力，来实现对抗体的鉴定，所述抗体以抑制细胞的方式而非细胞毒性的方式来发挥作用。可以利用本领域已知的方法检测活力，例如CellTiter-
Figure A20088001703600501
Cell Viability Assay或CellTiter-LuminescentCell Viability Assay(Promega，商品号分别是G8080和G5750)。在一些实施方案中，如果通过上文描述的方法测量的，与对照培养物相比，处理导致细胞数量的下降，且没有任何细胞死亡的证据，则认为抗体是潜在的细胞抑制性的。
[000211]在一些实施方案中，可以实施体外筛选测定，利用本领域已知的测定来鉴定促进ADCC的抗体。一个示例性的测定是In Vitro ADCCAssay。为了制备铬51-标记的靶细胞，将肿瘤细胞系生长在组织培养平板中，利用含10mM EDTA的无菌PBS收获。用细胞培养基洗涤脱离的细胞2次。用200μCi的铬51(New England Nuclear/DuPont)在37℃标记细胞(5x106)1小时，偶尔混合。用细胞培养基洗涤标记的细胞3次，然后重悬至浓度为1x105细胞/mL。在无调理作用的条件下使用细胞，或者通过用测试抗体孵育在测定前进行调理，所述抗体为PBMC测定中100ng/mL和1.25ng/mL或者NK测定中20ng/mL和1ng/mL。利用肝素，通过从正常的健康供体中收集血液，制备外周血单核细胞，并用等体积的磷酸缓冲的盐溶液(PBS)稀释。然后将血液分层置于LYMPHOCYTESEPARATION
Figure A20088001703600503
(LSM：Organon Teknika)上，根据生产商的说明离心。从LSM-血浆界面收集单核细胞，用PBS洗涤3次。效应细胞重悬在细胞培养基中，终浓度为1x107细胞/mL。在LSM纯化后，使用NK细胞分离试剂盒和磁柱(Miltenyi Biotech)，根据生产商的说明，通过阴性选择从PBMC中分离天然杀伤细胞(NK)。收集分离的NK细胞，洗涤并在细胞培养基中重悬至浓度为2x106细胞/mL。通过流式细胞仪分析验证对NK细胞的鉴定。沿着微量滴定板的横排，在细胞培养基中2倍系列稀释效应细胞(PBMC或NK)，制备不同的效应子∶靶比例(100μL最终体积)。对于PBMC，效应细胞的浓度范围在1.0x107/mL至2.0x104/mL之间，对于NK，范围在2.0x106/mL至3.9x103/mL之间。在滴定效应细胞后，向平板的每个孔以1x105细胞/mL添加100μL的铬51-标记的靶细胞(调理或未调理的)。获得初始的效应子∶靶比例为：PBMC 100∶1和NK细胞20∶1。一式两份的进行所有测定，每个平板都含有自发裂解(无效应细胞)和总裂解(靶细胞加100μL 1％十二烷基硫酸钠，1N氢氧化钠)的对照。平板在37℃孵育18小时，然后利用上清液收集系统(SkatronInstrument，Inc.)收获细胞培养上清液，并在Minaxi auto-gamma 5000系列γ射线计数器(Packard)中计数1分钟。然后，使用公式：％细胞毒性＝(样品cpm-自发裂解)/(总裂解-自发裂解)x100，以百分比细胞毒性来表示结果。
[000212]为了鉴定促进CDC的抗体，熟练的技术人员可以实施本领域已知的测定。一个示例性测定是In Vitro CDC测定。可以在没有或存在不同浓度的测试抗体的条件下，通过将表达肿瘤细胞抗原的细胞与含有人(或替代来源的)补体的血清孵育，测量体外CDC活性。然后，通过利用ALAMAR
Figure A20088001703600511
(Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202163-171(1997))定量活细胞，来测量细胞毒性。实施的对照测定是不添加抗体，或添加抗体但使用加热失活的血清和/或使用不表达所讨论的肿瘤细胞抗原的细胞。可选的，可以用肿瘤抗原或衍生自肿瘤抗原的肽来包被红血细胞，然后通过观察红细胞裂解测定CDC(参见例如Karjalainen和Mantyjarvi，Acta Pathol Microbiol Scand[C].1981Oct；89(5)：315-9)。
[000213]为了选择诱导细胞死亡的抗体，可以将由例如PI、台盼蓝或7AAD的摄入所指示的膜完整性损失相对于对照进行评估。一个示例性测定是利用肿瘤抗原表达细胞进行PI摄入测定。根据该测定，在补充了10％热失活FBS(Hyclone)和2mM L-谷氨酰胺(glutarnine)的Dulbecco′s修饰的Eagle培养基(D-MEM)∶Ham′s F-12(50∶50)中培养表达肿瘤细胞抗原的细胞。(因此，所述测定是在缺补体和免疫效应细胞的条件下实施的)。在100x20mm培养皿中，以3x106/皿的密度接种肿瘤细胞，允许附着过夜。然后，去除培养基，并用新鲜培养基或含有10μg/mL合适的单克隆抗体的培养基替换。细胞孵育为期3天。在各种处理后，用PBS洗涤单细胞层，并通过胰酶消化脱离。然后在4℃，1200rpm离心细胞5分钟，在3mL冰冷的Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，140mM NaCl，2.5mMCaCl2)中重悬团块，等分到35mm滤网覆盖的12x75管(每管1mL，每处理组3管)中，去除细胞块。管内然后加入PI(10μg/mL)。利用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM.CellQuest软件(BectonDickinson)分析样品。选择通过PI摄入确定统计学显著水平的诱导细胞死亡的抗体作为细胞死亡诱导抗体。
[000214]还可以在体内筛选抗体的凋亡活性，利用18F-膜联蛋白作为PET显像剂。在该方法中，用18F放射性标记膜联蛋白V，并在用所研究的抗体给药后施用于实验动物。在凋亡过程中最早发生的事件之一是磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧面翻转到细胞外侧表面，其中其可以与膜连蛋白接触。然后将动物进行PET成像(参见Yagle等人，J Nucl Med.2005Apr；46(4)：658-66)。还可以处死动物，移除单个器官或肿瘤，根据标准规程分析凋亡标志物。
[000215]在一些实施方案中，癌症的特征可以是基因表达产物例如FGF21，的过表达，而本申请还提供了用于治疗癌症的方法，所述癌症不认为是肿瘤抗原-过表达的癌症。为了确定癌症中的肿瘤抗原表达，可使用多种诊断/预后测定。在一些实施方案中，可以通过IHC分析基因表达产物过表达。将来自肿瘤活组织切片的石蜡包埋组织切片进行IHC测定，遵循以下肿瘤抗原蛋白染色强度基准：
0分：未观察到染色，或在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。
1+分：在多于10％的肿瘤细胞中检测到轻微的/勉强可辨的膜染色。细胞只有在它们的部分膜染色。
2+分：在多于10％的肿瘤细胞中观察到轻度至中度的完全膜染色。
3+分：在多于10％的肿瘤细胞中观察到中度至强烈的完全膜染色。
[000216]针对肿瘤抗原过表达评估具有0或1+评分的肿瘤可以表征为不过表达肿瘤抗原，而具有2+或3+评分的那些肿瘤可以表征为过表达肿瘤抗原。
[000217]可选的或额外的，可以在福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤组织中进行FISH测定，例如INFORMTM(Ventana出售，Ariz.)或PATHVISIONTM(Vysis，Ill.)，从而确定肿瘤中肿瘤抗原过表达(如果存在的话)的程度。
[000218]此外，可以通过与聚合物共价缀合来化学修饰抗体，以例如增加抗体的循环半衰期。每个抗体分子可以连接一个或多个(即，1、2、3、4、5或更多个)聚合物分子。聚合物分子优选的通过接头分子与抗体连接。聚合物通常可以是合成的或天然存在的聚合物，例如任选取代的直链或支链聚烯烃、聚亚烯(polyalkenylene)或聚氧化烯聚合物，或者分支或不分支的多糖，例如同-或异多糖。在一些实施方案中，聚合物是聚氧化乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下可溶于水，具有通式：R(O--CH2--CH2)nO--R，其中R可以是氢，或保护性基团例如烷基或链烷醇基。在一些实施方案中，保护性基团具有1-8个碳。在一些实施方案中，保护性基团是甲基。符号n是正整数，在1和1000之间，或2和500之间。在一些实施方案中，PEG具有平均分子量在1000和40,000之间，2000和20,000之间，或3,000和12,000之间。在一些实施方案中，PEG具有至少一个羟基。在一些实施方案中，羟基是末端羟基。在一些实施方案中，该羟基活化后与抑制剂上的游离氨基反应。然而，可以理解可以改变反应基的类型和量，来实现本发明的共价缀合的PEG/抗体。聚合物和将其与肽连接的方法，显示在美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546，均通过引用全文整合到本文中。
[000219]安全性研究
[000220]可以检验发明的抗体的安全性和毒理学特征。可以在USDACBER部门发行的文件中发现此类研究的指导条例，“Points to Consider inthe Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products forHuman Use”(Docket No.94D-0259，1997年2月28日)通过引用整合到本文中。通常，应该在前临床研究中，利用多种人组织样品和/或分离的人细胞类型来筛选候选抗体，评估非靶组织结合和交叉反应性。在从这些人组织研究中获得满意的结果后，可以筛选一组组织样品或从多种动物物种分离的细胞，来鉴定常规毒理学研究中适合使用的物种。如果没有鉴定出交叉反应的动物物种，则其他模型类型可以视为合适的。这些其它模型可以包括这样的研究，例如异种移植模型，其中将人肿瘤细胞移植到啮齿类宿主中，或使用替代的单克隆抗体，其识别毒理学研究选定的动物物种中的相应的肿瘤细胞抗原。应该理解，来自这些类型的替代模型的数据首先是近似的，在更高等物种中进行时应该谨慎进行。
[000221]对于候选的裸抗体，可以实施观察简单耐受性的研究。在这些研究中，通过观察任何剂量依赖性的药效效应，可以表征候选分子的治疗指数。应该使用宽的剂量范围(例如，0.1mg/kg至100mg/kg)。在评估治疗指数时应该考虑肿瘤细胞抗原数量间的差异、候选抗体与交叉反应的动物靶的亲和力，和抗体结合后的细胞应答的差异。还应该在合适的动物模型中进行药效和药物动力学研究，帮助指导在人中测试候选抗体时初始的剂量考虑。
[000222]对于候选免疫缀合物，必须在体内实施缀合物的稳定性研究。任选的，应该对免疫缀合物的单个组分进行药效学和药物动力学研究，确定候选免疫缀合物的任何降解产物的后果。还应该如上在合适的动物模型中进行药效和药物动力学研究，帮助指导初始的剂量考虑。当药物将与裸抗体的预处理组合给予时，必须对安全性研究的设计予以额外考虑。必须单独用裸抗体进行安全性研究，并且用免疫缀合物设计的研究必须牢记，免疫缀合物的最终剂量应比该类型的治疗方案中的更低。
[000223]对于放射性-免疫缀合物，应该进行动物组织分布研究，确定生物分布数据。此外，应该在进行的早和晚时间点实施对施用放射活性总剂量的代谢降解的计数。可以在体外利用血清或血浆测试放射性免疫缀合物的稳定性，发展测量游离放射性核素、放射性免疫缀合物和标记的、非抗体化合物的百分比的方法。
[000224]寡核苷酸
[000225]在一些实施方案中，FGF21调节剂是寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义或RNAi寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是与FGF21基因或基因产物的区域、结构域、部分或片段互补的。在一些实施方案中，寡核苷酸包括约5至约100个核苷酸，约10至约50个核苷酸，约12至约35个核苷酸，和约18至约25个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与FGF21基因或基因产物的区域、部分、结构域、或片段至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％同源。在一些实施方案中，在FGF21基因或基因产物的至少15、20、25、30、35、40、50或100个连续核苷酸上具有基本或完全的序列同源性。在一些实施方案中，在完整长度的FGF21基因或基因产物上具有基本或完全的序列同源性。在一些实施方案中，寡核苷酸在中度或严格杂交条件下与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子杂交。
[000226]在一些实施方案中，FGF21调节剂是双链RNA(dsRNA)分子，通过RNAi(RNA干扰)发挥作用。在一些实施方案中，dsRNA的一条链与FGF21基因的区域、部分、结构域或片段至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％同源。在一些实施方案中，在FGF21基因的至少15、20、25、30、35、40、50、100、200、300、400、500或1000个连续核苷酸上具有基本或完全的序列同源性。在一些实施方案中，在完整长度的FGF21基因上具有基本或完全的序列同源性。
[000227]在一些实施方案中，FGF21调节剂与FGF21RNA的包含SNP的区域杂交。在一些实施方案中，SNP在相应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置36、325、326、420、516、521或621的一个或多个位置上包含核苷酸取代。在一些实施方案中，FGF21调节剂与FGF21RNA的包含表1列举的SNP的区域杂交。
[000228]在一些实施方案中，在聚合酶链式反应(PCR)中使用发明的寡核苷酸。该序列可以基于(或设计于)基因组序列或cDNA序列，用于扩增、验证或检测特定细胞或组织中相同、相似或互补的DNA或RNA的存在。
[000229]小分子
[000230]在一些实施方案中，FGF21调节剂是小分子。如本文中使用的，术语“小分子”指分子量小于约10千道尔顿的有机或无机非聚合化合物。小分子的实例包括肽、寡核苷酸、有机化合物、无机化合物等。在一些实施方案中，小分子具有小于约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1千道尔顿的分子量。
[000231]模拟物
[000232]在一些实施方案中，FGF21调节剂是模拟物。如本文中使用的，术语“模拟物”指模拟肽的活性的化合物。模拟物不是肽，但可以包含通过非肽键连接的氨基酸。1997年6月10日申请的美国专利号5,637,677，及其母申请，均通过引用整合到本文中，包括对模拟物生产的详细指导。简而言之，通过不是肽的分子复制肽的三维结构，所述结构与FGF21的三维结构特异性相互作用。在一些实施方案中，FGF21模拟物是FGF21的模拟物或FGF21配体的模拟物。
[000233]诱饵
[000234]在一些实施方案中，FGF21调节剂是诱饵，其包含至少FGF21多肽的部分。在一些实施方案中，诱饵与天然FGF21竞争结合FGF21受体，例如FGFR-1或FGFR-2。在一些实施方案中，标记诱饵，从而有利于定量、定性和/或可视化。在其它实施方案中，诱饵还包括有利于分离和/或分隔诱饵，或诱饵-FGF21受体复合体的部分，所述复合体例如诱饵-FGFR-1或诱饵-FGFR-2复合体。在一些实施方案中，诱饵包含至少一部分与抗体或抗体片段融合的FGF21多肽。
[000235]治疗/预防癌症的方法
[000236]本发明提供了用于治疗和/或预防受试者的癌症或癌症的症状的方法，包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的FGF21调节剂。在一些实施方案中，癌症是与FGF21过表达相关的癌症。在一些实施方案中，癌症是结肠癌、肝癌、睾丸癌、胸腺癌、乳腺癌、皮肤癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤或黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是位于非激素调节的组织内。在一些实施方案中，已经诊断受试者患有癌症或对癌症易感。
[000237]癌症的症状是本领域技术人员普遍已知的，包括但不限于体重减轻(weight loss)、贫血、腹痛、肠梗阻、便血、腹泻、便秘、肠习惯的其它改变、结肠转移、死亡、虚弱、过度疲劳、进食困难、丧失食欲、慢性咳嗽、呼吸困难恶化、咳血、尿血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、肚胀、胃气胀、腹腔积液(fluid in peritoneal cavity)、阴道出血、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、呕血、重度出汗、发热、高血压、黄疸、晕眩、寒冷、肌痉挛、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移和胰腺转移，吞咽困难等。
[000238]根据药物化学师普遍已知的程序，并且根据患者的年龄、病况的严重程度和理想的最终药物制剂等，可以经验地确定调节化合物的治疗有效量。可以通过例如吸入或栓剂或至粘膜组织，进行本发明的调节剂的施用，例如通过灌洗阴道、直肠、尿道、颊和舌下组织，口服、局部、鼻内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴管内的、瘤内的、肌内、间质(interstitially)、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮的和经皮的。在一些实施方案中，通过灌洗、口服或动脉间施用抑制剂。其它合适的引入方法还可以包括可重复充电的或可生物降解的装置，和缓释或持续释放的多聚物装置。如上文讨论的，本发明的治疗组合物还可以作为组合疗法的一部分，与其它已知的抗癌剂或其他已知的抗骨疾病治疗方案一起施用。
[000239]本发明还提供了调节患者内FGF21-相关生物学活性的方法。方法包括向患者施用一定量的FGF21调节剂，所述量有效调节一种或多种FGF21生物学活性。在上下文中提出了用于测量FGF21生物学活性的合适测定。
[000240]本发明还提供了在需要其的患者中抑制癌细胞生长的方法，包括向患者施用治疗有效量的一种或多种FGF21调节剂。用于测量FGF21-相关细胞生长的合适测定是本领域技术人员已知的，并在上下文中提出。
[000241]本发明还提供了在需要其的患者中抑制癌症的方法。方法包括确定患者是否是本文所述的FGF21疗法的候选对象，如果患者是FGF21疗法的候选对象，则向患者施用治疗有效量的一种或多种FGF21调节剂。如果患者不是FGF21疗法的候选对象，则用常规的癌症治疗治疗患者。
[000242]本发明还提供了在诊断或怀疑患有癌症的患者中抑制癌症的方法。方法包括向患者施用治疗有效量的一种或多种FGF21调节剂。
[000243]本发明还提供了用于抑制患者内两个或多个细胞相互作用的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。用于测量FGF21-相关细胞相互作用的合适测定是本领域技术人员已知的，并在上下文中提出。
[000244]本发明还提供了调节患者的一种或多种癌症症状的方法。方法包括向所述患者施用治疗有效量的本文描述的FGF21组合物。
[000245]本发明还提供了用于在需要其的患者内抑制细胞生长的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。上下文中提出了用于测量FGF21-相关附着-不依赖性细胞生长的合适测定。
[000246]本发明还提供了用于在需要其的患者内抑制癌细胞迁移的方法，包括向患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。用于测量FGF21-相关细胞迁移的合适测定是本领域技术人员已知的。
[000247]本发明还提供了用于在需要其的患者内抑制癌细胞附着的方法，包括向患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。用于测量FGF21-相关细胞附着的合适测定是本领域技术人员已知的。
[000248]本发明还提供了在需要其的患者内抑制血管发生的方法，包括向患者施用治疗有效量的一种或多种FGF21调节剂。用于测量血管发生的合适测定是本领域技术人员已知的，并提出在上下文中。
[000249]本发明还提供了预防性治疗患者的方法，所述患者易于发展癌症、癌症转移或者其已经具有转移从而因此易于复发或再现。方法特别用于高风险个体，其例如具有癌症或转移性肿瘤的家族史，或表现出对癌症转移的遗传素质。在一些实施方案中，肿瘤是FGF21-相关肿瘤。此外，方法用于预防患者的FGF21-相关肿瘤复发，所述患者曾具有通过手术切除术移除的或用常规癌症治疗治疗过的FGF21-相关肿瘤。
[000250]本发明还提供了抑制癌症进展和/或引起癌症消退的方法，包括向患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。
[000251]在一些实施方案中，用本发明的FGF21调节剂联合化疗和/或放射疗法治疗需要抗癌治疗的患者。例如，在施用FGF21调节剂后，还可以用治疗有效量的抗癌放射治疗患者。在一些实施方案中，组合提供化疗治疗和FGF21调节剂。在一些实施方案中，组合施用FGF21调节剂和化疗以及放射疗法。
[000252]治疗方法包括向患者施用单次或多次剂量的一种或多种FGF21调节剂。在一些实施方案中，FGF21调节剂作为可注射的药物组合物施用，所述组合物是无菌的、无致热源，并包含与可药用载体或稀释剂组合的FGF21调节剂。
[000253]在一些实施方案中，本发明的治疗方案与癌症的常规治疗方案一起使用，包括但不限于手术、放射性疗法、激素消融和/或化疗。可以在常规癌症治疗之前、同时或之后进行本发明的FGF21调节剂的施用。在一些实施方案中，向患者施用两种或多种不同的FGF21调节剂。
[000254]在一些实施方案中，向患者施用的FGF21调节剂的量有效的抑制癌细胞生长、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管发生、FGF21信号传导、FGF21-介导的细胞-细胞附着、血管形成、激酶活性、癌细胞存活、脂肪细胞摄入葡萄糖、FGF21与FGF21受体之间的相互作用，FGF21受体的磷酸化，以及FGF21表达中的一种或多种。FGF21受体可以是FGFR-1或FGFR-2。在一些实施方案中，向患者施用的FGF21调节剂的量通过凋亡，有效的增加癌细胞死亡。
[000255]组合疗法
[000256]在一些实施方案中，发明提供了包括两种或多种FGF21调节剂的组合物，以仍提供改善的抗癌症和/或血管疾病的功效。在一些实施方案中，FGF21调节剂单克隆抗体。组合物包括两种或多种FGF21抗体，可以施用给患有或易于罹患癌症或血管疾病的人或哺乳动物。还可以与另一种治疗剂一起施用一种或多种抗体，所述另一种治疗剂例如细胞毒性剂或化疗剂。并行(cocurrent)施用两种或多种治疗剂不需要同时或通过同一途径施用所述活性剂，只要所述活性剂发挥其治疗效应的时间段存在重叠即可。可以考虑同时或顺序施用，在不同天或不同周施用。
[000257]在一些实施方案中，可以考虑不同抗体的组合施用，或“混合物(cocktail)”。此类抗体混合物可以具有一定优势，因为其含有利用不同效应子机制的抗体，或者组合了直接的细胞毒性抗体和依赖免疫效应功能的抗体。此类组合的抗体可以表现出协同的治疗效果。
[000258]细胞毒性剂指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。术语意在包括放射性同位素(例如，131I、125I、90Y和186Re)，化疗剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性的毒素或合成毒素，或其片段。非细胞毒性剂指不抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。非细胞毒性剂可以包括这样的活性剂，所述活性剂可以被活化为细胞毒性的。非细胞毒性剂可以包括珠、脂质体、基质或颗粒(参见例如美国专利公开2003/0028071和2003/0032995，其通过引用整合到本文中)。此类活性剂可以与根据本发明的抗体缀合、偶联、连接或相关联。
[000259]在一些实施方案中，常规的癌症药物与本发明的组合物施用。常规的癌症药物包括：
a)癌症化疗剂；
b)其它活性剂；
c)前体药物。
[000260]癌症化疗剂包括但不限于，烷化剂例如卡铂和顺铂；氮芥烷化剂；亚硝基脲烷化剂例如卡莫司汀(BCNU)；抗代谢物例如甲氨喋呤；甲酰四氢叶酸；嘌呤类似物抗代谢物，巯嘌呤；嘧啶类似物抗代谢物，例如氟尿嘧啶(5-FU)和吉西他滨
Figure A20088001703600611
激素抗肿瘤药，例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和他莫昔芬；天然抗肿瘤药，例如阿地白介素、白介素-2、多西他赛、依托泊苷(VP-16)、干扰素α、紫杉醇
Figure A20088001703600612
和维甲酸(ATRA)；抗生素天然抗肿瘤药，例如博来霉素、更生霉素、柔红霉素(Daunorubicin)、多柔比星、道诺霉素和丝裂霉素(包括丝裂霉素C)；以及长春花生物碱天然抗肿瘤药，例如长春碱、长春新碱、长春地辛；羟基脲；醋葡醛内酯；亚德里亚霉素(adriamycin)、异环磷酰胺、依诺他滨、环硫雄醇、阿柔比星、安西他滨、尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、卡波醌、卡铂、卡莫氟、色霉素A3、抗肿瘤多糖、抗肿瘤血小板因子、环磷酰胺
Figure A20088001703600613
施佐菲兰、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、达卡巴嗪、硫代肌苷、塞替派、替加氟、多拉司他汀、多拉司他汀类似物例如auristatin、CPT-11(依立替康)、米托蒽醌、长春瑞滨、替尼泊苷、氨基蝶呤、洋红霉素、埃斯波霉素(参见例如，美国专利号4,675,187)、新制癌菌素、OK-432、博来霉素、氟铁龙、溴尿苷、白消安、二磷酸己烯雌酚四钠、培洛霉素、苯丁抑制素
Figure A20088001703600614
干扰素-β、美雄烷、二溴甘露醇、美法仑、层粘连蛋白肽、香菇多糖、采绒革盖菌(Coriolus versicolor)提取物、替加氟/尿嘧啶、雌莫司汀(雌激素/氮芥)。
[000261]可以用作癌症患者治疗的其它活性剂包括EPO、G-CSF、更昔洛韦；抗生素、亮丙瑞林；哌替啶；齐多夫定(AZT)；白介素1到18，包括变体和类似物；干扰素或细胞因子，例如干扰素α、β和γ；激素，例如黄体生成素释放激素(LHRH)和类似物，以及促性腺素释放素(GnRH)；生长因子，例如转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放因子(GHRF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子同源因子(FGFHF)、肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子(IGF)；肿瘤坏死因子-α&β(TNF-α&β)；侵入抑制因子-2(IIF-2)；骨形态发生蛋白1-7(BMP 1-7)；生长抑素；胸腺素-α-1；γ-球蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；补体因子；抗血管发生因子；抗原物质；和前体药物。
[000262]“前体药物”指药学活性物质的前体或衍生形式，其与母体药物相比，对肿瘤细胞具有更低的细胞毒性或非细胞毒性，并能够被酶促活化或转变为活化的或更活化的母体形式。参见例如，Wilman，″Prodrugs inCancer Chemotherapy″Biochemical Society Transactions，14，第375-382页，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等人，″Prodrugs：A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery，″Directed Drug Delivery，Borchardt等人(编著)，第247-267页，Humana Press(1985)。前体药物包括但不限于，含磷酸盐/酯的前体药物、含硫代磷酸盐/酯的前体药物、含有硫酸盐/酯的前体药物、含有肽的前体药物、D-氨基酸修饰的前体药物、糖基化的前体药物、含有β-内酰胺的前体药物、含有任选取代的苯氧乙酰胺的前体药物或含有任选取代的苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶或其他5-氟尿苷的前体药物(其可以转变为更活化的细胞毒性游离药物)。本文中使用的可以衍生成前体药物形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述化疗剂。
[000263]临床方面
[000264]在一些实施方案中，本发明的方法和组合物在结肠癌、肝癌、睾丸癌、胸腺癌、乳腺癌、皮肤癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤和黑色素瘤中是特别有用的。在一些实施方案中，癌症是导管腺癌、小叶腺癌或转移性腺癌。
[000265]治疗/预防血管疾病的方法
[000266]本发明提供了用于在受试者中治疗和/或预防血管疾病或血管疾病症状的方法，包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明的FGF21调节剂。在一些实施方案中，血管疾病是冠状动脉病、外周动脉病、腹主动脉瘤、血块、深静脉血栓形成、静脉停滞病、静脉炎或静脉曲张。在一些实施方案中，已经诊断受试者具有血管疾病或对血管疾病易感。在一些实施方案中，受试者患有动脉粥样硬化。
[000267]血管疾病的症状是本领域技术人员普遍已知的，包括但不限于间歇性跛行、咽痛、局部缺血静息痛(ischemic rest pain)、溃疡、坏疽、萎缩(withered)的肌肉、疼痛、趾和腿毛发缺失、厚脚趾甲、发光皮肤(shiny skin)、胸痛和呼吸短促等。
[000268]根据药物化学师普遍已知的程序，并且根据患者的年龄、病况的严重程度和理想的最终药物制剂等，可以经验地确定调节化合物的治疗有效量。可以通过例如吸入或栓剂或至粘膜组织，进行本发明的调节剂的施用，例如通过灌洗直肠、尿道、颊和舌下组织，口服、局部、鼻内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴管内的、肌内、间质(interstitially)、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮的和经皮的。在一些实施方案中，通过灌洗、口服或动脉间施用抑制剂。其它合适的引入方法还可以包括可重复充电的或可生物降解的装置，和缓释或持续释放的多聚物装置。如上文讨论的，本发明的治疗组合物还可以作为组合疗法的一部分，与其它已知的活性剂或用于治疗血管疾病的另一治疗方案一起施用。
[000269]本发明还提供了增加需要其的患者内血管发生的方法，包括向患者施用治疗有效量的一种或多种FGF21调节剂。用于测量血管发生的合适测定是本领域技术人员已知的，包括显微镜检查测定和免疫组织化学，来检测冯维勒布兰德因子或CD31作为血管发生的阳性标志物(参见例如，Auerbach，Clinical Chemistry 49：1，32-40，2003；Taraboletti和Giavazzi，EJC 40：881-889，2004)。
[000270]本发明还提供了在诊断或怀疑患有血管疾病的患者中抑制血管疾病的方法。方法包括向患者施用治疗有效量的一种或多种FGF21调节剂。
[000271]本发明还提供了在患者中增加血管形成的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。用于测量血管形成的合适测定是本领域技术人员已知的，包括上文描述的用于测量血管发生的测定，以及监控内皮细胞增殖(WO 01/63281)。
[000272]本发明还提供了在患者中调节血管疾病的一种或多种症状的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的本文描述的FGF21组合物。
[000273]本发明还提供了预防性治疗患者的方法，所述患者易于发展血管疾病。方法特别适用于高风险个体，其例如具有血管疾病家族史，或表现出对血管疾病的遗传素质。
[000274]本发明还提供了抑制血管疾病进展的方法，包括向患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。
[000275]在一些实施方案中，用本发明的FGF21调节剂与手术、药物或特定饮食或运动方案联合治疗需要治疗血管疾病的患者。例如，在施用FGF21调节剂后，还可以用治疗有效量的抗血小板剂、抗凝剂或溶栓剂治疗患者。在一些实施方案中，在FGF21调节剂治疗之前和/或之后，通过血管成形术、支架、动脉粥样斑块切除或心脏搭桥手术治疗受试者。可以在常规的血管疾病治疗之前、同时或之后施用本发明的FGF21调节剂。在一些实施方案中，向患者施用两种或多种不同的FGF21调节剂。
[000276]药物组合物
[000277]本发明还提供了药物组合物，其包含一种或多种本文描述的FGF21调节剂和可药用的载体。在一些实施方案中，药物组合物被制备成可注射的，如液体溶液或悬浮液；还可以制备成固体形式，适合在注射前溶解或悬浮在液体运载体中。可药用的载体的定义包括脂质体。药物组合物中还可以存在可药用的盐，例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸的盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐等。对可药用的辅剂的透彻讨论可获得自Remington：The Science andPractice of Pharmacy(1995)Alfonso Gennaro，Lippincott，Williams，&Wilkins。
[000278]检测FGF21的方法
[000279]本发明还提供了用于检测FGF21的方法。在一些实施方案中，FGF21存在于患者或患者样品中。在一些实施方案中，方法包括向患者施用含有一种或多种FGF21调节剂的组合物，并检测患者中显像剂的分布。在一些实施方案中，患者样品包含癌细胞。在一些实施方案中，FGF21调节剂连接了显像剂或被可检测的标记。在一些实施方案中，FGF21调节剂是缀合了显像剂的FGF21抗体，被施用于患者来检测一种或多种肿瘤或确定患者对FGF21疗法的易感性。标记的抗体可以结合细胞上高密度的受体，从而在肿瘤细胞上积累。利用标准的成像技术，可以检测肿瘤位点。
[000280]本发明还提供了成像/检测表达或过表达FGF21的细胞或肿瘤的方法，包括将含有FGF21调节剂的组合物与样品接触，并检测样品中FGF21调节剂的存在。在一些实施方案中，样品是患者样品。在一些实施方案中，患者样品包含癌细胞。在一些实施方案中，FGF21调节剂连接了显像剂或被可检测的标记。
[000281]本发明还提供了用于定量患者、细胞或样品中存在的FGF21的量的方法。方法包括向患者或样品施用一种或多种抗体、探针或小分子，并检测样品中存在的FGF21的量。在一些实施方案中，抗体、探针或小分子连接了显像剂或被可检测的标记。此类信息表示例如，肿瘤是否与FGF21相关，从而是否应该使用或避免特定的治疗。在一些实施方案中，使用本领域技术人员普遍已知的标准技术，获得认为包含了肿瘤细胞的样品，并与标记的抗体、探针、寡核苷酸和小分子接触。在去除任何未结合的、标记抗体、探针、寡核苷酸或小分子后，确定了与细胞结合的标记抗体、肽、寡核苷酸或模拟物的量，或作为未结合的而除去的抗体、肽、寡核苷酸或模拟物的量。信息与存在的FGF21的量直接相关。
[000282]利用本领域普通技术人员普遍已知的程序可以实施成像。例如，可以通过放射性闪烁照相术、核磁共振成像(MRI)或计算机层析X射线照相书(CT扫描)实施成像。显像剂最常使用的放射性标记包括放射性的碘和铟。CT扫描成像可以使用重金属，例如铁螯合物。MRI扫描可以使用钆或锰的螯合物。此外，可以利用氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射器进行正电子成像术(PET)。
[000283]在一些实施方案中，FGF21调节剂是FGF21抗体。在一些实施方案中，调节剂连接了显像剂或被可检测的标记。在一些实施方案中，显像剂是18F、43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、77Br、87MSr、86Y、90Y、99MTc、111In、123I、125I、127Cs、129Cs、131I、132I、197Hg、203Pb或206Bi。
[000284]检测方法本领域技术人员普遍已知的。例如，检测多核苷酸的方法包括但不限于PCR、Northern印迹、Southern印迹、RNA保护和DNA杂交(包括原位杂交)。检测多肽的方法包括但不限于，Western印迹、ELISA、酶活性测定、狭线印迹、多肽质量指纹分析、电泳、免疫化学和免疫组织化学。检测方法的其它实例包括但不限于，放射性免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定、荧光免疫测定、时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)、双色荧光显微镜检查或免疫色谱测定(ICA)，都是本领域技术人员已知的。在本发明的一些优选的实施方案中，利用PCR方法学检测多核苷酸表达，利用ELISA技术检测多肽生产。
[000285]向细胞递送细胞毒性剂或诊断剂的方法
[000286]本发明还提供了用于向表达FGF21的一个或多个细胞递送细胞毒性剂或诊断剂的方法。在一些实施方案中，方法包括将本发明的FGF21调节剂与细胞接触，所述调节剂缀合了细胞毒性剂或诊断剂。
[000287]用于确定对FGF21疗法易感性的方法
[000288]本发明还提供了确定患者对FGF21疗法的易感性的方法。方法包括检测患者或患者样品中FGF21差异表达的证据的存在或缺失。患者或样品中存在FGF21差异表达的证据表示患者对FGF21疗法易感。在一些实施方案中，患者或患者样品中不存在FGF21差异表达的证据表示患者不是FGF21疗法的候选对象。
[000289]在一些实施方案中，治疗方法包括首先鉴定对FGF21疗法易感的患者，包括向需要其的患者施用含有与显像剂连接的FGF21调节剂的组合物，并检测患者中FGF21RNA或蛋白质的证据的存在或缺失。在一些实施方案中，治疗方法还包括如果患者是FGF21疗法的候选对象，向患者施用一种或多种的FGF21调节剂，如果患者不是FGF21疗法的候选对象，则用常规的治疗治疗患者。
[000290]在一些实施方案中，治疗方法包括首先鉴定对FGF21疗法易感的患者，包括测定患者的FGF21基因中SNP的存在或缺失。SNP可以是表1列举的一种或多种SNP。可以通过任何已知的方法确定SNP的存在或缺失，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、产生限制性位点的PCR、DNA测序等。在一些实施方案中，存在SNP可以指示患者具有FGF21相关癌症或病症，和/或是FGF21调节剂治疗的候选对象。
[000291]在一些实施方案中，如果确定患者携带了FGF21多肽(所述多肽在对应于SEQ ID NO：2的174位的位置处具有亮氨酸以外的氨基酸)，则鉴定患者是FGF21调节剂治疗的候选对象。在一些实施方案中，患者在174位具有脯氨酸。
[000292]在一些治疗性方法中，当鉴定患者具有癌症或易感癌症时，向患者单独施用或与其它抗癌药物组合施用一种或多种FGF21调节剂。
[000293]在一些治疗性方法中，当鉴定患者具有血管疾病或易感血管疾病时，向患者单独施用或与其它治疗血管疾病的药物组合施用一种或多种FGF21调节剂。
[000294]用于评估癌症进展的方法
[000295]发明还提供了用于评估患者中癌症进展的方法，包括比较第一时间点的生物学样品中的FGF21表达产物水平，和第二时间点的同一表达产物的水平。相对于第一时间点，表达产物在第二时间点的水平的改变是癌症进展的指标。
[000296]筛选的方法
[000297]本发明还提供了用于筛选抗癌剂或血管发生剂或抗血管发生剂的方法。方法包括将表达FGF21的细胞与候选化合物接触，确定是否调节了FGF21-相关生物学活性。在一些实施方案中，对癌细胞生长、整联蛋白介导的活性、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管发生、FGF21信号传导、FGF21-介导的细胞间附着、脂肪细胞摄入葡萄糖、FGF21与FGFR-1或FGFR-2的一种或两种之间的相互作用，FGFR-1或FGFR-2的磷酸化，以及FGF21表达中的一种或多种的抑制指示了抗癌剂。在其它实施方案中，内皮细胞增殖、血管发生、血管形成、FGF21信号传导、FGF21-介导的细胞间附着、脂肪细胞摄入葡萄糖、FGF21与FGFR-1或FGFR-2的一种或两种之间的相互作用，FGFR-1或FGFR-2的磷酸化，以及FGF21表达中的一种或多种的增加指示了用于治疗血管疾病的活性剂。
[000298]本发明还提供了鉴定癌症抑制剂的方法。方法包括将表达FGF21的细胞与候选化合物和FGF21配体接触，确定是否调节了FGF21-相关生物学活性。在一些实施方案中，对癌细胞生长、整联蛋白介导的活性、肿瘤形成、癌细胞增殖、癌细胞转移、细胞迁移、血管发生、FGF21信号传导、FGF21-介导的细胞间附着、脂肪细胞摄入葡萄糖、FGF21与FGFR-1或FGFR-2的一种或两种之间的相互作用，FGFR-1或FGFR-2的磷酸化，以及FGF21表达中的一种或多种的抑制指示了癌症抑制剂。在一些实施方案中，向患者施用的FGF21调节剂的量有效的增加了癌细胞凋亡。
[000299]在一些实施方案中，发明提供了筛选抗癌剂的方法，特别是抗转移癌活性剂，这是通过例如筛选推定的调节剂调节下游标志物的活性或水平的能力。在一些实施方案中，降低FGFR-1或FGFR-2水平的候选活性剂被鉴定为抗癌剂。
[000300]在一些实施方案中，发明提供了筛选治疗血管疾病的活性剂的方法，这是通过例如筛选推定的调节剂调节下游标志物的活性或水平的能力。在一些实施方案中，增加FGFR-1或FGFR-2水平的候选活性剂被鉴定为治疗血管疾病的活性剂。
[000301]用于纯化FGF21的方法
[000302]在一些实施方案中，发明提供了从包含FGF21的样品中纯化FGF21蛋白的方法。方法包括提供包含与固体支持物结合的本发明FGF21抗体的亲和基质，将样品与亲和基质接触，形成亲和基质-FGF21蛋白复合体，将亲和基质-FGF21蛋白复合体与剩余样品分离；并从亲和基质释放FGF21蛋白。
[000303]试剂盒
[000304]在一些实施方案中，本发明提供了用于成像和/或检测与FGF21过表达相关的基因或基因产物的试剂盒。发明的试剂盒包括可检测的抗体、小分子、寡核苷酸、诱饵(decoy)、模拟物或探针，以及用于实施发明的方法的说明书。任选的，试剂盒还可以包含一种或多种下述：对照(阳性和/或阴性)、对照的容器、阳性和/或阴性结果的代表性实例的照片或描述。
[000305]本文描述的每种专利、专利申请、登录号和出版物都通过引用全文整合到本文中。
[000306]除本文描述的以外，根据上述描述，发明的不同修饰对本领域技术人员是显而易见的。此类修饰还意在落入所附实施方案的范围内。出于示例的目的，本发明还展示了下列实施例，并非意在限制本发明的范围。
实施例
[000307]实施例1：FGF21刺激内皮细胞增殖
[000308]利用牛肾上腺皮质内皮(ACE)细胞实施增殖测定。如所述制备和培养细胞(Gospodarowicz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7311-7315，1989；Gospodarowicz等人，J.Cellular Physiology 127：121-136，1986)。在测定时，ACE细胞在无血清培养基中，以5000细胞/孔接种在24孔组织平板中。在1.4-466ng/mL范围内，添加不同浓度的FGF21或煮沸(boiled)的FGF21，一式两份，孵育进行72小时。孵育后，收获细胞并在Coulter细胞计数器中计数。在一式两份的样品之间平均细胞计数。FGF21刺激细胞增殖，而煮沸的FGF21对细胞增殖没有影响(图1)。
[000309]实施例2：结肠癌细胞系表现出高FGF21表达水平
[000310]检验正常成体组织中和来自癌症和正常组织的一组细胞系中的FGF21mRNA水平(图2和3)。利用实时RT-PCR测定表达水平，针对持家基因GusB的RNA水平将RNA水平标准化。
[000311]将来自正常人成体器官的总RNA(Stratagene，La Jolla，CA)和来自培养细胞的总RNA，用oligo-dT18引物，在42℃逆转录1小时，然后94℃加热5分钟，总反应体积20μl(First-StrandTM cDNA Synthesis Kit，Clontech)。然后，使用获得的混合物作为模板，用于在
Figure A20088001703600701
仪器(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，Indiana)中PCR。
[000312]利用下列基因特异性引物实施PCR：
Gus-B：正向引物5′-CCTTTTGCGAGAGAGATACT-3′(SEQ ID NO：209)
逆向引物5′-CCTTTAGTGTTCCCTGCTAG-3′(SEQ ID NO：210)
FGF21：正向引物5′-GTCCTCTCCTGCAATTCGGG-3′(SEQ ID NO：211)
逆向引物5′-CGTCCCATCCTCCCTGATCT-3′(SEQ ID NO：212)
[000313]在每个Lightcycler毛细管中的20μl PCR反应混合物含有：2μl的10x PCR缓冲液II、3mM MgCl2(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、140μM dNTP、1∶50000的SYBR Green I、0.25mg/ml BSA、1单位Taq聚合酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indiana)、0.175μM各种引物和2μl RT反应混合物。PCR扩增开始于95℃ 20秒变性，然后45次循环的95℃变性5秒、60℃退火1秒和72℃延伸30秒。在终循环结束，将PCR产物在60℃退火5秒，然后以0.2℃/秒缓慢加热至95℃，测量特定PCR产物的解链曲线。所有实验都一式两份进行。利用具有定量和解链曲线选项的Lightcycler软件(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，Indiana)实施数据分析。
[000314]观察到在正常组织类型中，心脏组织表达最高水平的FGF21。因此，将表达水平评估成正常心FGF21表达的百分比。在LS174T细胞(人结肠直肠腺癌；与心脏相比56倍FGF21表达)、SW480细胞(人结肠直肠腺癌；与心脏相比31倍FGF21表达)、HCT116(人结肠直肠腺癌；与心脏相比4.6倍FGF21表达)和HCT15(人结肠直肠腺癌；与心脏相比181倍FGF21表达)中观察到最高的FGF21表达水平(图2)。
[000315]实施例3：FGF21序列特征
[000316]在FGF21鉴定一些SNP。
表1
  GenBank参考ID   核苷酸位置1(mRNA)   核苷酸改变   氨基酸位置2   氨基酸改变
  rs17851645   36   A to G   12   无
  rs3745712   325   C to T   109   Ala至Thr
  rs3745711   326   G to T   109   Ala至Asp
  rs3745710   420   G to A   140   无
  rs885662   516   G to C   172   无
  rs17856566   521   T to C   174   Leu至Pro
  rs838130   621   G to A   207   无
1：核苷酸位置对应于SEQ ID NO：1中的位置
2：氨基酸位置对应于SEQ ID NO：2中的位置
[000317]FGF21(参见例如，美国专利号6,716,626)和FGF19x(WO01/18209)在其N-末端相同(氨基酸1-148)，但在氨基酸149之后不同(图4)。FGF19x的C-末端从氨基酸149开始仅5个氨基酸长度(LQRLL)。FGF21的C-末端从氨基酸149开始是60个氨基酸长度。FGF21转录物具有4个外显子，编码区残基位于外显子2-4(外显子2：nt 1-235(密码子1-78)；外显子3：nt 236-339(密码子79-112)；外显子4：nt 340-630(密码子113-210))。FGF21包括mRNA转录物的完整的第四外显子，而FGF19x仅包括第四外显子的一部分。两种蛋白质的信号肽都位于氨基酸1-28。FGF21的FGF21受体结合结构域位于氨基酸45-165。
[000318]实施例4：FGF21表位
[000319]可以通过本领域已知的任何多种方法鉴定用于抗体识别和制备的FGF21线性表位。一些示例方法包括探测来自抗原氨基酸序列的肽的抗体结合能力。可以通过使用BIACORE或ELISA方法评估结合。其它技术包括将位于平面固体支持物(“芯片”)上的肽文库暴露给抗体，并通过在固相筛选中使用的任何多重方法(multiple methods)检测结合。此外，可以使用噬菌体展示来筛选肽文库，在若干轮生物淘洗(biopanning)后选择表位。
[000320]下表2提供了已经鉴定为适合抗-FGF21抗体识别的线性表位的FGF21(SEQ ID NO：2)的区域。
表2
  定位区域(aa)   表位长度   表位   aa seq位置 表位#   SEQ IDNO：
  45-63   8-mer   RQRYLYTD   45-52   1   3
  45-63   8-mer   QRYLYTDD   46-53   2   4
  45-63   8-mer   RYLYTDDA   47-54   3   5
  45-63   8-mer   YLYTDDAQ   48-55   4   6
  45-63   8-mer   LYTDDAQQ   49-56   5   7
  45-63   8-mer   YTDDAQQT   50-57   6   8
  45-63   8-mer   TDDAQQTE   51-58   7   9
  45-63   8-mer   DDAQQTEA   52-59   8   10
  45-63   8-mer   DAQQTEAH   53-60   9   11
  45-63   8-mer   AQQTEAHL   54-61   10   12
  45-63   8-mer   QQTEAHLE   55-62   11   13
  45-63   8-mer   QTEAHLEI   56-63   12   14
  45-63   9-mer   RQRYLYTDD   45-53   13   15
  45-63   9-mer   QRYLYTDDA   46-54   14   16
  45-63   9-mer   RYLYTDDAQ   47-55   15   17
  45-63   9-mer   YLYTDDAQQ   48-56   16   18
  45-63   9-mer   LYTDDAQQT   49-57   17   19
  45-63   9-mer   YTDDAQQTE   50-58   18   20
  45-63   9-mer   TDDAQQTEA   51-59   19   21
  45-63   9-mer   DDAQQTEAH   52-60   20   22
  45-63   9-mer   DAQQTEAHL   53-61   21   23
  45-63   9-mer   AQQTEAHLE   54-62   22   24
  45-63   9-mer   QQTEAHLEI   55-63   23   25
  45-63   10-mer   RQRYLYTDDA   45-54   24   26
  45-63   10-mer   QRYLYTDDAQ   46-55   25   27
  45-63   10-mer   RYLYTDDAQQ   47-56   26   28
  45-63   10-mer   YLYTDDAQQT   48-57   27   29
  45-63   10-mer   LYTDDAQQTE   49-58   28   30
  45-63   10-mer   YTDDAQQTEA   50-59   29   31
  45-63   10-mer   TDDAQQTEAH   51-60   30   32
  45-63   10-mer   DDAQQTEAHL   52-61   31   33
  45-63   10-mer   DAQQTEAHLE   53-62   32   34
  45-63   10-mer   AQQTEAHLEI   54-63   33   35
  71-90   8-mer   GAADQSPE   71-78   1   36
  71-90   8-mer   AADQSPES   72-79   2   37
  71-90   8-mer   ADQSPESL   73-80   3   38
  71-90   8-mer   DQSPESLL   74-81   4   39
  71-90   8-mer   QSPESLLQ   75-82   5   40
  71-90   8-mer   SPESLLQL   76-83   6   41
  71-90   8-mer   PESLLQLK   77-84   7   42
  71-90   8-mer   ESLLQLKA   78-85   8   43
  71-90   8-mer   SLLQLKAL   79-86   9   44
  71-90   8-mer   LLQLKALK   80-87   10   45
  71-90   8-mer   LQLKALKP   81-88   11   46
  71-90   8-mer   QLKALKPG   82-89   12   47
  71-90   8-mer   LKALKPGV   83-90   13   48
  71-90   9-mer   GAADQSPES   71-79   14   49
  71-90   9-mer   AADQSPESL   72-80   15   50
  71-90   9-mer   ADQSPESLL   73-81   16   51
  71-90   9-mer   DQSPESLLQ   74-82   17   52
  71-90   9-mer   QSPESLLQL   75-83   18   53
  71-90   9-mer   SPESLLQLK   76-84   19   54
  71-90   9-mer   PESLLQLKA   77-85   20   55
  71-90   9-mer   ESLLQLKAL   78-86   21   56
  71-90   9-mer   SLLQLKALK   79-87   22   57
  71-90   9-mer   LLQLKALKP   80-88   23   58
  71-90   9-mer   LQLKALKPG   81-89   24   59
  71-90   9-mer   QLKALKPGV   82-90   25   60
  71-90   10-mer   GAADQSPESL   71-80   26   61
  71-90   10-mer   AADQSPESLL   72-81   27   62
  71-90   10-mer   ADQSPESLLQ   73-82   28   63
  71-90   10-mer   DQSPESLLQL   74-83   29   64
  71-90   10-mer   QSPESLLQLK   75-84   30   65
  71-90   10-mer   SPESLLQLKA   76-85   31   66
  71-90   10-mer   PESLLQLKAL   77-86   32   67
  71-90   10-mer   ESLLQLKALK   78-87   33   68
  71-90   10-mer   SLLQLKALKP   79-88   34   69
  71-90   10-mer   LLQLKALKPG   80-89   35   70
  71-90   10-mer   LQLKALKPGV   81-90   36   71
  101-119   8-mer   FLCQRPDG   101-108   1   72
  101-119   8-mer   LCQRPDGA   102-109   2   73
  101-119   8-mer   CQRPDGAL   103-110   3   74
  101-119   8-mer   QRPDGALY   104-111   4   75
  101-119   8-mer   RPDGALYG   105-112   5   76
  101-119   8-mer   PDGALYGS   106-113   6   77
  101-119   8-mer   DGALYGSL   107-114   7   78
  101-119   8-mer   GALYGSLH   108-115   8   79
  101-119   8-mer   ALYGSLHF   109-116   9   80
  101-119   8-mer   LYGSLHFD   110-117   10   81
  101-119   8-mer   YGSLHFDP   111-118   11   82
  101-119   8-mer   GSLHFDPE   112-119   12   83
  101-119   9-mer   FLCQRPDGA   101-109   13   84
  101-119   9-mer   LCQRPDGAL   102-110   14   85
  101-119   9-mer   CQRPDGALY   103-111   15   86
  101-119   9-mer   QRPDGALYG   104-112   16   87
  101-119   9-mer   RPDGALYGS   105-113   17   88
  101-119   9-mer   PDGALYGSL   106-114   18   89
  101-119   9-mer   DGALYGSLH   107-115   19   90
  101-119   9-mer   GALYGSLHF   108-116   20   91
  101-119   9-mer   ALYGSLHFD   109-117   21   92
  101-119   9-mer   LYGSLHFDP   110-118   22   93
  101-119   9-mer   YGSLHFDPE   111-119   23   94
  101-119   10-mer   FLCQRPDGAL   101-110   24   95
  101-119   10-mer   LCQRPDGALY   102-111   25   96
  101-119   10-mer   CQRPDGALYG   103-112   26   97
  101-119   10-mer   QRPDGALYGS   104-113   27   98
  101-119   10-mer   RPDGALYGSL   105-114   28   99
  101-119   10-mer   PDGALYGSLH   106-115   29   100
  101-119   10-mer   DGALYGSLHF   107-116   30   101
  101-119   10-mer   GALYGSLHFD   108-117   31   102
  101-119   10-mer   ALYGSLHFDP   109-118   32   103
  101-119   10-mer   LYGSLHFDPE   110-119   33   104
  136-170   8-mer   QSEAHGLP   136-143   1   105
  136-170   8-mer   SEAHGLPL   137-144   2   106
  136-170   8-mer   EAHGLPLH   138-145   3   107
  136-170   8-mer   AHGLPLHL   139-146   4   108
  136-170   8-mer   HGLPLHLP   140-147   5   109
  136-170   8-mer   GLPLHLPG   141-148   6   110
  136-170   8-mer   LPLHLPGN   142-149   7   111
  136-170   8-mer   PLHLPGNK   143-150   8   112
  136-170   8-mer   LHLPGNKS   144-151   9   113
  136-170   8-mer   HLPGNKSP   145-152   10   114
  136-170   8-mer   LPGNKSPH   146-153   11   115
  136-170   8-mer   PGNKSPHR   147-154   12   116
  136-170   8-mer   GNKSPHRD   148-155   13   117
  136-170   8-mer   NKSPHRDP   149-156   14   118
  136-170   8-mer   KSPHRDPA   150-157   15   119
  136-170   8-mer   SPHRDPAP   151-158   16   120
  136-170   8-mer   PHRDPAPR   152-159   17   121
  136-170   8-mer   HRDPAPRG   153-160   18   122
  136-170   8-mer   RDPAPRGP   154-161   19   123
  136-170   8-mer   DPAPRGPA   155-162   20   124
  136-170   8-mer   PAPRGPAR   156-163   21   125
  136-170   8-mer   APRGPARF   157-164   22   126
  136-170   8-mer   PRGPARFL   158-165   23   127
  136-170   8-mer   RGPARFLP   159-166   24   128
  136-170   8-mer   GPARFLPL   160-167   25   129
  136-170   8-mer   PARFLPLP   161-168   26   130
  136-170   8-mer   ARFLPLPG   162-169   27   131
  136-170   8-mer   RFLPLPGL   163-170   28   132
  136-170   9-mer   QSEAHGLPL   136-144   29   133
  136-170   9-mer   SEAHGLPLH   137-145   30   134
  136-170   9-mer   EAHGLPLHL   138-146   31   135
  136-170   9-mer   AHGLPLHLP   139-147   32   136
  136-170   9-mer   HGLPLHLPG   140-148   33   137
  136-170   9-mer   GLPLHLPGN   141-149   34   138
  136-170   9-mer   LPLHLPGNK   142-150   35   139
  136-170   9-mer   PLHLPGNKS   143-151   36   140
  136-170   9-mer   LHLPGNKSP   144-152   37   141
  136-170   9-mer   HLPGNKSPH   145-153   38   142
  136-170   9-mer   LPGNKSPHR   146-154   39   143
  136-170   9-mer   PGNKSPHRD   147-155   40   144
  136-170   9-mer   GNKSPHRDP   148-156   41   145
  136-170   9-mer   NKSPHRDPA   149-157   42   146
  136-170   9-mer   KSPHRDPAP   150-158   43   147
  136-170   9-mer   SPHRDPAPR   151-159   44   148
  136-170   9-mer   PHRDPAPRG   152-160   45   149
  136-170   9-mer   HRDPAPRGP   153-161   46   150
  136-170   9-mer   RDPAPRGPA   154-162   47   151
  136-170   9-mer   DPAPRGPAR   155-163   48   152
  136-170   9-mer   PAPRGPARF   156-164   49   153
  136-170   9-mer   APRGPARFL   157-165   50   154
  136-170   9-mer   PRGPARFLP   158-166   51   155
  136-170   9-mer   RGPARFLPL   159-167   52   156
  136-170   9-mer   GPARFLPLP   160-168   53   157
  136-170   9-mer   PARFLPLPG   161-169   54   158
  136-170   9-mer   ARFLPLPGL   162-170   55   159
  136-170   10-mer   QSEAHGLPLH   136-145   56   160
  136-170   10-mer   SEAHGLPLHL   137-146   57   161
  136-170   10-mer   EAHGLPLHLP   138-147   58   162
  136-170   10-mer   AHGLPLHLPG   139-148   59   163
  136-170   10-mer   HGLPLHLPGN   140-149   60   164
  136-170   10-mer   GLPLHLPGNK   141-150   61   165
  136-170   10-mer   LPLHLPGNKS   142-151   62   166
  136-170   10-mer   PLHLPGNKSP   143-152   63   167
  136-170   10-mer   LHLPGNKSPH   144-153   64   168
  136-170   10-mer   HLPGNKSPHR   145-154   65   169
  136-170   10-mer   LPGNKSPHRD   146-155   66   170
  136-170   10-mer   PGNKSPHRDP   147-156   67   171
  136-170   10-mer   GNKSPHRDPA   148-157   68   172
  136-170   10-mer   NKSPHRDPAP   149-158   69   173
  136-170   10-mer   KSPHRDPAPR   150-159   70   174
  136-170   10-mer   SPHRDPAPRG   151-160   71   175
  136-170   10-mer   PHRDPAPRGP   152-161   72   176
  136-170   10-mer   HRDPAPRGPA   153-162   73   177
  136-170   10-mer   RDPAPRGPAR   154-163   74   178
  136-170   10-mer   DPAPRGPARF   155-164   75   179
  136-170   10-mer   PAPRGPARFL   156-165   76   180
  136-170   10-mer   APRGPARFLP   157-166   77   181
  136-170   10-mer   PRGPARFLPL   158-167   78   182
  136-170   10-mer   RGPARFLPLP   159-168   79   183
  136-170   10-mer   GPARFLPLPG   160-169   80   184
  136-170   10-mer   PARFLPLPGL   161-170   81   185
  196-209   8-mer   MVGPSQGR   196-203   1   186
  196-209   8-mer   VGPSQGRS   197-204   2   187
  196-209   8-mer   GPSQGRSP   198-205   3   188
  196-209   8-mer   PSQGRSPS   199-206   4   189
  196-209   8-mer   SQGRSPSY   200-207   5   190
  196-209   8-mer   QGRSPSYA   201-208   6   191
  196-209   8-mer   GRSPSYAS   202-209   7   192
  196-209   9-mer   MVGPSQGRS   196-204   8   193
  196-209   9-mer   VGPSQGRSP   197-205   9   194
  196-209   9-mer   GPSQGRSPS   198-206   10   195
  196-209   9-mer   PSQGRSPSY   199-207   11   196
  196-209   9-mer   SQGRSPSYA   200-208   12   197
  196-209   9-mer   QGRSPSYAS   201-209   13   198
  196-209   10-mer   MVGPSQGRSP   196-205   14   199
  196-209   10-mer   VGPSQGRSPS   197-206   15   200
  196-209   10-mer   GPSQGRSPSY   198-207   16   201
  196-209   10-mer   PSQGRSPSYA   199-208   17   202
  196-209   10-mer   SQGRSPSYAS   200-209   18   203
[000321]位于氨基酸45-63的表位代表了FGF21的区域1中的表位(Pfam登录号PF00167，结构域序列的起始)；位于氨基酸71-90的表位代表了FGF21的区域3中的表位(Pfam登录号PF00167)；位于氨基酸101-119的表位代表了FGF21的区域4中的表位(Pfam登录号PF00167)；位于氨基酸136-170的表位代表了FGF21的区域2中的表位(Pfam登录号PF00167，结构域序列的结束)；而位于氨基酸196-209的表位代表了FGF21的区域5中的表位(C-末端)。
[000322]虽然本发明是根据其特定实施方案描述的，但本领域技术人员应该理解，可以在不脱离发明的真实意图和范围内产生多种改变和替换等价方案。此外，针对本发明的对象、意图和范围，可以进行多种修饰来调整特定情形、材料、物质组成、过程、过程步骤或步骤。所有此类修饰都意在本发明的范围内。
序列表
<110>诺瓦提斯公司(Novartis AG)
<120>治疗、诊断和检测FGF21-相关疾病的方法
<130>20366-065WO1
<150>US 60/939,512
<151>2007-05-22
<160>212
<170>FastSEQ for Windows版本4.0
<210>1
<211>630
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt 60
cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc 120
gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac 180
ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc 240
ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg 300
ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc 360
tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac 420
ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag tccccacacc gggaccctgc accccgagga 480
ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc 540
ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc 600
cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga                                  630
<210>2
<211>209
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
 1               5                  10                  15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
            20                  25                  30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
        35                  40                  45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
    50                  55                  60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
                85                  90                  95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
            100                 105                 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
        115                 120                 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
    130                 135                 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
                165                 170                 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
            180                 185                 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
        195                 200                 205
Ser
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>3
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp
 1               5
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>4
Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
 1               5
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>5
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala
 1               5
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>6
Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln
 1               5
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>7
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln
 1               5
<210>8
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>8
Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
 1               5
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>9
Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu
 1               5
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>10
Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
 1               5
<210>11
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>11
Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
 1               5
<210>12
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>12
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu
 1               5
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>13
Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
 1               5
<210>14
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>14
Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile
 1               5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
 1               5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>16
Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala
 1               5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>17
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln
 l               5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>18
Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln
 1               5
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>19
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
 1               5
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>20
Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu
 1               5
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>21
Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
 1               5
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>22
Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
 1               5
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>23
Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu
 1               5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>24
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
 1               5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>25
Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile
 1               5
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>26
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
 1               5
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>27
Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln
 1               5                  10
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>28
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln
 1               5                  10
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>29
Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
 1               5                  10
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>30
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu
 1               5                  10
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>31
Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala
 1               5                  10
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>32
Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
 1               5                  10
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>33
Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu
 1               5                  10
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>34
Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
 1               5                  10
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>35
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile
 1               5                   10
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>36
Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
 1               5
<210>37
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>37
Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser
 1               5
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>38
Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
 1               5
<210>39
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>39
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu
 1               5
<210>40
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>40
Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln
 1               5
<210>41
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>41
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu
 1               5
<210>42
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>42
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys
 1               5
<210>43
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>43
Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
 1               5
<210>44
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>44
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu
 1               5
<210>45
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>45
Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys
 1               5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>46
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro
 1               5
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>47
Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
 1               5
<210>48
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>48
Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val
 1               5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>49
Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser
 1               5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>50
Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
 1               5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>51
Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu
 1               5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>52
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln
 1               5
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>53
Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu
 1               5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>54
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys
 1               5
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>55
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
 1               5
<210>56
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>56
Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu
 1               5
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>57
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys
 1               5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>58
Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro
 1               5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>59
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
 1               5
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>60
Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val
 1               5
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>61
Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
 1               5                  10
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>62
Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu
 1               5                  10
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>63
Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln
 1               5                  10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>64
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu
 1               5                  10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>65
Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys
 1               5                  10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>66
Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
 1               5                  10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>67
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu
 1               5                  10
<210>68
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>68
Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys
 1               5                  10
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>69
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro
 1               5                  10
<210>70
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>70
Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
 1               5                  10
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>71
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val
 1               5                  10
<210>72
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>72
Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
 1               5
<210>73
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>73
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala
 1               5
<210>74
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>74
Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
 1               5
<210>75
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>75
Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr
 1               5
<210>76
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>76
Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
 1               5
<210>77
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>77
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser
 1               5
<210>78
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>78
Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu
 1               5
<210>79
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>79
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His
 1               5
<210>80
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe
 1               5
<210>81
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>81
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
 1               5
<210>82
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>82
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro
 1               5
<210>83
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>83
Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu
 1               5
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>84
Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala
 1               5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>85
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
 1               5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>86
Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr
 1               5
<210>87
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>87
Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
 1               5
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>88
Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser
 1               5
<210>89
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>89
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu
 1               5
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>90
Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His
 1               5
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>91
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe
 1               5
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>92
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
 1               5
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>93
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro
 1               5
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>94
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu
 1               5
<210>95
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>95
Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
 1               5                  10
<210>96
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>96
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr
 1               5                  10
<210>97
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>97
Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
 1               5                  10
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>98
Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser
 1               5                  10
<210>99
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>99
Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu
 1               5                  10
<210>100
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>100
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His
 1               5                  10
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>101
Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe
 1               5                  10
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>102
Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
 1               5                  10
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>103
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro
 1               5                  10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>104
Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu
 1               5                  10
<210>105
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>105
Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro
 1               5
<210>106
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>106
Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
 1               5
<210>107
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>107
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His
 1               5
<210>108
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>108
Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu
 1               5
<210>109
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>109
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro
 1               5
<210>110
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly
 1               5
<210>111
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>111
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
 1               5
<210>112
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>112
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys
 1               5
<210>113
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>113
Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser
 1               5
<210>114
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>114
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro
 1               5
<210>115
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>115
Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
 1               5
<210>116
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>116
Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg
 1               5
<210>117
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>117
Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
 1               5
<210>118
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>118
Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
 1               5
<210>119
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>119
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala
 1               5
<210>120
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>120
Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
 1               5
<210>121
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>121
Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg
 1               5
<210>122
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>122
His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
 1               5
<210>123
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>123
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro
 1               5
<210>124
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>124
Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala
 1               5
<210>125
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>125
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg
 1               5
<210>126
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>126
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe
 1               5
<210>127
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>127
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
 1               5
<210>128
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>128
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro
 1               5
<210>129
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>129
Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu
 1               5
<210>130
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>130
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro
 1               5
<210>131
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>131
Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
 1               5
<210>132
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>132
Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu
 1               5
<210>133
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>133
Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
 1               5
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>134
Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His
 1               5
<210>135
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>135
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu
 1               5
<210>136
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>136
Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro
 1               5
<210>137
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>137
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly
 1               5
<210>138
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>138
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
 1               5
<210>139
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>139
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys
 1               5
<210>140
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>140
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser
 1               5
<210>141
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>141
Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro
 1               5
<210>142
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>142
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
 1               5
<210>143
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>143
Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg
 1               5
<210>144
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>144
Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
 1               5
<210>145
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>145
Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
 1               5
<210>146
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>146
Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala
 1               5
<210>147
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>147
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
 1               5
<210>148
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>148
Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg
 1               5
<210>149
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>149
Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
 1               5
<210>150
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>150
His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro
 1               5
<210>151
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>151
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala
 1               5
<210>152
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>152
Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg
 1               5
<210>153
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>153
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe
 1               5
<210>154
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>154
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
 1               5
<210>155
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>155
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro
 1               5
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>156
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu
 1               5
<210>157
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>157
Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro
 1               5
<210>158
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>158
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
 1               5
<210>159
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>159
Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu
 1               5
<210>160
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>160
Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His
 1               5                  10
<210>161
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>161
Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu
1                5                  10
<210>162
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>162
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro
 1               5                  10
<210>163
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>163
Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly
 1               5                  10
<210>164
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>164
His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
 1               5                  10
<210>165
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>165
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys
 1               5                  10
<210>166
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>166
Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser
 1               5                  10
<210>167
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>167
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro
 1               5                  10
<210>168
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>168
Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
1                5                  10
<210>169
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>169
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg
 1               5                  10
<210>170
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>170
Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp
 1               5                  10
<210>171
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>171
Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
 1               5                  10
<210>172
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>172
Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala
 1               5                  10
<210>173
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>173
Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
 1               5                  10
<210>174
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>174
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg
 1               5                  10
<210>175
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>175
Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
 1               5                  10
<210>176
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>176
Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro
 1               5                  10
<210>177
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>177
His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala
 1               5                  10
<210>178
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>178
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg
 1               5                  10
<210>179
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>179
Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe
 1               5                  10
<210>180
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>180
Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
 1               5                  10
<210>181
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>181
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro
 1               5                  10
<210>182
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>182
Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu
 1               5                  10
<210>183
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>183
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro
 1               5                  10
<210>184
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>184
Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
 1               5                  10
<210>185
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>185
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu
 1               5                  10
<210>186
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>186
Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg
 1               5
<210>187
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>187
Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
 1               5
<210>188
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>188
Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro
 1               5
<210>189
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>189
Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
 1               5
<210>190
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>190
Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
 1               5
<210>191
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>191
Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
 1               5
<210>192
<211>8
<212>PRT
<213>人
<400>192
Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
 1               5
<210>193
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>193
Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
 1               5
<210>194
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>194
Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro
 1               5
<210>195
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>195
Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
 1               5
<210>196
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>196
Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
 1               5
<210>197
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>197
Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
 1               5
<210>198
<211>9
<212>PRT
<213>人
<400>198
Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
 1               5
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<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>199
Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro
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<210>200
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>200
Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
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<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>201
Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
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<210>202
<211>10
<212>PRT
<213>人
<400>202
Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
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<211>10
<212>PRT
<213>人
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Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
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<211>15
<212>PRT
<213>人
<220>
<223>引物
<400>204
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile
 1               5                  10                  15
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<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>205
Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu
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Lys Pro Gly Val
            20
<210>206
<211>19
<212>PRT
<213>人
<400>206
Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe
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Asp Pro Glu
<210>207
<211>35
<212>PRT
<213>人
<400>207
Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser
 1               5                  10                  15
Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu
            20                  25                  30
Pro Gly Leu
35
<210>208
<211>14
<212>PRT
<213>人
<400>208
Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
 1               5                  10
<210>209
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>209
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<211>20
<212>DNA
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<210>212
<211>20
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<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>212
cgtcccatcc tccctgatct    20

Claims (38)

1、在需要其的患者中治疗癌症或癌症症状的方法，其包括向患者施用治疗有效量的FGF21抑制剂。
2、在患者中调节FGF21-相关活性的方法，所述方法包括向患者施用有效的调节FGF21-相关的生物学活性的量的FGF21抑制剂。
3、调节表达FGF21的癌细胞中的一种或多种活性的方法，所述方法包括将细胞与有效调节活性的量的FGF21抑制剂接触。
4、在患者中抑制两个或多个表达FGF21的癌细胞的相互作用的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的FGF21抑制剂。
5、权利要求1-4的任一项的方法，其中FGF21抑制剂选自：
(a)与FGF21的胞外结构域(ECD)中的表位选择性结合的抗体；
(b)分离的双链RNA(dsRNA)，其包括第一链核苷酸和第二链核苷酸，所述第一链核苷酸包括SEQ ID NO：1、211和212所示序列或其完全互补的序列的至少19个连续的核苷酸，所述第二链核苷酸包括与第一链基本互补的序列，其中dsRNA分子少于627个核苷酸长；
(c)分离的核酸分子，其包括与选自SEQ ID NO：1、211和212的序列，或其完全互补的序列至少90％同一的序列的至少10个连续的核苷酸；
(d)小分子；
(e)模拟物；
(f)可溶性受体；和
(g)诱饵。
6、权利要求1、2或4任一项的方法，其还包括向患者施用常规的癌症治疗。
7、权利要求1-4中任一项的方法，其中与对照相比，FGF21抑制剂将FGF21表达降低至少30％。
8、权利要求1-4中任一项的方法，其中与对照相比，FGF21抑制剂导致表达FGF21的癌细胞群体中至少30％的细胞凋亡。
9、权利要求3或4中任一项的方法，其中癌细胞是内皮细胞。
10、权利要求3或4中任一项的方法，其中癌细胞是结肠癌细胞。
11、权利要求1-4中任一项的方法，其中FGF21抑制剂是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体或Fab片段。
12、权利要求11的方法，其中抗体特异性的结合选自SEQ IDNO：3-203的FGF21的一个或多个表位。
13、权利要求11的方法，其中抗体特异性的结合FGF21的FGF受体结合结构域的一个或多个表位，所述一个或多个表位选自SEQ IDNO：3-180。
14、权利要求11的方法，其中抗体特异性的结合FGF21的C-末端结构域的一个或多个表位，所述一个或多个表位选自SEQ ID NO：118-203。
15、权利要求11的方法，其中抗体特异性的结合由FGF21mRNA的外显子3编码的FGF21多肽中的一个或多个表位，所述一个或多个表位选自SEQ ID NO：26-76。
16、权利要求11的方法，其中抗体特异性的结合FGF21免疫原性区域中的一个或多个表位，所述免疫原性区域选自免疫原性区域1、2、3、4和5。
17、权利要求1的方法，其中所述癌症症状选自体重减轻、贫血、腹痛、肠梗阻、便血、腹泻、便秘、肠习惯的其它改变，和结肠转移。
18、鉴定癌症抑制剂的方法，其中癌症的特征是与对照相比FGF21的差异表达，所述方法包括将表达FGF21的细胞与候选化合物接触，并且确定是否调节了FGF21-相关的活性，其中FGF21-相关活性的调节表示候选化合物是癌症抑制剂。
19、鉴定癌症抑制剂的方法，所述癌症的特征是与对照相比FGF21的差异表达，所述方法包括将表达FGF21的细胞与候选化合物接触，并且确定是否调节了FGF21的下游标志物的活性，其中下游标志物的调节表示候选化合物是癌症抑制剂。
20、在需要其的患者中治疗血管疾病或血管疾病的症状的方法，其包括向患者施用治疗有效量的FGF21调节剂。
21、权利要求20的方法，其中与对照相比，FGF21调节剂将患者中的细胞增殖上调至少30％。
22、权利要求20的方法，其中FGF21调节剂上调一种或多种FGF21-相关的活性。
23、鉴定血管疾病的抑制剂的方法，所述方法包括将表达FGF21的细胞样品与候选化合物接触，并且确定是否调节了FGF21-相关的活性，其中FGF21-相关活性的调节表示候选化合物是血管疾病的抑制剂。
24、权利要求20或23的方法，其中血管疾病是冠状动脉病、外周动脉病、动脉粥样硬化、腹主动脉瘤、血块、深静脉血栓形成、静脉停滞病、静脉炎或静脉曲张。
25、权利要求2、3或22任一项的方法，其中FGF21-相关活性选自细胞增殖、血管发生、血管形成、细胞信号传导、激酶活性、脂肪细胞摄入葡萄糖、FGF21与FGFR-1或FGFR-2之一或两者之间的相互作用，FGFR-1或FGFR-2蛋白质的磷酸化，和凋亡。
26、组合物，其包括成纤维细胞生长因子21(FGF21)调节剂和一种或多种可药用的载体，其中，FGF21调节剂是分离的双链RNA(dsRNA)；分离的寡核苷酸，其包括SEQ ID NO：1的序列的至少10个连续的核苷酸；与FGF21的结构域中的表位结合的抗体，所述结构域选自信号肽结构域和FGF受体结合结构域；小分子；模拟物；可溶性受体；或诱饵。
27、权利要求26的组合物，其中FGF21调节剂是FGF21抑制剂。
28、权利要求26的组合物，其中FGF21调节剂是FGF21活化剂。
29、权利要求26的组合物，其中组合物调节至少一种FGF21-相关活性，所述活性选自细胞增殖、血管发生、血管形成、细胞信号传导、激酶活性、脂肪细胞摄入葡萄糖、癌细胞存活、FGF21与FGFR-1或FGFR-2之一或两者之间的相互作用，FGFR-1或FGFR-2蛋白质的磷酸化，和凋亡。
30、权利要求26的组合物，其中FGF21调节剂是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体或Fab片段。
31、权利要求30的组合物，其中抗体特异性的结合选自SEQ IDNO：3-203的FGF21的一个或多个表位。
32、权利要求30的组合物，其中抗体特异性的结合FGF21的FGF受体结合结构域的一个或多个表位，所述一个或多个表位选自SEQ IDNO：3-180。
33、权利要求30的组合物，其中抗体特异性的结合FGF21的C-末端结构域的一个或多个表位，所述一个或多个表位选自SEQ ID NO：118-203。
34、权利要求30的组合物，其中抗体特异性的结合由FGF21mRNA的外显子3编码的FGF21多肽中的一个或多个表位，所述一个或多个表位选自SEQ ID NO：26-76。
35、权利要求30的组合物，其中抗体特异性的结合FGF21免疫原性区域中的一个或多个表位，所述免疫原性区域选自免疫原性区域1、2、3、4和5。
36、权利要求30的组合物，其中抗体是标记的。
37、权利要求36的组合物，其中标记是酶、放射性同位素、毒素或荧光团。
38、权利要求26的组合物，其中FGF21调节剂是dsRNA分子，所述dsRNA分子包括第一链核苷酸和第二链核苷酸，所述第一链核苷酸包括SEQ ID NO：1的序列的至少19个连续的核苷酸，所述第二链核苷酸包括与第一链基本互补的序列，其中dsRNA分子少于627个核苷酸长。
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