CN107449715A - 活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法 - Google Patents
活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107449715A CN107449715A CN201610368392.6A CN201610368392A CN107449715A CN 107449715 A CN107449715 A CN 107449715A CN 201610368392 A CN201610368392 A CN 201610368392A CN 107449715 A CN107449715 A CN 107449715A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- living cells
- light
- analysis
- intracellular
- work
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
- G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
- G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement
- G01N2015/144—Imaging characterised by its optical setup
Abstract
本发明提供了活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法,具体地，本发明提供了一种活细胞胞内代谢分析仪，所述分析仪包括：光源装置，所述光源装置发出第一激发光，并将所述第一激发光导入活的生物细胞材料；显微成像装置，所述显微成像装置用于接收第一测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像；和控制装置，所述控制装置用于控制光源装置发射第一激发光；以及，处理所述图像装置所获得的第一信号，所述第一信号由所述第一测量光发出；并且，所述控制装置包括2个分析处理模块，分别为活细胞膜电势和温度的分析处理模块和活细胞内氧化还原势的分析处理模块。本发明的活细胞胞内代谢分析仪可直接对细胞胞内线粒体等代谢参数进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分析装置领域，具体地，涉及活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法。
背景技术
随着我国经济的快速发展，人们的膳食结构在几十年中完成了西方国家一、两百年才完成的膳食和疾病模式的转变。膳食中的营养素是构成和影响人体健康的重要物质，而大多数疾病也都是营养不平衡或者营养物质代谢紊乱所致，研究及分析营养素在生物体内的代谢途径，作用机制及调节成为预防和控制这些疾病的关键，活细胞代谢实时检测和分析设备能在微观层面更深入地探讨营养与代谢性疾病之间的关系，并将为生物学基础研究提供可靠的分析手段，为营养相关慢性疾病的预测、早期预防和营养干预提供新的策略和措施。
在单细胞和单分子水平上探讨细胞代谢的动态变化及相关生物学机制为生物学研究和药物筛选等所必需，这需要实现在活细胞水平进行代谢的检测。传统的生化技术无法观测到单个活细胞中代谢水平的变化及状况，通过光学或物理学观测手段则有可能实现。比如，目前在各类光学方法中，荧光成像方法可以实现对活细胞的非损伤性测量，如Seahorse细胞胞外代谢分析仪；利用物理学测量方法的，如Bionas细胞代谢分析仪。
目前，细胞代谢分析仪在科研、食品安全、医疗检测及制药领域有广泛的用途，如癌症细胞的代谢类型分析、免疫细胞形成的代谢前期、肥胖及糖尿病的代谢干预研究，以及神经退行性疾病的代谢标志等。除此之外，细胞代谢分析仪还能对心血管系统，内分泌系统、生殖泌尿系统及肌肉系统的各种细胞模型进行代谢研究，为精准医疗的诊断、干预及治疗提供参考。
然而，分别由美国和德国生产和销售的细胞代谢分析仪Seahorse和Bionas等这些仪器存在明显的缺陷，如功能简单且不能测定细胞内代谢参数，数据可靠性差，实验条件优化耗时，而且设备及耗材昂贵等诸多问题，很难满足当前生物学科研及应用工作的需求。
而目前国内尚无同类功能设备。从上所述可知，目前市面上的细胞代谢仪(如Seahorse和Bionas)仅能检测细胞外耗氧量、pH值或电阻的变化，而且仅能间接反映细胞内的代谢状况，在某些情况下缺乏相关性。考虑到线粒体是细胞内负责代谢的主要细胞器，线粒体膜电势和温度，胞内氧化还原势和细胞内pH值的变化等是直接反映细胞内代谢状况的参数。在定量分析方面，细胞胞外代谢仪(如Seahorse和Bionas)缺乏可信的参照，仅能用对照孔做为参考，这引入不可避免的实验误差(如细胞数目差异引入的误差等)，对操作人员有较高的要求，而且实验条件优化非常耗时。
因此，本领域迫切需要开发一种可以直接检测线粒体代谢参数的活细胞胞内代谢分析仪
发明内容
本发明的目的是提供一种可以直接检测线粒体代谢参数的活细胞胞内代谢分析仪。
本发明第一方面提供了一种活细胞胞内代谢分析仪，所述分析仪包括：
光源装置，所述光源装置发出第一激发光，并将所述第一激发光导入活的生物细胞材料，其中，所述第一激发光包括第一光谱辐射成分；
显微成像装置，所述显微成像装置用于接收第一测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像，其中，所述第一测量光由所述第一激发光与所述活的生物细胞材料相互作用后所产生；和
控制装置，所述控制装置用于控制光源装置发射第一激发光；以及，处理所述图像装置所获得的第一信号，所述第一信号由所述第一测量光发出；
并且，所述控制装置包括2个分析处理模块，分别为活细胞膜电势和温度的分析处理模块和活细胞内氧化还原势的分析处理模块，所述活细胞膜电势和温度的分析处理模块用于分析活细胞膜电势和温度的变化情况，所述活细胞内氧化还原势的分析处理模块用于分析活细胞内氧化还原势的变化情况。
在另一优选例中，所述显微成像装置还用于接收第二测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像，其中，所述第二测量光由所述第一激发光与所述活的生物细胞材料相互作用后所产生。
在另一优选例中，所述控制装置用于控制光源装置发射第一激发光；以及，处理所述图像装置所获得的第二信号，所述第二信号由所述第二测量光发出。
在另一优选例中，所述光源装置包括激光发射元件和光学装置。
在另一优选例中，所述光学装置包括双通道分光器件、透镜、反光镜、和物镜，用于将所述第一激发光聚焦到所述活的生物细胞材料上。
在另一优选例中，所述分析仪还包括焦面防漂移系统。
在另一优选例中，所述相互作用指激发产生荧光。
在另一优选例中，所述控制装置还包括活细胞内的pH的分析处理模块，用于分析活细胞内的pH的变化情况。
在另一优选例中，所述活细胞膜电势和温度的分析是亚细胞结构的温度分析；较佳地，所述亚细胞结构选自下组：线粒体、细胞膜、或其组合。
在另一优选例中，所述亚细胞结构包括线粒体。
在另一优选例中，所述细胞内氧化还原势包括线粒体的氧化还原势。
在另一优选例中，所述分析仪还包括载物平台，用来支撑所述活的生物细胞材料。
在另一优选例中，所述载物平台为电动载物平台。
在另一优选例中，所述活的生物细胞材料包括含有细胞内源性代谢小分子的台氏(Tyrode)溶液。
在另一优选例中，所述细胞内源性代谢小分子选自下组：黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form ofnicotinamide-adenine dinucleotid，NADH)、或其组合。
在另一优选例中，所述活的生物细胞材料包括含有温敏染料的台氏溶液。
在另一优选例中，所述温敏染料选自下组：Rhodamine B-ME、TMRM、Rhodamine800、Rhodamine 101-AM、Rhodamine 101-ME、或其组合。
在另一优选例中，所述活的生物细胞材料选自下组：褐色脂肪细胞、肝细胞、肾细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述活的生物细胞材料包括含有pH敏感染料的台氏溶液。
在另一优选例中，所述pH敏感染料选自下组：SNARF-1-AM(AcetoxymethylEster)、SNARF-5F-AM、SNARF-4F-AM、BCECF-AM、BCEF-AM、pHrodo-Green-AM、pHrodo-Red-AM、或其组合。
在另一优选例中，所述活的生物细胞中还包括诱导剂，用于诱导胞内指标的变化。
在另一优选例中，所述胞内指标包括：氧化还原势、膜电势和温度、和pH值。
在另一优选例中，所述氧化还原势的变化指FAD与FAD+NADH的比值变化。
在另一优选例中，所述FAD指所述活的生物细胞材料受到所述第一激发光激发后，FAD发出的一定波长的自发荧光值；NADH指所述活的生物细胞材料受到所述第一激发光激发后，FAD和NADH发出的一定波长的自发荧光值。
在另一优选例中，所述第一激发光波长为400－700nm，较佳地，410－680nm，更佳地，420－520nm，最佳地，430nm时，FAD的自发荧光波长范围为525-575nm。
在另一优选例中，所述第一激发光波长为300-400nm，较佳地，300-380nm，更佳地，300-360nm，最佳地，340nm时，FAD和NADH的自发荧光波长范围＞420nm。
在另一优选例中，所述温度的变化指Rh800与RhB-ME的比值变化，Rh800单通道荧光信号可以反映线粒体膜电势的变化，其中，Rh800指含有Rh800的所述活的生物细胞材料受到所述第一激发光激发后，所得到的一定波长的第一测量光值；RhB-ME指含有RhB-ME的所述活的生物细胞材料受到所述第一激发光激发后，所得到的一定波长的第一测量光值。
在另一优选例中，所述第一激发光波长范围为400－700nm，较佳地，500－680nm，更佳地，565－650nm，最佳地，559nm时，所述第一测量光的波长范围为560-780nm，较佳地，565-770nm，更佳地，575-620nm。
在另一优选例中，所述第一激发光波长范围为400－700nm，较佳地，410－680nm，更佳地，420－650nm，最佳地，635nm时，所述第一测量光的波长范围为640-780nm，较佳地，650-770nm，更佳地，655-755nm。
在另一优选例中，所述pH值变化指酸性荧光和碱性荧光的比值变化，其中，所述酸性荧光指所述活的生物细胞材料受到所述第一激发光激发后，所得到的反映酸化程度的一定波长的第一测量光值；所述碱性荧光指所述活的生物细胞材料受到所述第一激发光激发后，所得到的反映碱化程度的一定波长的第一测量光值。
在另一优选例中，所述第一激发光波长范围为400－700nm，较佳地，410－680nm，更佳地，420－650nm，最佳地，561nm时，反映酸化程度的第一测量光波长范围为400-780nm，较佳地，410-770nm，更佳地，575-600nm。
在另一优选例中，所述第一激发光波长范围为400－700nm，较佳地，410－680nm，更佳地，420－650nm，最佳地，561nm时，反映碱化程度的第一测量光波长范围为400-780nm，较佳地，410-770nm，更佳地，600-675nm。
在另一优选例中，所述第二测量光的波长范围可以与所述第一测量光的波长范围相同，也可以不同。
在另一优选例中，所述诱导剂选自下组：去甲肾上限素、肾上限素等交感神经递质及其类似物、PGE2等炎性因子、葡萄糖等营养小分子，或其组合。
在另一优选例中，所述第一激发光沿着公共入射光束路径撞击到所述活的生物细胞材料上，并且所述第一测量光和/或所述第二测量光沿着公共出射光束路径离开所述活的生物细胞材料，其中，所述公共入射光束路径和所述公共出射光束路径相对于彼此是共线的。
本发明第二方面提供了一种活细胞胞内代谢分析的方法，包括步骤：
(i)提供一活的生物细胞材料，所述活的细胞生物材料含有用于检测活细胞胞内代谢的检测试剂；
(ii)将光源装置发出的第一激发光导入活的生物细胞材料，其中，所述第一激发光包括第一光谱辐射成分；并用显微成像装置接收第一和/或第二测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像，其中，所述第一和/或第二测量光由所述第一激发光与所述活的生物细胞材料相互作用后所产生；
借助于控制装置控制光源装置发射第一激发光；以及
处理所述图像装置所获得的第一和/或第二信号，所述第一和/或第二信号由所述第一和/或第二测量光发出；
并且，所述控制装置包括2个分析处理模块，分别为活细胞膜电势和温度的分析处理模块和活细胞内氧化还原势的分析处理模块，所述活细胞膜电势和温度的分析处理模块用于分析活细胞膜电势和温度的变化情况，所述活细胞内氧化还原势的分析处理模块用于分析活细胞内氧化还原势的变化情况。
在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：含有细胞内源性有自发荧光的代谢小分子、含有温敏染料的台氏溶液、含有pH敏感染料的台氏溶液、或其组合。
在另一优选例中，所述检测试剂还包括诱导剂，所述诱导剂选自下组：去甲肾上限素、肾上限素等交感神经递质及其类似物、PGE2等炎性因子、葡萄糖等营养小分子、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了小型化细胞胞内代谢分析仪检测核心模块设计图。
图2显示了细胞胞内代谢分析仪能成功检测褐色脂肪细胞的线粒体膜电势和温度，胞内氧化还原势和细胞内pH值的变化等能直接反映细胞内代谢状况的参数。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可直接检测线粒体膜电势和温度、胞内氧化还原势和细胞内pH值的变化等能直接反映细胞内代谢状况的参数的活细胞胞内代谢分析仪。本发明结合非损伤性的活细胞标记方法，如细胞膜可通透性的荧光染料及细胞自发荧光，检测细胞内和线粒体的代谢参数，从而实现细胞胞内代谢分析。在此基础上，本发明人完成了本发明。
具体地，在本发明中，用温敏染料(如罗丹明B-ME和罗丹明800)检测线粒体的温度；采用EMCCD高灵敏度检测器检测细胞胞内FAD和NADH的自发荧光信号，从而判断氧化还原势的变化；用pH敏感染料检测细胞胞内pH。
本发明的主要优点包括：
(1)将荧光化学、光学物理及活细胞检测技术整合为一体的半自动分析设备；
(2)系统采用模块化设计，利于系统的小型化、定制和升级；
(3)灵敏度高，能检测活细胞自发荧光的变化；
(4)能够实现在线实时监测；
(5)数据都使用双通道比率数值，减少系统和实验误差，结果更加准确；
(6)使用成本低，无需购置昂贵的耗材。
(7)本发明的活细胞胞内代谢分析仪可以同时检测3种胞内线粒体等代谢参数，分别为活细胞的线粒体膜电势和温度；活细胞的胞内氧化还原势；和/或活细胞的胞内pH值的变化。
活细胞胞内代谢分析仪
本发明提供了一种活细胞胞内代谢分析仪，所述分析仪包括：
光源装置，所述光源装置发出第一照明光，并将所述第一照明光导入活的生物细胞材料，其中，所述第一照明光包括第一光谱辐射成分；
显微成像装置，所述显微成像装置用于接收第一测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像，其中，所述第一测量光由所述第一照明光与所述活的生物细胞材料相互作用后所产生；和
控制装置，所述控制装置用于：
控制光源装置发射第一照明光；以及
处理所述图像装置所获得的第一信号，所述第一信号由所述第一测量光发出；
并且，所述控制装置包括2个分析处理模块，分别为活细胞膜电势和温度的分析处理模块和活细胞内氧化还原势的分析处理模块，所述活细胞膜电势和温度的分析处理模块用于分析活细胞膜电势和温度的变化情况，所述活细胞内氧化还原势的分析处理模块用于分析活细胞内氧化还原势的变化情况。
如图1所示。本发明的活细胞胞内代谢分析仪可采取模块化设计，实现设备的小型化，定量检测的优化及固化，各种光学器件的设计、加工和验证等。
本发明的活细胞胞内代谢分析仪，系统核心可以安装在约0.6x 0.6x 1米的空间内，针对需要测定的细胞胞内多代谢参数，优化特定配置实现功能固化，为下一代细胞胞内代谢分析仪的研发提供小型化的原型机，为进一步降低成本提供基础。
如图1所示。荧光激发光源由单色仪、LED光源或激光器组成，通过二色分光镜(Dichroic Mirror，DM)或光纤合束，利用多通道模拟信号或声光调制器(Acousticoptical modulator，AOM)快速选择输出波长以及激光功率，并通过一组透镜及反光镜引入倒置或正置荧光显微镜的后光口，同时激光束聚焦到物镜的背焦面，构成激发光光路。系统中的荧光显微镜需配置电动Z轴及焦面防漂移系统，防止在长时间采集荧光图片的过程中发生离焦现象，同时配置电动载物台有助于快速精准地在XY方向定位感兴趣的多点参数。显微镜成像上端口或左端口安装分光器件(如分光镜或分光器DualCam)，连接的两台EMCCD或sCMOS高灵敏度检测器可以快速采集多染样品的荧光图像，实现数据的归一化处理及分析；配合激光谱线的高速切换，分别做单个或多个细胞胞内代谢参数的测定。
此外，主要电动器件都通过自编控制模块实现统一控制；检测器数据利用基于USB或火线接口对工作参数和采集数据进行分析。本发明的活细胞胞内代谢分析仪可开发两种测试方式，一种自动模式，只需在界面表格中选择测试信息，系统自动设置进行测试；另一种专家模式(科研用户)，可以根据研究实际需要，可以调整测试的参数，如微环境温度、线粒体温度及膜电压、氧化还原势、pH和测试时间等。
本发明的活细胞胞内代谢分析仪使用一台或两台高灵敏度检测器，实现单色或双色细胞胞内代谢参数测量。此系统采用模块化的显微成像元件，利于系统定制和升级；利用最简模块化设计实现细胞胞内代谢分析仪的小型化。同时还可满足不同样本量的测定(如满足单孔培养皿，24孔板或96孔板实验的需求)。显微成像系统左端口安装有镜筒透镜以及双通道分光器件(DualCam)，连接的一台或两台高灵敏度单分子检测器可以快速采集多染样品的荧光图像，配合光源的快速切换，分别做单色或多色细胞胞内代谢参数测量。
本发明的活细胞胞内代谢分析仪可直接对细胞胞内线粒体等代谢参数进行检测和实时监控，所述代谢参数选自下组的一种或多种：
(1)活细胞的线粒体膜电势和温度；
(2)活细胞的胞内氧化还原势；
(3)活细胞的胞内pH值的变化。
温敏染料
如本文所用，术语“温敏染料”指对具有温度敏感性的温敏荧光化合物。
在本发明中，所述“温敏染料”包括但并不限于：Rhodamine B-ME,TMRM,Rhodamine800，Rhodamine 101-AM，Rhodamine 101-ME，优选Rhodamine B-ME和Rhodamine 800。
在本发明中，本发明的温敏染料所发出的光的强度与温度相关，并且能够穿过细胞膜，甚至是可以富集于胞浆、细胞膜、线粒体等亚细胞结构，从而更易对细胞染色，因此，可利用本发明的温敏染料测量活细胞内温度分布。
本文所述的活细胞内温度分布是指亚细胞结构的温度分布；亚细胞结构指细胞的部分结构，通常比细胞更小，包括但不限于细胞膜、线粒体、中心体、高尔基体、胞浆等。在优选的实施方式中，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。本文所述的亚细胞定位是指温敏染料在上述亚细胞结构上的分布。
在一优选的实施方式中，可利用本发明的温敏染料测量活细胞内线粒体温度分布。
荧光
本发明涉及到两种荧光，即第一测量光(斯托克斯发光)与第二测量光(反斯托克斯发光)。
斯托克斯(Stokes)发光：即通常所说的荧光，其特征为荧光光谱较其相应的吸收光谱发生了向长波长方向的移动(红移)。
反斯托克斯(anti-Stokes)发光：指荧光光谱较其相应的吸收光谱发生了向短波长方向的移动(蓝移)。
斯托克斯发光与反斯托克斯发光产生的原因是：当光线照射到分子并且和分子中的电子云及分子键结产生交互作用，可以将分子从基态激发到一个虚拟的能量状态(激发态)。当激发态的分子放出一个光子后并返回到一个不同于基态的旋转或振动状态，在基态与新状态间的能量差会使得释放光子的频率与激发光的波长不同。如果最终振动状态的分子比初始状态时能量高，所激发出来的光子频率则较低(即，波长较长)，以确保系统的总能量守衡。这一个频率的改变被命名为斯托克斯位移(Stokes shift)，这一过程所产生的荧光即是斯托克斯发光。如果最终振动状态的分子比初始状态时能量低，所激发出来的光子频率则较高(即，波长较短)，这一个频率的改变被名为反斯托克斯位移(Anti-Stokesshift)，这一过程所产生的荧光即是反斯托克斯发光。
相对荧光强度：指在用温敏染料测量细胞内温度时，用浓度分布与温敏染料相一致的非温敏染料的发光强度对该温敏染料的发光强度作归一化处理所得到的比值；也可以指用某一荧光化合物不具温敏特性的斯托克斯发光对该荧光化合物具有温敏特性的反斯托克斯发光作归一化处理所得到的比值。
测量活细胞内温度分布的方法
在提供本发明的温敏染料的基础上，本发明提供了一种测量活细胞内温度分布的方法，所述方法包括：
当利用温敏染料所发出的光测量活细胞内温度分布时：
(1)利用本发明的温敏染料对活细胞生物材料进行染色；
(2)利用显微成像装置对步骤(1)所述染色的细胞生物材料进行成像；
(3)使用公式(1)对图像进行计算：
相对荧光强度：公式(1)
其中ks是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，ΔE是活化能，A是拟合常数，相对荧光强度是温敏染料的反斯托克斯发光用该化合物自身的斯托克斯发光归一化之后的比值，预先测定相对荧光强度随温度变化的标准曲线，利用公式(1)进行计算，从而得到活细胞内温度的分布图像。
测量活细胞内氧化还原势的方法
在本发明中，可以用本领域常用方法测量活细胞内氧化还原势。
在本发明中，以褐色脂肪细胞为例，测量活细胞内氧化还原势的变化情况。去甲肾上腺素处理前后，观测细胞胞内氧化还原势(利用FAD和NADH的自发荧光)的变化，从而判断本发明的活细胞胞内代谢分析仪的检测灵敏度。
测量活细胞内pH的方法
在本发明中，可以用本领域常用方法测量活细胞内的pH。
在本发明中，以褐色脂肪细胞为例，测量活细胞内pH的变化情况。去甲肾上腺素处理前后，观测细胞胞内pH的变化，从而判断本发明的活细胞胞内代谢分析仪的检测灵敏度。
本发明的活细胞胞内代谢分析仪还可以用癌症细胞株，检测代谢变所引起的胞内pH值的变化。
光源
光源通过光导纤维照射到检测线处，激发出的荧光通过光导纤维进入检测器，所得到的数据由计算机进行处理和分析。
本发明中，光源用于提供某一发射波长的光线，从而激发荧光物质发出荧光。可选用任何可以提供合适波长的光源，包括(但不限于)：LED、氙灯、卤钨灯、激光等。
一种优选的光源是激光光源，激光光源可用本领域常规的方法和设备(如激光器)产生。代表性的激光器包括(但并不限于)：半导体激光器、氦氖激光器、氩离子激光器、还包括波长可选的激光器、多波长激光器和双波长激光器等。
激光器产生的激光波长与激光介质有关，常见的激光波长见下表1：
表1常见的激光波长
| 激光种类 | 波长(纳米) |
| 氩氟激光(紫外光) | 193 |
| 氪氟激光(紫外光) | 248 |
| 氙氯激光(紫外光) | 308 |
| 氮激光(紫外光) | 337 |
| 氩激光(蓝光) | 488 |
| 氩激光(绿光) | 514 |
| 氦氖激光(绿光) | 543 |
| 氦氖激光(红光) | 633 |
| 罗丹明6G染料(可调光) | 570-650 |
| 红宝石(CrAlO3)(红光) | 694 |
| 钕-钇铝石榴石(近红外光) | 1064 |
实施例
以褐色脂肪细胞为例，用本发明的活细胞胞内代谢分析仪检测线粒体膜电势和温度变化，胞内氧化还原势和细胞内pH值变化等能直接反映细胞内代谢状况的参数，具体实验方案如下：
线粒体膜电势和温度的变化
利用经过前处理的原代培养或诱导分化的褐色脂肪细胞，比较去甲肾上腺素处理前后，验证新检测设备能否灵敏地检测线粒体膜电势和温度变化，以确定细胞胞内代谢分析仪在细胞胞内代谢参数检测方面的优势。举例如下：
A.褐色脂肪细胞在2毫升的含有温敏染料的Tyrode溶液(in mM:10Hepes,10glucose,3KCl,145NaCl,1.2CaCl2,1.2MgCl2,pH 7.4)中33度孵育1小时；
B.做为处理前对照，实时预检测5-10分钟后，后加入终浓度100nM的去甲肾上腺素处理；
C.数据处理分析后可以观测到NE诱导褐色脂肪细胞的产热变化。
细胞胞内氧化还原势的变化
利用原代培养或诱导分化的褐色脂肪细胞，比较去甲肾上腺素处理前后，验证新检测设备能否灵敏地检测细胞胞内氧化还原势(利用FAD和NADH的自发荧光)的变化，突出细胞胞内代谢分析仪在细胞胞内代谢参数检测方面的优势。举例如下：
A.褐色脂肪细胞在2毫升Tyrode溶液中33度孵育30分钟；
B.做为处理前对照，实时预检测5-10分钟后，后加入终浓度100nM的去甲肾上腺素处理；
C.数据处理分析后可以观测到NE诱导褐色脂肪细胞胞内氧化还原势的变化。
细胞胞内pH值的变化
利用原代培养或诱导分化的褐色脂肪细胞，比较去甲肾上腺素处理前后，验证新检测设备能否灵敏地检测细胞胞内pH值的变化，突出细胞胞内代谢分析仪在细胞胞内代谢参数检测方面的优势。举例如下：
A.褐色脂肪细胞在2毫升的含有pH敏感染料的Tyrode溶液中33度孵育30分钟；
B.做为处理前对照，实时预检测5-10分钟后，后加入终浓度100nM的去甲肾上腺素处理；
C.数据处理分析后可以观测到NE诱导褐色脂肪细胞胞内pH值的变化；
D.实验同样可以用癌症细胞株，检测代谢变化引起胞内pH值的变化等。
稳定性和重复性
通过进行多次(>3)平行实验，对比各次检测的结果检验细胞胞内代谢分析仪的稳定性和可重复性。
结果如图2所示。结果表明，本发明的活细胞胞内代谢分析仪能成功检测褐色脂肪细胞的线粒体膜电势和温度，胞内氧化还原势和细胞内pH值的变化等能直接反映细胞内代谢状况的参数。
此外，本发明的活细胞胞内代谢分析仪使用一台或两台高灵敏度检测器，实现单色或双色细胞胞内代谢参数测量。此系统采用模块化的显微成像元件，利于系统定制和升级；利用最简模块化设计实现细胞胞内代谢分析仪的小型化。系统配置焦面防漂移系统，防止在长时间采集图片的过程中发生离焦现象，同时配置电动载物台有助于快速精准地在XY方向定位感兴趣的样品，以及满足不同样本量的测定(如满足单孔培养皿，24孔板或96孔板实验的需求)。显微成像系统左端口安装有镜筒透镜以及双通道分光器件(DualCam)，连接的一台或两台高灵敏度单分子检测器可以快速采集多染样品的荧光图像，配合光源的快速切换，分别做单色或多色细胞胞内代谢参数测量。
综上，本发明的活细胞胞内代谢分析仪与同类科研装备的具体参数列表对比如下：
表2细胞胞内代谢分析仪性能参数对比
综上所述，本发明的活细胞胞内代谢分析仪可有效检测线粒体膜电势和温度，胞内氧化还原势和细胞内pH值的变化等能直接反映细胞内代谢状况的参数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述分析仪包括：
光源装置，所述光源装置发出第一激发光，并将所述第一激发光导入活的生物细胞材料，其中，所述第一激发光包括第一光谱辐射成分；
显微成像装置，所述显微成像装置用于接收第一测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像，其中，所述第一测量光由所述第一激发光与所述活的生物细胞材料相互作用后所产生；和
控制装置，所述控制装置用于控制光源装置发射第一激发光；以及，处理所述图像装置所获得的第一信号，所述第一信号由所述第一测量光发出；
并且，所述控制装置包括2个分析处理模块，分别为活细胞膜电势和温度的分析处理模块和活细胞内氧化还原势的分析处理模块，所述活细胞膜电势和温度的分析处理模块用于分析活细胞膜电势和温度的变化情况，所述活细胞内氧化还原势的分析处理模块用于分析活细胞内氧化还原势的变化情况。
2.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述显微成像装置还用于接收第二测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像，其中，所述第二测量光由所述第一激发光与所述活的生物细胞材料相互作用后所产生。
3.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述控制装置用于控制光源装置发射第一激发光；以及，处理所述图像装置所获得的第二信号，所述第二信号由所述第二测量光发出。
4.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述控制装置还包括活细胞内的pH的分析处理模块，用于分析活细胞内的pH的变化情况。
5.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述活的生物细胞材料包括含有细胞内源性代谢小分子的台氏(Tyrode)溶液。
6.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述细胞内源性代谢小分子选自下组：黄素腺嘌呤二核甘酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH)、或其组合。
7.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述活的生物细胞材料包括含有温敏染料的台氏溶液。
8.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述温敏染料选自下组：Rhodamine B-ME、TMRM、Rhodamine 800、Rhodamine 101-AM、Rhodamine 101-ME、或其组合。
9.如权利要求1所述的活细胞胞内代谢分析仪，其特征在于，所述活的生物细胞中还包括诱导剂，用于诱导胞内指标的变化。
10.一种活细胞胞内代谢分析的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)提供一活的生物细胞材料，所述活的细胞生物材料含有用于检测活细胞胞内代谢的检测试剂；
(ii)将光源装置发出的第一激发光导入活的生物细胞材料，其中，所述第一激发光包括第一光谱辐射成分；并用显微成像装置接收第一和/或第二测量光，并对所述活的生物细胞材料进行显微成像，其中，所述第一和/或第二测量光由所述第一激发光与所述活的生物细胞材料相互作用后所产生；
借助于控制装置控制光源装置发射第一激发光；以及
处理所述图像装置所获得的第一和/或第二信号，所述第一和/或第二信号由所述第一和/或第二测量光发出；
并且，所述控制装置包括2个分析处理模块，分别为活细胞膜电势和温度的分析处理模块和活细胞内氧化还原势的分析处理模块，所述活细胞膜电势和温度的分析处理模块用于分析活细胞膜电势和温度的变化情况，所述活细胞内氧化还原势的分析处理模块用于分析活细胞内氧化还原势的变化情况。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610368392.6A CN107449715B (zh) | 2016-05-30 | 2016-05-30 | 活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610368392.6A CN107449715B (zh) | 2016-05-30 | 2016-05-30 | 活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107449715A true CN107449715A (zh) | 2017-12-08 |
| CN107449715B CN107449715B (zh) | 2021-01-22 |
Family
ID=60485630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610368392.6A Active CN107449715B (zh) | 2016-05-30 | 2016-05-30 | 活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107449715B (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1383452A (zh) * | 1998-01-12 | 2002-12-04 | 新生物技术公司 | 治疗含有双微体dna的细胞的组合物及方法 |
| JP2005083980A (ja) * | 2003-09-10 | 2005-03-31 | Olympus Corp | 共焦点光学顕微鏡およびそれを用いた分析方法 |
| CN101632012A (zh) * | 2007-03-13 | 2010-01-20 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 基于照明光与细胞成分之间的不同相互作用分析生物细胞材料 |
| CN101679501A (zh) * | 2007-05-22 | 2010-03-24 | 诺瓦提斯公司 | 治疗、诊断和检测fgf21-相关疾病的方法 |
| US20100233733A1 (en) * | 2009-02-10 | 2010-09-16 | Nodality, Inc., A Delaware Corporation | Multiple mechanisms for modulation of the pi3 kinase pathway |
| CN101838344B (zh) * | 2010-05-12 | 2012-06-20 | 上海交通大学 | 具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子及其制备方法 |
| CN102517203A (zh) * | 2011-12-14 | 2012-06-27 | 浙江大学 | 同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的系统及方法 |
| WO2014043635A1 (en) * | 2012-09-14 | 2014-03-20 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic assisted cell screening |
| CN103733050A (zh) * | 2011-08-22 | 2014-04-16 | 光谱平台有限公司 | 代谢活性的快速检测 |
| CN104403003A (zh) * | 2011-09-26 | 2015-03-11 | 华东理工大学 | 基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针及其制备方法和应用 |
-
2016
- 2016-05-30 CN CN201610368392.6A patent/CN107449715B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1383452A (zh) * | 1998-01-12 | 2002-12-04 | 新生物技术公司 | 治疗含有双微体dna的细胞的组合物及方法 |
| JP2005083980A (ja) * | 2003-09-10 | 2005-03-31 | Olympus Corp | 共焦点光学顕微鏡およびそれを用いた分析方法 |
| CN101632012A (zh) * | 2007-03-13 | 2010-01-20 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 基于照明光与细胞成分之间的不同相互作用分析生物细胞材料 |
| CN101679501A (zh) * | 2007-05-22 | 2010-03-24 | 诺瓦提斯公司 | 治疗、诊断和检测fgf21-相关疾病的方法 |
| US20100233733A1 (en) * | 2009-02-10 | 2010-09-16 | Nodality, Inc., A Delaware Corporation | Multiple mechanisms for modulation of the pi3 kinase pathway |
| CN101838344B (zh) * | 2010-05-12 | 2012-06-20 | 上海交通大学 | 具有荧光标记性质的壳聚糖纳米粒子及其制备方法 |
| CN103733050A (zh) * | 2011-08-22 | 2014-04-16 | 光谱平台有限公司 | 代谢活性的快速检测 |
| CN104403003A (zh) * | 2011-09-26 | 2015-03-11 | 华东理工大学 | 基因编码的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸荧光探针及其制备方法和应用 |
| CN102517203A (zh) * | 2011-12-14 | 2012-06-27 | 浙江大学 | 同时检测细胞外环境毒物与细胞代谢的系统及方法 |
| WO2014043635A1 (en) * | 2012-09-14 | 2014-03-20 | President And Fellows Of Harvard College | Microfluidic assisted cell screening |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107449715B (zh) | 2021-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6550433B2 (ja) | 多重化組織用のデジタル的に強化された顕微鏡 | |
| Bright et al. | Fluorescence ratio imaging microscopy | |
| Bird et al. | Simultaneous two-photon spectral and lifetime fluorescence microscopy | |
| Model et al. | A standard for calibration and shading correction of a fluorescence microscope | |
| Hanley et al. | Spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy | |
| Kumar et al. | Multifocal multiphoton excitation and time correlated single photon counting detection for 3-D fluorescence lifetime imaging | |
| Sud et al. | Time-resolved optical imaging provides a molecular snapshot of altered metabolic function in living human cancer cell models | |
| Yurova et al. | Functional electrospun nanofibers for multimodal sensitive detection of biogenic amines in food via a simple dipstick assay | |
| US20100274500A1 (en) | Method and system for measuring membrane potential based on fluorescence polarization | |
| Chen et al. | Spectral discrimination between normal and leukemic human sera using delayed luminescence | |
| CN104764727A (zh) | 一种荧光成像分析系统及其荧光成像分析方法 | |
| da Silva et al. | A fluorescence digital image-based method using a 3D-printed platform and a UV-LED chamber made of polyacid lactic for quinine quantification in beverages | |
| Bestvater et al. | EMCCD-based spectrally resolved fluorescence correlation spectroscopy | |
| CN108693147A (zh) | 一种微型荧光成像仪及荧光检测方法 | |
| Chen et al. | A practical implementation of multifrequency widefield frequency‐domain fluorescence lifetime imaging microscopy | |
| Lloyd et al. | Instrumentation to rapidly acquire fluorescence wavelength-time matrices of biological tissues | |
| Görlitz et al. | Open source high content analysis utilizing automated fluorescence lifetime imaging microscopy | |
| Shear et al. | Multiphoton-excited fluorescence of fluorogen-labeled neurotransmitters | |
| CN204556502U (zh) | 一种荧光成像分析系统 | |
| Waharte et al. | Setup and characterization of a multiphoton FLIM instrument for protein–protein interaction measurements in living cells | |
| Zucker et al. | Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: use of multispectral beads | |
| CN109991197A (zh) | 测量样品荧光特性的分光光度计及方法 | |
| CN107449715A (zh) | 活细胞胞内代谢分析仪及其分析方法 | |
| Würth et al. | Polymer-and glass-based fluorescence standards for the near infrared (NIR) spectral region | |
| Kalinina et al. | Oxygen sensing PLIM together with FLIM of intrinsic cellular fluorophores for metabolic mapping |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |