CN104250646A - 一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记及检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记及检测方法和应用，该分子标记位于猪的Orexin基因核苷酸序列中，在SEQIDNO：1的第516bp处有一个G516-A516的碱基突变。利用引物:TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC；和GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC对该基因进行扩增，酶切后可准确检测猪的基因型。同时运用混合模型来统计分析Orexin基因SNP位点的基因型效应及其与饲料转化效率性状的关系，发现此多态位点与平均日增重、采食量、剩余采食量等饲料转化效率性状显著相关，促进了对猪饲料转化效率的研究进展。
Description
技术领域
本发明属于猪分子标记制备领域，具体涉及一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记，还涉及一种基于与猪饲料转化效率性状相关的分子标记的检测方法，还涉及一种与猪饲料转化效率性状相关分子标记的应用。
背景技术
畜牧业在现代农业发展中占据着非常重要的地位，其在农业生产中所占有的比值通常用来衡量一个国家和地区发展程度的重要指标。猪肉作为我国最主要的肉类来源，生猪养殖产业在我国畜牧业中占据着举足轻重的地位。在20世纪80年代中期，我国肉类产量约2000万吨，猪肉约占85%，2012年猪肉产量达到了5335万吨，约占肉类总量63.63%。虽然猪肉所占比重逐渐下降，但其始终占据主导地位。在养猪行业中，饲料成本占养猪总成本的65-75%。因此，降低生猪养殖中的饲料消耗，提高饲料利用效率，降低饲料成本关系到养猪企业发展，乃至生存。研究发现，猪的饲料转化效率同采食量、平均日增重、肌内脂肪等经济性状显著相关（赵克斌，提高生长育肥猪饲料转化率降低饲料成本的策略.猪业科学，2008，60-63）。因此，影响猪采食量、平均日增重、肌内脂肪等性状的基因可作为研究猪饲料转化效率的候选基因。
增食欲素Orexin是一种重要的神经肽，在小鼠的下丘脑中研究发现（Sakurai T,Amamiya A,Ishii M,et al.Orexins and orexin receptors:a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J].Cell,1998,92(4):573-585;De Lecea L,Kilduff TS,Peyron C,Gao X,Foye PE,Danielson PE,Fukuhara C,Battenberg EL,Gautvik VT,Bartlett FS,Frankel WN,van den Pol AN,Bloom FE,GautvikKM,Sutcliffe JG."The hypocretins:Hypothalamus-specific peptides with neuroexcitatory activity"[J].Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,1998,95(1):322–327）。外侧下丘脑是摄食中枢，刺激此处时饱食的动物还要采食，如损毁下丘脑外侧区，动物体重下降、厌食以致死亡。这两种现象表明，下丘脑是调节进食和能量平衡的关键部位，Orexin在该区域的特异性分布（Sakurai T,Amamiya A,Ishii M,et al.Orexins and orexin receptors:a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J].Cell,1998,92(4):573-585）说明Orexin与可能摄食行为有关。
Orexin A和Orexin B均是由prepro-orexin前体肽分泌，且能与G蛋白偶联的相关受体OX1R和OX2R结合，并激活OX1R和OX2R发挥生物作用。White等对大鼠下丘脑吻侧部注射OrexinA，发现摄食量显著增加并呈剂量依赖性。在注射OrexinA之前禁食时间分为：0h、3h、12h和24h，并在注射前给予200ms／kg2-脱氧葡萄糖，结果发现摄食量增加幅度同禁食时间长度呈正相关，摄食量同OrexinA注射剂量呈正相关。而且在注射前使用2-脱氧葡萄糖导致了更强的摄食反应（White CL,Ishii Y,Mendoza T,Upton N,Stasi LP,Bray GA,York DA.Effe-ct of a selective OX1R an-tagonist on food intake and body weightin two strains of rats that differ in susceptibility to dietary-induced obesity[J].Peptides,2005,26(11):2331-2338）。Novak等在大鼠外侧下丘脑头背部注射prepro-orexin前体肽后，发现大鼠摄食量增加，体力活动变得更加频繁，体温上升，从而能量消耗增加，血糖水平升高（Novak CM.Levine JA.Daily intraparaventrieular orexin-A treatment induces weight loss in rats[J].Obesity(Silver Spring),2009.17(8):1493-1498.）。同时，Orexin表达量的升高能促进胃酸分泌，提高动物机体采食量，而猪下丘脑腹内侧核（VMH）是参与Orexin刺激胃酸分泌的区域之一（Eliassi A,Nazari M,Naghdi N.Role of the ventromedial hypothalamic orexin-1receptors in regulation of gastric acid secretion in conscious rats[J].J Neuroendocrinol,2009,21(3):177-182.）。以上研究说明了增加Orexin基因的表达量，能促进动物提高采食量。
除了Orexin外，下丘脑还产生如促生长激素神经肽(Gal)、神经肽Y（NPY）、黑色素聚集激素(MCH)、黑皮质素受体-4（MC4R）、刺鼠相关肽(AgRP)、瘦素（leptin）、饥饿素(Ghrelin)、瘦素(Leptin)、神经肽B(NPB)、胰岛素（Insulin）等能调节畜禽采食行为的因子。下丘脑中的Orexin同NPY免疫阳性纤维相互支配，同时Orexin能通过促进NPY神经元活动增加采食量。Qi等发现在下丘脑中，Leptin能够直接抑制Orexin表达，以上实验表明Orexin可以通过与其他激素互作调节动物个体的采食行为（Qi Y,Henry B.A,Oldfield,B.J.Clarke I.J.The action of leptin on appetite-regulating cells in the ovine hypothalamus:Demonstration of direct action in the absence of the arcuate nucleus[J].Endocrinology,2010,151(5):2106-2116）。
剩余采食量（residual feed intake，RFI）是由Koch首次提出（Koch RM,Swiger LA,Chambers D,Gregory KE.Efficiency of feed use in beef cattle[J].Anim Sci,1963,22:486-494）。是畜禽实际采食量与根据其自身状况维持增重和生长所预测采食量的差值（RFI=实际采食量-预测采食量）。剩余采食量是反映饲料转化效率的可遗传性状，独立于生产水平、体格大小等性状，考虑了动物的平均日增重和校正了个体的代谢体重，被认为是测定饲料转化效率的主要参考方法。研究表明饲料转化效率高的动物剩余采食量低或者为负值（Archer JA,Richardson EC,Herd RM,Arthur PF.Potential for selection to improve effciency of feed use in beef cattle:A review[J].Australian Journal of Agriculture Research,1999,50(2):147-162）。
Boddicker通过随机选择40头生长性能接近的约克夏猪为低RFI组、对照组，限制饲喂饲料6周，比较两组的生长性能、采食量和胴体组成。结果与对照组相比，低RFI组消耗饲料比计划所用饲料少7.6%，且两组的生长性能、胴体组成无明显差异。表明在生产实践中，低RFI可降低畜禽采食量和提高饲料转化效率，降低养殖成本且对畜禽的生产性能无显著影响（Boddicker NJ.The effects of ad libitum and restricted feeding on Yorkshire pigsselected for reduced residual feed intake[J].Graduate Theses and Dissertations,2010:11760）。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记，该分子标记为包含一个SNP位点，位于核苷酸序列SEQ ID NO.1上，SEQ ID NO：1的第516bp处有一个G516-A516的碱基突变，导致AluⅠ-RFLP多态性。这个碱基突变位于Orexin基因第1内含子中，不改变其翻译的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是在于提供了一种基于与猪饲料转化效率性状的分子标记的检测方法，该方法具有检测准确、快速及成本较低等优点。
本发明还有一个目的在于提供了一种扩增与猪饲料转化效率性状的分子标记的引物对，其序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID.7所示，引物扩增出的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还有一个目的是在于提供了一种与猪饲料转化效率性状的分子标记在猪饲料转化效率性状相关分子标记辅助育种中的应用，该应用研究了与猪饲料转化效率性状相关的基因，发现了一个与饲料转化效率性状相关的多态位点。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记的获得：
（一）猪Orexin基因的引物设计与部分DNA序列扩增
用猪Orexin基因序列信息(GenBank收录号：NC_010454.3)作为引物设计的模板序列，利用生物学引物设计软件Oligo7.0设计引物，引物序列如下：
Orexin正向引物：CATGTATCAGAGGCTATTTGCACOrexin反向引物：ACCTGAAAACGGGCATGTCT。
（2）PCR扩增反应：
利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（购自美国invitrogen公司）从纯种美系大白阉割猪实验群体（该群体来源于湖北金林育种场，）（屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计236头，全部为美系纯种大白阉割公猪）耳组织中提取基因组DNA，具体操作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。
PCR反应：反应总体积为30μl，其中猪DNA模板3.0μl，PCRmix15μl，正向引物和反向引物各0.6nmol/μl，最后加去离子水至总体积30μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸40s，最后72℃延伸5min。PCR产物经1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分Orexin片段，长度为282bp，其序列为SEQ ID NO.2所示。
（3）PCR产物的纯化、测序
PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒（购自北京百泰克公司）纯化PCR产物。将纯化后的DNA溶液送至上海英骏公司正反向测序。
用引物扩增猪基因组DNA得到了282bp特异性扩增片段，如图2所示，正反向测序结果发现该片段所在的Orexin基因（SEQ ID NO.1所示）的第516位发现一个G-A转换（如图3所示），造成一个AluⅠ酶切位点
一种基于与猪饲料转化效率性状相关的分子标记的检测方法，其步骤如下：
（1）引物序列
Orexin的SNP分型引物:正向引物:5'TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC3'
反向引物:5'GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC3'
该引物扩增片段长度215bp，其序列为SEQ ID NO.3所示。
（2）PCR扩增条件
PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl，PCRmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸40s；最后72℃延伸5min。PCR产物经2％（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测。
（3）RFLP检测
PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物5μl，去离子水3.5μl，10×buffer1μl，限制性内切酶AluⅠ为0.5μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3.5%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
酶切产生三种基因型，GG基因型只有215bp一条带，AA基因型有179bp和36bp两条带，杂合子GA基因型有215bp、179bp和36bp三条带（其中36bp目的带太小未出现）。一种与猪饲料转化效率性状的分子标记在猪饲料转化效率性状相关的分子标记辅助育种中的应用，其步骤是：
采集样品的平均日增重、采食量、预测采食量、剩余采食量、饲料转化率及肌内脂肪6项指标。根据采集样品的群体结构，运用混合模型来统计分析Orexin基因SNP位点的基因型效应及其与饲料转化效率性状的关系：
Yij=μ+genotypei+εij+G
其中，Yij为处理后性状值，μ为总体均值，εij为随机误差，G为批次效应，假定服从N（0，σ2）分布。即可分析出基因型效应，完成基因型效应的多重性比较。采用SPSS16.0软件（AsiaAnalytics China）进行数据处理与统计分析。
统计分析发现该基因的A>G突变基因型，与平均日增重极显著相关（P=0.009），与采食量极显著的相关（P＝0.0007），与预测采食量呈显著相关（P＝0.016），与剩余采食量显著相关（P＝0.027）。通过最小二乘均数对基因型为AA、GG、AG的个体进行两两比较，结果表明GG、GA基因型平均日增重、日采食量、预测采食量、剩余采食量高于AA型基因型个体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明利用现有的PCR-RFLP技术，在Orexin基因第516bp处发现一个G/A突变，且发现此多态位点与平均日增重、采食量、剩余采食量等饲料转化效率性状显著相关，促进了对猪饲料转化效率的研究进展。
附图说明
图1为一种本发明技术流程图。
图2为一种猪Orexin基因基因组扩增电泳结果示意图。
M：DL2000分子量标记；
图3为一种本发明中猪Orexin基因测序发现的G＞A突变。
图4为一种猪Orexin基因外显子的Alu Ⅰ-RFLP的三种基因型(GG GA AA)电泳结果示意图。
M：50bpDNA分子量标记；P：PCR产物。
具体实施方式
实施例1：
一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记的获得：
（一）猪Orexin基因的引物设计与部分DNA序列扩增
用猪Orexin基因序列信息(NCBI：ID：397305，GenBank收录号：NC_010454.3)作为引物设计的模板序列，利用生物学引物设计软件Oligo7.0设计引物，引物序列如下：
Orexin正向引物：CATGTATCAGAGGCTATTTGCAC（该引物对用来寻找Orexin基因的多态位点）
Orexin反向引物：ACCTGAAAACGGGCATGTCT。
（2）PCR扩增反应：
利用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒（购自美国invitrogen公司）从纯种美系大白阉割猪实验群体（该群体来源于湖北金林育种场）（屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计236头，全部为美系纯种大白阉割公猪）耳组织中提取基因组DNA，具体操作方法参照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书进行。
PCR反应：反应总体积为30μl，其中猪DNA模板3.0μl，PCRmix15μl，正向引物和反向引物各0.6nmol/μl，加入去离子水至总体积30μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸40s，最后72℃延伸5min。PCR产物经1（W/V）%琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分Orexin片段，长度为282bp，其序列为SEQID NO.2所示。
（3）PCR产物的纯化、测序
PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒（购自北京百泰克公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是按照100mg胶块加入400μl GS Buffer的比例加入GS Buffer，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μl Wash Buffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管（DNA溶液）置于-20℃保存备用。将纯化后的DNA溶液送至上海英骏公司正反向测序。
用引物扩增猪基因组DNA得到了282bp特异性扩增片段，如图2所示，正反向测序结果发现该片段所在的Orexin基因（SEQ ID NO.1所示）的第516位发现一个G-A转换（如图3所示），造成一个Alu Ⅰ酶切位点
实施例2：
一种基于与猪饲料转化效率性状相关的分子标记的检测方法，其步骤如下：
PCR-RFLP诊断方法建立
（1）引物序列
Orexin的SNP分型引物:正向引物:5'TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC3'
反向引物:5'GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC3'
该引物扩增片段长度215bp，其序列为SEQ ID NO.3所示。
（2）PCR扩增条件
PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl，PCRmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸40s；最后72℃延伸5min。PCR产物经2％（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测。
（3）RFLP检测
PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物5μl，去离子水3.5μl，10×buffer1μl，限制性内切酶AluⅠ为0.5μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3.5%（W/V）琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
酶切产生三种基因型，GG基因型只有215bp一条带，AA基因型有179bp和36bp两条带，杂合子GA基因型有215bp、179bp和36bp三条带（其中36bp目的带太小未出现），如图4所示。
实施例3：
一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记在不同猪群体多态性检测中的应用，其步骤是：
利用PCR-AluⅠ-RFLP检测了纯种美系大白阉割猪实验群体（该群体来源于湖北金林育种场）（236个美系纯种大白阉割公猪群体）。该突变位点在实验群体中的基因型和基因频率如表1所示，检测结果显示，Orexin基因在实验群体中存在三种基因型，其中AA型个体有18头，GA型个体有85头，GG型个体有133头,酶切分型的检测结果与测序结果相符,本发明的检测方法可靠。此结果表明Orexin基因在纯种美系大白阉割猪实验群体中等位基因G占优势。
实施例4：
一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记与饲料转化效率性状的关联分析
本实施例的猪群来自本湖北金林育种场纯种美系大白阉割猪，屠宰测定与采样分成21个批次进行，测定个体数量共计236头，全部为美系纯种大白阉割公猪。
所分析的性状主要是与饲料转化效率性状相关的性状，包括：平均日增重、采食量、预测采食量、剩余采食量、饲料转化率及肌内脂肪6项指标。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析Orexin基因SNP位点的基因型效应及其与饲料转化效率性状的关系：
Yij=μ+genotypei+εij+G
其中，Yij为处理后性状值，μ为总体均值，εij为随机误差，G为批次效应，假定服从N（0，σ2）分布。即可分析出基因型效应，完成基因型效应的多重性比较。采用SPSS16.0软件（软件来自于AsiaAnalytics China）进行数据处理与统计分析。
对猪Orexin基因AluⅠ-RFLP多态性位点与部分饲料转化效率性状进行关联分析，由表1知：在236个个体中GG基因型有133个，GA基因型有85个，AA基因型有18个。
本实施例采用SPSS16.0软件中的广义线性模型对猪Orexin基因的A>G突变位点的多态在美系大白阉割猪群体中对饲料转化效率性状进行了初步的关联分析。初步分析结果见表1。统计分析发现该基因的A>G突变基因型，与平均日增重极显著相关（P=0.009），与采食量极显著的相关（P＝0.0007），与预测采食量呈显著相关（P＝0.016），与剩余采食量显著相关（P＝0.027）。通过最小二乘均数对基因型为AA、GG、AG的个体进行两两比较，结果表明GG、GA基因型平均日增重、日采食量、预测采食量、剩余采食量高于AA型基因型个体。
表1Orexin基因多态性位点基因型与饲料转化效率性状的关联分析检测
注：表中的性状均值为平均数±标准差。
ADG：平均日增重；FI：日采食量；PFI：预测日采食量；RFI：剩余采食量；FCR：饲料转化率；IMF：肌内脂肪。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记及检测方法和应用
<130> 一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记及检测方法和应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> 猪
<400> 1
cagttgacgg cctcaaagtt cctggctatt cagaccacgg aagacgacac ccttcctgga 60
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aaaactaaag gacagccagg gaagagtgca ggccagaggg gacgcggatg cagctgggca 840
gggcctgggc gtagtggttg gatgcaggcg cggcgagacc actcctagca cccagtctcc 900
tgcctcccta ggtctcctgg gccaccgtga cgctgctgct tctgctactg ttgctgccgc 960
ctgcggtgct gtcgcccggg gcggcggcgc agccactgcc cgactgctgc cgtcaaaaga 1020
cgtgctcctg ccgcctctac gagctgctac acggcgctgg caatcacgcg gccggcatcc 1080
tcactctggg caagcggcgg ccagggcccc cgggcctgca aggccggctg cagcgcctcc 1140
tgcaggccag cggcaaccac gcagcgggca tcctgaccat gggccgccgc gcaggcgcag 1200
agccagcgcc gcgcctctgc ccggggcgcc ggtgtctcgc tgcggctgcc tcatctgtag 1260
cgccgggagg acggtctggg atctgagccc ttgctcgggt tctgcctggc cccaccctag 1320
cccggccctc tcccctctgc ccgcccgagg tcagcccccc agaaaaaggg caataaagac 1380
gaagtctccc tctgt 1395
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> 猪
<400> 2
catgtatcag aggctatttg cacctgtcat ctcatttccc cctcccagca gccctgcaca 60
ggattattta atacccagtg ctctccctga gagggtagga aactggtcca aggcaatgag 120
ttgtttcttc tgtaaggggg taggtggaca aagcagcctg gatcctgcca gtccttgatt 180
tgcacgctgt cgggaggagg ggc(g/a)gataaa tagggcctct gtttgcctgg gtgaagtttt 240
cacagacttc gggggcagat tcagacatgc ccgttttcag gt 282
<210> 3
<211> 215
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcatctcatt tccccctccc agcagccctg cacaggatta tttaataccc agtgctctcc 60
ctgagagggt aggaaactgg tccaaggcaa tgagttgttt cttctgtaag ggggtaggtg 120
gacaaagcag cctggatcct gccagtcctt gatttgcacg ctgtcgggag gaggggc(g/a)gc 180
taaatagggc ctctgtttgc ctgggtgaag ttttc 215
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgtatcag aggctatttg cac 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acctgaaaac gggcatgtct 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcatctcatt tccccctccc agc 23
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaaaacttca cccaggcaaa cagaggccct atttagc 37
Claims (5)
1.一种与猪饲料转化效率性状相关的分子标记，含有SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点位于SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中， SEQ ID NO：1的第516 bp处有一个G516-A516的碱基突变。
2.权利要求1所述的分子标记，其特征在于，分子标记的引物序列为：正向引物: 5' TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC 3'；反向引物: 5'GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC 3'。
3.一种基于权利要求1所述的分子标记的检测方法，其特征在于，其步骤是：
（1）引物序列
Orexin的SNP分型引物: 正向引物: 5' TCATCTCATTTCCCCCTCCCAGC 3'
反向引物: 5' GAAAACTTCACCCAGGCAAACAGAGGCCCTATTTAGC 3'
（2）PCR扩增条件
PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl，PCRmix 5μl，最后加入去离子水至总体积10μl；PCR反应条件为：95℃预变性5min后，循环30次95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸40s；最后72℃延伸5min；PCR产物经2％W/V琼脂糖凝胶电泳检测；
（3）RFLP检测
PCR产物酶切反应体积是10μl ，其中PCR产物5μl，去离子水3.5μl，10×buffer 1μl，限制性内切酶AluⅠ为0.5μl (10U/μl) ，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3.5%W/V琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照；
酶切产生三种基因型，GG基因型只有215bp一条带，AA基因型有179bp和36bp两条带，杂合子GA基因型有215bp、179bp和36bp三条带，其中36bp目的带不出现。
4.权利要求1所述的分子标记在猪饲料转化效率性状相关分子标记辅助育种中的应用。
5.权利要求2所述的分子标记的引物序列在猪饲料转化效率性状相关分子标记辅助育种中的应用。
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