CN110358838A - Fa2h基因片段中与猪饲料转化相关的snp遗传标记 - Google Patents
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Abstract
本公开提供FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记，通过鉴定了一个影响公猪饲料增重比的分子标记ASGA0092975，筛选出影响猪饲料增重比的大效应分子遗传标记，标记位于猪6号染色体12904530bp位置，且属于FA2H基因内含子序列，该位置为一个C>T突变，标记是有利于降低饲料增重比的等位基因；通过检测标记基因型辅助种猪选育，可通过选留TT纯合种猪进入核心群，降低饲料增重比，有效减少饲料消耗量和养殖成本；在杜长大商品猪群体中，具有ASGA0092975位点多态性的TT基因型猪的饲料增重比比CC基因型猪降低0.08，日均采食量降低了187.83g/天；所以，该SNP位点显著降低了家猪的饲料增重比，同时，验证了T是有利于降低饲料增重比和平均日采食量的等位基因。
Description
技术领域
本公开涉及猪遗传基因技术领域，特别涉及FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记。
背景技术
饲料效率作为一个重要的经济性状，一直受到国内外养猪企业和种猪改良公司的重点关注。20世纪中期，国内外沿用饲料增重比(Feed/Gain ratio,F/G)研究饲料效率，该性状为中等遗传力数量性状。2015年Mignon等(Mignon G S,rideau N,Gabriel I,etal.Detection of QTL controlling feed efficiency and excretion in chickens feda wheat-based diet.Genetics Selection Evolution,47(1):74(2015))在鸡中检测到了13个与饲料转化率有关的QTL。据报道，猪的细胞信号转导抑制因子2(Suppressor ofCytokine Signalling 2,CRADD)基因、黑皮质素受体4(Melanocortin 4 receptor,MC4R)基因存在与饲料转化率显著相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点。研究表明，FA2H基因(Fatty Acid 2-Hydroxylase)对羟基化脂肪酸的合成和功能具有特异性，有利于调节蛋白质转运和脂肪代谢(Li Y,Wang C,Huang Y，etal.C.Elegans Fatty Acid Two-Hydroxylase Regulates Intestinal Homeostasis byAffecting Heptadecenoic Acid Production.CELL PHYSIOL BIOCHEM,49:947-960(2018))。Guo等(Guo L,Zhang X,Zhou D Q,et al.Stereospecificity of fatty acid 2-hydroxylase and differential functions of 2-hydroxy fatty acidenantiomers.Journal of lipid research,53(7):1327-35(2012))表明，脂肪细胞中FA2H基因的敲除会降低葡萄糖的摄取和脂肪生成。
饲料转化率作为评价饲料利用效率的中等遗传力性状，有良好的选择反应。利用SNP标记辅助选育饲料利用效率相关性状对养猪生产管理和企业经济效益具有重要影响。①低饲料增重比猪的饲料利用效率高(Vigors S,Sweeney T,Oshea C J,et al.Pigs thatare divergent in feed efficiency,differ in intestinal enzyme and nutrienttransporter gene expression,nutrient digestibility and microbialactivity.Animal,10(11):1848-1855(2016))，能降低生产中的饲料使用量和生产成本，进而节约了饲料资源，亦能一定程度减少猪的排污量，从而减缓猪与人类竞争粮食资源和养猪业环保问题的压力。②开发有效的分子标记用于饲料效率相关性状选育工作，大大缩短培育周期，降低培育成本，提高选种准确度，加快遗传进展，能避免引种-退化-再引种的现象。
因此，挖掘和利用新的与饲料增重比相关基因对于猪的遗传育种有着重大意义。基于覆盖全基因组的高密度SNP数据和大群体的性状表型记录，可通过全基因组关联分析技术(GWAS)(Hirschhorn,J.N.&Daly,M.J.Genome-wide association studies forcommon diseases and complex traits.Nat.Rev.Genet.6,95–108(2005))准确定位控制性状的候选基因。尽管该技术仍然存在一些缺陷(De,R.,Bush,W.S.&Moore,J.H.Bioinformatics challenges in genome-wide association studies(GWAS).Methods Mol.Biol.1168,63–81(2014))，其已被广泛应用于人类复杂疾病候选基因挖掘和畜禽重要经济性状关键基因的定位。经典的GWAS一般基于Plink(Purcell,S.etal.PLINK:A Tool Set for Whole-Genome Association and Population-Based LinkageAnalyses.Am.J.Hum.Genet.813,559–575(2007))等软件对所有标记逐个进行单标记回归分析，继而设定一个显著阈值来筛选显著位点。这类方法往往面临计算强度大、过高估计标记效应、显著性阈值设定不合理等问题。为了进一步提高GWAS的效率，新方法和软件不断被提出。其中，一步法全基因组关联分析(wssGWAS(WANG,H.,MISZTAL,I.,AGUILAR,I.,LEGARRA,A.&MUIR,W.M.Genome-wide association mapping including phenotypes fromrelatives without genotypes.Genet Res 94,73–83(2012)；Wang,H.et al.Genome-wideassociation mapping including phenotypes from relatives without genotypes ina single-step(ssGWAS)for 6-week body weight in broilerchickens.Front.Genet.5,1–10(2014)))同时利用系谱、历史个体表型记录和基因型数据进行关联分析，适用于大量个体拥有表型记录而只有少量个体拥有基因型数据的情况，尤其适用于畜禽重要经济性状的全基因组关联分析。基于GBLUPf90软件(Misztal,I.etal.BLUPF90 and related programs(BGF90).in Proc.7th WorldCongr.Genet.Appl.Livest.Prod.21–22(2002).doi:9782738010520)，可轻易实现wssGWAS。利用wssGWAS筛选出与猪饲料增重比相关的SNP分子标记，为家猪饲料效率性状的遗传选量提供了一种可行途径，对养猪业具有重要意义。
发明内容
针对上述技术问题，本公开提供FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记，SNP遗传标记即SNP分子遗传标记，通过鉴定了一个影响公猪饲料增重比的SNP分子遗传标记ASGA0092975，并进行公猪饲料增重比与全基因组分子遗传标记的关联分析，筛选出影响猪饲料增重比的大效应分子遗传标记，位于FA2H基因内含子序列，该位置为一个C>T突变，标记是有利于降低饲料增重比的等位基因，其中涉及的ASGA0092975遗传标记即SNP号为ASGA0092975的突变位点,见NCBI中猪基因组数据库(Sscrofa11.1)。
本公开涉及的SNP遗传标记(SNP分子遗传标记，ASGA0092975标记)，参阅Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Search/New？db＝core)，得到登录号为ASGA0092975的FA2H基因片段(RS号为rs81311825)，ASGA0092975位于猪6号染色体12904530bp位置，且属于FA2H基因内含子序列，该位置为一个C>T突变(突变位点)，C>T即C为大频率的等位基因，T为小频率的等位基因，符号>为等位基因频率大小。该SNP分子遗传标记的突变位点的上下游100bp的核苷酸序列如下：
5’-TGGCACCTGATGATCCTTAAATCTCCCCCCCGTCTGGCCCCCGGGGCTGATCATCTTCAGGTTTGTCACATCTGCCTCATAAACTCTGACATATGAAGTGR(T/C)TGGTCCAGCTGTCTCTCTCCGGGTTTTCCTGACCCCCTGCCCCATCCCTGGCTTTCGACATCTTCCACCAACAGCCCCCCGGCTCTGCTGCCTTCCTCAG-3’；R为突变位点，上述序列101位核苷酸处的R是C或T时，即R(T/C)时，导致上述序列多态性；当上述核苷酸序列的第101位核苷酸为T时，猪具有更低的饲料增重比，5’-和-3’分别表示核苷酸序列的5’端和3’端。
上述ASGA0092975标记基因型CC与TT公猪个体间饲料增重比相差0.14，TT个体比CC个体饲料增重比降低了6.57％，所以，T是有利于降低饲料增重比的等位基因，通过选留TT纯合种猪，降低饲料增重比，有效减少饲料消耗量和养殖成本，由于具有更低的饲料增重比提高了猪饲料转化率(由于猪的DNA是反向螺旋双链结构，两条链的突变位点核苷酸均为T时为TT基因型纯合猪，其中，每一条链有一个核苷酸序列，T表示一个突变位点为T，TT基因型是双链的突变位点都是T的纯合猪，同理，CC基因型为双链的突变位点都是C的纯合猪；CT基因型为一条链的突变位点是T另一条的突变位点是C的猪)。
筛选FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记的方法具体包括以下步骤：
1、分子标记的获得的流程步骤
1.1、采集公猪的耳组织样品或者血样，提取总DNA，并对DNA进行质量检测。采用GGP 50k SNP(GeneSeek，US)芯片进行基因分型，获得覆盖全基因组的SNP标记基因型。
1.2、根据最新版的猪参考基因组(Sscrofa11.1)，采用NCBI基因组比对程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对所有SNP标记的物理位置进行更新。基因组位置未知的SNP不用于关联分析。
1.3、对于所有常染色体上的SNP标记，利用Plink软件进行质量控制，标准为：个体检出率≥90％；SNP检出率≥90％；小等位基因频率≥0.01；哈迪-温伯格平衡p值≥10-6。对于缺失基因型，采用Beagle软件(version 4.1)进行填充。
2、分子标记的验证的流程步骤
2.1、整理种猪系谱，主要包括公猪个体号、父亲、母亲和初生日期等信息。采用公式对奥饲本(Osbern)全自动种猪生产性能测定系统(FIRE，美国)记录的生长数据进行分析获得饲料增重比表型数据，用于表型-基因型关联分析。其中，FCR为饲料增重比；Wa为活体增重量；Wf为饲料消耗量。
2.2、统计模型，采用加权的一步法全基因组关联分析法(weighted single stepgenome-wide association study,wssGWAS)进行全基因组关联分析。该方法首先基于混合模型方程组来估计个体育种值，继而基于育种值模型与标记效应模型的等价关系将育种值转换为标记效应。本发明采用的全基因组关联分析模型如下：
y＝Xb+Za+Wp+e，
其中，y为饲料增重比观测值向量；X，Z和W为设计矩阵；b为固定效应向量(环境、日龄)；为育种值向量；为个体永久环境效应；为残差。H为同时整合系谱和SNP标记的亲缘关系矩阵，其逆矩阵计算公式如下：
其中，A为基于系谱的亲缘关系矩阵；A22为A中有基因型个体对应的分块矩阵；Gω＝0.9G+0.1A22，为基于全基因组SNP标记的亲缘关系矩，Z为小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)校正后的基因型矩阵，其中0-2p，1-2p和2-2p分别代表AA，Aa和aa三种基因型，p为小等位基因频率；D为对角线矩阵，表示SNP的权重；pi为第i个标记的小等位基因频率；m为标记数量。
对于上述混合模型，采用AI-REML(average information restricted maximumlikelihood)法估计方差组分，并通过求解混合模型方程组获得育种值。通过迭代的方式获得标记权重，主要步骤如下：
第1步：初始化(t＝1)，D(t)＝I，G(t)＝λZD(t)Z′，
第2步：通过ssGBLUP计算个体育种值；
第3步：通过公式将个体育种值转换为SNP效应，其中为有基因型个体的育种值；
第4步：利用公式计算SNP权重用于下一轮迭代；
第5步：利用公式对SNP权重进行标准化，以保证方差一致；
第6步：利用公式G(t+1)＝λZD(t+1)Z′计算亲缘关系矩阵用于下一轮迭代；
第7步：令t＝t+1，并从第2步开始下一轮迭代。
上述步骤迭代三次，最终获得SNP标记效应。将第三轮迭代输出的标记效应作为最终的结果。计算过程主要通过在R统计分析平台编程调用BLUPF90软件来实现，其中AIREMLF90程序用于方差组分估计，BLUPF90程序用于计算育种值，postGSf90用于计算标记效应。
3、标记筛选
对于所有标记的效应值，取其绝对值画曼哈顿图，展示和筛选大效应的SNP标记。并采用方差分析和多重比较(R统计分析平台)，分析ASGA0092975标记不同基因型群体公猪饲料增重比差异情况。
本公开的有益效果为：本公开提供了FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记，通过检测该分子标记，可以应用于种猪的选育，选留低饲料增重比的纯合猪，可有效降低生产过程中饲料消耗量，降低养猪生产成本，提高企业经济效益和竞争力，加快高饲料利用效率品系的选育进度，该标记不同基因型公猪的饲料增重比有显著差异；ASGA0092975标记基因型CC与TT公猪个体间饲料增重比相差0.14，TT个体比CC个体饲料增重比降低了6.57％，所以，T是有利于降低饲料增重比的等位基因；通过检测ASGA0092975标记基因型辅助种猪选育，可通过选留TT纯合种猪进入核心群，降低饲料增重比，有效减少饲料消耗量和养殖成本；在杜长大商品猪群体中，TT个体比CC个体的饲料增重比极显著降低，TT基因型猪的饲料增重比比CC基因型猪降低0.08，日均采食量降低了187.83g/天；所以，该SNP位点显著降低了家猪的饲料增重比，同时，验证了T是有利于降低饲料增重比和平均日采食量的等位基因。
附图说明
通过对结合附图所示出的实施方式进行详细说明，本公开的上述以及其他特征将更加明显，本公开附图中相同的参考标号表示相同或相似的元素，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，在附图中：
图1所示为本公开的筛选FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记的方法工作流程图；
图2所示为本公开的ASGA0092975标记基因组位置及饲料增重比全基因组SNP效应分布。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本公开的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本公开的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
如图1所示为根据本公开的筛选FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记的方法工作流程图，下面结合图1来阐述根据本公开的筛选FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记的方法。
本公开筛选FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记的方法，具体包括以下步骤：
(1)表型-系谱数据采集
本公开的基础研究群体为杜洛克公猪，全部来自广西某核心种猪场。完整系谱中包含4个世代735头种猪，其中2015-2018年间记录了370头杜洛克公猪的饲料增重比性状表型数据。验证群体为杜长大商品猪，记录了1157头商品猪(577头母猪，582头公猪)的饲料增重比等性状表型数据。饲料增重比采用公式对奥饲本(Osbern)全自动种猪生产性能测定系统(FIRE，美国)记录的生长数据进行分析获得，用于表型-基因型关联分析。其中，FCR为饲料增重比；Wa为活体增重量；Wf为饲料消耗量。
(2)基因分型与质量控制
采集1733头猪的耳组织样品或者血样，提取总DNA，并采用GGP 50k SNP(GeneSeek，US)芯片进行基因分型，获得覆盖全基因组的50705个SNP标记。根据最新版的猪参考基因组(Sscrofa11.1)，采用NCBI基因组比对程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对所有SNP标记的物理位置进行更新。基因组位置未知的SNP不用于关联分析。对于所有常染色体上的SNP标记，利用Plink软件进行质量控制，标准为：个体检出率≥90％；SNP检出率≥90％；小等位基因频率≥0.01；哈迪-温伯格平衡p值≥10-6。对于缺失基因型，采用Beagle软件(version 4.1)进行填充。基于以上质量控制标准，剩余1623头公猪和28289个SNP标记用于关联分析。
(3)统计模型
为了充分利用所有表型数据和基因型数据，本发明公开采用加权的一步法全基因组关联分析法(weighted single step genome-wide association study,wssGWAS)进行全基因组关联分析。该方法首先基于混合模型方程组来估计个体育种值，继而基于育种值模型与标记效应模型的等价关系将育种值转换为标记效应。本发明采用的全基因组关联分析模型如下：
y＝Xb+Za+Wp+e，
其中，y为饲料增重比观测值向量；X，Z和W为设计矩阵；b为固定效应向量(环境、日龄)；为育种值向量；为个体永久环境效应；为残差。H为同时整合系谱和SNP标记的亲缘关系矩阵，其逆矩阵计算公式如下：
其中，A为基于系谱的亲缘关系矩阵；A22为A中有基因型个体对应的分块矩阵；Gω＝0.9G+0.1A22，为基于全基因组SNP标记的亲缘关系矩，Z为小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)校正后的基因型矩阵，其中0-2p，1-2p和2-2p分别代表AA，Aa和aa三种基因型，p为小等位基因频率；D为对角线矩阵，表示SNP的权重；pi为第i个标记的小等位基因频率；m为标记数量。
对应上述混合模型，采用AI-REML(average information restricted maximumlikelihood)法估计方差组分，并通过求解混合模型方程组获得育种值。通过迭代的方式获得标记权重，主要步骤如下：
第1步：初始化(t＝1)，D(t)＝I，G(t)＝λZD(t)Z′，
第2步：通过ssGBLUP计算个体育种值；
第3步：通过公式将个体育种值转换为SNP效应，其中为有基因型个体的育种值；
第4步：利用公式计算SNP权重用于下一轮迭代；
第5步：利用公式对SNP权重进行标准化，以保证方差一致；
第6步：利用公式G(t+1)＝λZD(t+1)Z′计算亲缘关系矩阵用于下一轮迭代；
第7步：令t＝t+1，并从第2步开始下一轮迭代。
上述步骤迭代三次，最终获得SNP标记效应，即得到SNP标记效应。将第三轮迭代输出的标记效应作为最终的结果。计算过程主要通过在R统计分析平台编程调用BLUPF90软件来实现，其中AIREMLF90程序用于方差组分估计，BLUPF90程序用于计算育种值，postGSf90用于计算标记效应。
(4)标记筛选
对于所有标记的效应值，取其绝对值画曼哈顿图，展示和筛选大效应的SNP标记。并采用方差分析和多重比较(R统计分析平台)，分析ASGA0092975标记不同基因型群体公猪饲料增重比差异情况。
分析不同基因型公猪饲料增重比
对于所有标记的效应值，取其绝对值画曼哈顿图，展示和筛选大效应的SNP标记(如图2所示，图2所示为本公开的ASGA0092975标记基因组位置及饲料增重比全基因组SNP效应分布)。并采用方差分析和多重比较(R统计分析平台)，分析不同基因型群体公猪饲料增重比差异情况(表1)。
FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记在猪饲料转化率辅助选择中的应用：
本公开鉴定了一个影响公猪饲料增重比的分子标记ASGA0092975，由表1可知，该标记不同基因型公猪的饲料增重比有显著差异(表1为ASGA0092975标记不同基因型杜洛克公猪饲料增重比)；
表1 ASGA0092975标记不同基因型杜洛克公猪饲料增重比
ASGA0092975标记基因型CC与TT公猪个体间饲料增重比相差0.14，TT个体比CC个体饲料增重比降低了6.57％，杜长大商品猪群体的TT个体比CC个体饲料增重比降低了0.08，日均采食量降低了187.83g/天，所以，T是有利于降低饲料增重比的等位基因；
通过检测ASGA0092975标记基因型辅助种猪选育，可通过选留TT纯合种猪进入核心群，降低饲料增重比，有效减少饲料消耗量和养殖成本，由于具有更低的饲料增重比提高了猪饲料转化率；
由表2可知(表2为ASGA0092975标记不同基因型杜长大商品猪饲料增重比)，在杜长大商品猪群体中，具有ASGA0092975位点多态性的TT基因型猪的饲料增重比比CC基因型猪降低0.08，日均采食量降低了187.83g/天；所以，该SNP位点显著降低了家猪的饲料增重比，同时，验证了T是有利于降低饲料增重比和平均日采食量的等位基因。
表2 ASGA0092975标记不同基因型杜长大商品猪饲料增重比
本公开的SNP分子遗传标记(ASGA0092975标记)位于猪6号染色体12904530bp位置，且属于FA2H基因内含子序列，该位置为一个C>T突变(突变位点)。该SNP分子遗传标记的突变位点的上下游100bp的核苷酸序列如下：
5’-TGGCACCTGATGATCCTTAAATCTCCCCCCCGTCTGGCCCCCGGGGCTGATCATCTTCAGGTTTGTCACATCTGCCTCATAAACTCTGACATATGAAGTGR(T/C)TGGTCCAGCTGTCTCTCTCCGGGTTTTCCTGACCCCCTGCCCCATCCCTGGCTTTCGACATCTTCCACCAACAGCCCCCCGGCTCTGCTGCCTTCCTCAG-3’；R为突变位点，上述序列101位核苷酸处的R是C或T时，即R(T/C)时，导致上述序列多态性；当上述核苷酸序列的第101位核苷酸为T时，猪具有更低的饲料增重比，5’-和-3’分别表示核苷酸序列的5’端和3’端。
(上述序列在突变点位为T时的序列如序列表SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列),序列表SEQ IDNo.1是本发明筛选得ASGA0092975遗传标记(即RS号为rs81311825)的突变位点上下游100bp的核苷酸序列。
主要参考文献：
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序列表
<110> 佛山科学技术学院
<120> FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记
<141> 2019-06-05
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> Sscrofa11.1
<220>
<221> gene
<222> (1)..(201)
<220>
<221> mutation
<222> (101)..(101)
<400> 1
tggcacctga tgatccttaa atctcccccc cgtctggccc ccggggctga tcatcttcag 60
gtttgtcaca tctgcctcat aaactctgac atatgaagtg ttggtccagc tgtctctctc 120
cgggttttcc tgaccccctg ccccatccct ggctttcgac atcttccacc aacagccccc 180
cggctctgct gccttcctca g 201
Claims (5)
1.FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记，其特征在于，所述SNP遗传标记位于猪6号染色体12904530bp位置，且属于FA2H基因内含子序列，该位置为一个C>T突变，猪参考基因组为Sscrofa11.1。
2.根据权利要求1所述的FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记，其特征在于，所述SNP遗传标记的序列为突变位点的上下游100bp序列。
3.根据权利要求2所述的FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记，其特征在于，所述SNP遗传标记的序列为以下所示：
5’-TGGCACCTGATGATCCTTAAATCTCCCCCCCGTCTGGCCCCCGGGGCTGATCATCTTCAGGTTTGTCACATCTGCCTCATAAACTCTGACATATGAAGTGRTGGTCCAGCTGTCTCTCTCCGGGTTTTCCTGACCCCCTGCCCCATCCCTGGCTTTCGACATCTTCCACCAACAGCCCCCCGGCTCTGCTGCCTTCCTCAG-3’；R为突变位点，当R为T时，猪具有更低的饲料增重比。
4.权利要求3所述的FA2H基因片段中与猪饲料转化相关的SNP遗传标记在猪饲料转化率辅助选择中的应用。
5.根据权利要求4所述的SNP遗传标记在猪饲料转化率辅助选择中的应用，其特征在于，SNP分子遗传标记的基因型CC与TT公猪个体间饲料增重比相差0.14，TT个体比CC个体饲料增重比降低了6.57％；杜长大商品猪群体的TT个体比CC个体饲料增重比降低了0.08，日均采食量降低了187.83g/天，通过选留TT纯合种猪，降低饲料增重比，有效减少饲料消耗量和养殖成本，由于具有更低的饲料增重比提高了猪饲料转化率。
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