CN111763750A

CN111763750A - 一种与猪低胆固醇相关的基因标志物组合及检测试剂盒

Info

Publication number: CN111763750A
Application number: CN202010827041.3A
Authority: CN
Inventors: 赵桂英; 段博芳; 相德才; 段纲; 翁亚烦
Original assignee: Yunnan Animal Epidemic Disease Prevention Control Center; Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Animal Epidemic Disease Prevention Control Center; Yunnan Agricultural University
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2020-10-13

Abstract

本发明公开了一种与猪低胆固醇相关的基因标志物组合及检测试剂盒，属于猪养殖领域。所述基因标志物组合包括基因ADACL、LPL和FABP4，所述检测试剂盒包括检测所述基因ADACL、LPL和FABP4的试剂。利用本发明，可以快速确定猪的低胆固醇，为猪育种提供有力支持。

Description

一种与猪低胆固醇相关的基因标志物组合及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及猪养殖领域，具体地，涉及一种与猪低胆固醇相关的基因标志物组合及检测试剂盒。

背景技术

脂类与葡萄糖、蛋白质一起在维持机体功能、能量代谢方面发挥着重要作用，脂类包括油脂和类脂，类脂又包括磷脂和固醇。胆固醇与动脉粥样硬化、心肌梗塞和冠心病等疾病密切相关，猪肉是外源性胆固醇的最主要来源之一，临床检查发现，90％的阿尔美兹海默症患者在生前存在粥样动脉硬化，进一步的研究发现高胆固醇摄入可以增加阿尔美兹海默症的发生。

猪肉是我国消费量最大的肉类，也是外源性胆固醇的最主要来源之一，因此，从改善人们饮食和健康的角度出发，开发低胆固醇猪肉及猪肉制品具有重要的现实意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种与猪低胆固醇相关的基因标志物组合，所述基因标志物组合包括基因ADACL、LPL和FABP4。

本发明第二方面提供一种检测权利要求1所述基因标志物组合的试剂盒，包括检测所述基因ADACL、LPL和FABP4的试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为分别用于扩增所述基因ADACL、LPL和FABP4的引物对。

在本发明的一些具体实施方案中，用于扩增基因ADACL的引物对包括具有SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物组成。

在本发明的一些具体实施方案中，用于扩增基因LPL的引物对包括具有SEQ IDNo.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列的上游引物组成。

在本发明的一些具体实施方案中，用于扩增基因FABP4的引物对包括具有SEQ IDNo.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.6所示核苷酸序列的上游引物组成。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于扩增内参基因ATCB的引物对。

在本发明的一些具体实施方案中，用于扩增基因ATCB的引物对包括具有SEQ IDNo.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.8所示核苷酸序列的上游引物组成。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括组织RNA提取试剂盒。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括反转录试剂。

本发明的有益效果

利用本发明，可以快速确定猪的低胆固醇，为猪育种提供有力支持。

附图说明

图1示出了RPKM值箱线图。

图2示出了RPKM值密度分布曲线。

图3示出了样本生物学重复相关性检测。

图4示出了肌肉组织差异表达基因散点图。

图5示出了背脂组织差异表达基因散点图。

图6示出了肝脏组织差异表达基因散点图。

图7示出了差异基因聚类热图。

图8示出了两个猪种3个组织上调基因GO分析。

图9示出了两个猪种3个组织下调基因GO分析。

图10示出了鉴定影响火毛撒坝猪胆固醇含量的关键基因韦恩图分析。

图11示出了RNA-seq与qRT-PCR基因差异倍数的比较。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

1方法

1.1试验动物与样品采集

试验动物：选用胎次、产仔日期相近的火毛撒坝猪和杜洛克猪各10头(5♂，5♀)70日龄健康仔猪作为试验动物，在相同的饲养管理条件下进行饲养。火毛撒坝猪由楚雄双柏县鄂嘉镇哀牢山生态畜牧养殖发展有限公司提供，杜洛克猪由昆明正邦有限公司提供。

260日龄饲养试验结束(火毛撒坝猪体重近90kg，杜洛克猪体重近110kg，两个猪种的体重符合屠宰指标)，随机屠宰火毛撒坝猪4头(2♂，2♀)、杜洛克猪4头(2♂，2♀)，取背最长肌、背脂、肝脏三个组织的RNA样品，置于RNase-Free的冻存管中，放进液氮中暂存，之后转于-80℃的超低温冰箱储存，备用；另取每头猪倒数第二、三肋骨处背最长肌500g作为后期胆固醇含量检测的样品，放在-20℃冰箱里保存，备用。

1.2胆固醇含量测定

胆固醇含量由中国广州分析测试中心进行检测：参照食品中胆固醇的检测标准(GB 5009.128-2016)，利用气相色谱法进行测定。

1.3总RNA的提取

火毛撒坝猪、杜洛克猪背最长肌、背脂、肝脏组织总RNA的提取参照TIANGEN DP419试剂盒说明书的方法进行。

1.4文库制备及上机测序

总RNA样本经检测合格后，进行RNA建库、上机测序。首先检测合格的火毛撒坝猪、杜洛克猪3个组织样品的mRNA进行富集，然后通过相关试剂把mRNA打成片段；其次是每个样品中片段化的mRNA合成双链cDNA，并对获得的双链cDNA进行处理；然后回收并扩增所有的目的片段；最后对两个猪种所构建的文库进行检测，合格的文库进行上机测序。。

1.5 RNA-seq生物信息学分析

火毛撒坝猪、杜洛克猪的背最长肌、背脂、肝脏组织通过高通量转录组测序获得原始序列后，参考猪基因组序列(GCA_000003025.6Sscrofa11.1)进行生物信息分析，包括对获得的全部初始数据进行过滤、纯净读序列质控后与参考基因组的序列进行比对、分析火毛撒坝猪和杜洛克猪间3个组织中基因差异表达的情况、筛选差异表达基因、注释到生物功能及通路。

(1)原始数据质控：测序得到的原始Reads文件的质量评估是通过Fast QC分析软件进行的，该软件提供了一种简单的方式来评估数据质量，用于指导下游分析。测序得到的raw reads包含一些带接头，重复的、低质量的reads，这些序列会对后续的信息分析造成很大的干扰，需要对测序数据进行进一步过滤，使用Trimmomatic软件对raw data进行Clean。

(2)测序reads的比对及基因表达量统计：利用STAR软件(版本2.5.3a)将火毛撒坝猪和杜洛克猪获得的clean reads比对到参考基因组Sus scrofa11.1(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/variation/gvf/sus_scrofa/)上，得到全面的转录本信息，并统计比对结果。再通过featureCounts(Subread-1.5.1，Bioconductor)对映射到每个基因外显子区域的读数进行计数，然后计算RPKM。

(3)火毛撒坝猪和杜洛克猪基因差异表达分析：差异表达基因(DifferentiallyExpressed Genes，DEGs)是指两个猪种样品间上调表达的基因和下调表达基因的汇总。本研究使用edgeR软件(版本3.12.1)分析基因在各样本中的差异表达情况，差异基因通过筛选阈值|logFC|≥1且FDR≤0.05为表达量显著差异的基因。

(4)两个猪种间差异基因的GO功能注释：基因本体论数据库(Gene Ontology，http://www.geneontology.org)，简称GO数据库，分为彼此间紧密联系的3类，细胞组分(Cellular Component，CC)，表示基因产物在细胞中的位置；分子功能(MolecularFunction，MF)，描述基于或基因产物的生物学活性和功能；生物过程(BiologicalProcess，BP)，该过程是由多种分子功能有序组成的。将基因按照其参与的GO条目进行功能分类注释。对获得的GO terms进行统计分析，首先计算每个GO term注释到的差异基因及数目，其次应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，差异表达基因中显著富集的GO条目，从而找出火毛撒坝猪和杜洛克猪种间差异表达基因显著相关的生物学功能，P<0.05时，该条目作为显著条目。

(5)两个猪种间差异表达基因的KEGG pathway富集分析：京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库(http://www.genome.jp/kegg/)，通过分子网络(KEGG路径图)和分层形式(功能层次)，整合了细胞功能和生物体特性知识，是通路代谢分析的主要数据库。利用KOBAS软件对差异表达的基因进行通路分析，通过与整个基因组背景相比找出显著富集的通路，FDR<0.05时，该通路为差异表达基因显著富集的通路，其中FDR值是校正后的P值。

1.6差异基因的荧光定量验证

根据火毛撒坝猪、杜洛克猪3个组织差异表达基因的GO功能注释、KEGG通路富集分析的结果，筛选了ACADL、LPL、FABP4基因，ACTB(β-actin)基因作为内参基因，进行Real-time PCR检测，以验证RNA-seq结果是否准确。具体过程如下：

(1))cDNA的获得：ACADL、LPL、FABP4、ACTB基因通过TSK302S试剂盒说明书的方法进行，首先制得体系Ⅰ，如下：

将制得的体系Ⅰ先在42℃水浴锅中孵育2min随后转到60℃的水浴锅孵育5min，然后加入以下组分，混匀后25℃孵育10min，接着55℃孵育30min，最后85℃孵育5min后冷藏备用。

(2)引物：引物设计由Primer 5.0软件完成，设计完成后由华大基因生物科技有限公司进行合成，上、下游引物的序列及相应的PCR退火温度见表1。

表1引物序列

(3)qRT-PCR体系(10μl)：参照试剂盒(TSE202)说明书的方法进行配制，体系如下：

(4)qRT-PCR扩增条件：参照TSE202试剂盒说明书的方法进行qRT-PCR扩增，反应条件如表2。

表2 qRT-PCR扩增条件

1.7数据的统计与分析

(1)使用Excel表格整理火毛撒坝猪和杜洛克猪的数据，用SAS9.0软件t检验10的TTEST程序对数据资料进行差异显著性检验，试验数据以“平均数±标准误(X±SE)”表示。

(2)以RPKM(Reads per Kilobase per Million Reads)值，即每一百万个比对上基因组的读段中比对到转录本的每一千个碱基上的读段个数，作为基因表达量的衡量指标。RPKM计算方法为：

(3)GO和KEGG进行超几何检验时，P值的计算公式如下：

GO分析时，式中N代表全部基因中GO注释到的基因数目，n代表N中差异表达基因的数目，M代表全部基因中富集到某特定GO term的基因数目，m代表富集到某特定GO term的差异表达基因数目；KEGG分析时，式中N代表全部基因中通路注释到的基因数目，n代表N中差异表达基因的数目，M代表全部基因中注释为某特定通路的基因数目，m代表注释为某特定通路的差异表达基因数目。

(4)荧光定量试验中，以ACTB(β-actin)作为内参基因，Ct值代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，利用-ΔΔCt值计算试验组与对照组之间的差异倍数。计算公式如下：

ΔCt＝Ct_目的基因－Ct_内参基因；

－ΔΔCt＝－(ΔCt_实验组－ΔCt_对照组)

2.结果

2.1火毛撒坝猪与杜洛克猪胆固醇含量的比较分析

本发明对火毛撒坝猪和杜洛克猪背最长肌的胆固醇含量进行检测，通过比较分析，结果表明火毛撒坝猪最长肌中的胆固醇含量为22.25±1.109mg/100g，而杜洛克猪的胆固醇含量为53.25±2.86mg/100g，两个猪种之间胆固醇含量差异极显著(P<0.01)，如图1所示。

2.2测序数据及其质量控制

本研究对4头火毛撒坝猪和4头杜洛克猪的背最长肌、背脂和肝脏三个组织，共24个样品进行了转录组测序。火毛撒坝猪和杜洛克猪的过滤后的序列数(clean reads)在背最长肌中分别有95362436.5条、82899945.6条；背脂中分别有92406291条、70180652条；肝脏中分别有9079850.5条、75399747条，过滤后序列总数所占的比例(clean reads rate)均在73％以上。对碱基分布和测序数据质量值进行分析，发现GC含量均在50％左右；Q30是指分别计算过滤后序列中碱基质量大于30的碱基所占的比例，本次试验结果均在90％以上，证明测序的数据质量是可靠的，可进行后续的数据分析。

2.3序列比对

过滤掉质量低的测序数据，将火毛撒坝猪、杜洛克猪的高质量纯净序列(cleandata)比对到猪参考基因组(sus scrofa 11.1)上，结果表明每个样品获得的序列能够映射到猪参考基因组上所占的比例(total_mapped)均在95％以上、未能比对上的序列数目所占比例(un_mapped_reads)均在5％以下，在参考序列上有多个比对位置的序列数目的比例(non_unique)均在10％以下、只有一个比对位置的序列数目比例(unique)均在90％以上；样品测序是从序列的两端同时进行的，每个样品获得的序列数分别用read1、read2表示，read1(％)、read2(％)是两端序列分别定位到猪参考基因组上的比例，两部分比例应该大体相同，本次试验所测得的两个猪种的三个部位的read1(％)、read2(％)均占50％左右(表3)。以上这些数据均表明本次获得的转录组数据利用率高，每个样品所构建的RNA文库质量高，选择的参考基因组能够满足火毛撒坝猪和杜洛克猪转录组测序后续分析的需求。

表3序列在参考基因组上的比对情况

2.4基因表达水平和相关性分析

2.4.1基因表达水平

火毛撒坝猪和杜洛克猪的基因表达水平以箱线图和密度图进行展示。在箱线图中，横坐标为两个猪种的3个组织样品名称，纵坐标表示log10(RPKM)，每个样品的箱线图对应5个统计量，这些样品的统计量基本上处于同一水平，表明火毛撒坝猪和杜洛克猪基因表达水平分布的离散程度较小，结果见图1。

密度图为火毛撒坝猪、杜洛克猪背最长肌、背脂、肝脏组织全部基因的表达量概率密度分布图，横坐标表示基因表达量(RPKM)以10为底的对数值，纵坐标则是基因数量与猪参考基因组片段长度的比值，即基因密度(图2)。火毛撒坝猪和杜洛克猪的样品由图中不同颜色表示，所有概率的总和为1，即图中每个区域的面积均为1；密度曲线的峰值表示两个猪种的不同样本基因表达量最集中的区域。

2.4.2样本生物学重复相关性检测

本试验用log2(RPKM)标准化后的基因表达值计算火毛撒坝猪、杜洛克猪样品间的相关系数。根据样本生物学重复相关性检测等分析发现，脂肪组织中，杜洛克猪样品D_1_Fat的重复性较差，现将其剔除，重新对两个猪种间3个组织的基因差异表达情况进行分析，结果显示两个猪种样品间基因表达水平相关性较高，整体上样品按组织分类聚在一起(图3)。

2.5背最长肌、背脂和肝脏组织的差异表达基因

2.5.1两个猪种3个组织差异基因的筛选

在本研究中，以|logFC|≥1且FDR≤0.05为条件对火毛撒坝猪和杜洛克猪的差异基因进行筛选，得到表达量差异显著的基因，且只对两个猪种间差异显著(P＜0.05)的基因进行分析。在火毛撒坝猪中上调的基因，在杜洛克猪中是下调的，反之亦然。两个猪种的背最长肌、背脂、肝脏三个组织中的差异表达基因的可视化结果全部采用散点图展示，散点图可以直观地反映出火毛撒坝猪和杜洛克猪3个组织中差异基因的情况，图中的横纵坐标分别表示试验组和对照组表达量RPKM的以2为底的对数；两个猪种的3个组织中未发生差异表达的基因用灰色点表示，火毛撒坝猪上调差异表达的基因用红色点表示、下调差异表达的基因用蓝色点表示；左上角标注了上下调基因的个数。

在背最长肌中，两个猪种间共鉴定出3683个显著的差异表达基因，以杜洛克猪为参照，火毛撒坝猪表达上调的基因有1516个、下调的基因2167个，可视化结果见图4。火毛撒坝猪主要的上调基因有Corf78、LDHB、TATDN1、MFAP1、ATP5ME、ZNHIT6等，下调基因有ZBTB20、GPC1、CHCHD5、SLC37A4、NARF、IRF7等。

在背脂组织中，两个猪种间共鉴定出3555个显著的差异表达基因，火毛撒坝猪与杜洛克猪相比较，上调基因有1820个，下调基因有1735个，可视化结果见图5。火毛撒坝猪主要的上调基因有Corf78、TTXNRD1、CD68、LDHB、FUS、ISCA2等，下调基因有FAM166B、ID1、NR4A3、CYP27A1、CYP21A2、RPL34、THAP3等。

在肝脏组织中，两个猪种间共鉴定出3554个显著的差异表达基因，火毛撒坝猪与杜洛克猪比较，1736个基因表达水平较高，1818个基因表达水平较低，可视化结果见图6。火毛撒坝猪主要的上调基因有Corf78、LDHB、ARSE、IL27RA、PALM3、SEC11A等，下调基因有GPC1、PHF20、MFAP4、MAPK7、SLC2A8、CYP21A2等。

2.5.2差异表达基因聚类分析

对火毛撒坝猪和杜洛克猪3个组织筛选到的差异表达基因进行聚类分析，衡量基因的表达情况(图7)。聚类热图中，x轴代表火毛撒坝猪和杜洛克猪3个组织的样本名称；y轴表示基因的聚类，表达模式相同或是越接近的基因聚集成类；色阶代表基因的表达丰度，红色表示表达上调，颜色越深上调越明显，蓝色表示表达下调，同理颜色越深下调越明显。火毛撒坝猪和杜洛克猪3个组织中的差异表达基因聚到同一类的，表明这些基因可能在某方面的功能具有相似的作用，又可能是在同一代谢过程或分子机制中发挥作用。

2.6三个组织差异表达基因GO功能富集分析

对火毛撒坝猪和杜洛克猪的背最长肌、背脂、肝脏组织的差异表达基因进行功能注释。结果表明，在上调差异表达基因中，3个组织显著富集的GO条目均是以生物过程(BP)为主，均呈现出生物过程(BP)>细胞组分(CC)>分子功能(MF)的趋势，如图8所示。而在下调差异表达基因中，与上调差异表达基因富集到的结果有着相似的趋势，同样也是生物过程(BP)富集到的GO条目最多，细胞组分(CC)和分子功能(MF)富集到的条目最少，如图9所示。由此可以得出，生物过程(BP)是火毛撒坝猪、杜洛克猪在3个组织中差异表达基因行使的主要生物学功能。

2.6.1两个猪种肌肉组织中差异表达基因的功能富集分析

火毛撒坝猪背最长肌上调差异表达基因中共富集到297个显著的GO条目，最显著的前20个GO条目如表4所示。生物过程(BP)主要富集在电子传递链、呼吸电子传递链、mRNA加工等条目；分子功能(MF)主要富集在RNA结合等条目；细胞组分(CC)主要富集在呼吸链、线粒体、核糖核蛋白复合物、剪接体复合物、大分子复合物等条目。富集到的差异表达基因中涉及到ACADL、LPL、SCD、LBR、STX12等与线粒体、大分子复合物、细胞器部分等GO条目相关的基因。

表4火毛撒坝猪背肌上调差异表达基因中显著的条目

火毛撒坝猪背最长肌下调差异表达基因中共富集到217个显著的GO条目，最显著的前20个GO条目如表5所示。生物过程(BP)主要富集在细胞对生物刺激的反应、响应DNA损伤的信号转导、细胞分解代谢过程的负调节、蛋白质分解代谢过程的负调节等条目；分子功能(MF)主要富集核糖体的结构成分，结构分子活性，GTP酶结合，Ras GTP酶结合，小GTP酶结合等条目；细胞组分(CC)主要富集在胞质部分、胞质核糖体、核糖体亚基、细胞质及细胞质小核糖体亚基等条目。富集到的差异表达基因中涉及到STAR、CAV3、DHCR24、LIPE、TGFB1等与核糖体的结构成分、酶结合、细胞对生物刺激的反应等GO条目相关的基因。

表5火毛撒坝猪肌肉下调差异表达基因显著的条目

从火毛撒坝猪背最长肌上、下调差异表达基因中发现5个GO条目与脂代谢相关，包括酰基辅酶A的生物合成过程(acyl-CoAbiosynthetic process)、乙酰辅酶A生物合成过程(acetyl-CoA biosynthetic process)、酰基辅酶A脱氢酶活性(acyl-CoA dehydrogenaseactivity)、乙酰辅酶A代谢过程(acetyl-CoA metabolic process)、使用酰基辅酶A脱氢酶进行脂肪酸β-氧化(fatty acid beta-oxidation using acyl-CoA dehydrogenase)。

2.6.2两个猪种背脂中差异表达基因的功能富集分析

火毛撒坝猪背脂组织上调差异表达基因中共富集到372个显著的GO条目，最显著的前20个GO条目如表6所示。生物过程(BP)主要富集主要氧化还原过程、细胞内运输、细胞内蛋白质转运、细胞蛋白定位、细胞大分子定位等条目；分子功能(MF)主要富集在氧化还原酶活性、辅因子结合等条目；细胞组分(CC)主要富集在细胞质部分、线粒体、细胞质、细胞器部分等条目。富集到的差异表达基因中涉及到LSS、OSBP、DHCR24、ACADL、NPC1、FABP4、STX12等与细胞质，细胞蛋白定位，氧化还原酶活性等GO条目相关的基因。

表6火毛撒坝猪脂肪上调差异表达基因显著富集的条目

火毛撒坝猪背脂下调差异表达基因中共富集到280个显著的GO条目，最显著的前20个GO条目如表7所示。生物过程(BP)主要富集在组织发育、循环系统发育、心血管系统发育、血管形态发生、血管生成、涉及形态发生的解剖结构形成、胚胎发育的调节、细胞质翻译、细胞表面受体信号通路、Notch信号通路的调节及脉管系统发育等条目；分子功能(MF)主要富集到核糖体的结构成分等条目；细胞组分(CC)主要富集在细胞溶质核糖体、细胞溶质大核糖体亚基、细胞质部分、核糖体等条目。注释到的差异表达基因中涉及到RPS11、SPDEF、LMO4、WNT6、ID1、PAK3、MAPK11等与组织发育、Notch信号通路的调控等GO条目相关的基因。

表7火毛撒坝猪脂肪下调调差异表达基因显著富集的条目

从火毛撒坝猪背脂上、下调差异表达基因中发现11个GO条目与脂代谢相关，包括脂酰辅酶A结合(fatty-acyl-CoAbinding)、脂肪酸β氧化(fatty acid beta-oxidation)、脂肪酸分解代谢过程(fatty acid catabolic process)、使用酰基辅酶A脱氢酶的脂肪酸β氧化(fatty acid beta-oxidation using acyl-CoA dehydrogenase)、脂质氧化(lipidoxidation)、乙酰辅酶A生物合成过程(acetyl-CoAbiosynthetic process)、细胞脂质分解代谢过程(cellular lipid catabolic process)、酰基辅酶A生物合成过程(acyl-CoAbiosynthetic process)、蛋白质脂质复合物结合(protein-lipid complex binding)、酰基辅酶A脱氢酶活性(acyl-CoAdehydrogenase activity)、脂蛋白颗粒结合(lipoproteinparticle binding)。

2.6.3两个猪种肝脏中差异表达基因的功能富集分析

火毛撒坝猪肝脏组织上调差异表达基因中共富集到263个显著的GO条目，最显著的前20个GO条目如表8所示。生物过程(BP)主要富集在氧化还原过程、细胞内运输、细胞内蛋白质转运、细胞蛋白定位、细胞大分子定位等条目；分子功能(MF)主要富集在RNA结合等条目；细胞组分(CC)主要富集在剪接体复合体、核糖核蛋白复合物、细胞器部分等条目。这些富集到的差异表达基因中涉及到OSBP、ACADL、CYP7A1、FABP4、LIPG等与细胞内细胞器部分等GO条目相关的基因。

表8火毛撒坝猪肝脏上调差异表达基因显著富集的条目

火毛撒坝猪下调差异表达基因中共富集到173个显著的GO条目，最显著的前20个GO条目如表9所示。生物过程(BP)主要性富集在非经典Wnt信号通路、经典Wnt信号通路调控、胚胎发育调控、发育诱导、胸腺T细胞分化等条目；分子功能(MF)主要富集在GTP酶结合、Ras GTP酶结合、小GTP酶结合及核糖体的结构成分等条目；细胞组分(CC)主要富集在胞质部分、细胞质核糖体、细胞外细胞器、收缩肌动蛋白丝束及细胞外囊泡等条目。富集到的差异表达基因中涉及到MKS1、FZD7、FZD8、SFRP5、DOC2A、RALBP1、LLGL1等与非经典的WNT信号通路、小GTP酶结合等GO条目相关的基因。

表9火毛撒坝猪肝脏下调差异表达基因中显著的GO条目

从火毛撒坝猪肝脏上、下调差异表达基因中发现6个GO条目与脂代谢相关，包括脂肪酸分解代谢过程(fatty acid catabolic process)、脂质氧化(lipid oxidation)、蛋白质-脂质复合物结合(protein-lipid complex binding)、酰基辅酶A脱氢酶活性27(acyl-CoA dehydrogenase activity)、脂蛋白颗粒结合(lipoprotein particle binding)、脂质稳态(lipid homeostasis)。

分析背最长肌、背脂、肝脏组织中富集到所有显著的功能条目，并未筛选到与胆固醇合成代谢直接相关的功能条目，但筛选到部分与乙酰辅酶A的合成代谢以及脂肪酸氧化、分解代谢等脂质代谢过程相关的GO功能条目，主要有酰基辅酶A脱氢酶活性、脂肪酰基辅酶A结合、脂肪酸β-氧化、脂质氧化、蛋白质-脂质复合物结合、细胞脂质分解代谢过程。其中酰基辅酶A脱氢酶活性(acyl-CoAdehydrogenase activity)是3个组织共有的GO条目，ETFA、ACADL基因是该条目中3个组织共同富集到的基因。

2.7差异表达基因的KEGG通路分析

首先，通过与整个基因组背景相比，应用超几何检验筛选出火毛撒坝猪、杜洛克猪背最长肌、背脂、肝脏组织的差异表达基因显著富集的Pathway，利用KEGG数据库进行通路分析。其次，本研究中以脂类代谢相关的通路作为目标通路，对3个组织富集到的全部显著的通路进行筛选，获得目标通路。

2.7.1背最长肌差异表达基因的KEGG通路分析

背最长肌组织中，通过分析，共发现了48条通路在火毛撒坝猪与杜洛克猪的差异表达基因中显著富集(上调差异表达基因中有23条，下调差异表达基因中有25条)，和6条目标通路，分别是脂肪酸代谢、PPAR信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸降解、脂肪酸延长、甘油磷脂代谢(表3-10)。

表10背最长肌中的目标通路

2.7.2背脂差异表达基因的KEGG通路分析

火毛撒坝猪与杜洛克猪的背脂组织差异表达基因通过KEGG数据库进行通路注释，显著富集到的通路共有73条(上调差异表达基因中有42条，下调差异表达基因中有31条)，共发现了8条目标通路，分别是脂肪酸降解、脂肪酸代谢、PPAR信号通路、甘油脂代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延长、磷脂酶D信号通路、初级的胆汁酸的生物合成(表11)。

表11背脂中的目标通路

2.7.3肝脏组织差异表达基因的KEGG通路分析

火毛撒坝猪与杜洛克猪的肝脏组织差异表达基因通过KEGG数据库进行通路注释，显著富集到的通路共有76条(上调差异表达基因中有52条，下调差异表达基因中有24条)，其中共发现了1条目标通路，即PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)。

综合以上背最长肌、背脂、肝脏3个组织的分析结果，发现上调差异表达基因中均富集到与脂类代谢相关的通路—PPAR信号通路，分析该通路，肌肉组织中富集到13个基因，背脂组织中富集到14个基因，肝脏组织中富集到20个基因，其中AQP7(Aquaporin 7)、LPL(Lipoprotein Lipase)、FABP4(Fatty Acid Binding Protein 4)、SLC27A6(SoluteCarrier Family 27Member 6)、ACADL(Acyl-CoA Dehydrogenase Long Chain)这5个基因是三个组织中共有的差异表达基因，结果见表12。

表12三个组织中的PPAR信号通路

2.8低胆固醇分子机制相关基因的鉴定

以|logFC|≥1且FDR≤0.05为筛选条件，初步筛选到部分与胆固醇合成代谢相关的基因，在两个猪种的肌肉组织差异表达基因中筛选到了27个基因，列举如下：ANXA6、CAV3、LAMTOR1、FABP4、SLC37A4、ACAT1、EHD1、MVD、PMVK、LIPE、CLN6、STX12、SCAP、DHCR24、SREBF2、STARD3、TGFB1、OSBPL5、DGKQ、LBR、STAR、DHCR7、FGF1、CYP39A1、ABCA1、SYP、LEPR，结果见表13。

表13肌肉组织中与胆固醇合成代谢相关的差异表达基因

在两个猪种的脂肪组织差异表达基因中筛选到了27个与胆固醇合成代谢相关的基因，列举如下：ACAT1、CH25H、AGT、CCR5、CYP39A1、CYP7B1、CYP8B1、DHCR24、DHCR7、EPHX2、FABP4、FGF1、G6PC、LCAT、LIPM、NFKBIA、NPC1、NPC1L1、OSBPL3、OSBPL5、OSBPL7、PPARA、SOAT1、STARD3、STX12、PLTP、LSS，结果见表14。

表14脂肪组织中与胆固醇合成代谢相关的差异表达基因

在两个猪种的肝脏组织差异表达基因中筛选到了23个与胆固醇合成代谢相关的基因，列举如下：MVD、HMGCR、TM7SF2、ABCA1、ABCA5、CYP7A1、ANXA6、APOD、CLN6、CYP39A1、DHCR7、EBP、FABP4、FGF1、HSD17B7、LIPE、LIPG、MED13、OSBPL5、SCAP、SLC37A4、STX12、SYP、TGFB1，结果见表15。

表15肝脏组织中与胆固醇合成代谢相关的差异表达基因

为了准确鉴定出可能影响火毛撒坝猪低胆固醇形成的关键基因，利用3个组织中筛选到的胆固醇合成代谢相关基因与3个组织中共有的PPAR信号通路涉及到29个的差异表达基因联合制出维恩图(图10)。图中，List1代表肌肉组织中与胆固醇相关的基因；List2代表背脂组织中与胆固醇相关的基因；List3代表肝脏组织中与胆固醇相关的基因；List4代表3个组织的PPAR信号通路中共有的基因。分析结果表明，6个基因出现在三个或更多的子集中，其中在棕色重叠区域标注的红圆圈代表脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(Adipocyte fattyacid-binding protein，FABP4)；在浅绿色重叠区域标注的红圆圈代表突触融合蛋白12(Syntaxin 12，STX12)、氧固醇样结合蛋白5(Oxysterol Binding Protein Like5，OSBPL5)、7-脱氢胆固醇还原酶(7-Dehydrocholesterol Reductase，DHCR7)、成纤维细胞生长因子1(Fibroblast GrowthFactor 1，FGF1)、细胞色素P450家族39亚家族A成员1(Cytochrome P450Family 39SubfamilyAMember 1，CYP39A1)。因此推测FABP4，STX12，OSBPL5，DHCR7，FGF1，CYP39A1这6个基因可能是影响火毛撒坝猪低胆固醇形成的分子机制的候选基因。

2.9荧光定量PCR验证

根据火毛撒坝猪、杜洛克猪3个组织差异表达基因的GO功能注释、KEGGpathway富集分析的结果，筛选了ACADL、LPL、FABP4这3个基因进行Real-time PCR检测，以验证RNA-seq结果是否准确。ACTB(β-actin)基因作为内参基因，利用qRT-PCR分别在两个猪种的三个组织中进行相对定量验证，测得火毛撒坝猪较杜洛克猪基因表达的差异倍数用-ΔΔCt值表示。两个猪种ACADL、LPL、FABP4基因的-ΔΔCt值在肝脏组织中分别为2.21、1.55、1.26；在背脂组织中分别为5.09、4.64、2.40；在背最长肌组织中分别为1.53、1.49、2.53(表16)。RNA-seq测得火毛撒坝猪较杜洛克猪基因表达的差异倍数用logFC值表示，两个猪种ACADL、LPL、FABP4基因的logFC值在肝脏组织中分别为2.40、4.31、3.56；在背脂组织分别为2.36、1.83、2.28；在背最长肌组织中分别为2.38、1.64、2.36。在3个组织中，两个猪种ACADL、LPL、FABP4基因的-ΔΔCt值与logFC值都是正值，说明这些基因都是上调表达基因，两种方法测得基因表达趋势基本一致(图11)，表明本研究RNA-Seq结果具有较高的准确性和可信度。

表16三个组织中ACADL、LPL、FABP4基因的相对表达量

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 云南农业大学,云南省动物疫病预防控制中心

<120> 一种与猪低胆固醇相关的基因标志物组合及检测试剂盒

<130> JIA-2020-1-W-019

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgtttggga ggagcaagca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatcacttcc agctccaggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaaggccta ccggtgcaat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtagggca tctgagcagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaggtgcag aagtgggatg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtagccgt gacacctttc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctggcacca caccttct 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgatctgggt catcttctca c 21

Claims

1.一种与猪代谢低胆固醇相关的基因标志物组合，其特征在于，所述基因标志物组合包括基因ADACL、LPL和FABP4。

2.一种检测权利要求1所述基因标志物组合的试剂盒，其特征在于，包括检测所述基因ADACL、LPL和FABP4的试剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为分别用于扩增所述基因ADACL、LPL和FABP4的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于扩增基因ADACL的引物对包括具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物组成。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于扩增基因LPL的引物对包括具有SEQID No.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列的上游引物组成。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，用于扩增基因FABP4的引物对包括具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.6所示核苷酸序列的上游引物组成。

7.根据权利要求3-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于扩增内参基因ATCB的引物对。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，用于扩增基因ATCB的引物对包括具有SEQ ID No.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.8所示核苷酸序列的上游引物组成。

9.根据权利要求3-6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括组织RNA提取试剂盒。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录试剂。