CN116837110B - 一种位于7号染色体上与鸡生长性状相关的snp位点及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了鸡7号染色体上与鸡生长发育性状相关的SNP位点，所述SNP标记的位点为鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位G>A，第11913258位C>T，第11913354位G>A。本发明通过优选上述SNP的优势等位基因，能够逐代增加优势等位基因频率，提高鸡的优良生长发育性状，加快鸡遗传改良进展从而有效提高鸡育种的经济效益。
Description
用技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及鸡染色体上与生长发育性状相关的SNP位点及其应用。
背景技术
种质资源，是在长久的社会发展中不断形成的重要的自然资源，含有各种丰富的优秀性状基因，这对改变当前畜禽现状具有重要作用。但是目前存在优良地方品种保护的问题，，尤其一些地方品种因保护不利而灭绝或濒临灭绝；育种技术较落后，畜禽疾病净化不到位，种质资源依赖进口，因此对畜禽种质资源的保护和选育已经迫在眉睫。
我国家禽养殖历史悠久，地方遗传资源丰富，总共有33个畜禽900多个品种，包括了地方、培育及引进品种和相关配套系；畜禽种质资源包括鸡240种，其地方品种就达115种之多，数量丰富。畜禽种质资源是保障畜产品有效供给的战略性资源，是农业科技原始创新与现代种业发展的物质基础。我国禽类资源虽然种类丰富，但大部分生产性能水平低，生长速度慢，从而导致耗料严重，饲养成本高。畜禽种质资源保护与开发利用已被高度重视，国家将重点支持畜禽种质资源发掘、品系培育、产业化开发等畜禽遗传资源改良和种业提升工程。
畜禽的生长速度缓慢，导致市场化程度低，从而导致养殖效益下降，使畜禽逐渐被市场边缘化，甚至面临淘汰的风险。畜禽产业在生产过程中非常重视体型的发育，可以很直观地用生长发育来判断畜禽的健康发育状况，生长发育状况很大程度上决定了畜禽的生产性能；其中骨骼发育和体重的发育规律略有不同，骨骼在10周龄发育较快，达到了成年时期的80％以上，12周龄达到90％，但体重则是在不断地发育过程中，8周龄时仅仅完成了最大体重的27％，而胫长又是衡量生长发育的关键指标，故可通过胫长衡量其生长发育情况，总之前期更应该关注骨骼的生长发育。根据畜禽骨骼和体重生长发育关系，必须在育雏期保证全面的营养供给，饲喂全价、营养的雏鸡料，使得胫长和体重均达标。
随着人们生活水平的提高和市场竞争日益激烈，消费者对肉品质的要求也在提高，肉质鲜美、风味独特的畜禽产品在市场上越来越受欢迎，无污染、无药物残留的绿色食品成为人们的追求。静原鸡具有耐粗饲、宜放牧、肉质鲜美等特点，在草原、林带、山地上放牧饲养，是一种天然的无公害食品，已得到广大消费者的普遍欢迎和认可。然而关于静原鸡的生长发育性状的研究，特别是与生长发育性状相关联的分子标记开发还十分欠缺。本发明从静原鸡生长发育规律开始，测量静原鸡关键时间点的体尺性状，分析其相关性；并通过研究KLF7基因在静原鸡中的多态性位点和生长性状相关联，筛选出对静原鸡生长发育性状有影响的位点，为地方鸡种特别是静原鸡分子育种，品种改良提供基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供通过KASP基因分型和相关性分析策略鉴别到了显著影响鸡生长发育性状的SNP，将其用于分子标记辅助选择和基因组选择中，选择对改良鸡生长发育性状有利的基因型进行留种，从而逐代提高优势等位基因的基因频率，则能加快种鸡育种改良的进程，为地方鸡养殖带来巨大经济效益。
首要目的在于确定影响鸡生长发育性状的SNP分子标记。所述分子标记位于鸡基因组参考序列7号染色体(NC_052538.1)上。
所述的分子标记的SNP位点对应于鸡GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位G>A突变，和/或第11913258位C>T突变，和/或第11913354位G>A突变。
所述SNP标记如SEQ ID NO:1，和/或SEQ ID NO:2，和/或SEQ ID NO:3所示，具体如下表所示
本发明的另一目的在于提供检测上述分子标记的KASP引物或包含上述KASP引物的检测试剂盒，所述引物如下表所示
本发明的另一目的在于提供上述的分子标记在筛选优良生长性状的鸡个体中的应用。具体为，检测鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型，和/或第11913258位基因型，和/或第11913354位基因型，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA的个体作为种鸡。
在一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA，且第11913258位基因型为CC，且第11913354位基因型GG的个体作为种鸡。
在另一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AG，且第11913258位基因型为CT，且第11913354位基因型GA的个体作为种鸡。
本发明的另一目的在于提供一种上述KASP引物或检测试剂盒在鉴定影响鸡生长发育性状的基因型中的应用。具体为，利用上述KASP引物检测鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型，和/或第11913258位基因型，和/或第11913354位基因型，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA的个体作为种鸡。
进一步地，将上述的KASP引物或检测试剂盒在鸡基因组选择育种中的应用。具体为，利用上述KASP引物或检测试剂盒检测鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型，和/或第11913258位基因型，和/或第11913354位基因型，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA的个体作为种鸡。
在一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA，且第11913258位基因型为CC，且第11913354位基因型GG的个体作为种鸡。
在另一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AG，且第11913258位基因型为CT，且第11913354位基因型GA的个体作为种鸡。
进一步地，将上述的KASP引物或检测试剂盒在改良鸡生长性状中的应用。具体为，利用上述KASP引物或检测试剂盒检测鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型，和/或第11913258位基因型，和/或第11913354位基因型，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA的个体作为种鸡。
在一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA，且第11913258位基因型为CC，且第11913354位基因型GG的个体作为种鸡。
在另一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AG，且第11913258位基因型为CT，且第11913354位基因型GA的个体作为种鸡。
本发明的另一目的在于提供一种鸡的遗传改良的方法，所述方法包括：确定种鸡资源群体中的种鸡的上述的影响鸡优良生长发育性状的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种鸡资源群体中保留鸡参考基因组GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位点为AA基因型的种鸡个体，以逐代提高该位点的AA基因型频率，从而提高后代鸡的生长发育。所述鸡群体包括静原鸡及其合成系。
在一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA，且第11913258位基因型为CC，且第11913354位基因型GG的个体作为种鸡。
在另一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AG，且第11913258位基因型为CT，且第11913354位基因型GA的个体作为种鸡。
具体包括以下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)利用前述KSAP引物或检测试剂盒对待测鸡的基因型进行检测；
(3)基于检测结果，确定所述待测鸡在鸡参考基因组GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位点的SNP标记的基因型，和/或第11913258位C>T突变，和/或第11913354位G>A突变的分子标记。
(5)保留鸡参考基因组GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位点为AA基因型的种鸡个体作为种鸡。
在一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AA，且第11913258位基因型为CC，且第11913354位基因型GG的个体作为种鸡。
在另一个优选实施例中，保留鸡7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位基因型AG，且第11913258位基因型为CT，且第11913354位基因型GA的个体作为种鸡。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
第一，确定了新的影响鸡生长性状的分子标记，并开发了相应KASP引物。
第二，确定了具有连锁关系的双倍型基因型与生长性状的相关性。
第二，本发明确定的SNP分子标记应用于种鸡优良生长性状的遗传改良中，可提高后代鸡的初生体高，进而增加养殖企业市场竞争力。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明的方法及其有益效果进行详细说明。
图1是静原鸡在鸡参考基因组GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913237位点的混池PCR测序结果。
图2是静原鸡在鸡参考基因组GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913258位点的混池PCR测序结果。
图3是静原鸡在鸡参考基因组GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913354位点的混池PCR测序结果。
图4是静原鸡在鸡参考基因组GRCg7b基因组7号染色体(NC_052538.1)上第11913237、11913258、11913354位点的双倍型连锁图，颜色越深代表连锁程度越高，未标数值为100％连锁。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本申请所使用的所有技术和科技术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。
实施例1静原鸡体重体尺性状相关性分析
体尺性状是指动物体所表现的形态结构中可用数字衡量的外貌形态特征，通过体尺对生产力高低的个体进行筛选，可以极大的促进种畜禽中经济性状的改良。
1、试验动物
本研究于2021年11月4日至2022年5月2日以宁夏回族自治区彭阳县静原鸡国家级保种场的静原鸡保种群为实验对象，随机选取静原鸡180只(公鸡和母鸡各90只)，所有实验动物均处于相同的饲养环境和饲养条件下。
2、试验方法
(1)生长性能测定
对静原鸡42、126、180日龄体尺进行测量。测定项目参照家禽生产性能名词术语和度量统计方法,测定指标有：体重X1，胫长X2，体斜长X3，龙骨长X4，胸宽X5，胸深X6，胸角X7，骨盆宽X8，胫围X9。
1.体斜长用皮尺沿体表测量肩关节至坐骨结节间的距离(cm)。
2.龙骨长用皮尺测量体表龙骨突前端到龙骨末端的距离(cm)。
3.胸宽用卡尺测量两关节之间的体表距离(cm)。
4.胸深用卡尺在体表测量第一胸椎到龙骨前缘的距离(cm)。
5.胸角用胸角器在龙骨前缘测量两侧胸部角度。
6.骨盆宽用卡尺测量两髋骨结节间的距离(cm)。
7.胫围胫骨中部的周长(cm)。
3、数据分析与处理
利用excel对数据进行统计，用SPSS 25.0软件对42日龄、126日龄、180日龄体重和体尺性状进行相关性检验。
结果如下：
表1 42日龄静原鸡体重体尺性状相关性分析
表2 126日龄静原鸡体重体尺性状相关性分析
表1显示，静原鸡在42日龄时，体重和胫长与其他体尺性状都表现为极显著正相关(P<0.01)；在静原鸡42日龄体重和体尺的相关性分析中，体重和胫长的相关性最大，其次是龙骨长和骨盆宽，表明了生长发育早期主要是躯干的生长发育。
表2显示，静原鸡公鸡在126日龄时，体重与胸深为不显著正相关(P>0.05)，与胫长、龙骨长为显著正相关(P<0.05)，与胸角为不显著负相关(P>0.05)，与其他体尺性状都表现为极显著正相关(P<0.01)。静原鸡母鸡在126日龄时，体重与胸深为显著正相关(P<0.05)，与胸角为不显著负相关(P>0.05)，与其他体尺性状都表现为极显著正相关(P<0.01)。
表3显示，静原鸡公鸡在180日龄时，体重与龙骨长为不显著正相关(P>0.05)，与胸角为不显著负相关(P>0.05)，与其他体尺性状都表现为极显著正相关(P<0.01)。静原鸡母鸡在180日龄时，体重与胸角为不显著正相关(P>0.05)，与龙骨长、胸深为显著正相关(P<0.05)，与其他体尺性状都表现为极显著正相关(P<0.01)；胫长与胸宽、胸深、骨盆宽为不显著正相关(P>0.05)，与胸角为不显著负相关(P>0.05)，与其他体尺性状都表现为极显著正相关(P<0.01)。
实施例2基因多态位点的筛选
1、试验动物
本研究于2021年11月4日至2022年5月2日以宁夏回族自治区彭阳县静原鸡国家级保种场的静原鸡保种群为实验对象，选取同一批次从出生佩戴翅号的静原鸡180只，在42日龄，126日龄，180日龄进行体尺测定，在126日龄时，对这180只鸡进行翅下静脉采血，用于后续实验。
2、试验仪器
用采血管收集上述样本所有个体静脉血，置于-80℃冰箱保存备用。
3、试验试剂
表4试验采用的主要试剂
4、血液DNA的提取以及混池的构建
使用DNA提取试剂盒对静原鸡血液DNA进行提取(具体操作步骤见附录)，同时用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取的质量，微量核酸蛋白检测仪检测提取出的DNA的浓度。对检测合格的DNA样品随机选取60个，各取1ul混合至1.5ml离心管中，构建DNA混合池，保存于-20℃用于后续实验。
5、引物设计及PCR扩增
在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已公布的原鸡KLF7(位于7号染色体NC_052538.1上)，基因序列，利用Primer5.0软件设计扩增(表4)，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表5 PCR引物
基因扩增体系为50μL：cDNA样品6μL，上、下游引物各2μL，TaqPCR Master Mix 25μL，ddH2O 15μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。对产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海生物工程有限公司进行测序。
6、测序结果及多态位点的筛选
将符合预期的扩增样品送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，结果利用SnapGene与原序列进行比对，与测序峰图相对照，寻找静原鸡群体中存在的SNP位点。图1-图3分别为rs313381531、rs313089555、rs740949494位点部分片段混池测序结果。表面上述位点在静原鸡群体中具有多态性。
实施例3 KASP分子标记的引物设计及检测
根据实施例2获得多态性SNP位点，设计KASP基因分型引物。
设计的引物的DNA序列如下所示：
表6 KASP分子标记引物信息
将检测出来的SNP位点和完整的静原鸡群体血液提交给康普森公司，进行KASP基因检测分型。
由表7可知，在42日龄静原鸡KLF7基因的SNP位点中，
在rs313381531中，GG型个体的体斜长显著高于GA型(P<0.05)，AA型的胫围极显著高于GA型(P<0.01)GG型的胫围显著高于AA型(P<0.05)；
在rs313089555中,CT型的骨盆宽显著高于CC型(P<0.05)。
在126日龄静原鸡KLF7基因的SNP位点中，
rs313381531中，AA型个体的体重、胫长、体斜长、骨盆宽显著高于GG型(P<0.05)，GA型个体的体斜长显著高于GG型(P<0.05)；
rs313089555中，TT型个体的龙骨长显著高于CC型(P<0.05)；
rs740949494中，AA型个体的龙骨长显著高于GG型(P<0.05)。
在180日龄静原鸡KLF7基因的SNP位点中,
在rs313381531中，AA型个体的体重极显著高于GG和GA型(P<0.01)，AA型个体的胫长和骨盆宽显著高于GG型(P<0.05)，AA型个体的胸深极显著高于GG型(P<0.01)，AA型个体的胫围极显著高于GG型(P<0.01)，AA型个体的胫围显著高于GA型(P<0.05)。
实施例5连锁不平衡分析
对上述3个突变位点在杂交后代中使用Haploview4.2软件进行连锁不平衡(LD)分析SNP间的连锁程度并推测其单倍型，结果(图4)表明，rs313381531、rs313089555、rs740949494在Block1区域存在强连锁不平衡,产生了GCG、ACG、GTA、GTG四种单倍型,依次命名为H1、H2、H3、H4。其中H1为优势单倍型，频率为0.538，H4最低，频率为0.028。在双倍型中，H1H1为优势双倍型，频率为0.301，并去掉小于3％的双倍型组合。
表8SNP位点单倍型及其双倍型分析
实施例6不同双倍型与生长性状的关联分析
使用一般线性模型(GLM)分析不同双倍型与不同阶段生长性状之间的关联性(表9)结果显示:在42日龄中，H2H2个体的胸宽显著大于H1H2双倍型的胸宽(P＜0.05)，H2H2个体的胫围显著大于H1H2双倍型的胫围(P＜0.05)。在126日龄中，H2H2个体的体斜长显著大于H1H3、H1H1双倍型的体斜长(P＜0.05)，H2H2个体的骨盆宽显著大于H1H1双倍型的骨盆宽(P＜0.05)，H2H3个体的胫长显著大于H1H3双倍型的胫长(P＜0.05)，H2H3个体的胸深显著大于H1H1、H2H4双倍型的胸深(P＜0.05)，H2H3个体的胫围显著大于H1H1、H1H2、H1H3双倍型的胫围(P＜0.05)。在180日龄中，H2H2个体的体重显著大于H1H1双倍型的体重(P＜0.05)，H2H2个体的胸宽显著大于H1H1、H1H3双倍型的胸宽(P＜0.05),H2H3个体的胸深显著大于H1H1双倍型的胸深(P＜0.05)，H2H3个体的骨盆宽、胫围显著大于H1H1、H1H2、H1H3双倍型的骨盆宽，胫围(P＜0.05)。且H2H2在42、126及180日龄的平均体重都是最重，H2H3个体在126及180日龄的平均体重均次重。故优选H2H2和H2H3为优势双倍型。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.影响静原鸡及其合成系生长发育性状的SNP分子标记组合，其特征在于，所述SNP标记组合由SNP1、SNP2和SNP3组成；
所述SNP1对应于鸡基因组GRCg7b基因组7号染色体NC_052538.1上第11913237位G>A突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
TGGGAGCACTGCTGTGATGTCTCTCTAATAGCGATTTCTTTCCCTCCCTCCCCCTCCTGCAGACATGCCTCGAGTTGGAGCGATACCTTCAGACTGAACC[G/A]CGGAAGATCTCTGAGAGCTTCGGTGAGGACTTGGACTGCTTCCTTCATGCCTCCTCAGCTCCAGATGCAGAGGACAGTATCCGACGGCTGGACCCCATCC中；
所述SNP2对应于鸡基因组GRCg7b基因组7号染色体NC_052538.1上第11913258位C>T突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：TCTCTAATAGCGATTTCTTTCCCTCCCTCCCCCTCCTGCAGACATGCCTCGAGTTGGAGCGATACCTTCAGACTGAACCGCGGAAGATCTCTGAGAGCTT[C/T]GGTGAGGACTTGGACTGCTTCCTTCATGCCTCCTCAGCTCCAGATGCAGAGGACAGTATCCGACGGCTGGACCCCATCCTTTTGCCAGTGGAGACGAGTA中；
所述SNP3对应于鸡基因组GRCg7b基因组7号染色体NC_052538.1上第11913354位G>A突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：GCTTCGGTGAGGACTTGGACTGCTTCCTTCATGCCTCCTCAGCTCCAGATGCAGAGGACAGTATCCGACGGCTGGACCCCATCCTTTTGCCAGTGGAGAC[G/A]AGTATGTGCGACAAAGGCGCCAACATGGACATTATCCTCTCACGGGACAAGCTGCTGTCTGAGACGTGCCTCAGCCTGCAGTCCACCAGCTCTTCCACAG。
2.用于检测权利要求1所述的SNP分子标记组合的KASP引物组，其特征在于，所述引物组的核酸序列如下：
SEQ ID NO.4：gaaggtgaccaagttcatgctGCGATACCTTCAGACTGAACCG
SEQ ID NO.5：gaaggtcggagtcaacggattGCGATACCTTCAGACTGAACCA
SEQ ID NO.6：GATACTGTCCTCTGCATCTGGAG
SEQ ID NO.7：gaaggtgaccaagttcatgctAAGCAGTCCAAGTCCTCACCG
SEQ ID NO.8：gaaggtcggagtcaacggattAAGCAGTCCAAGTCCTCACCA
SEQ ID NO.9：AATAGCGATTTCTTTCCCTCCCTC
SEQ ID NO.10：gaaggtgaccaagttcatgctATCCTTTTGCCAGTGGAGACG
SEQ ID NO.11：gaaggtcggagtcaacggattATCCTTTTGCCAGTGGAGACA
SEQ ID NO.12：CTTGTCCCGTGAGAGGATAATGTC。
3.一种用于检测权利要求1所述的SNP分子标记组合的试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求2所述的引物组。
5.一种改良静原鸡及其合成系生长发育性状的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：检测鸡基因组GRCg7b基因组7号染色体NC_052538.1上第11913237位核苷酸位点基因型，选择第11913237位点为AA基因型的个体作为种鸡，所述生长性状为如下性状的至少一种：体重、胫长、体斜长、胸宽、胸深、骨盆宽、胫围。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测鸡的鸡基因组GRCg7b基因组7号染色体NC_052538.1上第11913237位核苷酸位点基因型的方法包括以下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)采用引物组SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对待测鸡的基因型进行检测；
(3)基于步骤（2）的检测结果，确定所述待测鸡基因组7号染色体NC_052538.1上第11913237位核苷酸位点基因型。
7.权利要求1所述的SNP分子标记组合在改良静原鸡及其合成系生长性状中的应用，所述生长性状为如下性状的至少一种：体重、胫长、体斜长、胸宽、胸深、骨盆宽、胫围。
8.权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在改良静原鸡及其合成系生长性状中的应用，所述生长性状为如下性状的至少一种：体重、胫长、体斜长、胸宽、胸深、骨盆宽、胫围。
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