CN102822340A - 分离和纯化核酸的色谱设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过凝胶分离色谱分离和纯化核酸优选基因组DNA的色谱设备、使用该设备分离和纯化核酸优选基因组DNA的方法和包括该设备的试剂盒。

Description

分离和纯化核酸的色谱设备和方法
高品质核酸的分离是现代分子生物学中很多不同技术的前提，例如PCR扩增、印迹分析和基因组文库构建，用于如分子诊断领域。特别是当核酸获自含细胞材料的生物样品时，必须将它们与污染物如蛋白质、脂质和其它细胞成分相分离，否则这些污染物可能干扰下游应用中所使用的限制性酶、连接酶和/或耐热DNA聚合酶。此外，必须去除存在于生物样品中的RNA核酸酶(RNA酶)和特定DNA核酸酶(DNA酶)以避免DNA降解。
已开发了多种不同方法用于从含细胞组分的生物样品中分离基因组DNA。所有这些方法都包括通过破坏细胞膜来使起始材料破裂和裂解并释放其内容物至溶液中的步骤。所获得的溶液称为裂解物。在后续步骤中，从所述裂解物中去除蛋白质尤其是核酸酶以及其他污染物，并最终回收(或多或少)经纯化的DNA(综述可见凯杰公司(QIAGEN)关于“Genomic DNA Purification(基因组DNA纯化)”的手册)。所述DNA纯化步骤至关重要，因为污染物如盐、去污剂、有机溶剂特别是酚和乙醇的残留往往抑制DNA在下游应用中的性能。
用于从细胞裂解物分离基因组DNA的一种非常简单快速的技术是将细胞裂解物在高温如90°C下孵育约20分钟或在额外的蛋白酶消化后直接使用所述裂解物。但是，这些裂解物通常含有酶抑制性污染物如高盐负荷，因而，被视为快速粗糙技术的这些方法仅适用于有限范围的应用。
称作盐析的方法是用于将DNA与细胞裂解物中存在的其它细胞组分相分离的公知技术，其中通过添加含有高浓度盐如乙酸钾或乙酸铵的溶液来从粗提细胞裂解物中沉淀出蛋白质和其它污染物。然后通过离心将所形成的沉淀从含有DNA的溶液中去除，并通过在后续步骤中用醇沉淀来从上清液回收DNA。在这些方法中，蛋白质(尤其是核酸酶)和其它污染物的去除往往很低效，需要额外的RNA酶处理、透析和/或反复醇沉淀来获得足够纯的DNA以用于下游应用，使得这些方法繁复且费时。
将DNA与细胞裂解物中存在的其它化合物相分离的另一可能性是用有机溶剂从裂解物中萃取污染物。在第一步中，通常用去污剂裂解细胞，然后用溶剂如酚、氯仿和异戊醇萃取裂解物以去除污染物。这些方法的一个缺点是所用溶剂的毒性。此外，还需特别留意pH和盐浓度以确保多数污染物被萃取入有机相，而DNA保留在水相。然后通过醇沉淀从水相回收DNA。尽管有机萃取方法非常耗时，用这些方法所分离的DNA通常含有残留的酚和/或氯仿，会在下游应用如PCR中成为抑制剂。此外，所产生有毒废弃物的处置必须遵守公害废料指南(Hazardous waste guideline)。
近年来，开发了基于离子交换，亲和性和/或疏水性相互作用的吸着过程以尽可能降低纯化过程中的DNA降解。这些吸着(sorption)过程中，由于DNA和含树脂或基质的固定固相之间的特异性相互作用而将DNA或多或少地特异性“吸着”，可以是吸附、吸收或化学结合于所述固相，而污染物与固相的相互作用程度不同于DNA，因此可通过如清洗步骤来将污染物和所吸着的DNA分离。一旦去除污染物后，需通过洗脱步骤从固相回收DNA，洗脱步骤通常包括用溶液(流动相)淋洗固相的步骤，所述溶液中包含尽可能降低固相和DNA间相互作用的化合物，从而将DNA从固相移除。然后收集包含DNA(洗脱液)的流动相。这些基于固相的方法使DNA的分离纯化过程能自动化。此外，还能用这些方法可靠地处理相当微量的DNA。
阴离子交换方法是基于核酸的带负电磷酸和阴离子交换载体上的带正电表面分子之间的相互作用(Forcic等，J.Chromatogr.A 2005,1065(1),115-120)。在低盐条件下溶液中存在的DNA选择性结合固定相，而杂质如RNA、细胞蛋白质和代谢物可用中盐缓冲液从固定相洗出。下一步中，DNA可用含有高盐浓度的缓冲液从固相洗脱。然后通过醇沉淀从洗脱液回收经纯化的DNA。
在基于二氧化硅的方法中，核酸在高浓度离液盐存在下选择性吸着于硅胶膜(Hanselle等，Leg Med(东京)2003,5 Supp.1,S145-S149)。RNA、细胞蛋白质和代谢物从膜上洗除，然后用低盐缓冲液将DNA从硅胶膜上洗脱。
本领域也已知基于DNA和作为固定相的磁性颗粒之间的相互作用的固相方法(Prodělalová等，J.Chromatogr.A 2004,1056,43-48)。
尽管吸着方法可分离高品质DNA，这些"结合-清洗-洗脱"程序中要进行的步骤数量仍相对较高并因而费时。
为此，需要方法从处理的生物样品如获自生物样品的裂解物例如裂解的组织和血液样品中分离纯化的核酸，所述核酸优选含DNA，特别是基因组DNA，其中获取经纯化核酸的步骤数量相对已知吸着过程如阴离子交换和基于二氧化硅的方法有所减少，但不影响所得核酸的纯度。这样的方法应当使用户能并从污染物如蛋白质(特别是核酸酶)、脂质和其它细胞成分中分离和纯化核酸。另一方面，所述方法还应当足够温和以尽量减少核酸的化学或酶促降解以及机械剪切应力，否则会在纯化过程中造成大基因组DNA片段化。此外，所述方法还应当能适应各种不同来源的生物样品。
详细分析从处理的生物样品（特别是获自含细胞生物样品的裂解物）中分离和纯化核酸的已知方法，显示所有这些方法都面临所述核酸在整个分离和纯化过程期间不留在溶液中的问题。相反，在分离/纯化过程中，核酸必须沉淀，或者结合、吸附或附着于固体基质上。因此，必须有额外步骤将核酸从沉淀物中重溶，或者将其从固相上洗脱，这使所有上述方法或多或少较为耗时。
因此，本发明的目标是提供一种从处理的生物样品中分离和纯化核酸的设备和方法，所述生物样品优选获自含细胞生物样品的裂解物，其中分离所述核酸，从污染物如蛋白质(特别是核酸酶)与其它细胞组分中纯化所需的步骤数量相比已知方法减少，同时仍确保高品质的核酸适用于通过例如PCR等技术直接进行后续分析。
现已意外地发现，通过用下文详述的本发明设备和方法，可快速获取高品质的核酸，所述核酸优选含DNA且特别是高品质的基因组DNA。
根据本发明，术语“核酸”包含任意种类的DNA或RNA以及任意类型DNA与RNA的混合物。具体而言，取决于所用条件和步骤，可获得DNA与RNA的混合物或者可制得高度纯化的DNA，该DNA还与RNA分离。若下文中使用术语“DNA”，含DNA的经纯化核酸样品是指含RNA或者与RNA分离。优选本方法的条件产生高度纯化的DNA，基本不含RNA。
本发明提供一种通过凝胶过滤色谱从污染物中分离和纯化核酸的色谱设备，所述核酸优选包括DNA且特定是基因组DNA，所述方法包括至少一种色谱单元，所述单元包括：1.具有入口(2)和出口(3)的中空体(1)，该中空体(1)包含提供尺寸排阻特性的固体基质(4)，优选形成凝胶床；2.置于出口(3)与固体基质(4)之间用以使固体基质(4)保持在色谱单元内的多孔玻璃料、滤器、毛网或膜(5)；3.优选置于多孔玻璃料、滤器、毛网或膜(5)与基质(4)之间的无孔环(6)，密封所述玻璃料、滤器、毛网或膜(5)的外区以避免流动相进入玻璃料、滤器、毛网或膜(5)而不经过基质(4)；4.任选有至少一个可移除的闭合装置(7)以封闭色谱单元的入口(2)和/或出口(3)；以及5.任选有至少一个收集管以收集通过基质(4)后的流动相(洗脱液)，其中所述固体基质(4)优选为成凝胶聚合物，其尺寸排阻限度为150～500个碱基对(bp)，优选200～400bp，且最优选250～300bp。优选所述成凝胶聚合物的相应尺寸排阻限度为10～10000KDa，更优选20～8000kDa。
利用该装置，“阴性”色谱是可行的，这不同于色谱纯化DNA常规使用的其它色谱方法，固体基质吸着的并非DNA而是污染物，从而允许在单次淋洗步骤中进行色谱纯化。因此，该方法可称作“一步式”色谱法。已令人惊奇的发现，本发明的色谱设备不仅能移除小分子量的污染物，还能作为不进入所述凝胶床但维持在其上表面的固体材料的深度过滤器。更意外的是，由于固体材料通常易于堵塞凝胶的孔，从而妨碍或扰乱进一步的色谱。
因此，本发明设备具体适用于从样品中移除固体污染物，特别是从裂解物中移除沉淀，例如分别使用相同申请人于本申请同日提交的题为“method forisolating and purifying nucleic acids”（分离和纯化核酸的方法）和相同申请人于本申请同日提交的题为“method for precipitating anionic surfactant ions in thepresence of nucleic acids”（在核酸存在下分离阴离子表面活性剂的方法）的共同待批申请中所述的裂解细胞和移除十二烷基硫酸根离子的方法时十二烷基硫酸根离子和碱金属单价离子或碱土金属二价离子形成的沉淀。使用本发明色谱设备，获得的洗脱液含高度纯化的脱盐核酸，优选DNA，特别为gDNA，而基本不含残余的十二烷基硫酸根离子。
所述色谱设备不限于特殊形状。可使用色谱中常用的任何设备。所述色谱设备可选自但不限于用于抽气或压力柱色谱的常规柱、离心柱或多孔板。通常，使用的所谓色谱柱具有圆形横截面，直径小于其长度。所述柱可为例如圆柱型或圆锥型或其组合。
所述色谱设备的优选实施方式示于图1，显示具有入口(2)和出口(3)、含固体基质(4)的中空体(1)，配有多孔玻璃料(5)以及所述固体基质(4)和所述多孔玻璃料(5)之间的无孔环(6)。所述色谱设备的入口(2)优选用可移除螺帽(7)闭合。应注意该实施方式中基质的上表面不与所述玻璃料平行，这是由于固定角度转子中所述柱的离心过程。
本发明的色谱设备优选可用于尺寸排阻色谱（SEC）。若有机溶剂用作洗脱液（流动相），SEC也称为凝胶渗透色谱（GPC）。本发明中，优选水基流动相，例如用水、水性有机溶剂或水性缓冲液/溶液作为流动相。这种情形中，SEC也称作凝胶过滤色谱。尺寸排阻色谱是一种色谱方法，其中分子基于其尺寸而分离，或更精确说是基于其流体力学体积而分离。通常，悬浮在水性介质中时能形成凝胶床的固体基质如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或其混合物可悬浮于缓冲液中并堆积在柱的中空主体内，所述柱由玻璃、塑料、特氟隆或者与流动相和分析物都不反应的任意其它材料制成。然后将待纯化的样品应用于凝胶床上表面的中心，然后使其经由重力或由离心或加压推动流过凝胶。根据本发明，优选施加离心力将流动相沿柱下移，其中柱在离心机内离心(称为离心柱技术)。由于凝胶中的交联，凝胶内存在一定尺寸的孔。小分子能穿过这些孔，并因而较慢地移动通过凝胶床，随着它们通过柱而被持留，而大分子不能穿过这些孔并较快地沿柱下移。通过柱以后，随即在柱出口处收集含已纯化分析物的流动相(现称为洗脱液)。为了将固体基质保持在柱的中空主体内，优选在柱出口和固体基质之间放置多孔玻璃料、滤器、毛网或膜。所述多孔滤器、玻璃料、毛网或膜优选允许任何核酸通过而不依赖其尺寸，最多至且特别是基因组DNA。
SEC中，尺寸排阻限度限定了分子量，大于其的分子将被截留在固定相。固体基质的尺寸排阻限度可通过凝胶的交联度来调节。能形成具有不同交联度凝胶床的各种固体基质可以市售获得。另一方面所述尺寸排阻优选不受所述色谱设备中玻璃料、滤器、毛网或膜的限制。
凝胶过滤色谱且特别是采用离心柱的凝胶过滤色谱中的常见问题是，流动相可能沿柱的内壁向下流，因此进入玻璃料、滤器、毛网或膜而不通过固体基质。在高通量应用中并非所有待纯化的样品溶液都恰好施加到凝胶床平整表面的中心或者样品被快速施加时尤为如此。流动相不进入凝胶床时，不发生色谱分离，且得到带污染的洗脱液。为克服这一问题，本发明的色谱装置优选在多孔玻璃料、滤器、毛网或膜与基质之间配有无孔环。该环封闭所述玻璃料、滤器、毛网或膜的外区，从而避免流动相不通过基质而进入所述玻璃料、滤器、毛网或膜。此外，柱内流动相的速度减慢，从而改善选择性。
所述无孔环优选由促进其纳入所述中空体的柔性或弹性材料制备。然而，非柔性或非弹性材料也可使用。在优选实施方式中，所述无孔环基于聚烯烃或两种或更多聚烯烃的混合物制备，任选含一种或多种其他添加剂。形成环的材料优选含聚乙烯或聚丙烯或其混合物，最优选高密度聚乙烯。在特别优选的实施方式中，所述环与所述中空体内壁接触的部分具有沿着所述外环完整长度或至少沿着部分所述长度的至少一个切口或凹陷，例如以沟槽的形式。合适的无孔环市售可得，如北欧化工公司（Borealis AG）的基于高密度聚乙烯的MG 9641。
本发明的色谱设备可任选含至少一个可移除的闭合装置以封闭色谱单元的入口和/或出口。若所述入口和出口配有该可移除的闭合装置，则用于密封所述入口的闭合装置和用于密封所述出口的那些可相同或不同。
本发明的色谱设备还可与至少一个收集管组合以收集通过基质后的流动相(洗脱液)。根据本发明，所述色谱设备还可在每色谱单元配有一个收集管，即若所述色谱设备仅含一个色谱单元，则优选仅用一个收集管。另一方面，若所述色谱设备含数种色谱单元例如多孔板形式的24、48或96种色谱单元，则也可用多于一个收集管，也优选采用多孔板的形式。可补充其他收集管用于收集预离心期间从所述柱排出的液体。
在一个优选实施方式中，成凝胶聚合物优选选自葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或其混合物，更优选为葡聚糖和聚丙烯酰胺的混合物。尺寸排阻限度不同的这些成凝胶聚合物可市售获得，例如商标为Sephacryl、Sephadex或Sepharose。一种特别优选的固体基质是S-400HR Sephacryl树脂，可从GE医疗保健公司(GE-Healthcare)市售获得，该产品是球形烯丙基葡聚糖/N，N′-亚甲基双丙烯酰胺基质，尺寸排阻限度为271bp(对应于20-8000kDa)。其它合适的成凝胶聚合物可具有甲基丙烯酸基料，例如羟基化甲基丙烯酸聚合物，如可从托索生物科学集团(Tosoh Biosciences LLP(前身为TosoHaas))获得的ToyopearlHW 65，其尺寸排阻限度为40-5000kDa。
在本发明的一个优选实施方式中，所述可移除的闭合装置是一次性闭合装置，选自下组盖箔、封条和可脱离末端（break-away end）（优选由其组成），或者选自下组的可重新紧闭的闭合装置：螺帽和搭锁帽（优选由其组成）。在另一优选实施方式中，所述色谱单元的入口和出口用所述可移除的闭合装置封闭，且优选以预溶胀在溶剂中的凝胶形式提供所述固体基质，所述溶剂选自水、有机溶剂与水的均相混合物，或者水性缓冲液。在此实施方式中，优选在临使用前通过离心(预离心)从色谱单元中排除溶剂，而同时建立基质床形式的基质。
本发明的另一实施方式是包括平行形式的多个色谱单元的所述色谱设备，所述色谱单元优选是多孔板的形式，其中多孔板的各孔含有一个单独的色谱单元。
本发明还提供用本发明色谱设备通过凝胶过滤色谱纯化核酸的方法，所述核酸优选DNA，特别是基因组DNA，所述方法包括步骤：1.提供含待纯化核酸的样品，所述核酸优选具有至少400bp，优选500bp，更优选至少600bp，其中所述样品为液体洗脱剂优选水性洗脱剂中的溶液或悬液形式，2.通过离心(预离心)在色谱单元内建立基质，优选基质床，3.将样品应用于基质（床）上表面(的中心)，4.通过离心从色谱单元洗脱核酸并同时收集洗脱液。在特别优选的实施方式中，步骤3和步骤4之间没有其他步骤。这表示步骤3之后直接进行步骤4。
待纯化的样品优选为经处理的生物样品，更优选获自任何生物样品的裂解物。所述生物样品优选是含细胞的生物样品，更优选选自新鲜和冷冻的组织、血液、其他体液和革兰氏阴性菌。
采用本发明的方法，原则上可以从各种处理的生物样品分离出所有种类的核酸如脱氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸（RNA），包括合成的、经遗传工程改造的或天然存在的单链或双链DNA，脱氧核糖核苷酸或核糖核酸的寡和多核苷酸，用限制性内切核酸酶部分消化DNA获得的DNA片段，线粒体DNA，质粒DNA，和宏基因组(metagenomics)DNA，代表从某一群落生境(biotope)或生物群落(biocenosis)中发现的所有微生物获得的全部DNA。本发明所述方法优选用于分离和纯化基因组DNA，在本发明中基因组DNA是获自单一生物体的包含该生物体全部遗传信息的大分子量DNA，相对于质粒DNA、通过限制性内切核酸酶的作用部分消化的DNA和宏基因组DNA。在该优选实施方式中，获得经纯化的高分子量DNA，而DNA的较小片段保留在色谱材料中。由于高分子量和大尺寸，难以分离和纯化完整的高品质基因组DNA，因为基因组DNA存在相当高的降解风险，这或者是由于分离过程中的机械应力特别是剪切应力，或者是由于化学和酶促降解。另一方面，降解的DNA可能导致下游分析中的定量和定性误差。本发明所述方法提供了快速、稳健、安全、易于操作且温和的方法来从各种不同处理的生物样品中分离和纯化核酸，特别是基因组DNA。
利用本发明所述方法，可以从各种处理的起始材料中分离核酸，优选DNA和更优选基因组DNA，这些材料包括但不限于动物和人体组织如肝、脾、肺、心、脑、肾等，动物和人的血液、液体、唾液或精液，动物和人细胞的细胞培养物，动物和人的骨髓，酵母，细菌，昆虫，植物和啮齿动物的尾。样品优选为动物或人来源的经处理的含细胞生物样品。在另一优选实施方式中，样品包含处理的革兰氏阴性菌。样品可以在取自其天然环境后立即裂解(新鲜样品)，或可以在裂解前通过冷冻或化学稳定剂的作用而稳定化，例如通过福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE组织)或包括柠檬酸盐、阳离子表面活性剂如PAXgeneTM(德国PAX公司（PreAnalytiX)）或肝素的血液稳定剂。更优选样品选自裂解的新鲜或冷冻的组织和血液，最优选裂解的哺乳动物组织和血液。
预离心步骤优选通过将所述装置在500～900x g离心1～7分钟进行，优选在700x g离心2~5分钟，且最优选在700x g离心3分钟。
在该实施方式中，所述基质以基质床提供，所述色谱单元中的基质床体积优选为100μL～2mL范围，更优选500μL～1mL范围，且最优选700～800μL，其中800μl可能特别优选用于基因组DNA。优选以成凝胶聚合物的分散剂来提供所述基质，所述分散剂溶于水，盐溶液如0.9%NaCl，或适当缓冲液例如TE、TAE、PBS等等，或在稀释的缓冲液中，而所述分散剂优选包含60-90%，更优选70-80%且特别是75%的成凝胶聚合物。色谱单元内基质床的装填水平优选为0.5cm～2.0cm范围，更优选1.0～1.5cm。在标准96孔板中，基质床的体积优选为约0.8mL。所用基质床的确切体积和填充水平取决于由柱所限定的中空主体的尺寸和形状，以及待纯化样品的种类和用量，这是本领域技术人员所熟知的。
所述基质可在样品应用于其表面前清洗。可通过施加水、缓冲液或盐溶液，如0.5-1%,优选0.9%NaCl水溶液到所述基质表面，并离心所述色谱设备进行清洗步骤。所述基质优选用制备时所用相同量的水、缓冲液或盐溶液清洗一次或两次，即100μl-2ml,优选500μl-1ml,更优选600μl-800μl。
应用于所述基质的样品量取决于基质使用的体积。优选将最多约100μL的样品体积施加到装填有600μL～800μl基质床或装填水平为1.0cm～1.5cm基质床的柱中。本领域技术人员能因此测定适合其他基质实施方式的样品体积。
将核酸从色谱单元上洗脱的步骤优选通过将所述装置在500～900x g离心1～7分钟进行，优选在700x g离心2~5分钟，且最优选在700x g离心3分钟。
利用本发明所述设备和方法，可从处理的生物样品中获得高度纯化的核酸如高度纯化的DNA，例如仅需约6分钟(3分钟的柱预离心，和3分钟的色谱分离本身)获自裂解的组织样品，而用例如QIAamp试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)纯化相同量的裂解组织通常需要约18分钟。
就通过UV/可见光光谱法、凝胶电泳、电导率测定、HPLC分析、PCR和其它试验所评价的纯度和得率而言，用本发明设备和方法所分离核酸的品质和纯度与用小型纯化的现有技术方法(例如非常成功的QIAamp技术(凯杰公司，德国希尔登))所得核酸的品质和纯度相当，或在很多情况下甚至更好。此外，本发明所述方法获得的含核酸洗脱液可冷冻用于长期保存，或者可以在色谱后立即在如定量实时PCR(qRT-PCR)、PCR等下游应用中处理而无需用额外步骤从洗脱液中分离核酸。由于纯化过程中核酸基本保留在溶液中，且既不通过添加有机溶剂如乙醇来沉淀，也不吸着或结合于固体基质如二氧化硅膜或阴离子交换树脂，本发明所述方法比本领域已知的核酸分离和纯化方法快得多。此外，本发明所述方法可以完全自动化。
用本发明设备和方法待纯化的样品优选为裂解物。所述样品优选为通过进行裂解过程获自含细胞的生物样品的裂解物，所述过程包括步骤：1.将含细胞的样品与裂解缓冲液混合，2.孵育所述混合物得到至少包含DNA、RNA和蛋白质的裂解物；3.任选分解裂解物中存在的RNA；4.任选从裂解物中选择性沉淀可溶污染物，其中所述核酸尤其是DNA优选在所有步骤2-4期间基本留在溶液中。
为了快速但温和裂解生物样品，如相同申请人于本申请同日提交的题为“method for isolating and purifying nucleic acids(分离和纯化核酸的方法)”的共同待审申请中所述，所述裂解缓冲液优选含阴离子表面活性剂离子源、优选硫酸根离子、更优选十二烷基硫酸根离子(DS-)，但基本不含任何螯合或络合剂如乙二胺四乙酸（EDTA）。此类试剂的非限制性示例有EDTA、EGTA、EDDS(亚乙基二酰胺二乙酸)、NTA(氮川三乙酸)、葡糖酸、异抗坏血酸、酒石酸、柠檬酸、亚氨基二琥珀酸、三乙醇胺。该裂解缓冲液优选含缓冲试剂、H2SO4和表面活性剂离子源，但基本不含螯合或络合剂和Mg2+离子，这表示其含有低于10mg/L的络合剂和Mg2+离子，优选低于1mg/L，更优选低于0.1mg/L，更优选低于0.001mg/L，且最优选所述裂解缓冲液完全不含有任何络合或螯合剂和Mg2+离子(0mg/L)。所述裂解缓冲液pH为7.5-10，优选8-9和最优选8.5，且还可包括蛋白酶如QIAGEN蛋白酶K或QIAGEN蛋白酶,(凯杰公司，德国希尔登)。阴离子表面活性剂是如硫酸盐、磺酸盐和羧酸盐，优选烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、烷磺酸盐、烷基苯磺酸盐和烷基羧酸盐。特别优选能提供显示与十二烷基硫酸根(DS-)相似沉淀性质的表面活性剂离子的表面活性剂，更优选能提供硫酸根离子的表面活性剂，且最优选提供十二烷基硫酸根离子源的表面活性剂。作为十二烷基硫酸根离子源，可使用溶于水后能释放十二烷基硫酸根离子(H3C(CH2)11SO4 -)入溶液中的任何化合物。十二烷基硫酸根离子源优选选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵和十二烷基硫酸锂，且最优选十二烷基硫酸钠。缓冲液中表面活性剂离子源的浓度取决于待裂解的样品，但优选1-100mmol/L，更优选5-75mmol/L，更优选10-50mmol/L和最优选25mmol/L。缓冲物质可以是能提供pH至少为7.5的任何适宜缓冲物质如TRIS、HEPES、HPPS或任意氨缓冲溶液。优选的缓冲物质是TRIS。缓冲液中缓冲物质的浓度优选范围为1～100mmol/L，更优选5～75mmol/L，更优选10～50mmol/L，且最优选25mmol/L。缓冲液中缓冲物质对表面活性剂离子源的分子比例优选范围是3:1～1:3，更优选2:1～1:2，更优选1.2:1～1:1.2，且最优选1:1。所述裂解缓冲液还可包含选自下组的活性组分：稳定剂如叠氮化钠，增溶剂等。缓冲液中的氯离子浓度优选低于10mmol/L，更优选低于1mmol/L，更优选低于0.1mmol/L。
该缓冲液使样品材料在低盐裂解条件即低渗条件下快速裂解，这表示所述缓冲溶液中的总离子浓度低于待裂解细胞内的总离子浓度。例如，在NaCl的情形中，包含低于0.9wt%NaCl (约155mmol NaCl，对应于310μmol/L溶解离子)的水溶液是低渗的。用该缓冲液，即使是固体材料含量相对高的样品如组织样品，通常在如56°C下用时不到40分钟就完全裂解了。裂解可在温度范围45°C～70°C下进行，优选50°C～68°C，最优选62°C。对于10mg样品组织的裂解，使用的缓冲液体积优选为80～150μL，更优选80～120μL，更优选80～100μL，且最优选80μL。因此可就较高或较低含量的样品计算比例(缓冲液:样品)。
可以在裂解样品后可选地分解裂解物中存在的RNA。分解RNA的步骤包括降低裂解物中溶解的RNA含量和/或灭活RNA和/或促进RNA与DNA分离的任意方法，包括部分或完全性的热、化学和/或酶促水解、消化、转化和/或分解RNA的任意方法，和/或从溶液中去除RNA或其片段如通过沉淀、吸附过程等等。用于分解样品中RNA的简单方法是通过将样品加热到至少60°C的温度而不另外添加分解剂。若RNA保持在样品中，则推荐仅将样品加热至最高58°C，优选最高56°C。在一个优选实施方式中，分解RNA如相同申请人于本申请同日提交的题为“method for isolating and purifying nucleic acids(分离和纯化核酸的方法)”的共同待审申请所述完成，其中生物样品与裂解缓冲液的混合物的孵育步骤，以及裂解物中所存在RNA的任选分解步骤在单个步骤中进行，优选通过将混合物加热至温度等于或高于60°C，优选60°C～70°C，更优选61°C～65℃，且最优选62°C。优选将混合物加热10～80分钟(min)，更优选15～60分钟，更优选20～50分钟，且最优选30～45分钟。
在裂解步骤期间或之后提高温度至最高80°C会额外地使样品中的蛋白质(例如酶)变性而不影响所需的DNA，特别是基因组DNA。当然，该情况中不获得RNA。
用本发明所述方法从10mg样品可得到的DNA量取决于样品，例如其种类和新旧。通常从10mg不同组织样品中获得约5-70μg基因组DNA。
约10mg的用量是分子诊断中常规分析的样品量。但应当理解，使用本发明所述方法能处理更大或更小的样品材料量，例如分别在g-范围或μg-至ng-范围。在此情况中，试剂、缓冲液、固体基质的用量以及色谱装置的尺寸需要通过放大或缩小来调整，这是本领域技术人员所熟知的。
如上所述裂解所述样品和任选地分解所述样品中存在的RNA后，优选通过沉淀从所述裂解物中移除表面活性剂离子。优选如相同申请人于本申请同日提交的题为“method for precipitating anionic surfactant ions in the presence ofnucleic acids(在核酸存在下沉淀阴离子表面活性剂的方法)”的共同待审申请中所述通过向裂解物中添加溶液（沉淀溶液）进行沉淀，所述溶液包含碱金属的单价离子和/或碱土金属的二价离子，所述离子选自下组Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+、Ba2+或其混合物（优选由其组成），这类离子与表面活性剂离子，特别是十二烷基硫酸根离子形成不溶性沉淀。所述沉淀溶液优选含Sr2+离子。所述沉淀溶液包含碱金属和/或碱土金属的水溶性盐，例如RbCl、SrCl2、CaCl2或BaCl2，其在溶于水时提供碱金属的单价离子和/或碱土金属的二价离子。沉淀溶液中单价和二价金属离子的浓度优选范围是0.1～10mol/L，优选0.5～5mol/L，更优选0.75～2.5mol/L，最优选0.9～1.2mol/L。向一定体积液体样品(裂解物)所添加沉淀溶液的体积取决于该样品溶液中的表面活性剂离子浓度。在优选实施方式中，液体样品对沉淀溶液的体积比范围为4:1～12:1，优选5:1～11:1，更优选6:1～10:1，且最优选7:1～9:1。例如，若如上所述通过裂解样品获得80μL的液体样品，则优选添加10μL的1M沉淀溶液以沉淀表面活性剂离子。
术语沉淀理解为向含有溶解核酸和表面活性剂离子的溶液添加某一物质或物质混合物的步骤，所添加的物质与所述表面活性剂离子反应以形成不溶于所得溶液的复合物，从而从所述溶液中沉淀出来。任选地，可孵育所述混合物以确保沉淀形成的完全性，所述孵育优选在-10°C-10°C、优选–5°C-5°C、更优选–2.5°C-2.5°C且最优选–1°C-1°C，优选持续3-60分钟、更优选5-30分钟且最优选约10分钟，如将该混合物在冰浴中静置。
本发明提供一种用于分离和纯化核酸的试剂盒，所述核酸优选含DNA，尤其是基因组DNA，所述试剂盒包含：1.本发明的色谱设备和一种或多种选自下组的组分，2.裂解缓冲液，3.碱土金属单价离子和/或碱土金属二价离子的离子源，和任选用于从洗脱物直接扩增一种或多种靶核酸的一种或多种引物。所述试剂盒优选含上述裂解缓冲液。在具体优选的实施方式中，所述试剂盒还包括碱金属单价离子和/或碱土金属二价离子的离子源，所述离子选自下组Rb+、Cs+、Ca2+、Sr2+、Ba2+或其混合物，优选由其组成，所述离子源的形式是待用户溶解的水溶性碱土金属盐，或是待用户稀释的母液或是即用型溶液，此外所述试剂盒优选包括本分离和/或纯化方法的说明。
附图说明
图1显示本发明色谱装置的一个优选实施方式。图1a显示所述装置的侧视图，图1b显示俯视图。
图2显示用不同方法将从碱土金属二价金属离子和十二烷基硫酸根离子形成的沉淀移除后溶液中存在的SDS残余量（参见实施例1）。虽然使用大量过量沉淀溶液没有检测到显著优势（50μL与25μL），在移除所述沉淀中过滤步骤（过滤（filt））通常比离心（离心（centrif））明显更有效。若所述样品在冰浴（冰）中孵育10分钟然后过滤，则获得最佳的结果。
图3显示先前用沉淀溶液处理的10mg猪肝组织裂解物的纯化结果，使用不同凝胶过滤树脂与通过MiniSart滤器（德国哥廷根的萨托瑞斯公司(Sartorius)）、硅料（凯杰公司，德国海尔登）、硅颗粒床（QiaExII，凯杰公司，德国海尔登）、或QIA-粉碎柱（凯杰公司，德国海尔登）的简单过滤作比较。所述纯化方法对gDNA量(以μg计)、对洗脱液中存在的SDS量（以μmol/L计）和对水稀释后的洗脱液传导率（以20°C参考温度下的μS计）的影响如实施例2所述测定。
图4显示按实施例2所述用尺寸排阻限度不同的市售Sephacryl树脂(S200,S400,S500和S1000)去除污染物的程度。
图5显示按实施例3所述的PAGE分析所得结果，所述分析为粗猪肝组织裂解物(泳道1)，"经沉淀"的粗猪肝组织裂解物(泳道2)，用QIAamp裂解试剂盒与RNA酶从猪肝组织所得裂解物(泳道3)，用QIAamp裂解试剂盒从猪肝组织所得裂解物而不添加RNA酶(泳道4)，QIAGEN蛋白酶(泳道5)，RNA酶A(泳道6)，以及按本发明所述纯化的洗脱液(泳道7～9)和用QIAamp试剂盒所得洗脱液(泳道10和11)的对比。泳道L中分析了蛋白质标准品。
图6显示对200μL按实施例4所述未添加RNA酶所得粗猪肝裂解物的AEX-HPLC分析。还显示对HPLC运行所收集的不同组分的琼脂糖凝胶分析。
图7显示10mg新鲜猪肝的样品用a)本发明所述方法，和b)QIAamp试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)纯化的洗脱物所得HPLC概况的比较(见实施例4)。尽管两个样品中残留污染物的含量相当，按校正曲线所确定，本发明所述方法获得的gDNA得率高出近50%(9.2μg对比6.2μg)。
图8显示gDNA洗脱液的紫外/可见光谱，分别通过利用本发明所述方法(上部光谱)和利用QIAamp试剂盒(下部光谱)裂解并纯化10mg猪肝组织获得洗脱液(见实施例5)。
图9显示用本发明所述方法分离并纯化自大鼠尾部的样品的抑制研究(jun试验)(见实施例6)。由于样品中存在高浓度gDNA，在未稀释样品中观察到强产物抑制，甚至在10倍稀释的样品中也观察到弱抑制，而更高稀释度的样品中未见抑制。
图10显示按实施例6所述从qRT-PCR反应所得的CT值，所述反应在TAQman 7700分析仪上于jun试验中扩增用本发明所述方法(标为“一步式”)和用QIAamp试剂盒从10mg大鼠肝组织获得的裂解物。同样在未稀释和10倍稀释的本发明方法所纯化样品中观察到产物抑制。但对于稀释样品，本发明所述方法所得裂解物的CT值始终较低。
图11显示用本发明所述方法纯化的两个血液样品的SYBR-green II染色琼脂糖凝胶(见实施例8)。作为参比，在左侧显示DNA长度标准(GIBCO 1kb plusDNA梯度，英杰公司(Invitrogen GmbH)，德国卡尔斯鲁厄)。
图12显示从肝、肾和脾组织样品获得的RT-PCR结果，所用样品或保存在市售的RNAlater试剂(凯杰公司，德国希尔登)中，冷冻在干冰上(-78°C)待用，或在收到时即使用(新鲜样品)。用市售的DNeasy试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)(左侧)和本发明所述方法(右侧，标为“一步式”)按实施例9所述裂解并纯化样品。对两种方法而言，可见RT-PCR反应中所得CT值都相当。
图13显示按本发明所述从肝和脾组织的裂解与纯化所得洗脱液的琼脂糖凝胶(见实施例10)。
图14显示按本发明所述，如实施例11所示在凝胶过滤步骤中用水、缓冲液AE和2倍浓缩的缓冲液AE为洗脱剂，裂解并纯化大鼠肝组织所得洗脱液中gDNA(以μg计)和SDS(以μM计)的含量和电导率(稀释后以μS为单位)。
图15显示对来自FFPE大鼠肝组织的18S rRNA编码基因的RT-PCR的CT值(实施例12)。利用市售试剂盒(1)和本发明所示方法和设备(2和3)裂解并纯化FFPE团块的切片。
图16显示利用市售试剂盒(1)和本发明所示方法和设备(2和3)从FFPE大鼠肝组织所得gDNA的量(实施例12)。
实施例
材料与一般实验过程
凝胶过滤介质获自GE医疗保健公司(GE Healthcare，德国弗莱堡)，离子交换介质获自默克公司(Merck KgaA，德国达姆施塔特)。
除非另有说明，所分析的组织样品是大鼠的肝组织样品。
确定gDNA的含量与纯度：为评估纯化样品(洗脱液)中gDNA的量(gDNA得率)，通过紫外/可见光谱在260nm下测定样品的吸光度。从OD260值(260nm下的光密度)中减去320nm下测定的背景吸光值，所得数值乘以DNA的特征吸光系数50，并乘以稀释因子来获得以μg/μL计的gDNA。此外，紫外/可见光谱还用于评价所得DNA的纯度。残余固体颗粒不显示明显的吸收峰，但导致整个光谱的基线提高。游离血红蛋白的吸光最大值在波长410nm处，而盐和防腐剂如叠氮化钠的吸收波长在230nm以下。用Spectramax II (分子装置公司(Molecular Devices)，美国加利福尼亚州萨尼维尔)96孔板分光计记录紫外/可见光谱。
用HPLC分析进行所得gDNA含量的更精确测定。用软件计算光谱中含gDNA峰的曲线下面积(AUC)并与HPLC标准曲线比较以确定样品中的gDNA量。还用HPLC分析确定样品的纯度，利用Vision BioCad工作站(前景生物系统公司(Perseptive Biosystems)，美国马萨诸塞州弗雷明汉)。采用装有离子交换树脂TMAE-Fractogel(S)(伊默克公司(E.Merck)，德国达姆施塔特)的0.83mLPeek柱。在缓冲于pH7.2的递增CaCl2梯度中以1.5mL/min流速分析样品，CaCl2浓度在35个柱体积内从0mmol/L升到300mmol/L。持续监控260nm和410nm下的吸光度。
用50mL含2.5μL SYBR-Green II的0.8%琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳。样品在100V下运行40分钟。用来自伯乐公司(BioRad)或LTF实验室仪器公司(LTF-Labortechnik公司，德国瓦瑟堡)的市售设备分析凝胶。
SDS定量：按适用于96孔分光计的Rusconi等的改良方法(Rusconi等，Anal.Biochem.,2001,295(1),31-37)来通过紫外/可见光谱测定残留SDS浓度。该试验基于羰花青染料“全染剂(Stains All)”(4,5,4’,5’-二苯并-3,3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青溴)与SDS的特异性反应，该反应导致形成黄色(最大吸光值在438nm)。由于SDS在本实施例中用作十二烷基硫酸根离子源，应理解溶液中的SDS量等于溶液中存在的十二烷基硫酸根离子量。
将1mL染料母液(含1.0mg“全染剂”的1.0mL 50%异丙醇)用1.0mL甲酰胺和18mL水稀释得到该染料的即用型溶液。为测定样品中的SDS量，将5μL样品溶液放入微孔板内，和100μL即用型溶液混合，并在室温避光孵育5分钟然后在438nm下读板。通过与校正曲线比较得到样品中的SDS量，所述校正曲线通过记录SDS浓度分别为250、167、111、74、49、32和21μmol/L的溶液在438nm下的吸光度来建立。
电导率测量：为确定样品中的离子强度，用Consort C831电导计(LTF实验室仪器公司，德国瓦瑟堡)进行电导率测量，校正至20°C。测量所需最小体积为2mL，因此在测量前用1980μL水稀释各样品的20μL各等分样品。
PCR扩增:实时PCR(qRT-PCR)试验在Rotor-Gene 2000或3000循环仪(Corbett公司，澳大利亚悉尼)以50μL规模进行，或在TaqMan 7700分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，美国加利福尼亚州福斯特城)上进行。
就jun RT-PCR试验而言，联用来自应用生物系统公司的2x TaqMan PCR通用预混试剂和来自应用生物系统公司(德国达姆施塔特)基于引物/探针系统(FAM)的市售试剂盒(产品号:4327113F)，其中包括20x Jun PCR引物/探针混合物。
基因组DNA标准纯化自大鼠尾部，使用QIA-symphony平台(凯杰公司，德国希尔登)，并通过后续的阴离子交换色谱(AEX)用QIAGENtip 2500按生产商方案(凯杰公司，德国希尔登)来进一步纯化。gDNA等分存放于–20°C，并在临用前解冻。
实施例1：移除十二烷基硫酸根离子和锶离子形成的沉淀
相同申请人于本申请同日提交的题为“method for isolating and purifyingnucleic acids(分离和纯化核酸的方法)”和相同申请人于本申请同日提交的题为“method for precipitating anionic surfactant ions in the presence of nucleicacids（在核酸存在下沉淀阴离子表面活性剂离子的方法）”的共同待审申请中描述了含表面活性剂离子的新裂解缓冲液和通过添加示例的锶离子从含该离子如十二烷基硫酸根离子和DNA的溶液中选择性沉淀表面活性剂离子的方法。为了最优化从所述裂解液中对这些沉淀的移除，不同量的0.5MSrCl2水溶液(分别为25μL和50μL)加入获自10mg组织裂解的裂解物，所述裂解是通过在含浓度均为25mmol/L的TRIS和SDS并通过添加H2SO4调节pH到8.5的裂解缓冲液中于62°C孵育所述样品40分钟。添加所述沉淀溶液后，混合物在室温或冰浴（约0°C）中孵育10分钟。然后分别通过在充有600μL GE医疗保健公司S1000SF基质（GE医疗保健公司，德国弗莱堡）短凝胶过滤柱上离心或过滤移除形成的沉淀。
结果如图2A（左手边）和2B（右手边）所示：图2A显示离心（centrif）和凝胶过滤色谱（filt）后上清/洗脱液中分别的SDS残余量[μmol/L]。可观察到凝胶过滤色谱在从所述溶液中移除SDS方面比理性更有效。样品冰浴孵育时发现洗脱液中最低量的残余SDS。在该情况中，将加入所述裂解液的沉淀溶液加倍时没有观察关于纯化后洗脱液中检测到的残余SDS量方面的优势。图2B可以看出，氯化锶对沉淀残余蛋白也有效。为了确保通过沉淀溶液进行低样品稀释，所述沉淀溶液中的SrCl2浓度调整为1.0M，且10μL该沉淀溶液足以影响从用80μL所述裂解缓冲液孵育10mg组织所得裂解物中沉淀出十二烷基硫酸根离子和残留蛋白质。
实施例2：优化用于从裂解液纯化gDNA的离心柱
实施例1显示过滤在移除添加SrCl2溶液后形成的沉淀方面比简单离心更有效。因此，凝胶过滤色谱所需的基质的最小量用GE-医疗保健公司S1000SF基质测定。结果与其他过滤方法比较，具体为通过下述的过滤：QIA粉碎柱（凯杰公司，德国海尔登）、硅料（材料编号：1016844，凯杰公司，德国海尔登）、硅颗粒床（QiaExII，凯杰公司，德国海尔登）、通过0.2μm膜MiniSart滤器的无菌过滤(德国哥廷根的萨托瑞斯公司)和市售可得的G25离心柱(GE-医疗保健公司)。
10μL 1M SrCl2-溶液加入80μL如实施例1所述获得的裂解物。混合物在冰浴中孵育，然后应用于不同过滤装置。用离心通过过滤装置移出移动相，然后收集并分析所获洗脱液。各实验一式两份地进行。对各洗脱液，如通常方法所述测定存在的纯化gDNA含量。根据通常方法中所述的方案通过紫外/可见光谱测定SDS含量。此外，通过通常方法的传导率测量法测定洗脱液中离子的存在。结果见图3。gDNA含量以μg计，SDS含量以μmol/L计且20μL洗脱液用1.980μL水稀释后的传导率以μS计。
如图3所示，传统料QIA粉碎柱和MiniSart滤器在移除SDS或其他盐上无效。市售G25离心柱能移除样品中存在的约2/3的SDS，然而，洗脱液中的残余SDS量仍太高而不能在后续PCR反应中直接使用该洗脱液。使用硅颗粒床没有获得可重复结果，不同实验的结果彼此高度偏离。此外，用QIA粉碎柱和MiniSart滤器获得的洗脱液显示黄色。
使用S1000基质，400μL或更少的基质含量不足以用固定角度转子在离心期间形成均匀的凝胶床。确保柱高2.5cm内径0.8-0.9cm的离心柱中形成均匀凝胶床所需的最小基质量为600μL。
用离心柱的凝胶过滤色谱中常见的问题是所述裂解物可能进入所述离心柱的内壁，穿过玻璃料而不进入所述凝胶床。当大样品体积应用于柱或当所述样品没有严格应用于所述凝胶床的中央时，则尤其如此。结果，污染物未从这些样品中移除。通过引入优选位于多孔料、滤器、毛网或膜与基质之间的无孔环，密封所述玻璃料、滤器、毛网或膜的外部区域，以阻止移动相进入所述玻璃料而不穿过基质，从而克服上述问题。
下一步骤中测定基质床的最优尺寸排阻限度。向图1所示离心柱中填入600μL不同的市售凝胶过滤基质(含有球形烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺基质的Sephacryl树脂)，柱内配有致密二氧化硅玻璃料(基质编号1017499,凯杰公司，德国希尔登)、塑料环和螺帽。表1给出所用树脂的尺寸排阻限度(分别以碱基对(bp)，或kDa表示)。
表1
  树脂   尺寸排阻限度
  S-200HR   30bp(5-250kDa)
  S-300HR   118bp(10-1500kDa)
  S-400HR   271bp(20-8000kDa)
  S-500HR   1078bp(ND)
  S-1000SF   20000bp(ND)
所有树脂于使用前在水中平衡：将10mL树脂与40mL水混合，使树脂沉降，直至获得10mL沉降物，弃去上清(水)。该过程重复三次。最终，通过加水将悬浮树脂的体积调整至10mL。通过在700x g持续3分钟的预离心步骤(预离心)建立凝胶床以使柱备用。将如上所述获自10mg组织的全部裂解物(包括沉淀物)施加到各柱的凝胶床上表面中心。然后通过700x g离心3分钟洗脱DNA。各试验进行至少两次。如上所述测定存在于洗脱液中的gDNA和SDS含量。合并同一树脂纯化的所有样品，用合并样品的经稀释溶液测定样品的电导率。结果见图4。与前文讨论的过滤方法相比，所有树脂都适于显著减少样品中的SDS和其它离子含量。根据Goldenberger等，(D.Goldenberger等，Genome Res.1995,4,368-370)所述，样品中SDS浓度超过345μmol/L会完全抑制PCR反应。对于实时PCR反应，可容许的最大SDS含量约为250μmol/L。采用S400HR树脂能从样品中完全去除SDS。还证明该树脂有助于去除残留的RNA小片段。
实施例3：洗脱液的PAGE分析
为评估纯化过程中蛋白质的去除程度，并确定凝胶过滤色谱后所得洗脱液中存在的蛋白质残留量，在含SDS的市售TRIS/HEPES 2-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶(LTF-LABORTECHNIK)上通过PAGE分析按实施例4所述用S400HR树脂所纯化的样品。用NOVEX XCell系统(英杰公司，德国卡尔斯鲁厄)将凝胶在所提供的TRIS/HEPES缓冲液中以100V运行25分钟。将掺有蛋白质大小标记的15μL样品用15μL随凝胶提供的2X缓冲液稀释。混合物加热至95°C持续5分钟，然后在冰浴中冷却，此后上样至凝胶袋内。凝胶通过在Gradipure染液(Gradipore公司，澳大利亚悉尼)中浸没过夜来染色，然后用水淋洗。结果见图5。名为“L”的泳道是SeaBlue蛋白标准品，获自英杰公司(德国卡尔斯鲁厄)。泳道1中，分析用上述裂解缓冲液从10mg猪肝组织获得的15μL粗裂解物。泳道2中，分析添加上述沉淀溶液后的15μL相同裂解物(未经过滤步骤)。为了比较，在泳道3中，分析用QIAamp试剂盒获得且经过15μL RNA酶A处理的15μL裂解物。在泳道4中，分析用QIAamp试剂盒获得但未添加RNA酶的15μL裂解物。为了比较，分别在泳道5和6中分析QIAGEN蛋白酶和RNA酶A。7～9各泳道中，分析了通过本发明所述凝胶过滤色谱纯化后所得洗脱液的20μL等分样(共获得100μL洗脱液)。在10和11泳道中，分析用QIAamp试剂盒所得洗脱液的20μL等分样。(共获得400μL洗脱液)。可见通过添加氯化锶已将大量蛋白质与SDS一起共沉淀。剩余量的蛋白质可通过本发明所述的凝胶过滤色谱来有效去除，用本发明方法所得结果与使用市售QIAamp试剂盒所得结果相当，特别是在注意到QIAamp试剂盒所得洗脱液的稀释度高达4倍的情况下。用肺样品和小鼠尾部所得的结果相当(数据未显示)。
实施例4：洗脱液的AEX-HPLC分析
为检测微量的残留污染物例如蛋白质和RNA片段，在TMAE-Fractogel SHPLC柱上用CaCl2梯度于pH 7.2以1.5mL/min流速进行阴离子交换(AEX)HPLC分析。在含5%TRIS(pH7.2)的水溶液中建立跨35个柱体积的0mmol/L～300mmol/L CaCl2的梯度。所用进样体积为200μL。
在初始实验中，分析没有RNA酶时用上述缓冲液孵育10mg猪肝组织所得的200μL粗裂解物。从HPLC采集7个组分，按常规方法与全染剂染料反应，随后在琼脂糖凝胶上分析。HPLC色谱图和琼脂糖凝胶的图片见图6所示。
组分1和2不与该染料反应，表明SDS和核酸的浓度低于21μmol/L SDS的检测限。组分3和4在添加染料后显示蓝色，表明存在不能用SYBR-Green II在琼脂糖凝胶上染色的核苷酸或可溶蛋白质。组分5和6在RNA典型性电导率下洗脱，并在琼脂糖凝胶中给出小于100bp的微弱核酸条带，而组分7含有基因组DNA。
在进一步实验中，通过HPLC分析比较用本发明设备和方法纯化的样品和用市售QIAamp试剂盒纯化的样品。为确定基因组DNA的含量，利用校正曲线来关联gDNA洗脱峰的曲线下面积和柱上所加载的gDNA量，所述校正曲线采用了递增量基因组大肠杆菌(E.coli)DNA，该DNA由阴离子交换色谱纯化。图7中显示用本发明所纯化样品(a)与用QIAamp试剂盒所纯化样品(b)的重叠色谱图，两个色谱图均在波长260nm下监测。从根据本发明所纯化50μL洗脱液得到的得率(图7中迹线a)显著高于从使用QIAamp试剂盒所得200μLgDNA中得到的gDNA量。(用于比较，图7中的迹线a和b相对某一共同进样体积标准化。)这表明用本发明所述纯化方法可获得洗脱物中的高浓度gDNA。通过对HPLC色谱图中相应峰的积分来测定，两种样品中的残留蛋白质和其它杂质的含量相当。用校正曲线来测定，按本发明所述纯化的样品中存在的gDNA量为9.2μg，而通过使用QIAamp试剂盒所得的gDNA量为6.2μg。
实施例5：用紫外/可见光谱测定洗脱液中gDNA的得率和纯度
根据本发明所述方法裂解并纯化12个10mg猪肝的样品，凝胶过滤步骤中用水为洗脱剂，并与用QIAamp柱和相同洗脱剂所纯化的6个10mg猪肝样品作比较。结果见图8，支持HPLC分析所得结果。在gDNA有最大吸光值的波长260nm处，用本发明所述方法所纯化样品中的吸光值总是高于QIAamp所纯化样品。此外，在QIAamp所纯化样品的光谱中的基线高于本发明方法所纯化样品的光谱中的基线，这可能表明QIAamp纯化样品中的残留固体颗粒含量较高。
实施例6：所纯化大鼠尾部gDNA的RT-PCR分析
为确保按本发明所述纯化的样品中没有PCR抑制剂，按上所述裂解20mg大鼠尾部并用如上详述的本发明方法纯化。然后在Rotorgene系统(Corbett公司，澳大利亚悉尼)上采用jun-系统以实时PCR(RT-PCR)方式分析这些纯化的样品并和用AEX色谱所得gDNA获得的结果作比较。联用来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的2x TaqMan PCR通用预混试剂和市售的引物/探针系统(FAM-TAMRA,应用生物系统公司，德国达姆施塔特)，该系统中包括20xjun PCR引物/探针混合物。根据生产商的说明书进行RT-PCR。具体地，通过将混合物95°C加热20分钟进行聚合酶活化，通过双链体在95°C解链15秒并在60°C退火60秒钟来进行循环。共进行40个循环。反应混合物由22.5μL含gDNA样品，25μL预混试剂和2.5μL引物混合物组成。本发明所述纯化的样品以未稀释形式和用水稀释(稀释因子10、100和1000)后在PCR中用作模板。尽管未稀释样品(图9中曲线1)由于样品中的高浓度gDNA而显示相当强的产物抑制，本发明所述方法纯化的所有样品的序列都能扩增，无论稀释因子的高低。用水稀释10倍的样品(曲线2)仅显示弱抑制。扩增前分别稀释100倍或1000倍的样品(曲线3和4)的样品中未见抑制。为了比较，还进行没有靶标的反应(无靶标反应，NTC)，并在相同条件下扩增通过AEX色谱纯化的3个样品。
与用QIAamp试剂盒裂解和纯化的样品相比，用源自10mg冷冻肝组织如上所述裂解和按本发明纯化的样品获得类似结果。图10显示用不同稀释度的纯化样品的jun试验中，这些样品的RT-PCR所得CT值的比较。用本发明所纯化的未稀释样品的反应中再次观察到产物抑制。按本发明所纯化样品分别稀释10倍、100倍和1000倍所得的CT值始终低于用QIAamp纯化样品所得CT值，表明按本发明所纯化样品中存在更高含量的gDNA。
实施例7：比较用本发明所述方法和用QIAamp试剂盒从不同组织样品获得gDNA的得率
表2中所列不同组织的样品按上述裂解并随后通过添加锶离子来从裂解物中沉淀出SDS，或者按QIAamp方案裂解所述样品。裂解(和可应用时的沉淀十二烷基硫酸根离子)后，合并以相同纯化方法获自同类组织的样品，然后分成各100μL的等分样。将这些等分样分别按本发明所述方法或按QIAamp方案纯化。用紫外/可见光谱和/或HPLC分析来分析样品中存在的gDNA含量。所得平均结果见表2。
表2
Figure BDA00002205997500231
Figure BDA00002205997500241
实施例8：裂解和纯化人血样品
由于血液样品的高液体含量，细胞裂解使用两倍浓缩的裂解缓冲液(2X)，该缓冲液含50mmol/L TRIS与50mmol/L SDS，通过添加H2SO4调至pH8.5。将来自同一供体的2个40μL人血样品与等量2X裂解缓冲液混合。然后通过添加10μL QIAGEN蛋白酶(2.5AU/ml)来消耗血蛋白。样品在62°C孵育10分钟。如上所述通过沉淀从裂解物去除SDS，并用本发明的离心柱通过凝胶过滤色谱纯化样品。然后在琼脂糖凝胶上分析5μL和10μL的等分样(图11)。分析的所有样品中都可见gDNA条带，且没有可测的较短片段。
用18S gDNA引物定量分析样品中存在的gDNA量显示样品中平均得率为600ng gDNA(对两种样品，各进行两次RT-PCR，gDNA含量确定为所有4次实验的平均值)。
实施例9：不同动物组织样品的RT-PCR
从大鼠肝、肾和脾组织如上裂解和用本发明方法纯化获得或用市售DNeasy试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)按DNeasy方案获得的50ng纯化gDNA(由紫外/可见光谱估测)用作RT-PCR的靶标。使用新鲜和冷冻的组织样品，以及稳定在市售RNAlater试剂(凯杰公司，德国希尔登)中的样品。然后于TAQman系统上在基于SYBR-Green的RT-PCR反应中分析样品。如图12可见，两种方法在RT-PCR反应中所得CT值相当，无论所分析的样品类型如何(分别为新鲜、冷冻和稳定于RNAlater中)。调至pH 9.0的含有10mmol/L TRIS/HCl和0.5mmol/L EDTA的缓冲液AE用于按前文所述过程平衡离心柱并用作洗脱剂。
实施例10：从肝和脾样品纯化高分子量gDNA
分别如上裂解和按本发明所述纯化20mg大鼠的肝和脾组织。裂解在30分钟内完成。各实验一式两份地进行。在PCR反应和在溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶上分析所得裂解物中的gDNA质量(图13)，图中清楚显示高分子量的gDNA条带，即使凝胶过量上样。表3显示样品中存在的gDNA含量以及纯度，纯度用样品在波长260nm下的吸光度与在波长280nm下的吸光度之间的比值来评估。尽管反应条件未最终优化，仍获得大量纯度良好的gDNA。
表3
  样品   ng DNA/μL洗脱液   A260   A260/A280
  肝1   654.29   3.089   1.84
  肝2   621.75   12.44   1.72
  脾1   1330.87   26.62   1.85
  脾2   1494.49   29.89   1.82
实施例11：比较不同的柱缓冲液
如上所述裂解各10mg冷冻大鼠肝组织样品。添加沉淀试剂后，所述样品使用本发明柱通过凝胶过滤色谱纯化，分别在水和缓冲液AE中平衡。此外，数种样品在双倍浓缩的裂解缓冲液中裂解并通过凝胶过滤色谱用本发明离心柱纯化，在缓冲液AE中平衡。通过凝胶电泳分析所得洗脱液并测定gDNA和SDS含量以及洗脱液的电导率。仅在2个样品中测得SDS。结果见图14。
实施例12：从FFPE组织样品分离和纯化gDNA
裂解来自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)大鼠肝块的10μm厚样品，并分离与纯化gDNA，采用a)市售QIAamp试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)和b)本发明所述方法和设备。
a)在1mL二甲苯中裂解来自FFPE块的3份各10μm切片，涡旋混合10秒钟，全速离心2分钟。抽吸移除上清液。通过向各样品添加1mL EtOH，样品涡旋10秒，全速离心2分钟并去除上清液来萃取残留二甲苯。含有样品的开口管室温孵育20分钟使残留EtOH挥发。所得团块重悬于180μL ATL缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)中。向各样品添加20μL蛋白水解酶K(2.5AU/ml)(凯杰公司，德国希尔登)，涡旋混合样品。将样品在56°C孵育1小时，然后在90°C孵育1小时。样品冷至室温，然后向各样品添加1μL RNA酶A(10U/ml)(凯杰公司，德国希尔登)。向各裂解物添加200μL AL缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)，涡旋充分混合样品。然后添加200μL EtOH，再次涡旋样品。将裂解物转至QIAamp MinElute柱(凯杰公司，德国希尔登)并在6000xg离心1分钟。将QIAamp MinElute柱放入洁净的2mL收集管并弃去流出液。打开柱并用500μL AW1缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)洗涤且在6000xg离心1分钟。将QIAamp MinElute柱放入洁净的2mL收集管并弃去流出液。再次打开柱并用500μL AW2缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)洗涤且在6000xg离心1分钟。将QIAamp MinElute柱放入洁净的2mL收集管并弃去流出液。将膜全速离心3分钟以去除痕量的缓冲液。在洁净的1.5ml微量离心管中用100μl不含RNA酶的水室温孵育1分钟然后全速离心1分钟来完成gDNA的洗脱。
b)将各10μm的3份FFPE块切片在80μL上述裂解缓冲液(25mmol/lTris/H2SO4,25mmol/L SDS,pH8.5)中裂解，该缓冲液中加有10μL QIAGEN蛋白酶(2.5AU/ml)(德国希尔敦)和1μL RNA酶A(7000U/ml)。涡旋混合样品。将3个样品62°C孵育30分钟，然后90°C孵育1小时，而另3个样品56°C孵育1小时，然后90°C孵育1小时。向各样品添加10μL所述沉淀溶液(1mol/LSrCl2)，然后涡旋混合样品，并在冰上孵育10分钟。然后各样品转移到本发明的预旋转的离心柱上（“一步式柱”），所述柱在700xg离心3分钟，同时收集含gDNA的洗脱液。
为评估所得gDNA的量和品质，在TAQman系统上进行基于SYBR Green的RT-PCR，用18SrRNA的编码基因作为靶标。结果见图15和16。尽管两种方法的RT-PCR所得CT值相当(用本发明所纯化样品的CT值略低)，用本发明所述设备和方法所得gDNA的量约为用市售试剂盒所得gDNA的量的约1.5到约几乎2倍。由图16可见，裂解时间延长至1小时对由FFPE样品获得gDNA的得率产生有利影响。

Claims (14)

1.一种通过凝胶过滤色谱从污染物中分离和纯化核酸的色谱设备，所述核酸优选包括DNA，尤其是基因组DNA，所述方法包括至少一种色谱单元，所述单元包括：
1.具有入口(2)和出口(3)的中空体(1)，所述中空体(1)包括固体基质(4)，优选形成凝胶床，
2.置于所述出口(3)和所述固体基质(4)之间的多孔玻璃料、滤器、毛网或膜(5)，其将所述固体基质留在色谱单元内，优选允许任何尺寸的核酸穿过，
3.位于多孔玻璃料、滤器、毛网或膜(5)与基质(4)之间的无孔环(6)，所述无孔环密封所述玻璃料、滤器、毛网或膜(5)的外部区域，以阻止移动相进入所述玻璃料(5)而不穿过基质(4)，
4.任选至少一种可移除闭合装置(7)，所述闭合装置密封所述色谱单元的入口(2)和/或出口(3)，和
5.任选至少一种收集管，所述收集管收集穿过所述基质(4)的移动相（洗脱液），
其中所述固体基质是尺寸排阻限度为150-500bp的凝胶形成聚合物，优选200-400bp和最优选250-300bp。
2.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述凝胶形成聚合物选自下组：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或其混合物，优选为葡聚糖和聚丙烯酰胺的混合物。
3.如权利要求1或2所述的设备，其特征在于，所述可移除闭合装置是选自下组的一次性闭合装置：盖箔、封条和可脱离末端，或者选自下组的可重新紧闭的闭合装置：螺帽和搭锁帽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的设备，其特征在于，所述色谱单元的入口和出口用可移除闭合装置密封，且所述固体基质以预溶胀在溶剂中的凝胶形式提供，所述溶剂选自水、有机溶剂与水的均相混合物，或者水性缓冲液，其中所述溶剂在临使用前通过离心(预离心)从色谱单元中排除，并同时建立基质（床）。
5.如权利要求1-4中任一项所述的设备，其特征在于，所述设备还包括平行形式的多个不同色谱单元，这些色谱单元优选是多孔板的形式，其中多孔板的各孔含有一个单独的色谱单元。
6.一种用权利要求1-5中任一项所述的设备通过凝胶过滤色谱纯化核酸的方法，所述核酸优选包括DNA，尤其是基因组DNA，所述方法包括步骤：
1.提供待纯化的含核酸的样品，其中所述样品为液体优选水性洗脱剂中溶液或悬液的形式，
2.在所述色谱单元中建立基质，优选通过离心（预离心），
3.将该样品应用于所述基质上表面，
4.优选通过离心从所述色谱单元中洗脱所述核酸，并同时收集所述洗脱液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品是获自生物样品的裂解物，优选获自选自下组的含细胞生物样品：新鲜和冷冻的组织、血液、其他体液和革兰氏阴性菌。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，通过将所述装置在500～900x g离心1～7分钟进行，优选在700x g离心2~5分钟，且最优选在700xg离心3分钟而实施所述预离心步骤。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，每色谱单元内基质床的体积为100μL～2mL范围，优选500μL～1mL范围，且最优选700～800μL。
10.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述每600μL-800μl基质床的样品体积范围为10-100μL。
11.如权利要求6-10中任一项所述的方法，其特征在于，通过将所述装置在500～900x g离心1～7分钟进行，优选在700x g离心2~5分钟，且最优选在700x g离心3分钟而实施所述从色谱单元中洗脱核酸的步骤。
12.如权利要求6-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是通过在先的裂解过程获得的含细胞生物样品的裂解物，所述过程包括步骤：
1.混合所述含细胞样品和裂解缓冲液，
2.孵育所述混合物以获得至少含DNA、RNA和蛋白的裂解物，
3.任选分解裂解物中含有的RNA，
4.任选选择性沉淀除DNA以外的溶质。
13.一种用于分离和纯化核酸的试剂盒，所述核酸优选基因组DNA，所述试剂盒包含：
1.权利要求1-5中任一项所述的设备，
和一种或多种选自下组的组分：
2.裂解缓冲液，
3.碱土金属单价离子和/或碱土金属二价离子的离子源，和
4.用于直接扩增一种或多种靶核酸的引物。
14.如权利要求1-6中任一项所述的色谱设备在分离或纯化基因组DNA中的用途。
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