CN110327661A - 层析柱组件 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种层析柱组件,其提供了用于执行层析分离的可承受的自装填的柱。层析柱组件包括具有在大致相对的端部处的第一开口和第二开口的柱管,以及具有卡扣配合设计或栓接设计的端盖。柱组件还包括接合器轴,其通过端盖插入柱中以用于实现期望的底座容积。柱组件还可包括包围第二开口的第二端盖,且可选的接合器轴可通过第二端盖插入柱中,允许底座容积的进一步调整。
Description
本申请为2016年3月25日进入中国国家阶段的PCT申请“层析柱组件”(申请号:201480053202.0,申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司)的分案申请。
技术领域
本发明涉及使用液体层析法提纯细胞组分,诸如蛋白质和/或缩氨酸。更具体而言,本发明涉及一种层析柱及用于提纯一种或多种细胞组分的套件,以及其使用方法。
背景技术
生物技术方法在蛋白质、缩氨酸、核酸和其它生物实体的研究中用于日益增加的范围。由于其通用性和对实体的灵敏度,故在此背景下,层析法通常是优选的提纯方法。层析法基于通过将混合物溶解在流动相(例如,如缓冲液的液体)中且使其穿过固定相(例如,可为珠/树脂的层析基质)来分离混合物的原理。更具体而言,包括目标实体(例如,化学/生物分子)的混合物引入移动相中,移动相然后与也称为层析基质的固定相接触。目标实体在其由移动相传送穿过固定基质时,然后将经历固定相与移动相之间的一系列相互作用。相互作用利用了混合物中的目标实体和其它组分的物理或化学性质的差异。
层析方法可在不同操作模式中运行。最简单的模式是批层析法,其中移动相添加到包含固定相的容器中;在适合时段内允许目标实体与固定相之间的相互作用;取回移动相;以及添加洗脱剂来释放目标实体。另一方面,在柱层析法中,包含样本(混合物)的移动相加入包含固定相的柱的顶部。通过打开柱的下端处的出口,移动相穿过柱,在此期间,样本与固定相相互作用。通常通过在顶部应用少量洗脱剂且又允许洗脱剂由重力或使用层析法系统穿过柱来执行洗脱。
一旦在固定相上获得目标实体的适合负载,则液流从移动相变到洗脱剂,可选地具有一种或多种中间洗液,且在柱的出口处从洗脱剂回收目标部分。洗脱剂通常包括梯度,诸如盐或pH梯度。为了避免较大污染物的污染且获得柱各处的有利液体分布,入口通常配备有过滤器和机械液体分送器器件。更常见的是,出口将类似地存在过滤器和一些机械液体分送器器件。
执行蛋白质提纯的许多研究者使用基本层析法系统或通过人工方法。由于工作流的强制性,故这些使用者中的大多数采用自装填的空柱,对其自己的柱装填其选择的介质。许多销售者在此领域提供空柱。Bio-Rad提供Econo品牌下的低压层析柱。这些是具有流接合器的玻璃柱,且经得起小于1巴的低操作压力。Pall Corporation提供LRC柱,其可经得起10到30巴的操作压力。其螺纹锁系统允许活塞的快速粗略调整,随后精细调整(这给予了各种底座高度的覆盖)。
选择装填其自己的柱的使用者在低压柱节段中的有限压力规格、可承受性、易用性、具有接合器的端盖的复杂设计和柱的尺寸/规模的限制方面面临不断的挑战。存在对于更加用户友好且可经得起较高柱压力的良好的层析柱设计的需要。
发明内容
本文公开了新颖层析柱设计和使用此的方法。因此,本发明的第一方面在于提供结合新颖端盖设计的自装填的层析柱组件,其适用于生物分子(诸如蛋白质和/或缩氨酸)从初始生物材料的提纯。
本发明的特定方面提供了一种用于柱组件的新颖端盖,其为卡扣配合端盖。此柱可采用达到2巴的背压。
本发明的另一个特定方面提供了一种用于柱组件的新颖端盖,其为具有使用固持件或卡簧的栓接设计。此柱可采用达到5巴的背压。
本发明的第二方面在于提供一种使用包括根据本发明的某些实施例的新颖端盖的自装填层析柱组件对生物分子层析分离的方法。
本发明的第三方面提供了一种用于制作层析柱组件的套件,该套件包含根据本发明的某些实施例的新颖端盖构件。
本发明的进一步的细节和优点将从以下描述和权利要求中呈现。
附图说明
图1示出了根据本发明的一个实施例的层析柱组件的一部分的示意图,示出了端盖、接合器轴、销止挡件,以及柱管的一部分。
图2示出了根据本发明的一个实施例的层析柱组件的一部分的示意图,示出了端盖、固持件/弹性挡圈以及柱管的一部分的栓接设计。
具体实施方式
本发明涉及一种层析柱组件,其提供了用于执行层析分离的可承受的自我装填的柱,包括但不限于亲和力、离子交换、凝胶过滤、脱盐和使用层析系统或通过重力流的生物分子(诸如蛋白质)的缓冲交换。层析柱组件的模块化设计提供了某些优点,例如,易用性、自组装选择,以及耐高压加热性。
在第一方面中,本发明涉及液体层析柱组件,其包括具有在大致相对的端部处的第一开口和第二开口的柱管,以及根据本发明的某些方面的包围第一开口的端盖。可选地,柱组件还包括接合器轴,其从第一开口插入柱中以用于实现期望的底座容积。柱组件还可包括包围第二开口的第二端盖。在某些实施例中,第二端盖为根据任何现有技术设计的端盖。在其它实施例中,第二端盖为根据本发明的某些实施例的端盖,且可选的接合器轴通过第二端盖插入柱中,允许底座容积的进一步调整。
在一个实施例中,本发明提供了具有卡扣配合设计的端盖。卡扣配合端盖的使用允许层析柱组件经得起高于某些现有技术的端盖的柱压力。该柱可采用达到2巴的背压。卡扣配合设计还使柱组装过程容易完成,且因此很用户友好。在接合器轴存在时,该层析柱组件可结合任何层析系统使用;不考虑接合器轴的存在,新颖层析柱组件允许使用者执行重力流操作。
在实施例的变型中,本发明提供了具有内螺纹的卡扣配合设计的端盖,以及具有互补螺纹的可动接合器轴。包括可动接合器(一个或两个的组合或没有)允许使用者产生不同的底座容积,且在层析系统上或通过重力流方法使用柱。
在实施例的另一变型中,除具有内螺纹的卡扣配合设计的端盖(22)和具有互补螺纹的可动接合器轴(21)之外,包括了隐藏的销(即,止挡件)(24),其在第一开口端(图1)附近穿过柱管(23)的边沿的一部分。隐藏的销防止接合器轴与端盖一起旋转(由于摩擦),因此允许了底座高度的容易的调整。作为备选,O形环可用于在接合器轴与柱管之间引入摩擦(以防止接合器旋转)。
端盖的卡扣配合设计使得柱组件极为用户友好,且可在达到2巴的背压下操作。该设计允许使用者利用一个或两个接合器的组合实现各种底座高度。其还允许使用者将该柱用于重力流应用,而不使用层析系统。
在另一个实施例中,本发明提供了具有栓接设计的端盖(图2)。端盖(42)利用螺栓(44)栓接在第一开口端附近的柱(45)的边沿上,因此包围第一开口。具有内螺纹的端盖螺母(41)与具有互补螺纹的接合器轴(46)接合。可动接合器轴的使用(一个或两个的组合或没有)允许使用者调整底座容积。可选的销止挡件(43)可包括在端盖(42)上。止挡件防止接合器在端盖螺母旋转时旋转,因此允许底座高度的容易的调整。端盖螺母借助于弹性挡圈或任何类型的固持件[47]装固到栓接端盖。
端盖的栓接设计允许使用者与层析系统一起使用这些柱组件。这些柱组件可经得起达到5巴的背压。该设计允许使用者利用一个或两个接合器的组合实现各种底座高度。
柱管可由对生物分子的常规提纯期间使用的大部分化学制品提供抵抗力的任何生物相容材料制成。因此,例如,层析管可由适合的塑料材料、钢或玻璃制成。在某些实施例中,柱管由丙烯酸或聚丙烯材料制成。作为优选,柱管为透明的。柱管还可包括常规元件,诸如过滤器、分配器件、管路、配件、袋等。
柱管可具有不同高度和内径,以便端盖、接合器和相关构件制作成具有匹配尺寸。在某些实施例中,层析柱组件提供从1到170mL的柱底座容积。作为优选,具有卡扣配合端盖的层析柱组件具有从1到70mL的柱底座容积。还作为优选,具有栓接端盖的层析柱组件具有从2到130mL的柱底座容积。
在某些实施例中,柱管的内径在5到50mm之间,而柱管的长度在50到1000mm之间。在某些优选实施例中,用于具有卡扣配合端盖的柱组件的柱管具有10mm的直径和相应地100、200或400mm的长度。在某些其它实施例中,用于具有卡扣配合端盖的柱组件的柱管具有16mm的直径和200mm的长度。在某些其它优选实施例中,用于具有栓接端盖的柱组件的柱管具有60mm的直径和相应地200、400或700 mm的长度。
在某些实施例中,接合器轴可由对生物分子的常规提纯期间使用的大部分化学制品提供抵抗力的任何生物相容材料制成。因此,例如,接合器轴可由适合的塑料材料制成。在某些实施例中,用于具有卡扣配合端盖的柱组件的接合器轴由聚丙烯材料制成。在某些实施例中,用于具有栓接端盖的柱组件的接合器轴由高强度材料制成,以便经得起操作压力。例如,Grivory GVX-5H natural可为适合材料。Grivory GVX-5H natural为基于半晶质聚酰胺与部分芳香共聚酰胺的组合的50%玻璃纤维增强的工程热塑性材料。Grivory GVX-5H natural具有优化的流动性,且适用于注射模塑技术零件,甚至在吸湿之后呈现出优异的特征:高硬度和强度;高的尺寸稳定性、很低的翘曲;良好的化学抵抗性;以及很好的表面光洁度。另一示例性材料为PEEK 450G,尤其是在需要高强度时。此外,材料也可为任何数目的其它玻璃/碳填充的生物相容塑料。
在某些实施例中,在插入柱中的一端处的接合器轴可包括分配板。分配板允许进入液体在柱中均匀分配,因此提供了提高的柱性能。
在某些实施例中,端盖可由不会很快侵蚀接合器材料的任何材料制成。
根据本发明的液体层析柱组件容易使用。模块化设计允许柱组件的较好且较快的组装。备选设计也允许使用者能够使用基本层析系统在2到5巴之间的压力下操作,且提供了重力流应用的能力。该设计还适于提供用于市场上的任何基本液体层析系统的层析柱组件。其还通过允许使用者使用亲和力、离子交换、凝胶过滤和使用这些备选设计的柱中任一者的脱盐技术执行不同类型的提纯来提供完整的解决方案。此外,相比于直接竞争者的产品,该柱是更加可承受的,且具有优异的压力规格。
在本发明的第二方面中,提供了使用包括新颖端盖设计的自装填的层析柱组件的用于生物分子分离的方法。
在一个示例性实施例中,本发明涉及使用根据本发明的某些实施例的层析柱组件通过连续液体层析法用于从粗细胞溶解产物提纯一种或多种目标细胞组分,该方法包括以下步骤:
(a)容器中的细胞的溶解提供粗细胞溶解产物,且可选地净化细胞溶解产物;
(b)使这样得到的细胞溶解产物穿过根据本发明的某些实施例的层析柱组件,其装填适合的层析基质来吸收目标组分;
(c)通过使基质与释放吸收的组分的洗脱缓冲液接触来回收目标组分。
包含在液体(诸如发酵液)中的细胞的化学和机械溶解是本领域中公知的。化学溶解可结合任何适合的溶解试剂来执行,诸如清洁剂、溶解酶或离液剂。在有利实施例中,用于步骤(a)中的溶解试剂为酶。在特定实施例中,化学溶解通过加入适合量的溶菌酶且在适合的条件下获得。机械溶解也是本领域中公知的,且常用方法包括声处理、弗氏细胞破碎、均化、研磨和冷冻-解冻分解溶解。如本领域的技术人员将认识的那样,机械溶解的持续时间应当适于足够长以避免下游过程中的过滤器的阻塞,但足够短以不使期望的目标蛋白质和/或缩氨酸变性。在一个实施例中,步骤(a)包括化学和机械溶解两者。在化学溶解之后,机械溶解然后由任何公知的方法(诸如声处理)来执行。在本方法的优选实施例中,步骤(a)包括添加溶菌酶,随后声处理。这样获得的粗细胞溶解产物然后可选地在直接加入层析柱之前净化。
对于诸如亲和力、离子交换、凝胶过滤、脱盐或缓冲交换这样的常用层析分离方法,层析基质的选择是本领域的技术人员公知的。
如公知的那样,层析基质通常在加入样本之前利用适合的结合缓冲液平衡。样本优选与结合缓冲液组合,以获得适合的吸收(结合)条件。因此,在一个实施例中,在步骤(a)中,溶解产物与结合缓冲液组合来提供适合pH的移动相。示范性结合缓冲液将含有尿素和胍。施加的量将取决于处理的规模。在一个实施例中,本发明以分析规模执行,且移动相量然后达到50ml,诸如1到50ml,例如1ml或5ml。
洗脱通常根据本领域中的标准协议执行,其通常涉及添加洗脱缓冲液。作为备选,洗脱通过降低pH来执行。洗脱缓冲液可按照连续或逐步的pH梯度加入。此梯度洗脱将至少用于确定给定过程的最佳洗脱条件,且一旦此条件确定,则可在步骤(c)加入最佳pH的洗脱缓冲液。
粗溶解产物源自的细胞可为任何原核细胞或真核细胞,诸如细菌、酵母等。目标组分可为任何细胞组分,诸如多肽、蛋白质、蛋白质片段、DNA、RNA、其它核酸序列、碳水化合物、脂类、胆固醇或激酶。在一个实施例中,至少一个目标组分为蛋白质。目标蛋白质可为10000到200000Da的范围中的任何尺寸。在本方法的一个有利实施例中,至少一种目标组分为缩氨酸。
在另一个示例性实施例中,本发明涉及使用根据本发明的某些实施例的层析柱组件,以用于从混合物分离关注的生物分子,该方法包括以下步骤:
(a)向根据本发明的某些实施例的层析柱组件装填适合的层析基质;
(b)使混合物行进越过层析柱来吸收关注的生物分子;
(c)使基质与洗脱缓冲液接触,这释放关注的吸收的生物分子;以及
(d)收集关注的生物分子。
在本发明的第三方面,提供了用于制作层析柱组件的套件。套件包括在单独的隔间中的根据本发明的端盖,以及柱管。
在某些实施例中,套件中的端盖为卡扣配合端盖。在优选实施例中,卡扣配合端盖包括内螺纹,且套件还包括接合器轴,其包括互补的螺纹。在另一个实施例中,柱管包含开口端附近的其边沿上的销止挡件。
在某些实施例中,套件还包括螺栓、具有内螺纹的端盖螺母、固持环、具有互补螺纹的接合器轴(46),且端盖和柱管两者包含用于螺栓的开口。在一个实施例中,端盖包括销止挡件,其在接合器轴关于柱管旋转时防止端盖的移动。
在某些实施例中,套件还可包括对于生物细胞的层析分离有用的额外装置。
在有利实施例中,套件还包括说明书,诸如书面的或电子保存的说明书。
尽管已经示出和描述了本发明的特定实施例,但本领域的技术人员将清楚的是,在不脱离本发明的教导内容的情况下可作出变化和修改。前述描述和附图中阐释的主题仅通过说明提供且不作为限制。在基于现有技术以其适合的观点查阅时,意在使本发明的实际范围限定于下述权利要求中。
Claims (10)
1.一种液体层析柱组件,包括:
柱管,其具有在大致相对的端部处的第一开口和第二开口;以及
包围所述第一开口且卡扣配合在对应的柱管端部上的卡扣配合端盖;
用于从所述第一开口插入所述柱中的接合器轴;
其中所述卡扣配合端盖的端盖螺母具有内螺纹,且所述接合器轴具有互补的螺纹,从而所述端盖螺母与所述接合器轴接合;
其中所述端盖利用螺栓栓接在第一开口端附近的所述柱的边沿上,因此包围所述第一开口。
2.根据权利要求1所述的液体层析柱组件,其特征在于,所述组件可采用达到5巴的背压。
3.根据权利要求1所述的液体层析柱组件,其特征在于,所述液体层析柱组件还包括在所述第一开口附近跨越所述柱管的边沿的一部分的隐藏的销,所述销可操作使得所述接合器轴与所述端盖的旋转被防止。
4.根据权利要求1所述的液体层析柱组件,其特征在于,所述液体层析柱组件还包括O形环以在所述接合器轴与所述柱管之间引入摩擦来防止所述接合器轴的旋转。
5.根据前述权利要求中任一项所述的液体层析柱组件,其特征在于,所述液体层析柱组件还包括从所述第二开口插入所述柱中的第二接合器轴。
6.根据前述权利要求中任一项所述的液体层析柱组件,其特征在于,所述液体层析柱组件还包括包围所述第二开口的第二卡扣配合端盖。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的液体层析柱组件,其特征在于,所述接合器轴在插入所述柱的端部处包括分配板以允许进入液体在所述柱中均匀分配。
8.一种用于从混合物分离关注的生物分子的方法,包括:
(a)向根据权利要求1-7的任一项的层析柱组件装填适合的层析基质;
(b)使混合物行进越过层析柱来吸收关注的生物分子;
(c)使基质与洗脱缓冲液接触,这释放关注的吸收的生物分子;以及
(d)收集关注的生物分子。
9.一种用于组装层析柱组件的套件,包括在单独的隔间中的如权利要求1-7的任一项中所述的层析柱组件的部件。
10.根据权利要求9所述的套件,其特征在于,所述套件还包括书面或电子保存的说明书。
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