WO2014032285A1 - 用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法 - Google Patents

用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a multidimensional liquid chromatography separation system for protein separation, and in particular to a multidimensional liquid chromatography separation system for rapid on-line separation of proteins.
  • the present invention also relates to a separation method for protein separation using the liquid chromatography separation system. Background technique
  • the number of theoretical plates of the liquid chromatography column is generally 10 4 -10 5 .
  • the resolution of commercial chromatography columns is far from satisfactory, so two-dimensional liquid chromatography (2D) must be used.
  • -LC two-dimensional liquid chromatography
  • mD-LC multidimensional liquid chromatography
  • the 2D-LC and mD-LC separations are available in off-line and on-line.
  • the early 2D-LC separation method was mainly off-line, that is, the one-dimensional liquid phase separated fraction was collected, and the one-dimensional fraction was directly processed into a small amount, or processed (concentrated or After buffer exchange, a portion, or all, is injected into the second dimension column for separation.
  • Off-line methods have the disadvantages of time consuming, difficult to operate, sample contamination, low recovery, and poor repeatability.
  • the switching interface in mD-LC technology is the key to the entire system.
  • Commonly used sample loops alternately store transferred samples, parallel columns alternately enriched analytical samples and trapped column-enriched samples, and the entire two columns without interfaces.
  • these instruments have fatal flaws.
  • On-line 2D-LC and mD-LC liquid chromatographs with interfaces can only inject 1-10% of the one-dimensionally collected sample (only a few microliters) to the second-dimensional chromatographic separation.
  • MMC mixed-mode chromatography
  • a cylindrical 2D column (referred to as a 2D column) has more advantages than a 2D-LC with a flat 2D column.
  • this chromatography has the potential advantages of: 2D-LC analysis of the entire operation of the protein, including collecting the effluent from the first separation mode to the collection and storage of these effluents, online buffering at high flow rates After the exchange of the solution and the re-equilibration of the chromatographic system and the second injection into the same two-dimensional column, the separation using the second separation mode is carried out in a closed system, thereby realizing the "single column of the online protein" Rapid analysis of two-dimensional chromatography.”
  • the system is characterized in that it not only prevents environmental pollution, but also that the target protein can be quantitatively and completely transferred to the second-dimensional chromatographic separation, so that the low-abundance work in proteomics can be achieved.
  • the lower limit of detection of the protein will greatly accelerate the speed of today's proteomics "top-down-mass spectrometry" strategy. If the mixed mode column in MMC is used, because the column load is much higher than that of the usual column, it can be used for large-scale production of protein drugs, which will greatly save costs.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a novel multi-dimensional liquid chromatography separation system and a novel method for separating and purifying proteins and polypeptides using the same, which can realize a protein including a polypeptide (hereinafter referred to as a protein) online. Rapid analysis, separation and large-scale preparation, from shortening the purification process, improving the speed and recovery rate of each protein in two-dimensional and multi-dimensional separation, preventing environmental pollution and reducing the time and cost of the separation process.
  • Figure 1 uses a 1 mm long, 10 mm diameter pie-shaped column, also known as a chromatographic cake, where Figure 1A, Figure 1B, and Figure 1C are biphenyl, carbonic anhydrase, and fifteen peptide (GEPPPGKPADDAGLV), respectively. Chromatograms in RPLC linear gradient elution under simultaneous injection conditions, while Figure 1D, Figure IE, and Figure IF show the relationship between retention times of biphenyl, carbonic anhydrase, and fifteen peptides, and their asynchronous injection times, respectively. .
  • the corresponding values on the upper and lower abscissa are the "critical migration time fc MP " and "critical migration eluent concentration C CMP " of carbonic anhydrase and fifteen peptide under RPLC, respectively.
  • the injection lags the gradient for less than fc MP ie, when the concentration of the acetonitrile is lower than C CMP
  • the carbonic anhydrase and the pentapeptide are not eluted
  • both A is greater than fc MP (ie, when the concentration of the eluent acetonitrile is higher than C CMP )
  • carbonic anhydrase and pentapeptide will elute from the chromatographic cake, which is the protein and peptide in the chromatographic cake, or chromatogram
  • the “stagnation-migration” phenomenon on the column It is the discovery of this "stagnation-migration" phenomenon of proteins and peptides on chromatographic
  • an aspect of the present invention provides an mD-LC separation system for protein separation, the mD-LC system comprising a detection device, wherein the mD-LC separation system comprises:
  • a mobile phase storage tank for storing a liquid of a mobile phase separated by a multidimensional liquid chromatography
  • a sump device comprising p splicing device switching units, wherein p is greater than or equal to 1, the sump device selectively causing at least liquid entering the sump device to flow into the sump device a collection device;
  • the first infusion device delivers the mobile phase suitable for the first dimension separation to the first sample introduction device, and the first sample introduction device introduces a protein containing the protein to be separated from outside the system Separating the sample (as is) and causing it to enter the separation device along with the mobile phase from the first infusion device, the separation device performing first-dimensional liquid chromatography separation on the sample to be separated and thereby obtaining different fractions;
  • a middle distillate in the different fractions obtained after separation that needs to be subjected to further liquid chromatography separation is collected by the collection device and the middle distillate is stored in at least one concentrating device, and will not be required
  • the further separated fraction is discharged from the system through the liquid discharge device;
  • the first infusion device sends a mobile phase having a suitable composition to the liquid chromatographic separation and stores it in the collection device and stores it in the at least one collection All or a portion of a middle distillate in the apparatus is delivered to the injection mixer along with the mobile phase, the second infusion device being removed from the mobile phase storage tank for liquid chromatography separation a mobile phase having a suitable composition and delivering the mobile phase to the injection mixer, the injection mixer bringing all or part of the middle distillate from the at least one sump and the mobile phase
  • the mobile phase of the second infusion device is mixed to obtain a second-dimensional injection mixture having a suitable composition, and the separation device performs second-dimensional or more multi-dimensional liquid chromatography separation on the injection mixture. This gives different two-dimensional separated fractions.
  • the amount of the mobile phase having the appropriate composition for the second or more multi-dimensional separation delivered by the first infusion device and the second infusion device is adjusted and metered, thereby enabling
  • the eluent concentration in the second or more multi-dimensionally separated injection mixture is lower than all of the middle distillates contained in the injection mixture to be retained in the second or more dimensional separation
  • the critical migration eluent concentration of the protein is adjusted and metered, thereby enabling The eluent concentration in the second or more multi-dimensionally separated injection mixture is lower than all of the middle distillates contained in the injection mixture to be retained in the second or more dimensional separation.
  • a strong eluent can be connected to any of the lines and devices.
  • the first and second infusion systems can deliver any strong elution solvent when the chromatographic system or a portion of the separation device requires periodic cleaning.
  • isolation refers to liquid chromatography separation.
  • the "dimensional" number of liquid chromatography separation refers to the number of different separation modes of the cylindrical column used for liquid chromatography performed in the liquid chromatography separation process (ie, the sample to be separated) The number of times a product enters a cylindrical LC column for separation using different separation modes.)
  • "Multidimensional liquid chromatography” refers to more dimensional two-dimensional liquid chromatography including two-dimensional liquid chromatography (for example, three-dimensional Liquid chromatography), in other words, "mD-LC” also includes "2D-LC”.
  • a column with i separation mode means that there are i separation modes and can be used for different separation processes.
  • i 2 the column is a column with two or more LC separation modes that can be used in two or more different separation modes (also referred to as “mixing” in this application Mode, or mixed mode column (MMC column)”).
  • MMC column mixed mode column
  • fraction means a portion of a target product having a different retention time obtained by separating a liquid phase entering a column.
  • “Middle fraction” refers to a fraction of the target product which is further separated in each fraction obtained after the separation of the previous one.
  • mobile phase suitable for liquid chromatography separation means that the mobile phase can be used as a mobile phase in a certain dimensional liquid chromatography separation to separate the corresponding proteins. It is well known to those skilled in the art to determine the appropriate mobile phase in accordance with the nature of the protein to be separated, the chromatographic principles employed in the separation, and the type of column used.
  • the multi-dimensional liquid chromatography separation system can be used for analytical purposes (analytical multidimensional liquid chromatography separation system less than 10 mg), and preparation use (semi-preparative mD-LC separation system) lO Mg to 100 mg, preparation grade 100 mg to 100 g, production use (production type mD-LC separation system) greater than > 100g.
  • preparation use si-preparative mD-LC separation system
  • lO Mg to 100 mg
  • preparation grade 100 mg to 100 g preparation grade 100 mg to 100 g
  • production use production type mD-LC separation system
  • the mobile phase storage tank for storing the mobile phase is well known to those skilled in the art. Those skilled in the art will readily appreciate that the number of mobile phase storage tanks is related to the type and scale of mobile phase used in the mD-LC separation system of the present invention. Compared with the conventional liquid chromatography separation system, the liquid chromatography separation system of the present invention uses more mobile phases, and therefore requires a larger number of mobile phase storage tanks, for example, two-dimensional liquid chromatography separation according to the present invention. The system requires the use of 4 different mobile phase solutions, which can include 4 mobile phase storage tanks.
  • the mobile phase storage tank and the two infusion systems shown in Figure 2 can be connected to four mobile phase storage tanks, for a total of eight mobile phase storage tanks.
  • the 2D-LC, mD-LC separation system separation system according to the present invention comprises at least 4 mobile phase storage tanks. From analysis to semi-preparation to preparation, to production scale Accumulate 1 L of glass bottles to stainless steel tanks of tons of capacity. For large-scale, fixed products, the number of tanks used can be greatly reduced due to the fixed production process.
  • the first infusion device and the second infusion device may each include one or more pumps, such as an injection metering pump, a reciprocating metering pump, and a diaphragm metering pump.
  • pumps such as an injection metering pump, a reciprocating metering pump, and a diaphragm metering pump.
  • the first infusion device and/or the second infusion device may be composed of a multi-element gradient unit and a pump, respectively, the multi-element gradient unit having a plurality of infusion channels and capable of delivering and metering the flow rate of each channel.
  • the multivariate gradient units are well known to those skilled in the art, and preferably each infusion set has at least 4 channels.
  • the first infusion device and/or the second infusion device may be a first pump and a second pump, respectively, having a plurality of infusion channels and capable of delivering and metering the flow of each channel.
  • the first pump and the second pump are preferably pumps each having at least 4 channels.
  • the pump is a high capacity high pressure pump known to those skilled in the art, preferably a membrane type ultra high pressure pump or a reciprocating ultra high pressure pump known to those skilled in the art.
  • the ultrahigh pressure pump is preferably an ultra high pressure pump that pressurizes the liquid to below 40 MPa and 40 MPa.
  • the high pressure pump is preferably a high pressure pump that pressurizes the liquid to above 20 MPa.
  • the multi-dimensional liquid chromatography system is monolithic, that is, all hardware is assembled in one housing, and its operation is controlled by a control system; or the multi-dimensional liquid chromatography system is split, that is, each hardware and automatic control system is installed on Two or more housings are used, and an automatic control system of the existing chromatograph and other operating automation systems are used.
  • the flow rate of the high pressure pump is preferably from 0.001 to 10 ml/min.
  • the flow rate of the high pressure pump is preferably from 0.01 to 100 ml/min.
  • the flow rate of the high pressure pump is preferably from 0.1 to 10 liters / minute.
  • the infusion device further comprises a degassing unit that removes the gas in the mobile phase liquid in a known manner.
  • a tank valve is provided between the mobile phase storage tank and the infusion set, the tank valve being operable to control whether the mobile phase storage tank is in communication with the infusion set.
  • the first sample introduction device is well known to those skilled in the art for injection of a conventional liquid chromatography system
  • the injector can be a manual injector or an autosampler, a chromatographic pump.
  • the injector can be a conventional 6-pass chromatographic injection valve that quantitatively feeds the sample to be separated into a multi-dimensional liquid chromatography separation system in accordance with the present invention.
  • the injection mixer in the second sample introduction device can be any mixer known to those skilled in the art that is adapted to thoroughly mix the middle distillate with the mobile phase.
  • the mixer includes, but is not limited to, a mixing tank or mixer.
  • the mixing tank may include a stirring member, and examples of the stirring member include, but are not limited to, a magnetic stirring rod, a stirring paddle driven by an electric motor or an engine.
  • pipe mixers include, but are not limited to, nozzle-type pipe mixers, vortex pipe mixers, perforated plate pipe mixers, profiled plate pipe mixers, static pipe mixers.
  • a valve is disposed on the pipeline connecting the second sampling device and the second infusion device.
  • the separation of the next dimension, as described above, the middle distillate containing the target product after the separation from the upper one-dimensional chromatogram by the second sample introduction device Before being sent to the separation device, it is necessary to carry out all or part of the upper one-dimensional collection liquid containing the middle product of the target product pushed by the first infusion device, and then the flow rate of the mobile phase transported by the second infusion device.
  • the implementation of this particular mode of mixing is, first of all, that the critical migration eluent concentration of a target protein is determined for the liquid chromatographic separation conditions in which the protein is to be carried out, the separation conditions including the mobile phase solution.
  • the type, separation mode, and characteristics of the column thus determine the critical migration "eluent" concentration of the protein under the separation conditions.
  • the corresponding "eluent” refers specifically to the mobile phase solution or displacer as a strong eluent in the next dimension separation, and the mobile phase solution or displacer concentration is the protein under the separation condition.
  • the critical migration eluent concentration Accordingly, for the injection mixture, the eluent referred to as the "eluent" concentration is the mobile phase solvent or displacer as a strong eluent in the liquid chromatographic separation to be performed.
  • the critical migration eluent concentration of a protein is specifically related to the nature of the protein itself, the type of mobile phase solution chosen, and the column used, all need to be in a second or more dimensional separation.
  • the critical migration eluate concentration of the retained protein should be determined experimentally in advance.
  • the critical migration eluent concentration can be separated by a linear gradient elution under a non-synchronous injection condition using a pure sample of the corresponding protein, or a mixture containing the corresponding protein, using the same separation conditions. Predetermined. Those skilled in the art will appreciate that once the critical migration eluent concentration of a protein under certain separation conditions is predetermined, the critical migration eluent concentration can be used for the separation process under the same separation conditions without further determination. The critical migration eluent concentration.
  • the chromatography column or chromatography cake of the separation device can be any chromatography column or chromatography cake known to those skilled in the art that can be used to separate proteins. According to common knowledge in the art, for different sample proteins to be separated, one skilled in the art can readily select a suitable column, or a chromatography cake for separation.
  • a "suitable" column or chromatographic cake means that the column has the desired liquid chromatographic separation mode and is capable of at least partially separating proteins in the liquid entering the column.
  • the column pressure of the chromatographic cake is lowered to the column of the common type, so it is more suitable for use as a preparative or production type of multi-dimensional liquid chromatography under high flow rate and low pressure conditions. Separate the system.
  • the porous valve refers to a valve having a number of holes equal to or more than 8, such as a 10-way valve, or a multi-way valve of more channels.
  • the separation device includes more than two columns
  • the chromatography is selectively performed by the column switching valve of the separation device instead of a dedicated switching device in a multi-dimensional chromatography.
  • a suitable column in the column is connected to the flow path.
  • the chromatography column or chromatographic cake switching unit of the separation device may include at least one multi-pass valve having one inlet as the separation device a valve inlet and n valve outlets in one-to-one correspondence with the n columns, the multi-way valve selectively flowing liquid entering the separation device into the chamber by switching n valve outlets A column, or a column in a chromatography cake.
  • the chromatography column or chromatographic cake switching valve of the separation device comprises a first multi-way valve and a second multi-way valve, the first multi-way valve having a valve inlet and n pairs as inlets of the separation device a valve outlet of the n columns correspondingly connected to each other, the second multi-way valve having a valve outlet as an outlet of the separation device and n valves communicating with the n columns in one-to-one correspondence Entrance.
  • Chromatography of the column, or chromatographic cake by switching between n valve outlets of the first multi-way valve and switching between n valve inlets of the second multi-way valve a column, or a chromatography cake, wherein the liquid flowing into the separation device flows into the column through the first multi-way valve, or a column in the chromatography cake, and passes through the second multi-way valve
  • the separation device flows out.
  • the liquid chromatography separation modes used in each dimension separation may be the same or different, and therefore, the number m of separation modes used in the mD-LC separation system may be equal to or smaller than the mD-LC separation system.
  • the number of separations Preferably, the two-dimensional separation mode is the number q of columns in the "orthogonal" mode, and is replaced by a 2D-LC switching valve of the same column.
  • the separation modes used for adjacent two-dimensional separations are usually different.
  • the separation device may not include a switching valve between the columns.
  • the mD-LC separation system according to the present invention may further comprise a desalination device.
  • Desalination devices for use in liquid chromatography systems are well known to those skilled in the art for removing at least a portion of the salt from the liquid.
  • the conventional desalination device can be desalted by an exclusion chromatography column in parallel with the column of the separation device. Testing device
  • the detection device includes a detector that can be used to detect different protein components in a liquid chromatography method.
  • the detector can be any type of detector commonly used in liquid chromatography systems known to those skilled in the art.
  • the mobile phase flow rate is high during scale production, and a drain hole in parallel with the detector must be added to simultaneously discharge, inspect and collect the target product from the drain hole.
  • the fluid entering the detecting device is divided by 1/10 to 1/1000, and the separated portion is sent to the detector.
  • the sump of the sump device may be a liquid storage tube, a liquid storage tank, a liquid storage tank or a liquid storage tube and/or a liquid storage tank and/or a liquid storage tank connected in series.
  • the number p of the sump depends on the complexity of the protein sample to be separated and is related to the number of fractions collected in each fraction separated and stored for further separation.
  • p satisfies the following formula:
  • Xj is the middle distillate fraction that is collected and stored for further separation in the j-division separation.
  • the volumes of the sump of the sump device are all or partially different from each other. It will be readily understood by those skilled in the art that a larger volume fraction can be accommodated in a larger volume sump, a smaller volume fraction can be accommodated in a smaller volume sump, and a fraction can be accommodated. In two or more collectors.
  • the concentrating device includes a small-capacity snubber in addition to the p storchers satisfying the formula (3).
  • the small volume concentrator is used to rapidly discharge the fraction that does not need to be collected and stored through the collection and storage device and finally from the liquid discharge port.
  • the sump switching valve of the sump device comprises a third multi-way valve, or a multi-position selector valve (see one of 11-1 shown in FIG. 2) and a fourth multi-way valve (see FIG. The same one of the illustrated 11-2),
  • the third multi-way valve has a valve inlet as an inlet of the liquid storage device and p valve outlets communicating with the p collectors in one-to-one correspondence
  • the fourth multi-way valve has a valve outlet as an outlet of the liquid storage device and p valve inlets communicating with the p collectors in one-to-one correspondence.
  • both the third multi-way valve and the fourth multi-way valve allow liquid to flow countercurrently through the valve body, i.e., allowing liquid to flow from the valve outlet and out of the valve inlet.
  • the draining device can be a draining device commonly used in liquid chromatography systems known to those skilled in the art.
  • the liquid discharged from the system through the drain means includes both the fraction as the final separated product which does not require further separation, and the waste liquid in the flow path.
  • the draining device may be a conduit that is connected to the outside of the system.
  • the liquid chromatography separation system may include a first liquid discharge device and a second liquid discharge device, wherein the first liquid discharge device may discharge liquid from the detection device to the outside of the system,
  • the second drain device can discharge the liquid from the liquid storage device to the outside of the system, so that the first drain device can discharge the mobile phase displaced during the injection, and enable the second drain device to discharge the target product and Waste liquid.
  • the liquid chromatography separation system according to the present invention when the liquid chromatography separation system according to the present invention is in a production or production scale, since the detection tank of the detector does not allow a large volume of liquid to flow, a third liquid discharge device is required, and the third liquid discharge device is A branch pipe having a diameter much larger than the diameter of the detection cell is disposed in parallel with the detecting means and receives the mobile phase from the separating means so that more than 90% of the mobile phase can be discharged from the third liquid discharging means.
  • the liquid discharging device can be three liquid discharging devices commonly used in liquid chromatography systems known to those skilled in the art, the first liquid discharging device discharges the mobile phase displaced during the injection, and the second liquid discharging device
  • the device is a drain port of the target product and a drain port for a large amount of waste liquid
  • the third drain device is specially designed for mass production, and is connected in parallel with the detector through a two-way valve, the two-way valve
  • the two pore sizes can be adjusted so that 90% to 99.9% of the mobile phase containing the target product is discharged to the product collection device or waste collection device without passing through the detector, and only 0.1% to 10% of the same composition flows. Flow through the detector to the sync.
  • the flow path switching device switches the flow path in a manner of selectively forming any one of the following flow paths: a conventional separation flow path that sequentially connects the mobile phase storage tank, the first infusion device, the first injection device, the separation device, the detection device, and the first drainage device;
  • a first dimension separation flow path sequentially connecting the mobile phase storage tank, the first infusion device, the separation device, the detection device, the collection device, and the second drainage device;
  • Not collecting a second or higher dimensional separation flow path of the middle distillate which in turn communicates with the mobile phase storage tank, the first infusion device, the collection device, the second injection device, the separation a device, the detecting device, and the first draining device, and sequentially communicating the mobile phase storage tank, the second infusion device, and the second sampling device.
  • the various components in the flow path are "connected in sequence” to mean that the various devices of the sequence are sequentially connected in space through the pipeline through the valve and the pipeline, so that the fluid in the flow path passes successively in time.
  • Each pair of adjacent components in the sequence is such that liquid in the mD-LC separation system of the present invention can flow through the various components in the sequence of components in the order of the sequence of components.
  • the sequence of components does not specifically list the valves and tubing in the flow path.
  • the mD-LC separation system further comprises a thermostat device that maintains at least the collection device at a time that can prolong the inactivation time of the protein Under constant temperature conditions.
  • the thermostat maintains the entire mD-LC separation system according to the present invention at a constant temperature condition capable of prolonging the inactivation time of the protein.
  • the constant temperature is preferably 4. C.
  • the thermostatic device may be an incubator equipped with a cooling device to maintain a constant temperature in the tank (preferably maintained at 4 ° C), and the collecting device or the entire multi-dimensional liquid phase A chromatographic separation system is housed in the space.
  • thermostat system can be assembled in one housing with the other components of the chromatograph to form an integral system, or a separate unit system.
  • the multidimensional liquid chromatography separation system according to the present invention may further comprise a sterilization device that kills at least the bacteria present in the collection device in a known manner.
  • the sterilization device causes at least partial killing of bacteria throughout the mD-LC separation system according to the present invention.
  • the sterilizing device may include a steam generating device and a steam injecting or electrothermal device, the steam generating device capable of generating steam having a temperature of 140 ° C or higher, the steam injecting device injecting the steam into a multi-dimensional liquid chromatography separation system Collecting device.
  • the sterilizing device includes an electric heating device that performs heating directly by electric power or by hot air generated by electric heating. All or part of the sterilizing device may be assembled in one housing with other components of the chromatograph as a unitary system, or may be separately assembled as a unitary system.
  • the mD-LC separation system according to the present invention may further comprise an automated control device that, in addition to performing conventional liquid chromatography automated operations well known to those skilled in the art, The valves in the sump device and the flow path switching device are automatically switched.
  • the mD-LC separation system according to the present invention is a monolithic or split type.
  • the automatic control device is a whole and can also be divided into two independent control devices. The former is a brand new "system", and the latter is only a match. There is an automatic control system used by the chromatograph.
  • the mD-LC separation system according to the present invention may further comprise a conventional liquid mixing device which is well known to those skilled in the art and which makes the various components in the flow path more adequate in a known manner.
  • the ground mixing means for example, the conventional liquid mixing device can be disposed after the infusion device so that the various mobile phase liquids in the effluent from the conveying device are better mixed with each other.
  • some or all of the components of the mD-LC separation system in accordance with the present invention are mounted in one or more housings to form an integral or split instrumentation.
  • the infusion device, the sample introduction device, the separation device, the sump device, the flow path switching device, the automatic control device, the conventional detection device, and the conventional liquid discharge device are installed in one housing to form a monolithic multi-dimensional liquid phase.
  • the chromatograph can also be assembled into a split "system" in more than two housings.
  • the present invention provides a 2D-LC separation system (hereinafter referred to as a 2D-LC separation system) using a cylindrical chromatography column for protein separation, the 2D-LC separation system including a detection device, characterized in that
  • the 2D-LC separation system includes:
  • a mobile phase storage tank that stores a liquid for a mobile phase of 2D-LC separation
  • a separation device comprising a column switching unit and n columns, or a column having two or more separation functions, wherein the column switching unit selectively causes liquid entering the separation device to selectively Flow into one of the n columns, n is a non-negative integer and satisfies the following formula:
  • a sump device comprising p sump and sump switching valves, wherein p is greater than or equal to 2, the sump switching unit selectively causing liquid entering the sump to selectively flow into the At least one of the sump devices.
  • a flow path switching device consisting of a valve and a pipe connected to the above device, by switching a valve in the flow path switching device, the flow path switching device being formed in addition to a conventional liquid chromatography separation Outside the flow path, a flow path for performing 2D-LC separation is also formed;
  • the first infusion device delivers the mobile phase suitable for the first dimension separation to the first sample introduction device [as shown in FIG. 2, the first from left to right The root column is a 2D column, the other is a single single separation mode column, the first sample introduction device introduces the original sample from outside the system and causes it to enter the separation device along with the mobile phase from the first infusion device.
  • the separating device performs first-dimensional liquid chromatography separation on the sample to be separated and thereby obtains different fractions, and the middle distillate in the collecting device and the fraction that needs further liquid chromatography separation and the middle
  • the fraction is stored in at least one sump, and the fraction that does not require further separation is discharged from the system through the drain 2;
  • the first infusion device sends a mobile phase suitable for liquid chromatography separation to the collection device and a middle distillate stored in the at least one sump along with the The mobile phase is delivered together to the injection mixer, the second infusion device withdraws a mobile phase suitable for liquid chromatography separation from the mobile phase storage tank and delivers the mobile phase to the injection mixer
  • the sampling mixer mixes a middle distillate and a mobile phase from the at least one sump with a mobile phase from the second infusion device to obtain an injection mixture
  • the separation device The sample mixture was subjected to a second-dimensional liquid chromatography separation to thereby obtain different fractions.
  • first infusion device and the second infusion device adjust and meter the amount of the mobile phase for the second dimension separation delivered thereby, such that in the injection mixture for the second dimension separation
  • the eluent concentration is lower than the critical migration eluent concentration of all of the middle distillates contained in the injection mixture that need to be retained in the second dimensional separation.
  • the liquid chromatography separation system may include a first liquid discharge port and a second liquid discharge port and a third liquid discharge port, wherein the first liquid discharge device can discharge the liquid from the detecting device Outside the system, the second draining device can discharge the product and the liquid discharged from the waste liquid storage device from the original sample to the outside of the system.
  • the third discharge port is specially designed for mass production.
  • the two-way valve is connected in parallel with the detector. The size of the two holes of the valve can be adjusted so that the mobile phase containing the target product is 90 to 99.9%.
  • the detector is discharged to the product collection device, or the waste collection device, and only 0.1 to 10% of the same composition flows into the detector synchronously.
  • the flow path switching device switches the flow path in a manner of selectively forming any one of the following flow paths:
  • a conventional separation flow path that sequentially connects the mobile phase storage tank, the first infusion device, the first injection device, the separation device, the detection device, and the first drainage device;
  • a first dimension separation flow path sequentially connecting the mobile phase storage tank, the first infusion device, the separation device, the detection device, the collection device, and the second drainage device;
  • Another aspect of the present invention is to provide a novel mD-LC separation method for protein separation, the mD-LC separation method comprising the following steps:
  • Pre-preparation determining the critical migration eluent concentration of all proteins in the protein sample to be separated that need to be retained in the second or more multidimensional separation under the second dimensional or more multidimensional separation conditions;
  • the middle distillate is injected into the parallel column by a high flow rate mobile phase.
  • the "high flow rate" mobile phase means that the flow rate of the mobile phase is higher than the flow phase flow rate generally employed in liquid chromatography separation of target proteins by gradient elution.
  • the multidimensional liquid chromatography separation method according to the present invention can be carried out online or offline.
  • the fraction after the upper one-dimensional separation is collected in an in-line manner, and then the middle fraction requiring further separation is directly sent to the next-dimensional separation.
  • the mD-LC separation method according to the present invention can be carried out using the mD-LC separation system according to the present invention, the steps of which are as follows:
  • Second-dimensional or more-dimensional separation After the upper-dimensional separation is completed, a flow path for the second-dimensional or more multi-dimensional separation is formed by the flow path switching device, and in the presence of the column switching valve By switching the column switching, the column for the second dimension or more multi-dimensional separation is connected; the mobile phase for the next dimension separation is transported to the sump by the first infusion device to make a need
  • the middle distillate for the next dimension separation flows out of the respective sump and into the sample mixer of the second infusion device, while the mobile phase for the next dimension separation is sent to the Injecting the mixer such that the middle distillate is mixed with the mobile phase to obtain a next-dimensional separated injection mixture; the injection mixture is injected into the next-dimensional separated column, and
  • the amount of mobile phase delivered by the first infusion device and the second infusion device is adjusted and metered such that the eluent concentration in the injection mixture is lower than all of the middle distillate needs to be retained in the next dimension separation
  • Pre-preparation determining the critical migration eluent concentration of all proteins in the protein sample to be separated that need to be retained in the second-dimensional separation under the second-dimensional separation conditions;
  • the amount of the mobile phase used for the second-dimensional separation is adjusted and metered so that the concentration of the eluent in the injection mixture is lower than that of the injection mixture
  • the 2D-LC separation method of the present invention is carried out by the multidimensional liquid chromatography separation system or the 2D-LC separation system of the present invention
  • the concentration of the agent is removed such that the protein remains in the column to complete the second dimension injection; the sample mixture is separated into different fractions in the column by gradient elution through the column switching valve 6-2 is entered into the detector for detection; separation of this step is performed for all of the middle distillates separated from the first dimension and requiring a second dimension separation. Buffer exchange and rebalancing of the chromatographic system
  • the LC separation method or the two-dimensional liquid chromatography separation method may further include the following steps:
  • Buffer exchange the mobile phase used in the next-dimensional separation is used as a buffer, and the buffer is passed through the next-dimensional separation column, wherein the concentration of the eluent in the buffer is lower than The critical migration eluent concentration of all proteins in the middle fraction that need to be retained in the next dimension separation, thereby at least partially replacing the original mobile phase in the column.
  • the collection liquid containing the target protein which is separated from the previous one-dimensional separation is a mixture of the solution 1 and the solution 2 having a known composition, and the composition thereof can be estimated from the gradient time and the composition of the solution 1 and the solution 2.
  • the retention time of different proteins is different, so the composition in different protein collection solutions is not fixed. It can be expressed by solution X.
  • the collection solution is generally more than 3 mL, and the solution X is pushed into the second by the solution 1 or 2.
  • the sample device it is not mixed with the push liquid, so in the second sample device, after mixing with the solution 3 or 4 pushed by the second infusion device and the solution X, the second dimension separation from the beginning to the complete entry into the chromatogram
  • This entire process of the column is a buffer exchange or buffer solution exchange of the sample.
  • Re-equilibration of the chromatographic system During the X injection of the solution, the mobile phase used for the one-dimensional chromatographic separation, which was originally left in the column, is partially replaced, which helps the rebalancing of the chromatographic system. It can also be considered as part of the equilibrium process of the second-dimensional chromatographic system. If you need to continue to achieve complete equilibrium, then use the solution 3 or 4 to flow through the column.
  • the middle distillate can be separated after the buffer exchange and re-equilibration of the chromatography system are completed.
  • the flow phase flow rate during rebalancing of the buffer exchange and chromatography system is higher than the flow phase flow rate typically employed in liquid chromatography separation by gradient elution.
  • the buffer exchange can be carried out by the mD-LC separation system of the present invention, wherein the mobile phase used in the next-dimensional separation is used as a buffer, and the buffer is made by the first infusion device and/or the second infusion device.
  • the concentration of the eluent in the buffer is lower than The critical migration eluent concentration of all proteins in the interdistillate that need to be retained in the next dimension to at least partially replace the original mobile phase in the column.
  • the flow rate of the buffer delivered by the first infusion device and/or the second infusion device is higher than the flow rate of the mobile phase generally employed when performing liquid chromatography separation by gradient elution.
  • the 2D-LC separation method according to the present invention may include the following steps before or after the injection of the step (4):
  • Figure 2 is a flow path diagram of an exemplary mD-LC separation system. The components in Figure 2 are:
  • FIG. 3 shows the results of 2D-LC (WCX, HIC) separation of the prion protein by the commercial column ⁇ WCX column.
  • Figure 4 shows the WCX column and the product TSKgel G4000SWXL through the Shim-pack PA-CM
  • Figure 5 shows the results of an online single-column two-dimensional liquid chromatography column (2D (WCX, HIC) for rapid purification of cytochrome C in bovine pancreas.
  • pump A (3) and quaternary gradient unit 1-2 as well as pump B (9) and quaternary gradient unit 1-1 can be commodity quaternary gradient pumps, which can be powered and metered by the pump itself.
  • the flow pump A (3) and the quaternary gradient unit 1-2 of the mobile phase channel are mainly used for the first-dimensional chromatographic separation, and are also used for sending the one-dimensional fraction stored in the collecting and storing device to the two-dimensional chromatographic injection. Or two-dimensional chromatographic separation.
  • Pump B (9) and Quaternary Gradient Unit 1-1 are mainly used for second or multi-dimensional chromatographic separation and are used in combination with pump A (3) to implement two or more Dimensional chromatographic injection and chromatographic separation.
  • Pump A ( 3 ) and pump B ( 9) are high pressure pumps with a flow range of preferably 0.001 to 10 ml/min, accuracy ⁇ 0.001 mL, maximum pressure of 40 MPa; for preparative multi-dimensional liquid chromatography separation systems, pump A ( 3 ) and pump B ( 9) flow range is preferably 0.01 to 100 ml / min, accuracy ⁇ 0.01 mL, maximum pressure is 20 MPa; for production multi-dimensional liquid chromatography separation system, pump A ( 3 ) and pump B The flow rate of (9) is preferably 0.1 to 10 liters/min with an accuracy of ⁇ 0.1 mL and a maximum pressure of 20 MPa.
  • the six-way injection valve 4-1 has six ports with ports 1-4 for connection to the sample loop and port 6 for connection to the injector drain.
  • the sample loop has a capacity of, for example, 10 ml.
  • the in-valve configuration of the six-way injection valve 4-1 is: In the injection state, the port 1 hole of the six-way injection valve 4-1 is in communication with the port 2 hole, and the port 3 hole is connected to the port 4 hole. Port 5 is connected to port 6 hole. In the non-injection state or injection preparation state, port 1 is connected to port 6 hole, port 2 is connected to port 3, and port 4 is connected to port 5. .
  • the port of the six-way injection valve 4-1 1 hole and port 4 holes are respectively connected to both ends of the sample ring, and the port 6 hole is connected to the injector discharge port.
  • the mixer 12 is, for example, a nozzle type pipe mixer having two mixer inlets (mixer inlet M1 and mixer inlet M2) and a mixer outlet M0.
  • the inlet M1 of the mixer 12 is in communication with the outlet of the pump B (9).
  • the mixer 12 mixes the upper one-dimensional fraction with the mobile phase used for the next-dimensional chromatographic separation in an appropriate ratio so that the concentration after mixing is lower than the "lowest concentration of the eluent" required for the two-dimensional chromatographic separation.
  • the six-way valve 4-2 and the mixer together form a second injection device.
  • the column set 7 or the chromatographic cake set 14 includes commercial chromatography columns and mixed mode chromatography columns or commercial chromatography cakes and mixed mode chromatography cakes commonly used by those skilled in the art who are commonly used for protein separation, and the total number is n, which is simple. For this reason, these columns/chromatizers are collectively recorded as column 1, column 2, column 3, ..., column n.
  • the multi-way valve 6-1 has an inlet 0 and at least n outlets (denoted as outlet 1, outlet 2, outlet 3, ..., outlet n, respectively).
  • the multi-way valve 6-2 has an outlet 0 and n inlets (respectively referred to as inlet 1, inlet 2, inlet 3, ..., inlet N).
  • the inlet 0 of the multi-way valve 6-1 serves as the inlet of the separation device
  • the outlet 0 of the multi-way valve 6-2 serves as the outlet of the separation device
  • the outlet 1 to the outlet n of the multi-way valve 6-1 are respectively associated with the column 1 to the inlet of the column n - correspondingly connected
  • the inlet 1 to the inlet n of the multi-way valve 6-2 are in communication with the outlets of the column 1 to the column n, respectively, in one-to-one correspondence.
  • the chromatographic cake set 14 can be configured as various chromatographic separation media loaded in a pie-shaped cavity of immortal steel or polymeric material, which can be in one-dimensional, two-dimensional or even multi-dimensional mode, and can be used in the column group 7 One member is mounted in parallel with other columns. Through multi-way valves 6-1 and 6-2, chromatographic cake 14 can be placed in series with the chromatography system to perform various forms of multi-dimensional chromatographic separation.
  • the sump device is made of stainless steel, peek tube or titanium steel, and can be a spiral-shaped, olive-shaped hollow tube of different volumes and shapes to accommodate and store the effluent.
  • One end of the concentrating device is connected to the eight-way valve 11-1, and the other end is connected to the eight-way valve 11-2.
  • the capacities of the sumping devices 10-1 to 10-8 are the same as each other and at least 2 ml, or are different from each other and vary between 2 ml and 2 liters.
  • the eight-way valve 11-1 has one inlet 0 and eight outlets (outlet 1 to outlet 8), and the eight-way valve 11-2 has one outlet 0 and eight inlets (inlet 1 to inlet 8).
  • the inlet 0 of the eight-way valve 11-1 serves as the inlet of the sump, and the outlet 0 of the eight-way valve 11-2 serves as the outlet of the sump.
  • the outlet 1 to the outlet 8 of the eight-way valve 11-1 are respectively connected to one end of the concentrating device 10-1 to the concentrating device 10-8, and the inlet 1 to the inlet 8 of the eight-way valve 11-2 are respectively connected to the concentrating device 10 -1 to the other end of the splicing device 10-8.
  • the in-valve configuration of the eight-way valve 11-1 and the eight-way valve 11-2 is: an inlet of the eight-way valve 11-1 in a state of switching to the connected stowage device 10- ⁇ (the natural number of ⁇ is 1 to 8) 0 is in communication with the outlet ⁇ , and the outlet 0 of the eight-way valve 11-2 is in communication with the inlet ⁇ .
  • the liquid may sequentially flow through the eight-way valve 11-1, the collecting device and the eight-way valve 11-2 through the collecting device; meanwhile, the eight-way valve 11-1 Both the eight-way valve 11-2 and the eight-way valve 11-2 allow the liquid to flow in the reverse direction. At this time, the liquid can sequentially flow through the eight-way valve 11-2, the collecting device, and the eight-way valve 11-1 through the collecting device.
  • the oscillator 18 is used to uniformly agitate the collected liquid stored in the olive-shaped accumulating device (e.g., 10-1 and 10-2 in Fig. 2).
  • the oscillator 18 is used when the protein solution is desalted or only a portion of the collection is reinjected to the next separation.
  • the drain port 17-1 as the first drain device is connected to the port 2 of the three-way valve 5-4 as the drain port 17-2 of the second drain device and 6 of the six-way valve 4-2 The holes are connected.
  • the drain port includes three drain ports: a main drain port 17-1 for the fraction collector, a waste liquid drain port 17-2 for two-dimensional injection, and a drain port 17 for large-scale purification of the protein. 3.
  • the drain port 17-3 includes a parallel shunt tube 19 in parallel with the detector 13. In the large-scale purification of the protein, in order to prevent high pressure flowing through the detection tank of the detector, more than 90% of the mobile phase flows through the parallel shunt to the fraction collector 15, only 1% to 10% The mobile phase flows through the detection cell for "on-line monitoring" of the protein.
  • Fraction collector 15 is dedicated to collecting the final product after purification, and of course to collect the desired intermediate fraction, which is commercially available.
  • the in-valve configuration of the three-way valves 5-1, 5-2, 5-3, and 5-4 is: the first switching state of the three-way valves 5-1, 5-2, 5-3, and 5-4 5-la, 5-2a, 5-3a, and 5-4a, their respective ports 1 are connected to port 2; another one of the three-way valves 5-1, 5-2, 5-3, and 5-4 In the switching states 5-lb, 5-2b, 5-3b, and 5-4b, their respective ports 1 are in communication with port 3.
  • the port 2 of the six-way injection valve 4-1 is in communication with the outlet of the pump 1.
  • Port 2 of the three-way valve 5-1 is in communication with the mixer inlet M2, and port 3 of the three-way valve 5-1 is in communication with the port 2 of the three-way valve 5-3.
  • the port 1 of the three-way valve 5-2 communicates with the inlet 0 of the multi-way valve 1 as the inlet of the separating device, and the port 3 of the three-way valve 5-3 communicates with the mixer outlet M0.
  • the port 1 of the three-way valve 5-3 is in communication with the inlet 0 of the multi-way valve 1
  • the port 3 of the three-way valve 5-2 is in communication with the port 3 of the three-way valve 5-4.
  • Port 2 of the three-way valve 5-4 is in communication with the drain port 17-1.
  • the cryostat control box comprises a sterilizing device, which is an incubator equipped with a cooling device, keeps the space inside the box at a constant temperature of 4 ° C, and accommodates the concentrating device, or the entire multi-dimensional liquid chromatography separation system Within the space. All or part of the temperature control system can be assembled in one housing with the other components of the chromatograph as a one-piece system or as a separate system.
  • the sterilization device includes a steam generating device and a steam injecting device, or an electric heating device.
  • the steam generating device is capable of generating steam having a temperature of 140 ° C or higher, and the steam injecting device injects the steam into a collecting device of a multi-dimensional liquid chromatography separation system.
  • the sterilizing device may employ an electric heating device that directly heats by electric power, or The heating is performed by hot air generated by electric heating.
  • a computer control device as an automatic device that automatically controls the operations of the quaternary gradient units 1-1 and 1-2, the pumps A (3) and the pump B (9), and the cryostat control box 8, And receiving a signal from the detector 13.
  • the workstation 16 designs dedicated operating software depending on whether the system is split or integrated.
  • the former is used in conjunction with a conventional liquid chromatograph, so the system is only used in conjunction with a chromatographic system, and the software is a design; the latter requires the software of the usual chromatograph to be considered together with the multidimensional chromatography system designed in this patent.
  • As a whole design software it eventually becomes a brand new workstation that does not contain any of the usual chromatograph workstations.
  • the flow path switching device switches the six-way valve 4-2, the three-way valve 5-1, the three-way valve 5-2, the three-way valve 5-3, and the three-way valve 5-4 to form different flows by the following means Road:
  • the six-way injection valve 4-1 is further switched to the injection state (port 1 is connected to port 2, port 3 is connected to port 4, and port 5 and port 6 are connected. It is connected so that the sample loop is connected to the flow path of the two-dimensional liquid chromatography separation system of the present invention, thereby forming a conventional separation flow path (referred to as flow path A0) in the injection state.
  • the six-way injection valve 4-1 is further switched to the non-injection state (port 1 is connected to port 6, port 2 is connected to port 3, and port 4 is connected with Port 5 is connected so that the sample loop does not communicate with the flow path of the two-dimensional liquid chromatography separation system of the present invention, thereby forming a conventional separation flow path (referred to as flow path A) in a non-injection state.
  • flow path A a conventional separation flow path
  • the six-way injection valve 4-1 is further switched to the injection state (port 1 is connected to port 2, port 3 is connected to port 4, and port 5 is connected to port 6)
  • the sample loop is connected to the flow path of the two-dimensional liquid chromatography separation system of the present invention, thereby forming a first-dimensional separation flow path (referred to as a flow path B0) in the injection state.
  • the six-way injection valve 4-1 is further switched to the non-injection state (port 1 is connected to port 6, port 2 is connected to port 3, and port 4 and port 5 are connected.
  • the six-way valve 4-2 is switched to the non-injection state (port 1 is connected to port 6, port 2 and port 3 is connected, and port 4 is in communication with port 5), thereby forming a second-dimensional separation flow path (referred to as flow path C) when the intermediate separation product is not collected according to the present invention.
  • flow path C a second-dimensional separation flow path
  • the conventional liquid chromatographic separation of protein samples can be carried out by operating the 2D-LC separation system according to the present invention shown in Fig. 2 in accordance with the following procedure:
  • the mobile phase of the appropriate composition select the mobile phase of the appropriate composition, turn on the pump A (3), and set the appropriate gradient elution conditions, including the initial concentration, linear, or nonlinear gradient elution mode. , the time of the gradient, etc.
  • the appropriate solvent is taken out from the mobile phase storage tank by a quaternary gradient unit 1-2 at a suitable flow rate (for example, the solvent 1 and the solvent 2 are separately taken out and transported from the mobile phase storage tank 1 and the mobile phase storage tank 2), and
  • the separation unit is in a state of connecting any of the columns or chromatographic cakes to balance the chromatographic system as necessary.
  • the 2D-LC system separation system according to the present invention shown in Fig. 2 is set to the state of the flow path A (the conventional separation flow path when the sample is not injected).
  • the protein sample is separated into individual fractions with different retention times by gradient elution in the column or chromatographic cake and detected in detector 13.
  • the separated sample was discharged from the liquid discharge port 17-1 and collected.
  • the gradient elution in step (1) above is a linear gradient elution.
  • the gradient elution in step (1) above is a non-linear gradient elution. In a specific embodiment, the gradient elution in step (1) above is a linear gradient elution under non-synchronized injection conditions.
  • Figure 1 shows biphenyl (which is a small molecule organic)
  • Figure 1B shows carbonic anhydrase (a macromolecular protein)
  • Figure 1C shows the 15 peptide (GEPPPGKPADDAGLV) under non-synchronous injection conditions (ie The injection time is different from the gradient elution time.
  • the next injection time is called the gradient elution separation of the previous injection one minute.
  • the liquid chromatographic separation method is conventional liquid chromatography separation
  • Figure 1E shows the relationship between the retention time R of carbonic anhydrase and the injection time.
  • the retention time at the 3rd/4th injection is specified, and the retention time at the first injection is the average of n-1 t R from the 1st to the first injection.
  • the standard deviation is ⁇ 2 ⁇ .
  • the standard deviation of the mean > 2 ⁇ , it indicates that the protein has moved significantly on the column. From the above criteria, it can be determined that the moment at which the protein moves significantly should fall to t R 1 , i.e., within the interval between the two injections indicated by the vertical arrow in Figure 1D.
  • g is the linear gradient steepness, that is, the rate of change of the eluent concentration per unit time, and the calculation method is:
  • ⁇ % is the amount of change in the concentration of the eluent expressed by the volume fraction in the linear gradient elution, and is the elapsed time of the linear gradient elution corresponding to V%.
  • the two-dimensional separation of injection time is 3-5 Minutes, this is because it is suitable for the carbonic anhydrase in this particular example.
  • C CMP of each protein in a protein sample that needs to be retained in the second dimension or more multidimensional separation is determined.
  • the appropriate solvent is taken out from the mobile phase storage tank by a quaternary gradient unit 1-2 at a suitable flow rate (for example, the solvent 1 and the solvent 2 are separately taken out and transported from the mobile phase storage tank 1 and the mobile phase storage tank 2), and The separation unit is in a state of connecting any column or chromatographic cake to balance the chromatographic system as necessary.
  • the flow path B (the first dimensional separation flow path when not injecting)
  • the state of the pump A (3) is turned on, and the quaternary gradient unit 1-2 is taken out from the mobile phase storage tank at a suitable flow rate and transported as a suitable solvent for the mobile phase separated by the first-dimensional liquid chromatography (for example, separately from the storage)
  • Tank 1 and tank 2 take out and deliver solvent 1 and solvent 2),
  • the mixed protein sample is separated into the column or chromatographic cake by gradient elution into different retention times.
  • the individual fractions are detected in the detector 13.
  • the liquid storage tube 10-2 is transferred to the sump device 10 by switching the eight-way valve 11-1 and the eight-way valve 11-2. Any one of 8 is connected so that the fraction is collected and stored in the concentrating device.
  • the concentrating device 10-1 is connected by switching the eight-way valve 11-1 and the eight-way valve 11-2, thereby passing the fraction through the concentrating device 10-1. It flows through the detector 13 and exits the system from the drain to the drain port 17-2.
  • Second-Dimensional Separation The 2D-LC separation system according to the present invention shown in Fig. 1 is then set to form a flow path C (second-dimensional separation flow path), and the eight-way valve 11-1 and eight are switched.
  • the valve 11-2 is connected such that any of the concentrating devices equipped with the middle distillate separated by the first-dimensional liquid chromatography is connected, and the multi-pass valves 6-1 and 6-2 are switched for the second-dimensional chromatographic separation.
  • the column or chromatography cake is connected.
  • Suitable solvents for example, taken out from storage tank 3 and storage tank 4 and transported separately Agent 3 and solvent 4) such that the intermediate fraction is mixed with the mobile phase to obtain a second dimensionally separated injection mixture, which is injected into a second dimensionally separated column and passed Adjusting the flow rates of pump A (3 ) and quaternary gradient unit 1-2 and pump B (9) and quaternary gradient unit 1-1 such that the eluent concentration C in the injection mixture is lower than the middle distillate All of the critical migration eluent concentrations of the proteins that need to be retained in the second dimension separation allow these proteins to remain in the column or chromatographic cake to complete the second dimension injection.
  • the injection mixture is separated into different fractions in the column or chromatographic cake by gradient elution and detected in the detector 13.
  • the sample separated by the second-dimensional liquid chromatography is discharged from the liquid discharge port 17-2 and collected in the fraction collector 15.
  • the gradient elution in step (4) above is a linear gradient elution. In a specific embodiment, the gradient elution in step (4) above is a non-linear gradient elution.
  • the nature of the mixed protein to be separated as needed one skilled in the art can readily select a suitable chromatography column or chromatography cake for the first dimensional chromatographic separation and the second dimensional chromatographic separation, and can be easily selected as the first dimensional chromatographic separation.
  • the multidimensional liquid chromatography separation method or the 2D-LC separation method according to the present invention may further include the following before or after the second dimension injection in the step (4) of the aforementioned two-dimensional liquid chromatography separation scheme. Steps:
  • the mobile phase used in the second-dimensional separation is used as a buffer (for example, solution 3 and solution 4 in mobile phase tank 3 and mobile phase tank 4), through pump A (3) and/or pump B (9) delivering the buffer to a second-dimensionally separated column or chromatographic cake, wherein the concentration of the eluent in the buffer is high or lower than all of the middle distillate needs to be retained in the next dimension separation
  • the critical migration eluent concentration of the protein thereby at least partially replacing the first separated mobile phase (such as solvent 1 and solvent 2) in the column.
  • the collected first-dimensional separated fraction is taken as the mobile phase X (X indicates that its composition is known, but the composition is different for different proteins), it is also regarded as a buffer, as described above.
  • buffer exchange is performed, and the second injection is performed simultaneously with the buffer solution exchange.
  • the middle distillate is then subjected to a second dimensional separation.
  • the mobile phase such as solution 2, which is pumped out of the collection device, is mixed with solution 3 or 4, or mixed in an appropriate ratio to achieve rebalancing of the 2D-LC system.
  • the column should be periodically cleaned with a strong eluent. Any solution can be removed from the reservoir using solution pump A or B. More dimensional liquid chromatography separation system
  • more dimensional liquid chromatography separation systems may include more mobile phase storage tanks than the 2D-LC separation system of Figure 2, and that the infusion set also has more infusion channels accordingly. .
  • Example 1 2D-LC (WCXX HIC) separation of 7 proteins by a commercial column ⁇ WCX column
  • Myo myoglobin-containing
  • RNase ribonuclease
  • Cyt-c cytochrome c
  • ⁇ -producing protein a-Chy
  • lysozyme Li-S
  • Car carbonic anhydrase
  • ⁇ -Amy ⁇ -Amy
  • the first dimension separation uses the weak cation exchange (WCX) separation mode
  • the second two-dimensional separation uses the hydrophobic interaction (HIC) separation mode
  • the column used in this example is a commercial Shim-pack PA-CM WCX column, which is a WCX/HIC mixed mode column (150 mm X 7.9 mm), in the first dimension separation and HIC mode in WCX mode. This column is used in the second two-dimensional separation.
  • the pump solution 1 is used to transport a salt solution for the mobile phase of the WCX mode (left side (3, 4 peaks in the left side of Fig. 3)) and gradient elution to make Myo , RNase and Lys are separated (1, 2, 5 peaks on the left of Figure 3), while Car and ⁇ -Amy are not retained (6, 7 peaks on the left of Figure 3), Cyt-c and a-Chy are not complete. Separate (3, 4 peaks on the left of Figure 3).
  • the Myo, RNase, and Lys proteins were separated by the first dimension, and the middle distillate containing Car and ⁇ -Amy and the middle distillate containing Cyt-c and a-Chy were separately collected in the storage tube 10 of the collecting device. -2 and in the reservoir 10-3.
  • the concentration of the salt is increased, and the second injection, buffer replacement, and re-equilibration of the second-dimensional HIC separation system are performed according to the method described above (the platform of the salt concentration curve in Fig. 3) within the area).
  • the method is to pump the liquid A of the HIC into the mixer 12 by the pump B (9), and adjust the concentration of the liquid in the pump A (3 ) and the pump B (9) so that the mixed concentration falls on the Cyt-c and
  • the critical migration eluent concentration of a-Chy is within C CMP (the exact value of C CMP has been passed, as previously obtained by conventional liquid chromatography analysis as shown in Figure 1).
  • the middle distillate containing Car and ⁇ -Amy was again injected, buffer exchanged, and the third system (but the second HIC separation) was re-equilibrated as described above. This is done by: pumping liquid A of HIC to mixer 12 with pump B (9), and adjusting the concentration of the eluent after mixing by adjusting the flow of liquid in pump A (3) and pump B (9)
  • the critical migration eluent concentration of Car and ⁇ -Amy is within C CMP (this C CMP has been previously obtained by conventional liquid chromatography analysis).
  • Car and ⁇ -Amy in the middle distillate are all retained in the column. Chromatographic separation in HIC mode was then performed by gradient elution, and Car and a-Amy were separated (6' and 7' peaks in Figure 3).
  • Example 2 WCX column and B product of the commercial Shim-pack PA-CM
  • the TSKgelG4000SWXLSEC column was subjected to three-dimensional (multidimensional) 3D-LC (WCX X HIC X SEC) to simultaneously purify and desalt the ⁇ -producing protein ( ⁇ -Chy) and trypsin (Try).
  • G4000SWXL According to the aforementioned 2D-LC separation system and 2D-LC separation method, this embodiment simultaneously purifies ⁇ -Chy and Try from the bovine pancreas extract prepared by the conventional method and degreased, and then separates the obtained protein. Desalt separately.
  • the first dimension separation adopts the WCX mode
  • the second dimension separation adopts the HIC mode.
  • the salt solution of the mobile phase for the WCX mode is transported by the pump A(3) and subjected to gradient elution to initially separate the ⁇ -Chy and Try proteins (1, 2 in Fig. 4). Peak), however, the purity after initial separation is still not up to standard. Therefore, the intermediate separation of the ⁇ -Chy and Try proteins containing the preliminary separation is separately collected in the liquid storage tube 10-2 and the liquid storage tube 10-3 of the liquid storage device.
  • the middle distillate containing the Try(l) and a-Chy(2) proteins was used according to the method described above [(the chromatographic peaks Try(l) and ⁇ -Chy (2) in Figure 4) Collected separately in two sump devices.
  • the method is to pump the liquid A for the HIC separation mode to the mixer 12 by the pump B (9), and adjust the concentration of the liquid in the pump A (3) and the pump B (9) so that the mixed concentration falls on
  • the critical migration eluent concentration of a-Chy is within C CMP (the exact value of the C CMP has been passed, as previously obtained by conventional liquid chromatography as shown in Figure 1).
  • the middle distillate a-Chy will remain in the same column.
  • Subsequent chromatographic separation in the HIC separation mode was followed by gradient elution to obtain purified a-Chy (2').
  • the second injection of Try(l), the buffer replacement, and the re-equilibration of the second HIC separation system of the next dimension were carried out according to the method described above (the platform area of the salt concentration curve shown on the right side of Fig. 4) that).
  • the method is to use pump B (9) to deliver the liquid A for the HIC separation mode to the mixer 12, and to adjust the flow rate of the liquid in the pump A (3) and the pump B (9) so that the mixed concentration falls on Try(l) has a critical migration eluent concentration within C CMP (the exact value of C CMP has been passed, as previously obtained by conventional liquid chromatography as shown in Figure 1).
  • the a-Chy and Try purified by two-dimensional chromatography were separately collected in an elliptical set and a liquid storage tube. After shaking for 5 min, the collected samples were mixed and injected into the commercial TSKgel G4000SW xl SEC column to remove the salt. .
  • the separation and purification of ct-Chy and Try proteins were completed in 70 minutes, the purity of which was 82% and 95%, respectively, and the total mass recovery was 85.0% and 83.5%, the activity recovery rate was 59.4% and 76.5%, respectively, due to on-line collection, storage, and re-injection desalting, compared with the normal offline de-salting quality and activity recovery rate 50 ⁇ 70%, after salt removal
  • the quality and activity recovery of the two proteins is greatly increased to 80 to 90%.
  • the nonlinear gradient elution mode was used in the separation.
  • the column, mobile phase and chromatographic conditions used were as follows: WCX column: Commodity Shim-pack PA-CM (100 mm x 7.5 mm ID).
  • WCX mobile phase A solution is 0.02 M tris (HCl, pH 6.5); B solution is 0.02 M Tris-HCl + 1.0 M sodium chloride (pH 6.5);
  • Liquid C consists of 3.0 M ammonium sulfate + 0.05 M potassium dihydrogen phosphate (PBS, pH 7.0); D liquid is 0.02 M PBS (pH 7.0).
  • Injection volume ⁇ -Chy 10 ⁇ , Trypsin 20 ⁇ , Trypsin and ⁇ -Chy have a protein concentration of 10
  • Example 3 Online single-column two-dimensional liquid chromatography column (2D (WCX, HIC) for rapid purification of cytochrome c in bovine pancreas
  • the cytochrome c is extracted from the bovine pancreas: the fresh bovine pancreas is removed from the fat and connective tissue and washed, and then quickly stored in a refrigerator at -20 ° C; after the frozen bovine pancreas is sliced, the meat grinder is used.
  • the chromatographic method used in this example is: as shown in Figure 5, in the first dimension chromatographic separation, the elution conditions of a linear gradient elution of NaCl with a mobile phase flow rate of 1.0 mL/min and 0 to 1.0 mol/L Next, in the interval of 5.5-10.5 min, a one-dimensional sample containing Cyt c was collected online and stored in a loop. Then, using a large flow rate of 2.5 mL/min, a 3.0 mol/L ammonium sulfate rapid equilibrium chromatography system was used for 10 min, and then the same operation as the one-dimensional and two-dimensional chromatographic separation methods shown in Example 3 was carried out at a flow rate of 1.0 mL.
  • the one-dimensional collection liquid is discharged from the collection and storage rings, and simultaneously mixed with the 3.0 mol/L solution delivered from the B pump at a flow rate of 2.0 mL/min, mixed in a chromatograph mixer. So that the original first-dimensional collection liquid can be The medium salt concentration is increased from very low to 2.0 mol/L, which is sufficient to have sufficient retention in the HIC separation mode in this same 2D (WCX, HIC) column, which can be completed in 7.0 min. Finally, the retained protein was eluted with a linear gradient of 3.0 mol/L ammonium sulfate for 10 min, and the fraction in the time range of 43.5-46.5 min was collected.
  • Xi'an Aofeng - 2D (WCX, HIC) column (silica matrix, particle diameter, 5 ⁇ , pore size 30 nm; 50 mmX 4.6 mm I.D).
  • Nonlinear gradient elution mode (shown by the dashed line in Figure 5):

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Abstract

一种用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法。用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统包括流动相储罐（2）、第一输液装置（3，1-2）和第二输液装置（9，1-1）、第一进样装置（4-1，4-2）和第二进样装置（12）、分离装置（7）、集存装置（10）、至少两个排液装置（7-1，7-2，7-3）和流路切换装置（11）。在实施每一维液相色谱分离时，该集存装置收集需要进行下一步液相色谱分离的目标中间馏分并将其储存在集存器中；在第二维或更多维的液相色谱分离时，通过第二进样装置的进样混合器使来自集存器的全部目标中间馏分与流动相混合，并用该第一输液装置和第二输液装置对其输送的流动相的量进行调节和计量，使得该进样混合液中的洗脱剂浓度低于该目标中间馏分中所有需要在该维分离中保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。

Description

用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法 技术领域
本发明涉及一种用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 具体地， 涉及一种 用于蛋白在线快速分离的多维液相色谱分离系统。 本发明还涉及使用该液相色谱 分离系统进行蛋白分离的分离方法。 背景技术
液相色谱是分析、 分离和纯化蛋白最有效的方法， 其广泛应用于从天然的动 植物体液提取和分离活性蛋白， 及基因工程生产的各种重组蛋白药物的制备和生 产， 也是生化实验室必不可缺的设备， 如在蛋白组学研究中为寻找 "标记" 蛋白 的蛋白及多肽分离。 由于这样的生物大分子所存在的环境成分十分复杂， 通常称 之为复杂成分中的生物大分子的分离和分析。 色谱柱是色谱分析的核心。 科学家 一直在尽力提高色谱柱效以用一根色谱柱就能解决一般较复杂的物质分离和分析 问题。 对分离小分子溶质而言， 液相色谱柱的理论塔板数一般为 104-105。 然而， 对于更复杂混合物的分析， 比如细胞中的成份、 体液及动物组织中成分的分离， 目前商品色谱柱的分离度远远达不到要求，因此必须要用二维液相色谱法 (2D-LC) 或多维液相色谱法（mD-LC)才能部分地解决这些问题。 2D-LC和 mD-LC技术已 经成为当前色谱研究的热点和未来发展的方向。
进行 2D-LC和 mD-LC分离有离线 （off-line) 和在线 （on-line) 两种方式。 早期的 2D-LC分离法主要是离线的方式， 就是将一维液相分离后的馏分收集 后对该一维馏分， 或不经过处理直接进一少部分样， 或须进行处理 （浓集或缓冲 液交换） 后， 再将其一部分， 或全部进样到第二维色谱柱进行分离。 离线方式具 有费时、 难于操作、 样品易污染、 回收率低和重复性差等缺点。
为适应 2D-LC和 mD-LC法的研究， 多个公司都开始开发在线模式的 2D-LC 和 mD-LC法， 很快就生产了这种类型的色谱仪。 但原则上这些色谱仪都是在已有 色谱仪的基础上加以改进， 增加了一组并联的色谱柱 （2-3 根）， 且在这些并联色 谱柱之间加上切换接口， 以使从一根色谱柱流出的馏分能在线地转到另一个柱以 进行下一个模式分离。 然而， 这些在线 2D-LC和 mD-LC法存在着诸多问题， 例 如不同模式的色谱的组合需要解决流动相兼容性的问题， 接口衔接也是很关键的 技术问题。
mD-LC技术中的切换接口是整个系统的关键。 常用的有样品环交替储存转移 样品、 平行柱交替富集分析样品和捕集柱富集样品以及无接口的整体两根色谱柱。 然而这些仪器均存在致命的缺陷。 有接口的在线 2D-LC和 mD-LC用液相色谱仪 均只能将一维收集的样品的 1-10%进样（仅限几微升）到第二维色谱分离， 无法用 其于蛋白质制备， 尤其是无法实施工业化生产； 而无接口的这种混合模式柱的两 种流动相必须兼容， 只能在一些特定情况下， 如强阳离子交换色谱 （SCX) 填料 在前， 反相液相色谱 （RPLC) 填料在后的情况下方可实现如此的在线二维分离， 如果二者填充顺序相反， 则该无切换器法就无法使用。
在此科学发展的背景下， 科学家又提出了 "混合模式色谱" （mixed-mode chromatography, MMC ) 法， 即在液相色谱中同时应用两种或两种以上的作用力 使溶质进行保留和分离的色谱方法。 该方法具有更高的选择性和高色谱柱负载量， 这为半制备和制备型色谱的发展提供了新的选择和思路。 然而， 与传统的色谱柱 只能用于由一种力控制的一种分离模式比较， 因其还是以一种作用力为主， 而另 外一种作用力为辅， 从而达到改善该主分离里的效果， 故也只能达到 "一柱一用" 的效果。
早在上世纪的 80年代初， Guiochon等人 （Chromatographia, 第 17卷， 第 3 期， 第 121-124页， 1983 ) 提出了用二维色谱柱实施 2D-LC的方法。 因其所称的 二维是指空间上的二维 （平面） 色谱， 其二维色谱柱为方形 （lO cm x lO cm), 如 同通常的薄层色谱版， 且申请了专利， 但未得到推广， 甚至未见到任何用于实际 的报道。 而通常讲的二维色谱法指的是用圆柱形的色谱柱。 在两年前， 本专利的 申请人等使用了圆柱形二维色谱柱提出了 "在线蛋白单柱二维液相色谱法"， 在普 通色谱仪上加了几个阀门和几个螺旋形的样品环后， 用一根圆柱形的二维色谱柱 对蛋白实施了 2D-LC分离， 达到了快速分离的目的。 然而该方法还存在以下几个 问题： （1 ) 因受色谱仪最大流速 （仅为 5毫升 /分钟） 和集存装置中每个集存管的 最大体积 （仅为 5 毫升） 的限制， 其仅能在分析规模上进行， 无法放大到制备规 模， 更无法再放大到生产规模； （2) 因该仪器只用一根色谱柱分离蛋白， 无法实 施只有用多个色谱柱才能进行的 mD-LC法纯化的高纯度（如注射胰岛素的纯度要 求蛋白〉99%) 的目的； （3 ) 因无强有力的理论支持， 只能凭借经验， 用手动进行 操作， 无法设计程序用计算软件控制， 而这又是当今现代化仪器的必要条件， 且 未包括多肽在应用范围之内； （4) 所用色谱柱是专门制备的 "2D-LC", 尚无商业 化产品， 其他人难以实施； 以及 （5 ) 更为重要的是， 所有支持该方法实施的只是 几种设备的附件， 在现有色谱仪上的无序拼凑， 既无对制造一种新设备的整体构 思的框架， 也没有任何可供实施的技术方案和技术参数。与用平板形 2D色谱柱来 实施 2D-LC相比较， 用圆柱形 2D色谱柱 （简称 2D柱） 具有更多的优点。
尽管如此， 该色谱法又有潜在的如下优点： 蛋白的 2D-LC分析的全部操作， 包括收集从第一分离模式的流出液到这些流出液的收集并储存、 在高流速条件下 的在线缓冲溶液的交换和色谱系统的再平衡以及二次进样到该同一个二维色谱柱 后， 用第二分离模式的分离， 均在一封闭的体系中进行， 从而实现了 "在线蛋白 的单柱二维色谱快速分析"。 该体系的特征是它不仅能防止环境的污染， 而且目标 蛋白可定量地， 完全地转移到第二维色谱分离， 如此可将蛋白组学中的低丰度功 能蛋白的检测下限，或灵敏度提高 10-100倍，将会大大加快当今的蛋白组学的"自 上而下 -质谱分析"策略的速度。 如采用 MMC中的混合模式柱， 因其柱负荷又较 通常色谱柱高很多， 将其用在蛋白药物的大规模生产， 会大大的节约成本。
考虑到该方法的潜在优点， 申请人通过深入研究， 在原有基本属零件的 "堆 积" 的基础上研究开发了一种新的现代化的用于蛋白分离的新型设备——蛋白多 维液相色谱纯化系统。 发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的多维液相色谱分离系统以及利用 该系统分离和纯化蛋白和多肽的新方法， 其能够实现包括多肽在内的蛋白 （以下 简称为蛋白） 的在线快速分析、 分离和规模化制备， 从縮短纯化工艺， 提高二维 及多维分离中各蛋白速度和回收率， 防止来自环境的污染， 减少分离过程的耗时 和成本。
申请人最近发现， 在反相液相色谱 （RPLC)、 疏水相互作用色谱 （HIC)、 亲 合色谱 （AFC)、 离子交换色谱 （IEC) 四类液相色谱模式中， 在线性梯度洗脱条 件下对蛋白进行液相色谱分离时， 蛋白在色谱柱中的保留行为存在着 "停滞-迁移" 的普遍现象， 而且每种蛋白都有自己特有 "停滞 -迁移 "区域或时间空间。 换言之， 当流动相中洗脱剂的浓度小于某个蛋白的临界迁移洗脱剂浓度 CCMP时， 该蛋白就 不会从色谱柱中被洗脱。 当洗脱剂的浓度逐渐升高达到 cCMP时， 蛋白才会依他们 各自的 "停滞-迁移"的空间， 逐个被移动并被洗脱。 该临界迁移洗脱剂浓度 CCMP 对应的保留时间为临界迁移时间 fcMP。 因此从梯度开始 （ί=0) 到 fcMP之间的时间 空间， 就为实施蛋白分离纯化提供了进行各种色谱分离的辅助操作空间。 只要是 在线性浓度梯度洗脱条件保持不变的前提下， 只要进入色谱柱的流体中洗脱剂的 浓度低于 CCMP， 蛋白的保留时间就将保持不变。
下面以图 1为例来说明蛋白的 "停滞-迁移"现象。
图 1所用的是一长 1 mm, 直径 10 mm的饼形色谱柱， 又称色谱饼， 其中图 1A、 图 1B和图 1C分别为联苯、 碳酸酐酶和十五肽 （GEPPPGKPADDAGLV) 在非同 步进样条件下在 RPLC线性梯度洗脱中的色谱图， 而图 1D、 图 IE和图 IF分别表 示联苯、 碳酸酐酶和十五肽的保留时间与其非同步进样时间之间的关系。 其中所 采用的色谱条件为： 色谱饼 （ 10 mm X 1 mm内径）， 装填 RPLC填料 （颗粒直径 3 μηι, 孔径 30nm); 流动相为乙腈-水 （0.1%三氟醋酸）。
在 RPLC线性梯度洗脱条件 （洗脱剂为乙腈-水溶液） 下， 分别对小分子溶质 联苯、 生物大分子碳酸酐酶和十五三种样品进行非同步进样 （即在梯度开始后经 过每推后一定的间隔时间 （图 1中为 1分钟）， 换言之， 该样品是在不同的洗脱剂 浓度下进样的）下的液相色谱分离， 所得的色谱图分别如图 1A、 图 IB和图 1C所 示， 将上述三种样品的保留时间 ¾对线性梯度时间 t (下横座标） 和洗脱剂浓度 CMeCN (上横座标） 作图， 所得的保留行为曲线如图 1D、 图 1E和图 1F所示。 可 见， 作为小分子化合物的联苯与作为碳酸酐酶以及作为多肽的十五肽均表现出了 两种完全不同的保留行为。 碳酸酐酶和十五肽的保留行为曲线具有明显的水平直 线部分和上升部分， 两部分之间存在着明显的拐点， 该拐点在图 1D和 1E中以箭 头标出， 称作 "临界迁移点"， 其在上下横坐标上的对应数值分别为碳酸酐酶和十 五肽在 RPLC下的 "临界迁移时间 fcMP"和 "临界迁移洗脱剂浓度 CCMP"。 当进样 滞后于梯度的时间 小于 fcMP时（即当洗脱剂乙腈的浓度低于 CCMP时），碳酸酐酶 和十五肽不会被洗脱， 而当进样滞后于梯度的时间， 既 A大于 fcMP时 （即当洗脱 剂乙腈的浓度高于 CCMP时）， 碳酸酐酶和十五肽才会从色谱饼上洗脱， 这就是蛋 白和多肽在色谱饼， 或色谱柱上的 "停滞-迁移"现象。 正是由于蛋白和多肽在色 谱饼或色谱柱上的这种 "停滞-迁移"现象的发现， 才会为在如此薄的色谱饼上进 行蛋白和多肽的快速和高效分离奠定了理论基础。
根据上述发现， 本申请提出一种新型多维液相色谱分离系统以及使用此系统 分离蛋白的方法。
因此， 本发明的一个方面是提供一种用于蛋白分离的 mD-LC 分离系统， 该 mD-LC系统包括检测装置， 其特征在于， 所述 mD-LC分离系统包括：
( 1 ) 流动相储罐， 其用于储存多维液相色谱分离的流动相的液体；
(2)第一输液装置和第二输液装置， 所述第一输液装置和第二输液装置彼此 独立地从所述流动相储罐取出适用于液相色谱分离的流动相并将该流动相输送至 所述多维液相色谱分离系统中指定的流路中， 并且可彼此独立地调节和计量流量;
( 3 ) 第一进样装置和第二进样装置， 所述第二进样装置还包括进样混合器； 其中， 第一进样装置可使用六位进样阀， 用于进原样； 而第二进样装置则用 于二维及多维色谱纯化过程；
(4)分离装置， 其包括色谱柱切换单元和 n根色谱柱， 或者包括具有 m种以 上的 q根分离功能的色谱柱， 其中所述色谱柱切换单元使进入所述分离装置的液 体选择性地流入所述 n根色谱柱中的一根色谱柱， n为非负整数， m为所述多维液 相色谱分离系统中所用的不同分离模式的数量， 并且 n与 m之间满足下式：
m^n (式 1 )
当使用 q根混合模式色谱柱并实现 m个 （m 2) 分离模式进行有效分离时
« = m - q ; (式 2)
其中， i为正整数， q为具有 m种分离模式的色谱柱个数；
( 5 ) 集存装置， 其包括 p个集存装置切换单元， 其中 p大于或等于 1， 所述 集存装置使进入所述集存装置的液体选择性地流入所述集存装置中的至少一个集 存装置；
( 6) 至少二个排液装置， 所述 mD-LC分离系统中的液体从所述排液装置排 出至系统外； 其中， 作为所述第一进样装置的六位进样阀的排液孔可作为所述多维液相色 谱分离系统的第一排废装置； 同时， 第二排液装置既可用于馏分收集， 也可用于 排出废液；
( 7)流路切换装置由与上述装置相连的阀门和管路连接所组成， 通过对所述 流路切换装置中的阀门进行切换， 所述流路切换装置除了形成常规液相色谱分离 中的流路外， 还形成用于进行 mD-LC分离的流路；
其中， 在第一维分离时， 所述第一输液装置将适用于该第一维分离的流动相 输送至第一进样装置， 所述第一进样装置从系统外引入包含待分离蛋白的待分离 样品 （原样） 并使其随来自第一输液装置的流动相一同进入所述分离装置， 所述 分离装置对该待分离样品进行第一维液相色谱分离并由此得到不同的馏分；
在每一维分离时， 通过所述集存装置收集经分离后得到的不同馏分中需要进 行进一步液相色谱分离的中间馏分并将该中间馏分储存在至少一个集存装置中， 并将不需要进一步分离的馏分通过所述排液装置从系统中排出；
在第二维或更多维分离时， 所述第一输液装置将适用于液相色谱分离的， 具 有合适组成的流动相送至所述集存装置并将其储存于所述至少一个集存装置中的 一种中间馏分的全部， 或部分随着该流动相一同被输送至所述进样混合器中， 所 述第二输液装置从所述流动相储罐取出适用于液相色谱分离的， 具有合适组成的 流动相并将该流动相输送至所述进样混合器中， 所述进样混合器使来自所述至少 一个集存装置的中间馏分的全部， 或部分和流动相与来自所述第二输液装置的流 动相混合从而得到具有合适组成的第二维进样混合液， 所述分离装置再对所述进 样混合液进行第二维或更多维的液相色谱分离并由此得到不同的二维分离后馏 分。
其中， 所述第一输液装置和第二输液装置对其输送的用于第二维或更多维分 离的所说的具有合适组成的流动相的量， 是由调节和计量， 从而使得用于第二维 或更多维分离的所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间 馏分中的所有需要在该第二维或更多维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂 浓度。
在周期性清洗色谱系统时， 可将强洗脱液接入任何一个管路和装置中。 例如， 当该色谱系统或部分分离装置需要周期性清洗时， 该第一和第二输液系统可输送 任何强洗脱溶剂。
在本申请中， "蛋白 "也包括作为蛋白、 人工合成多肽以及蛋白的水解产物的 多肽， "蛋白样品"、 "原样"是指包含目标蛋白及多肽的混合物。
在本申请中， "分离"是指液相色谱分离。
在本申请中， 液相色谱的 "分离模式"与 "分离机理"是同义词。
在本申请中， 如众所周知的， 液相色谱分离的 "维"数是指在该液相色谱分 离流程中所实施的液相色谱所用圆柱形色谱柱的不同分离模式数 （即待分离的样 品进入圆柱形液相色谱柱用不同分离模式进行分离的次数）， "多维液相色谱"是 指包括二维液相色谱在内的和多于二维的更多维液相色谱 （例如三维液相色谱）， 换言之， "mD-LC"也包括 "2D-LC" 。
在本申请中， "色谱柱"是指圆柱形液相色谱柱 （简称色谱柱）， "具有 i种分 离模式的色谱柱"是指具有 i种分离模式并可用于 i种不同的分离过程的液相色谱 柱。 本领域技术人员容易理解， 当 i = l时， 该色谱柱为仅具有一种液相色谱分离 模式， 从而可用于一种分离过程的色谱柱（本申请中称作"一维色谱柱")； 当 i 2时， 该色谱柱为具有两种或更多种液相色谱分离模式， 从而可用于两种或更多种 不同的分离模式的一根色谱柱 （本申请中也称作 "混合模式， 或混合模式色谱柱 (MMC柱）"）。 在极个别情况下， 如 RPLC分离多肽， 也可实施单一模式的二维 色谱分离。
在本申请中， 如众所周知的， "馏分"是指将进入色谱柱的液相分离后得到的 具有不同保留时间目标产品的部分。 "中间馏分"指经上一维分离后得到的各馏分 中还需要进行进一步分离的目标产品馏分。
在本申请中， "适用于液相色谱分离的流动相"是指该流动相能够作为某一维 液相色谱分离中的流动相而使得相应的蛋白得以分离。 对于本领域技术人员而言， 结合待分离蛋白的性质、 分离时所选用的色谱原理以及所用色谱柱的种类来确定 合适流动相的方法是公知的。
以处理量的不同来区分， 根据本发明的多维液相色谱分离系统可用于分析用 途（分析型多维液相色谱分离系统小于 10 mg)、并制备用途（半制备型 mD-LC分 离系统） lO mg至 lOO mg, 制备级 100 mg至 100 g， 生产用途 （生产型 mD-LC分 离系统） 大于〉 100g。 本领域技术人员容易理解， 用于上述不同用途的 mD-LC分 离系统中的各个装置将具有不同的尺寸。对于制备和生产用途的 mD-LC分离系统 而言， 本说明书中的术语 "进样"可理解为 "进料"， "样品"可理解为 "原料"， "产物"可理解为 "产品"。 流动相储罐
所述用于储存流动相的流动相储罐是本领域技术人员所公知的。 本领域技术 人员容易理解， 流动相储罐的数量与本发明的 mD-LC分离系统中所用的流动相种 类和规模相关。 相对于常规液相色谱分离系统， 本发明的液相色谱分离系统所用 的流动相种类更多， 因此所需要的流动相储罐数量也较多， 例如， 根据本发明的 二维液相色谱分离系统需要使用 4种不同的流动相溶液，则可包括 4个流动相储 罐， 又如根据本发明的三维液相色谱分离系统需要使用 5 种或更多不同的流动相 溶液， 可包括 5个流动相储罐及图 2所示的两个输液系统可分别连四个流动相储 罐， 共 8个流动相储罐。 优选地， 根据本发明的 2D-LC、 mD-LC分离系统分离系 统包括至少 4个流动相储罐。 从分析到半制备到制备， 再到生产规模可分别由容 积 1 L的玻璃瓶到容积为吨级的不锈钢贮罐不等。 对于大规模的， 固定产品而言， 因生产工艺固定， 所用贮罐数可大大减小。 输液装置和进样装置
所述第一输液装置和所述第二输液装置可分别包括一个或多个泵， 例如注射 式计量泵、 往复式计量泵和隔膜式计量泵。
可选地， 所述第一输液装置和 /或所述第二输液装置可分别由多元梯度单元和 泵组成， 所述多元梯度单元具有多个输液通道并且可输送和计量各通道流量。 所 述多元梯度单元是本领域技术人员所公知的，并且优选地每个输液装置具有至少 4 个通道。
可选地， 所述第一输液装置和 /或所述第二输液装置可分别为具有多个输液通 道并且可输送和计量各通道流量的第一泵和第二泵。 所述第一泵和第二泵优选地 为分别具有至少 4个通道的泵。
本领域技术人员容易根据所述 mD-LC系统所需要的进样压力、流量以及泵送 精度来确定前文所述的泵的型号和手动注射器进样或自动的进样阀进样。 可选地， 所述泵为本领域技术人员公知的大容量的高压泵， 优选本领域技术人员公知的隔 膜式超高压泵或往复式超高压泵。
对于分析型 mD-LC分离系统， 所述超高压泵优选地为将液体加压至 40兆帕 以下和 40兆帕已上的超高压泵。 对于制备型和生产型多维液相色谱分离系统， 所 述高压泵优选地为将液体加压至 20 兆帕以上的高压泵。
所述多维液相色谱系统为整体式， 即所有硬件组装在一个壳体内， 并且其操 作由一个控制系统进行控制； 或者所述多维液相色谱系统为分体式， 即各个硬件 和自控系统安装于两个或两个以上的壳体内， 并且使用现有色谱仪的自控系统和 其他操作的自控系统。
对于分析型 mD-LC分离系统， 所述高压泵的流量范围优选地为 0.001 至 10 毫升 /分钟。 对于制备型 mD-LC分离系统， 所述高压泵的流量范围优选地为 0.01 至 100毫升 /分钟。对于生产型 mD-LC分离系统，所述高压泵的流量范围优选地为 0.1至 10升 /分钟。
优选地， 所述输液装置还包括脱气单元， 所述脱气单元以公知方式除去所述 流动相液体中的气体。
可选地， 在所述流动相储罐和所述输液装置之间设有储罐阀门， 所述储罐阀 门可控制所述流动相储罐是否与所述输液装置连通。
优选地， 根据本发明的 mD-LC分离系统中的所述第一输液装置和第二输液装 置能够输送的流动相流量之和高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时通常的流动 相流量。
所述第一进样装置为本领域技术人员公知的用于常规液相色谱系统的进样 器， 该进样器可为手动进样器或自动进样器， 色谱泵。 例如， 所述进样器可为常 规的 6通色谱进样阀， 其将待分离的样品定量地送入根据本发明的多维液相色谱 分离系统。
所述第二进样装置中的进样混合器可为本领域技术人员公知的任何适于使所 述中间馏分与流动相充分混合的混合器。 可选地， 所述混合器包括但不限于混合 罐或混合器。
所述混合罐可包括搅拌部件， 所述搅拌部件的例子包括但不限于磁搅拌子， 以电动机或发动机驱动的搅拌桨。
所述管道混合器的例子包括但不限于可为喷嘴式管道混合器、 涡流式管道混 合器、 多孔板式管道混合器、 异形板式管道混合器、 静态管道混合器。
可选地， 连通所述第二进样装置与所述第二输液装置的管路上设有阀门。 下一维的分离， 如前所述， 在通过所述第二进样装置将所述的从集存液装置 中流出的， 经上一维色谱分离后的， 含有目标产品的中间馏分， 在送入分离装置 之前， 就必须要要对第一输液装置推动的含有目标产品的中间馏分的上一维收集 液的全部， 或部分， 再与由第二输液装置的输送的流动相的流量进行调节和计量， 从而使得二者混合后的 "含有目标产品中间馏分的稀释液， 或 "目标产品的再进 样"溶液中洗脱剂浓度的最终浓度低于该目标产品的临界迁移洗脱剂浓度。 本领 域技术人员应能理解， 对所述该下一维分离前的一维馏分样品的 "前处理"（样品 中的 "缓冲液置换" 防止样品的质量及体积过载） 是实现第二维和更多维分离所 必需的， 换言之， 正是因为根据本发明的输液装置和进样装置能够将中间馏分与 流动相以特殊的方式混合并且使混合后的洗脱剂浓度低于需要得以保留的蛋白的 临界迁移洗脱剂浓度， 才使本发明的多维液相色谱分离系统能够实现蛋白样品的 多维液相色谱分离目标蛋白。
该特殊的混合方式的实施是， 首先应注意的是， 某种目标蛋白的临界迁移洗 脱液浓度是针对将要进行该蛋白的液相色谱分离条件来确定的， 该分离条件包括 了流动相溶液的种类、 分离模式以及色谱柱的特性， 如此便确定了该蛋白在该分 离条件下特有的临界迁移 "洗脱液"浓度。 该所对应的 "洗脱液"是特指在该下 一维分离时作为强洗脱剂的流动相溶液或置换剂， 而该流动相溶液或置换剂浓度 即为该蛋白在该分离条件下的临界迁移洗脱液浓度。 相应地， 对于所述进样混合 液而言， 其 "洗脱液"浓度所指的洗脱液是在将要进行的液相色谱分离中作为强 洗脱剂的流动相溶剂或置换剂。
其次， 因为某种蛋白的临界迁移洗脱液浓度特定地与该蛋白自身的性质、 所 选用的流动相溶液种类以及所用的色谱柱相关， 所以所有需要在第二维或更多维 分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱液浓度应当预先以实验方法确定。
例如， 所述临界迁移洗脱液浓度可通过采用相同的分离条件对相应蛋白的纯 样品， 或者包含相应蛋白的混合物进行非同步进样条件下的线性梯度洗脱分离而 预先确定。 本领域技术人员将理解， 一旦预先确定了某种蛋白在某种分离条件下 的临界迁移洗脱液浓度， 则该临界迁移洗脱液浓度可用于相同分离条件下的分离 过程， 而无需再次确定该临界迁移洗脱液浓度。
通过阅读上述说明， 本领域技术人员应能够调节和计量所述第一输液装置和 第二输液装置所输送的液体量， 从而使所述进样混合液的洗脱液浓度低于所有需 要在该维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱液浓度。 分离装置
所述分离装置的色谱柱或色谱饼可为本领域技术人员公知的任何可用于分离 蛋白的色谱柱或色谱饼。 根据本领域的公知常识， 对于不同的待分离蛋白样品， 本领域技术人员容易选择合适的色谱柱， 或色谱饼用于分离。
在本申请中， "合适"的色谱柱或色谱饼是指该色谱柱具有所需要的液相色谱 分离模式， 并能够使进入该色谱柱的液体中的蛋白至少部分地得以分离。
所述色谱柱或色谱饼在处理量相同的情况下， 色谱饼的柱压降低于常用类型 的色谱柱， 因而更加适合在高流速、 低压条件下用作制备型或生产型的多维液相 色谱分离系统。
在本申请中， 所述的多孔阀是指孔数等于， 或多于 8以上的阀， 例如 10通阀， 或更多通道的多通阀。
本领域技术人员容易理解， 如果所述分离装置包括两根以上的色谱柱， 则通 过所述分离装置的色谱柱切换阀， 而并非通常多维色谱中的专用切换装置， 选择 性地使所述色谱柱中的合适色谱柱连通至流路中。
当所述分离装置包括两根以上的色谱柱或色谱饼时， 所述分离装置的色谱柱 或色谱饼切换单元可包括至少一个多通阀， 所述多通阀具有一个作为所述分离装 置入口的阀门入口和 n个与所述 n个色谱柱一一对应地连通的阀门出口， 所述多 通阀通过对 n个阀门出口进行切换而使进入所述分离装置的液体选择性地流入所 述色谱柱， 或色谱饼中的一根色谱柱。
优选地， 所述分离装置的色谱柱或色谱饼切换阀包括第一多通阀和第二多通 阀， 所述第一多通阀具有一个作为所述分离装置入口的阀门入口和 n个与所述 n 个色谱柱一一对应地连通的阀门出口， 所述第二多通阀具有一个作为所述分离装 置出口的阀门出口和 n个与所述 n个色谱柱一一对应地连通的阀门入口。 通过所 述第一多通阀的 n个阀门出口之间的切换和所述第二多通阀的 n个阀门入口之间 的切换， 可使所述色谱柱， 或色谱饼中的一根色谱柱， 或色谱饼连通， 即流入所 述分离装置的液体经过所述第一多通阀流入所述色谱柱， 或色谱饼中的一根色谱 柱， 并经过所述第二多通阀从所述分离装置流出。
应注意的是， 各维分离中所用的液相色谱分离模式可以相同或不同， 因此， 所述 mD-LC分离系统中所用的分离模式数量 m可以等于或小于该 mD-LC分离系 统的分离次数。 优选地， 该二维的分离模式为 "正交型"模式中色谱柱的个数 q， 而代之为相同色谱柱进行 2D-LC的切换阀门。 当然， 一般而言， 相邻的两维分离 所用的分离模式通常是不同的。
本领域技术人员容易理解， 如果所述分离装置仅包括一根混合模式色谱柱， 则所述分离装置可不包括色谱柱之间切换阀。
优选地， 根据本发明的 mD-LC分离系统还可包括除盐装置。 用于液相色谱系 统中的除盐装置是本领域技术人员所公知的， 其用于从液体中除去至少部分的盐。 例如， 该常规除盐装置可为与所述分离装置的色谱柱相并联的排阻色谱柱除盐。 检测装置
所述检测装置包括可用于在液相色谱方法中检测不同蛋白组分的检测器。 所 述检测器可以是本领域技术人员公知的常用于液相色谱系统中的任何类型的检测 器。 优选地， 在规模生产过程中流动相流速很高， 必须加一个与检测器并联的排 液孔以使其目标产品从排液孔中同时排出、 检测和收集。 该进入检测装置的流体 中分出 1/10至 1/1000， 并将该分出的部分送入检测器中。 集存装置所述集存装置的所述集存器可为储液管、 储液罐、 储液槽或者相互 串联的储液管和 /或储液罐和 /或储液槽。所述集存器的数量 p取决于待分离蛋白样 品的复杂程度， 并且与每一维分离时得到的馏分中被收集并储存以进行进一步分 离的馏分数量相关。 优选地， p可满足下式：
P ^max(xj) (3)
其中 Xj为第 j维分离时进行收集和储存以进行进一步分离的中间馏分数。 可选地， 所述集存装置的集存器的容积全部或部分地彼此不同。 本领域技术 人员容易理解， 可将体积较大的馏分容纳于容积较大的集存器中， 可将体积较小 的馏分容纳于容积较小的集存器中， 还可将一种馏分容纳于两个或多个集存器中。
优选地， 所述集存装置除了包含满足式 （3 ) 的 p个集存器以外， 还包括一个 容积小的集存器。 所述容积小的集存器用于使不需要收集和储存的馏分快速通过 所述收集和储液装置最终从排液口排出。
优选地， 所述集存装置的集存器切换阀包括第三多通阀， 或多位选择阀 （见 图 2所示的 11-1中的一个） 和第四多通阀 （见图所示的 11-2中的同一根）， 所述 第三多通阀具有一个作为所述储液装置入口的阀门入口和 p个与所述 p个集存器 一一对应地连通的阀门出口， 所述第四多通阀具有一个作为所述储液装置出口的 阀门出口和 p个与所述 p个集存器一一对应地连通的阀门入口。 通过对所述第三 多通阀的 p个阀门出口和所述第四多通阀的 p个阀门入口进行切换， 可使至少一 个所述集存器连通， 即流入所述集存装置的液体经过所述第三多通阀流入至少一 个所述集存装置， 并经过所述第四多通阀从所述集存装置流出。 更优选地， 所述第三多通阀和第四多通阀均允许液体逆向地流过阀体， 即允 许液体从阀门出口流入并从阀门入口流出。 此时， 通过对所述第三多通阀的 p个 阀门出口和所述第四多通阀的 p个阀门入口进行切换， 可使至少一个集存装置连 通， 流入所述集存装置液体可经过所述第三多通阀流入至少一个所述集存装置， 并经过所述第四多通阀从所述集存装置流出， 流入所述集存装置的液体也可逆向 地经过所述第四多通阀流入所述至少两个集存装置中的至少一个集存装置 （即从 所述第四多通阀的出口流入， 并从所述第四多通阀的入口流向所述集存装置）， 并 逆向地经过所述第三多通阀从所述集存装置流出 （即从所述三多通阀的出口流入， 并从所述三多通阀的入口流出所述集存装置）。
当用 SEC模式除盐时， 因为二维流出液体积较大且流出液中目标蛋白的浓度 随时间在不断地变化， 加之并不能一次性完全进样到 SEC柱上， 其集存装置为椭 圆形， 并伴随着用振荡器的搅拌使其混合均匀以便能分次、 等量地将收集液进样 到 SEC柱上除盐。 排液装置
所述排液装置可为本领域技术人员公知的常用于液相色谱系统中的排液装 置。 通过所述排液装置排出系统外的液体既包括不需要进一步分离的作为最终分 离产物的馏分， 也包括流路中的废液。 作为一种简单的情况， 所述排液装置可为 连通至系统外的管路。
优选地， 根据本发明的液相色谱分离系统可包括第一排液装置和第二排液装 置， 其中所述第一排液装置可将来自所述检测装置的液体排出至系统外， 所述第 二排液装置可将来自所述储液装置的液体排出至系统外， 从而使得第一排液装置 能够排出进样时置换出的流动相， 并使得第二排液装置能够排出目标产品和废液。
优选地， 当根据本发明的液相色谱分离系统为制备或生产规模时， 由于检测 器的检测池不允许大体积液体流过， 故需设置第三排液装置， 该第三排液装置为 直径远大于检测池直径的支管， 与所述检测装置并联设置， 并从分离装置接收流 动相， 从而使得 90%以上的流动相能够从所述第三排液装置排出。
可选地， 所述排液装置可为本领域技术人员公知的常用于液相色谱系统中的 三个排液装置， 第一排液装置排出进样时置换出的流动相， 第二排液装置为目标 产品排液口和大量废液的排液口， 而第三排液装置则是为大规模生产用而专门设 计的， 通过一个二通阀而与检测器并联， 该二通阀的两个孔大小可以调节， 以使 含有目标产品的 90%至 99.9%的流动相不经过检测器而排出到产品收集装置或废 液收集装置， 而仅有 0.1%至 10%的相同组成的流动向同步流过检测器。
流路切换装置
优选地， 所述流路切换装置以选择性地构成以下流路中任何一种的方式来切 换流路： 常规分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述第一 进样装置、 所述分离装置、 所述检测装置和所述第一排液装置；
第一维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述分 离装置、 所述检测装置、 所述集存装置和所述第二排液装置；
收集中间馏分的第二维或更高维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所 述第一输液装置、 所述集存装置、 所述第二进样装置、 所述分离装置、 所述集存 装置、 所述集存装置以及所述第二或第三排液装置， 并且依次连通所述流动相储 罐、 所述第二输液装置和所述第二进样装置；
不收集中间馏分的第二维或更高维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述集存装置、 所述第二进样装置、 所述分离装置、 所述检 测装置和所述第一排液装置， 并且依次连通所述流动相储罐、 所述第二输液装置 与所述第二进样装置。
在本申请中， 流路中的各个部件 "依次连通"是指通过阀门和管路将所述序 列的各个装置在空间上通过管路依次连通， 使流路中的流体在时间上依次先后经 过所述序列中每一对相邻部件， 以使得本发明的 mD-LC分离系统中的液体能够依 照所述部件序列的先后顺序流过所述部件序列中的各个部件。 为简洁起见， 所述 部件序列不具体列出流路中的阀门和管路。
恒温装置
优选地， 为了避免所分离的蛋白在分离过程中失活， 根据本发明的 mD-LC分 离系统还包括恒温装置， 所述恒温装置至少使所述集存装置保持在能够延长蛋白 的失活时间的恒温条件下。 可选地， 所述恒温装置使整个根据本发明的 mD-LC分 离系统保持在能够延长蛋白的失活时间的恒温条件下。 所述恒温温度优选地为 4。C。 例如， 所述恒温装置可为恒温箱， 该恒温箱装有冷却装置， 从而使箱体内的 空间保持恒温（优选地保持在 4°C下）， 并将所述集存装置或者整个多维液相色谱 分离系统容纳于该空间内。
所述恒温系统的全部或部分可以和色谱仪的其他部件组装在一个壳体内成为 整体式系统， 也可分开装成分体式系统。
灭菌装置
优选地， 根据本发明的多维液相色谱分离系统还可包括灭菌装置， 该灭菌装 置以公知方式至少使存在于所述集存装置中的细菌被杀灭。 可选地， 所述灭菌装 置使整个根据本发明的 mD-LC分离系统中的细菌被至少部分地杀灭。所述灭菌装 置可包括蒸汽发生装置和蒸汽注入或电热装置， 所述蒸汽发生装置能够产生温度 为 140°C 以上的蒸汽， 所述蒸汽注入装置将所述蒸汽注入多维液相色谱分离系统 的集存装置。
所述灭菌装置包括电加热装置， 所述电加热装置通过电力直接进行加热， 或 者通过电加热所产生的热风来进行加热。 所述灭菌装置的全部或部分可以和色谱仪的其他部件组装在一个壳体内成为 整体式系统， 也可分开装成分体式系统。
自动化控制装置
优选地， 为了实现自动化操作， 根据本发明的 mD-LC分离系统还可包括自动 化控制装置， 该自动化控制装置除了完成本领域技术人员公知的常规液相色谱自 动化操作以外， 还对所述分离装置、 集存装置以及流路切换装置中的阀门进行自 动切换。 根据本发明的 mD-LC分离系统为整体式或分体式的不同， 该自动化控制 装置为一个整体， 也可分为两个独立的控制装置， 前者为全新的 "系统"， 后者只 是配合现有色谱仪使用的自控系统。
任选地， 根据本发明的 mD-LC分离系统还可包括常规液体混合装置， 该常规 液体混合装置是本领域技术人员所公知的， 其以公知方式使流路中的各种组分更 充分地相互混合， 例如， 可将该常规液体混合装置设置于所述输液装置之后， 从 而使从该输送装置的流出液中的各种流动相液体更好地相互混合。
壳体
可选地， 将根据本发明的 mD-LC分离系统的部分或全部组件安装在一个或多 个壳体内， 从而形成整体式或分体式的仪器设备。 例如， 将所述输液装置、 进样 装置、 分离装置、 集存装置、 流路切换装置、 自动化控制装置、 常规检测装置以 及常规排液装置安装于一个壳体内， 从而形成整体式的多维液相色谱仪， 也可组 装成两个以上壳体内的分体式 "系统"。
二维液相色谱分离系统
特别地， 本发明提供一种用于蛋白分离的使用圆柱形色谱柱的 2D-LC分离系 统（以下简称 2D-LC分离系统）， 该 2D-LC分离系统包括检测装置， 其特征在于， 所述 2D-LC分离系统包括：
( 1 ) 流动相储罐， 其储存用于 2D-LC分离的流动相的液体；
(2)第一输液装置和第二输液装置， 所述第一输液装置和第二输液装置彼此 独立地从所述流动相储罐取出适用于液相色谱分离的流动相并将该流动相输送至 所述 2D-LC分离系统的流路中， 并且可彼此独立地调节和计量流量；
( 3 ) 第一进样装置和第二进样装置， 所述第二进样装置包括进样混合器；
(4) 分离装置， 其包括色谱柱切换单元和 n根色谱柱， 或者包括一根具有两 种以上分离功能的色谱柱， 其中所述色谱柱切换单元使进入所述分离装置的液体 选择性地流入所述 n根色谱柱中的一根色谱柱， n为非负整数且满足下式：
n 〉 q (4)
当用通常的两根单分离模式色谱柱在该多维色谱系统上实施离线 2D-LC时， n = 2, q = 0， m = 0; 应注意的是， 此处说明的是如何用通常色谱柱 （即一根 色谱柱只有一种分离模式） 在该多维色谱系统上实施离线和在线 2D-LC, 故所用 色谱柱的个数 n=2， q = 0, m = 0。 当用一根 2D色谱柱在该多维色谱系统上实施离线和在线 2D-LC时， n = m = q = 1 (5)
(5 ) 集存装置， 其包括 p个集存器和集存器切换阀， 其中 p大于或等于 2， 所述集存器切换单元使进入所述集存装置的液体选择性地流入所述集存装置中的 至少一个集存器。
(6)至少二个排液装置，所述 2D-LC分离系统中的液体从所述排液装置排出 至系统外；
(7) 流路切换装置， 其由与上述装置相连的阀门和管路所组成， 通过对所述 流路切换装置中的阀门进行切换， 所述流路切换装置除了形成常规液相色谱分离 中的流路外， 还形成用于进行 2D-LC分离的流路；
其中， 在第一维分离时， 所述第一输液装置将适用于该第一维分离的流动相 输送至第一进样装置 [如图 2中所示 7， 从左向右数的第一根色谱柱为 2D柱， 其它 为通常的单分离模式柱]一根， 所述第一进样装置从系统外引入原样品并使其随来 自第一输液装置的流动相一同进入所述分离装置， 所述分离装置对该待分离样品 进行第一维液相色谱分离并由此得到不同的馏分， 所述集存装置和所述馏分中需 要进行进一步液相色谱分离的中间馏分并将该中间馏分储存在至少一个集存装置 中， 并将不需要进一步分离的馏分通过所述排液装置 2从系统中排出；
在第二维分离时， 所述第一输液装置将适用于液相色谱分离的流动相送至所 述集存装置并将储存于所述至少一个集存器中的一种中间馏分随着该流动相一同 被输送至所述进样混合器中， 所述第二输液装置从所述流动相储罐取出适用于液 相色谱分离的流动相并将该流动相输送至所述进样混合器中， 所述进样混合器使 来自所述至少一个集存器的中间馏分和流动相与来自所述第二输液装置的流动相 混合从而得到进样混合液， 所述分离装置对所述进样混合液进行第二维液相色谱 分离并由此得到不同的馏分。
其中， 所述第一输液装置和第二输液装置对其输送的用于第二维分离的流动 相的量进行调节和计量， 从而使得用于第二维分离的所述进样混合液中的洗脱剂 浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中的所有需要在该第二维分离中得以保 留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。
优选地， 根据本发明的液相色谱分离系统可包括第一排液口和第二排液口和 第三排液口， 其中所述第一排液装置可将来自所述检测装置的液体排出至系统外， 所述第二排液装置可将产品及来自所述进原样时排出废液储液装置的液体排出至 系统外。
第三排液口是为大规模生产用而专门设计的， 与检测器并联的二通阀， 该阀 的两个孔大小可以调节，以使含有目标产品的 90〜99.9% 的流动相不经过检测器而 排出到产品收集装置，或废液收集装置，只是 0.1〜10%的相同组成的流动向同步流 过检测器。 优选地， 所述流路切换装置以选择性地构成以下流路中任何一种的方式来切 换流路：
常规分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述第一 进样装置、 所述分离装置、 所述检测装置和所述第一排液装置；
第一维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述分 离装置、 所述检测装置、 所述集存装置和所述第二排液装置；
第二维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述馏、 所述第二进样装置、 所述分离装置、 所述检测装置和所述第一排液装置， 并且依 次连通所述流动相储罐、 第二输液装置与所述第二进样装置。 本发明的另一方面在于提供一种新的用于蛋白分离的 mD-LC 分离方法， 该 mD-LC分离方法包括以下步骤：
( 1 )预先准备： 确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维或更多维分离中 得以保留的蛋白在该第二维或更多维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度；
(2) 第一维分离： 通过梯度洗脱对蛋白样品进行常规液相色谱分离， 从而得 到不同的馏分；
(3 ) 收集和储存中间馏分： 收集并储存经上一维分离得到的馏分中需要进行 进一步分离的中间馏分；
(4)第二维或更多维分离： 将一种需要进行下一维分离的全部或部分的中间 馏分与用于下一维分离的流动相混合从而得到下一维分离的进样混合物， 将所述 进样混合物进样至下一维分离的同一混合模式色谱柱或并联的另一模式或混合模 式色谱柱中； 随后， 通过梯度洗脱， 将保留在所述步骤 （4) 的下一维分离的色谱 柱中的所述进样混合物进行第二维或更 mD-LC分离， 从而再次得到不同的馏分； 对所有的由上一维分离得到且需要进行此维分离的中间馏分进行上述分离。
(5 ) 重复上述步骤 （3 ) 和 （4)， 从而得到所有的目标蛋白产物。
其中， 在所述步骤 （4) 中， 对用于所述下一维分离的流动相的量进行调节和 计量， 从而使得所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间 馏分中的所有需要在该第二维或更多维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂 浓度。
优选地， 在所述步骤 （4) 中， 通过高流速的流动相而使所述中间馏分进样至 所述的并联的色谱柱中。
在本申请中， "高流速"的流动相是指该流动相的流速高于通过梯度洗脱进行 液相色谱分离目标蛋白时所通常采用的流动相流速。
进一步优选地， 在所述步骤 （4) 中， 将所述中间馏分的进样至所述色谱柱的 时间少于该中间馏分的分离时间的一半。
根据本发明的多维液相色谱分离方法可在线进行， 也可离线进行。 在根据本发明的 "在线馏分离方法" 中， 经上一维分离后的馏分通过在线方 式收集， 随后将需要进一步分离的中间馏分直接送至下一维分离。
在根据本发明的 "离线 mD-LC分离方法"中， 经上一维分离后的馏分通过离 线方式收集， 再将需要进一步分离的中间馏分进行下一维分离。 通过本发明的 mD-LC分离系统实施本发明的 mD-LC分离方法
根据本发明的 mD-LC分离方法可使用根据本发明的 mD-LC分离系统来实施， 其步骤如下：
( 1 )预先准备： 确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维或更多维分离中 得以保留的蛋白在该第二维或更多维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度 CCMP ;
(2) 第一维分离： 通过所述流路切换装置形成用于第一维分离的流路， 通过 第一输液装置输送用于第一维分离的流动相， 并通过第一进样装置将该蛋白样品 进样至所述 mD-LC分离系统内， 在存在所述色谱柱切换单元时通过切换该色谱柱 切换单元使得用于第一维分离的色谱柱连通， 通过梯度洗脱使所述蛋白样品在所 述色谱柱中分离成不同的馏分并用检测器检测；
(3 ) 收集和储存中间馏分： 通过切换所述馏中的集存器切换单元， 使需要进 行进一步分离的中间级分被收集并分别储存于不同的集存装置中， 并将不需要进 行进一步分离的馏分从第二排液口排出系统；
(4) 第二维或更多维分离： 上一维分离完成后， 通过所述流路切换装置形成 用于第二维或更多维分离的流路， 并在存在所述色谱柱切换阀时通过切换该色谱 柱切换发使得用于第二维或更多维分离的色谱柱连通； 通过第一输液装置将用于 下一维分离的流动相输送至集存装置， 以使一种需要进行下一维分离的中间馏分 从相应集存器中流出并进入所述第二输液装置的进样混合器中， 同时通过第二输 液装置将用于下一维分离的流动相送至所述进样混合器中， 从而使所述中间馏分 与所述流动相混合得到下一维分离的进样混合物； 将所述进样混合物进样至下一 维分离的色谱柱中， 并且通过对所述第一输液装置和第二输液装置所输送的流动 相的量进行调节和计量， 使该进样混合物中的洗脱剂浓度低于该中间馏分中的所 有需要在下一维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而使所述蛋白 保留于所述色谱柱中， 从而完成第二维进样；
随后， 通过梯度洗脱使所述进样混合物在所述色谱柱中分离成不同的馏分并 用检测器检测；
对所有的由上一维分离得到且需要进行此维分离的中间馏分进行此步骤的分 离；
(5 ) 重复上述步骤 （3 ) 和 （4)， 从而得到所有的目标蛋白产物。
(6) 多维色谱的最后一维色谱分离可以是除盐。 通常使用排阻色谱柱 （SEC 柱）。 二维液相色谱 （2D-LC) 分离方法
特别地，本发明提供一种新的用于蛋白分离的单柱 2D-LC分离方法，该 2D-LC 分离方法包括以下步骤：
( 1 )预先准备： 确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维分离中得以保留 的蛋白在该第二维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度；
(2)第一维分离： 用图 2中的一根通常的单分离模式色谱柱对蛋白样品进行 第一维液相色谱分离， 从而得到不同的馏分；
(3 ) 收集和储存中间馏分： 收集并储存经第一维分离得到的馏分中需要进行 第二维分离的中间馏分；
(4)第二维分离： 将所述中间馏分与用于第二维分离的流动相混合从而得到 进样混合物， 将所述进样混合物的全部或部分的进样至第二维分离的色谱柱中； 随后将所述进样混合物进行第二维液相色谱分离， 从而得到目标蛋白产物； 对所 有的由第一维分离得到且需要进行第二维分离的中间馏分进行此步骤的分离。
其中， 在所述步骤（4)中， 对用于第二维分离的流动相的量进行调节和计量， 从而使得所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中 的所有需要在该第二维分离中得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。 通过本发明的多维液相色谱分离系统或 2D-LC分离系统实施本发明的 2D-LC 分离方法
根据本发明的 mD-LC分离系统或 2D-LC分离方法可使用根据本发明的 2D-LC 分离系统来实施， 其步骤如下：
( 1 )预先准备： 确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维分离中得以保留 的蛋白在该第二维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度 CCMP;
(2) 第一维分离： 通过所述流路切换装置形成用于第一维分离的流路， 通过 第一输液装置输送用于第一维分离的流动相， 并通过第一进样装置， 如用图 2 中 的一根通常的单分离模式色谱柱， 将该蛋白样品进样至所述 mD-LC分离系统内， 在存在所述色谱柱切换阀时通过切换该色谱柱切换阀使得用于第一维分离的色谱 柱连通， 通过梯度洗脱使所述蛋白样品在所述色谱柱中分离成不同的馏分并在检 测器中检测；
(3 ) 收集和储存中间级分： 通过切换所述集存液装置中的集存器切换单元， 使需要进行进一步分离的中间馏分被收集并分别储存于不同的集存液装置中， 并 将不需要进行进一步分离的级分从第二排液口排出系统；
(4) 第二维分离： 第一维分离完成后， 通过所述流路切换阀形成用于第二维 分离的流路，并通过所述色谱柱切换阀 6-1切换到第二维单模式色谱分离柱进行第 二维色谱分离， 切换阀使得用于第二维分离的色谱柱连通； 通过第一输液装置将 用于第二维分离的流动相输送至集存装置， 以使一种需要进行第二维分离的中间 馏分从其集存器中流出并进入所述第二输液装置的进样混合器中， 同时通过第二 输液装置将用于第二维分离的流动相送至所述进样混合器中， 从而使所述中间馏 分与所述流动相混合得到第二维分离的进样混合物， 将所述进样混合物进样至第 二维分离的色谱柱中， 并且通过对所述第一输液装置和第二输液装置所输送的流 动相的量进行调节和计量， 使该进样混合物中的洗脱剂浓度低于该中间馏分中的 所有需要在第二维分离中得以保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而使所 述蛋白保留于所述色谱柱中， 完成第二维进样； 通过梯度洗脱使所述进样混合物 在所述色谱柱中分离成不同的馏分通过色谱柱切换阀 6-2进入到检测器中检测；对 所有的由第一维分离得到且需要进行第二维分离的中间馏分进行此步骤的分离。 缓冲液交换和色谱系统的再平衡
在所述步骤 （4 ) 的进样之前或进样完成后， 当上一维分离后的中间样品中的 流动相组成与下一维分离的流动相组成不匹配时， 根据本发明的 mD-LC分离方法 或二维液相色谱分离方法还可包括以下步骤：
缓冲液交换： 将下一维分离中所用的流动相作为缓冲液， 并使所述缓冲液流 过所述下一维分离的色谱柱， 其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述中间馏级 分中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而至少部 分地置换所述色谱柱中原有的流动相。
举例而言， 从前一维分离流出的含有目标蛋白的收集液是会有已知组成的溶 液 1和溶液 2的混合液， 其组成可从梯度时间及该溶液 1和溶液 2的组成估算而 知， 但不同蛋白的保留时间不同， 故不同蛋白收集液中的组成并不固定， 可用溶 液 X表示， 收集溶液一般都会在 3 mL以上， 而该溶液 X在溶液 1或 2推动下进 入第二进样装置时， 它是不与该推动液混合的， 故在第二进样装置中与由第二输 液装置推动的溶液 3或 4与溶液 X混合后， 从开始到完全进入色谱第二维分离柱 的这一全过程为样品的缓冲溶液交换或缓冲溶液置换。
色谱系统的再平衡： 在溶液 X进样的过程中， 事实上就将原来残留在色谱柱 中的用于一维色谱分离的流动相进行了部分置换， 这有助于色谱系统的再平衡， 也可视其为第二维色谱体系平衡过程中的一部分， 如需再继续实现完全平衡， 就 再用溶液 3或 4流过该色谱柱。 所述缓冲液交换和色谱系统的再平衡完成后， 才能对所述中间馏分进行分离。 优选地， 所述缓冲液交换和色谱系统的再平衡时的流动相流速高于通过梯度 洗脱进行液相色谱分离时所通常采用的流动相流速。
优选地， 可通过本发明的 mD-LC分离系统来实施缓冲液交换， 其中将下一维 分离中所用的流动相作为缓冲液， 通过第一输液装置和 /或第二输液装置使所述缓 冲液流过所述下一维分离的色谱柱， 其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述中 间馏分中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而至 少部分地置换所述色谱柱中原有的流动相。 优选地， 所述第一输液装置和 /或第二 输液装置所输送的缓冲液的流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时所通常采 用的流动相流速。
特别地， 在所述步骤（4 ) 的进样之前或进样完成后， 根据本发明的 2D-LC分 离方法可包括以下步骤：
缓冲液交换： 将第二维分离中所用的流动相作为缓冲液， 并使所述缓冲液流 过所述第二维分离的色谱柱， 其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述中间馏分 中所有需要在第二维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而至少部分 地置换所述色谱柱中原有的流动相。 优选地， 所述第一输液装置和 /或第二输液装 置所输送的缓冲液的流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时所通常采用的流 动相流速。
所述缓冲液交换和色谱系统的再平衡完成后， 再对所述中间馏分进行第二维 分离。 色谱柱的再生
色谱柱需要周期性地再生， 可用合适的强洗脱溶液在高速条件下清洗色谱柱。 本领域技术人员能够通过所采用的色谱分离模式来选择合适的强洗脱溶液。 通过阅读本申请所公开的技术内容， 本领域技术人员应能理解， 本发明人发 现了蛋白的 "停滞-迁移"现象并将其创造性地应用于液相色谱分离技术， 从而设 计出本发明的 mD-LC分离系统和 mD-LC分离方法， 其中通过将再次进样时的进 样混合物中的洗脱剂浓度保持在低于其中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白 的临界迁移洗脱剂浓度， 从而实现了将前一维分离后所得馏分全部进样至下一维 分离的色谱柱， 并且不需要将前一维分离后的馏分除盐， 也无需任何特殊的柱间 接头。
本发明的优势特别地在于能够实现全部目标中间馏分的定量转移， 进而实现 蛋白和多肽的快速分离。 附图说明
图 1A-1F 显示了在非同步进样条件下对联苯、 碳酸酐酶和十五肽 ( GEPPPGKPADDAGLV ) 进行 RPLC线性梯度洗脱的结果。
图 2为示例性的 mD-LC分离系统的流路结构图， 图 2中各部件为：
1、 四元梯度单元
2、 流动相储罐 2-2、 溶液 2
2-3、 溶液 3
2-4、 溶液 4
3、 泵 A
4、 六通阀组： 包括一个六通进样阀和一个六通阀
4-1、 六通进样阀 4-1， 其为第一进样 （原样） 装置
4- 2、六通阀 4-2， 该六通阀 4-2和相关阀门以及混合器 12—起组成第二进 样装置
5、 三通阀：
5- 1、 三通阀 5-1
5-2、 三通阀 5-2
5-3、 三通阀 5-3
5- 4、 三通阀 5-4
6、 多通阀组： 包括 2个多通阀
6- 1、 多通阀
6-2、 多通阀导入流体到色谱柱 （饼）
7、 色谱柱 （饼） 组
8、 低温恒温控制箱 （包括灭菌装置）
9、 泵 B
10、 集存装置
10-1、 集存装置 10-1
10-2、 集存装置 10-2
10-3、 集存装置 10-3
10-4、 集存装置 10-4
10-5、 集存装置 10-5
10-6、 集存装置 10-6
10-7、 集存装置 10-7
10- 8、 集存装置 10-8
11、 多通阀组： 包括两个 8通阀
11- 1、 八通阀 1
11-2、 八通阀 2
12、 混合器
13、 检测器
14、 色谱饼
15、 镏分收集器
16、 工作站 17-1、 主排液口
17-2、 二维进样时的废液排液口
17-3、 大规模纯化蛋白时的排液口
18、 振荡器
19、 并联分流管
图中粗实线表示管线， 而细实线表示数据线。 图 3显示了通过商品柱奥岚 WCX柱对 Ί种蛋白的 2D-LC (WCX, HIC) 分 离的结果。
图 4显示了通过商品 Shim-pack PA-CM的 WCX柱和商品 TSKgel G4000SWXL
SEC除盐柱共两根色谱柱实施三维色谱 3D-LC(WCX/HIC/SEC)对 a-Chymotrypsin 和 Trypsin同时进行纯化并除盐的结果。
图 5显示了在线单柱二维液相色谱柱 （2D (WCX, HIC) 快速纯化牛胰腺中 的细胞色素 C的结果。 具体实施方式
本发明的技术方案及其优势将通过阅读以下的具体实施方案而显而易见。 二维液相色谱 (2D-LC)分离系统
特别地， 在一个具体实施方案中， 根据本发明的为如图 2所示的 mD-LC分离 系统用于 2D-LC的疏水色谱（HIC)和离子交换色谱（IEC)的分离系统， 其包括：
(a)作为流动相储罐的 4个储罐（分别为流动相储罐 2-1至 2-4)容积和材料 可随系统规模而异， 从 lOO mL至 100 L, 从玻璃材质到不锈钢材质不等。 其中， 所述流动相储罐 2-1至 2-4各自装有用于液相色谱分离的溶液，所述溶液分别表示 成溶液 1 -2分别为 HIC流动相的 A溶液和 B溶液， 而溶液 3-4分别为 IEC流动相 的 A溶液和 B溶液， 其中溶液 1和溶液 2用作第一维色谱分离的溶液， 而溶液 3 和溶液 4用作第二维色谱分离的溶液。
(b) 作为第一输液装置的泵 A (3)和四元梯度单元 1-2， 作为第二输液装置 的泵 B (9)和四元梯度单元 1-1， 其 4个通道均分别与流动相储罐 2-1至 2-4—一 对应连通， 并且能够独立地调节和计量 4个通道的流量。
其中， 泵 A (3) 和四元梯度单元 1-2以及泵 B (9) 和四元梯度单元 1-1均可 为商品四元梯度泵， 可用泵本身提供的动力输送和计量四种不同流动相通道的流 泵 A (3)和四元梯度单元 1-2主要用于第一维色谱分离， 也用于将储存在集、 存装置中的一维馏分送出配合二维色谱进样， 或二维色谱分离。 泵 B (9) 和四元 梯度单元 1-1主要用于第二维或多维色谱分离， 并与泵 A (3) 联用实施二维或多 维色谱进样和色谱分离。
泵 A ( 3 ) 和泵 B ( 9) 为高压泵， 其流量范围优选为 0.001至 10毫升 /分钟， 精度 ± 0.001 mL， 最大压力为 40 MPa; 对于制备型多维液相色谱分离系统， 泵 A ( 3 ) 和泵 B ( 9) 的流量范围优选为 0.01至 100毫升 /分钟， 精度 ± 0.01 mL，最大 压力为 20 MPa; 对于生产型多维液相色谱分离系统， 泵 A ( 3 ) 和泵 B ( 9) 的流 量范围优选为 0.1至 10升 /分钟， 精度 ± 0.1 mL最大压力为 20MPa。
( c) 作为第一进样装置的六通进样阀 4-1和 4-2以及作为第二进样装置的混 合器 12。
其中， 六通进样阀 4-1为一维进样和第一废液排出阀； 六通阀 4-2为第二维进 样的控制阀， 明确标注有 "inject"和 " load" 阀位， 以表明二维分离体系的工作 状态。
所述六通进样阀 4-1具有 6个端口， 其端口 1-4孔连接以作为样品环， 端口 6 孔与进样器排液口相连。 所述样品环的容量例如为 10毫升。 所述六通进样阀 4-1 的阀内构造为： 在进样状态下， 所述六通进样阀 4-1的端口 1孔与端口 2孔连通， 端口 3孔与端口 4孔连通， 而端口 5孔与端口 6孔连通； 在非进样状态或进样准 备状态下， 端口 1孔与端口 6孔连通， 端口 2孔与端口 3孔连通， 而端口 4孔与 端口 5孔连通。 六通进样阀 4-1的端口 1孔与端口 4孔分别与样品环的两端连通， 而端口 6孔与进样器排液口连通。
所述混合器 12例如为喷嘴式管道混合器， 其具有两个混合器入口 （混合器入 口 Ml和混合器入口 M2 )和一个混合器出口 M0。 所述混合器 12的入口 Ml与泵 B ( 9) 的出口连通。 混合器 12将上一维馏分与下一维色谱分离所用流动相以合适 比例在其中混合， 从而使混合后的浓度低于二维色谱分离要求的 "洗脱剂的最低 浓度"。 六通阀 4-2和该混合器共同组成了第二进样装置。
( d) 由色谱柱组 7或色谱饼组 14、 作为色谱柱切换单元的多通阀 6-1和多通 阀 6-2以及上述部件之间的连通管路所组成的分离装置。 多通阀 6-1和多通阀 6-2 用于控制目标蛋白进入色谱柱组 7或色谱饼组 14中的所需分离模式中的一个。
所述色谱柱组 7或色谱饼组 14包括多根本领域技术人员公知的常用于蛋白分 离的商用色谱柱及混合模式色谱柱或商用色谱饼及混合模式色谱饼， 其总数为 n 根，为简洁起见将这些色谱柱 /色谱饼统一记为色谱柱 1、色谱柱 2、色谱柱 3、……、 色谱柱 n。 多通阀 6-1具有一个入口 0和至少 n个出口 （分别记为出口 1、 出口 2、 出口 3、 ……、 出口 n)。多通阀 6-2具有一个出口 0和 n个入口 （分别记为入口 1、 入口 2、 入口 3、 ……、 入口 N)。 多通阀 6-1的入口 0作为所述分离装置的入口， 多通阀 6-2的出口 0作为所述分离装置的出口，多通阀 6-1的出口 1至出口 n分别 与色谱柱 1至色谱柱 n的入口——对应地连通， 而多通阀 6-2的入口 1至入口 n 分别与色谱柱 1至色谱柱 n的出口一一对应地连通。多通阀 6-1和多通阀 6-2的阀 内构造为： 在切换至某根色谱柱 (X ( ct为 1至 n的自然数） 的状态下， 多通阀 6-1 的入口 0与对应于该色谱柱 α的出口 α连通，而多通阀 6-2的出口 0与对应于该色 谱柱 a的入口 α连通。
其中， 色谱饼组 14可设置成装填在不朽钢、 聚合材料的饼形空腔内的各种色 谱分离介质， 其可为一维、 二维或者甚至多维模式， 可作为色谱柱组 7 中的一员 而与其他色谱柱并联地安装在一起，通过多通阀 6-1和 6-2，色谱饼组 14可与色谱 系统串联以实施各种形式的多维色谱分离。
( e)作为检测装置的检测器 13， 其为本领域技术人员公知的常用于检测蛋白 质的检测器。 可使用 UV、 折光、 电化学、 质谱等类型的检测器， 可用于蛋白， 或 多肽检测的检测器均可使用， 这些检测器可市购获得。
( 0 由作为集存器的 8个储液管 （记为集存装置 10-1至集存装置 10-8)、 作 为集存器切换单元的八通阀 11-1和八通阀 11-2以及上述部件之间的连通管路所组 成的集存装置。
所述集存装置由不锈钢、 peek管或钛钢为材料制成， 其可为容积不等、 形状 各异的螺旋管状、 橄榄状空心管， 以容纳和储备流出液。 该集存装置的一端连接 八通阀 11-1， 另一端接八通阀 11-2。
八通阀 11-1和 11-2分别连接至 8个集存装置的两端， 每一个通路连接一个集 存装置， 从而控制馏分进入相应的集存装置。
其中， 集存装置 10-1至 10-8的容量彼此相同且至少为 2毫升， 或者彼此不同 且在 2毫升至 2升之间变化。 八通阀 11-1具有一个入口 0和 8个出口 （出口 1至 出口 8)， 而八通阀 11-2具有一个出口 0禾 B 8个入口 （入口 1至入口 8)。 八通阀 11-1的入口 0作为所述集存装置的入口， 而八通阀 11-2的出口 0作为所述集存装 置置的出口。八通阀 11-1的出口 1至出口 8分别与集存装置 10-1至集存装置 10-8 的一端连通，而八通阀 11-2的入口 1至入口 8分别与集存装置 10-1至集存装置 10-8 的另一端连通。 八通阀 11-1和八通阀 11-2的阀内构造为： 在切换至连通集存装置 10-β ( β为 1至 8的自然数）的状态下， 八通阀 11-1的入口 0与出口 β连通， 而八 通阀 11-2的出口 0与入口 β连通。 在切换至某个储液管的状态下， 液体可依次经 过八通阀 11-1、 该集存装置和八通阀 11-2流过所述集存装置； 同时， 八通阀 11-1 和八通阀 11-2均允许液体逆向地流动， 此时， 液体可依次经过八通阀 11-2、 该集 存装置和八通阀 11-1流过所述集存装置。
振荡器 18用于对储放在橄榄形集存装置（例如图 2中的 10-1和 10-2 )中的收 集液搅拌均匀。 在将蛋白溶液进行除盐， 或者只将收集液的一部分再进样到下一 维分离时使用该振荡器 18。
( g)作为第一排液装置的排液口 17-1与三通阀 5-4的端口 2相连， 作为第二 排液装置的排液口 17-2与六通阀 4-2的 6孔相连。
排液口包括三个排液口： 接馏分收集器的主排液口 17-1、 二维进样时的废液 排液口 17-2和在大规模纯化蛋白时的排液口 17-3。 排液口 17-3包括与检测器 13并联的并联分流管 19。 在大规模纯化蛋白时， 为防止高流量流过检测器的检测池所产生的高压， 将 90%以上的流动相经该并联 分流管流至馏分收集器 15中， 仅 1%至 10%的流动相流过检测池以作蛋白的 "在 线监测"用。
馏分收集器 15专门用于收集纯化后的最终产品， 当然也可用来收集想要的中 间馏分， 馏分收集器 15可市购获得。
(h) 作为流路切换装置的六通阀 4-2、 三通阀 5-1、 三通阀 5-2、 三通阀 5-3、 三通阀 5-4以及上述阀门之间的连通管路。
其中， 六通阀 4-2具有 6个端口 （端口 1至端口 6)， 三通阀 5-1、 5-2、 5-3和 5-4各自具有 3个端口 （端口 1、 端口 2和端口 3 )。 六通阀 4-2的阀内构造为： 在 该六通阀 4-2的第一种切换状态 4-2a下， 端口 1与端口 2连通， 端口 3与端口 4 连通， 而端口 5与端口 6连通； 在该六通阀 4-2的另一种切换状态 4-2b下， 端口 1 与端口 6连通， 端口 2与端口 3连通， 而端口 4与端口 5连通。 三通阀 5-1、 5-2、 5-3和 5-4的阀内构造为：在该三通阀 5-1、 5-2、 5-3和 5-4的第一种切换状态 5-la、 5-2a、 5-3a和 5-4a下， 其各自的端口 1与端口 2连通； 在该三通阀 5-1、 5-2、 5-3 和 5-4的另一种切换状态 5-lb、 5-2b、 5-3b和 5-4b下， 其各自的端口 1与端口 3 连通。六通进样阀 4-1的端口 2与泵 1的出口连通。检测器的入口与作为分离装置 出口的多通阀 6-2的入口 0连通， 检测器的出口与三通阀 5-4的端口 1连通。六通 阀 4-2的端口 1与八通阀 11-2的出口 0连通， 六通阀 4-2的端口 2与六通进样阀 4-1的端口 3连通， 六通阀 4-2的端口 3与三通阀 5-1的端口 1连通， 六通阀 4-2 的端口 4与三通阀 5-2的端口 2连通， 六通阀 4-2的端口 6与排液口 17-2连通。 三通阀 5-1的端口 2与混合器入口 M2连通， 三通阀 5-1的端口 3与三通阀 5-3的 端口 2连通。 三通阀 5-2的端口 1与作为分离装置入口的多通阀 1的入口 0连通， 三通阀 5-3的端口 3与混合器出口 M0连通。三通阀 5-3的端口 1与多通阀 1的入 口 0连通， 三通阀 5-2的端口 3与三通阀 5-4的端口 3连通。 三通阀 5-4的端口 2 与排液口 17-1连通。
(0 作为恒温装置的低温恒温控制箱 8， 该低温恒温控制箱使图中虚线方框 以内的部件保持在 4° C的恒温下。
该低温恒温控制箱包括灭菌装置， 其为装有冷却装置的恒温箱， 使箱体内的 空间保持恒温在 4°C， 并将所述集存装置， 或者整个多维液相色谱分离系统容纳于 该空间内。 该控温系统的全部或部分可以和色谱仪的其他部件组装在一个壳体内 成为整体式系统， 也可分开装成分体式系统。
所述灭菌装置包括蒸汽发生装置和蒸汽注入装置， 或电加热装置。 所述蒸汽 发生装置能够产生温度为 140°C 以上的蒸汽， 所述蒸汽注入装置将所述蒸汽注入 多维液相色谱分离系统的集存装置。
该灭菌装置可采用电加热装置， 所述电加热装置通过电力直接进行加热， 或 者通过电加热所产生的热风来进行加热。
(j ) 作为自动化装置的计算机控制装置， 该计算机控制装置自动地控制四元 梯度单元 1-1和 1-2、 泵 A (3 ) 和泵 B (9) 以及低温恒温控制箱 8的操作， 并接 收来自检测器 13的信号。
工作站 16依据该系统是分体式还是整体式来设计专用的操作软件。 前者是与 通常的液相色谱仪联合使用， 故该系统只是配合色谱系统使用， 其软件是一种设 计； 而后者则要把通常色谱仪的软件与本专利设计的多维色谱系统一并考虑， 作 为一个整体设计软件， 最终成为一个不含有任何通常色谱仪工作站的全新的工作 站。 所述流路切换装置通过以下方式来切换六通阀 4-2、 三通阀 5-1、 三通阀 5-2、 三通阀 5-3和三通阀 5-4从而形成不同的流路：
(A) 常规分离流路： 将六通阀 4-2切换至状态 4-2b (端口 1与端口 6连通， 端口 2与端口 3连通， 而端口 4与端口 5连通）， 三通阀 5-1切换至状态 5-lb (端 口 1与端口 3连通），三通阀 5-2切换至任何状态，三通阀 5-3切换至状态 5-3a (端 口 1与端口 2连通）， 三通阀 5-4切换至状态 5-4a (端口 1与端口 2连通）， 从而形 成依次连通流动相储罐、 四元梯度单元 1-2、 泵 A (3 )、 色谱柱组 7/色谱饼组 14、 检测器 13和排液口 17-1的常规分离流路。
一方面，在上述常规分离流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀 4-1切换成 进样状态（端口 1与端口 2连通，端口 3与端口 4连通， 而端口 5与端口 6连通）， 从而使样品环连通至本发明的二维液相色谱分离系统的流路中， 从而形成进样状 态的常规分离流路 （称作流路 A0)。
另一方面，在上述常规分离流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀 4-1切换 成非进样状态 （端口 1与端口 6连通， 端口 2与端口 3连通， 而端口 4与端口 5 连通）， 从而使样品环不与本发明的二维液相色谱分离系统的流路连通， 从而形成 非进样状态的常规分离流路 （称作流路 A)。
(B)第一维分离流路：将六通阀 4-2切换至状态 4-2b (端口 1与端口 6连通， 端口 2与端口 3连通， 而端口 4与端口 5连通）， 三通阀 5-1切换至状态 5-lb (端 口 1与端口 3连通）， 三通阀 5-2切换至状态 5-2b (端口 1与端口 3连通）， 三通阀 5-3切换状态 5-3a (端口 1与端口 2连通）， 三通阀 5-4切换至状态 5-4b (端口 1 与端口 3连通）， 从而形成依次连通流动相储罐、 四元梯度单元 1-2、 泵 A (3 )、 色谱柱组 7/色谱饼组 14、 检测器 13、 储液管组 10和排液口 17-2的流路。
一方面，在上述流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀 4-1切换成进样状态 (端口 1与端口 2连通， 端口 3与端口 4连通， 而端口 5与端口 6连通）， 从而使 样品环连通至本发明的二维液相色谱分离系统的流路中， 从而形成进样状态的第 一维分离流路 （称作流路 B0)。 另一方面，在上述流路的阀门状态下，进一步将六通进样阀 4-1切换成非进样 状态 （端口 1与端口 6连通， 端口 2与端口 3连通， 而端口 4与端口 5连通）， 从 而使样品环不与本发明的二维液相色谱分离系统的流路连通， 从而形成根据本发 明的多维液相色谱分离中的第一维分离流路 （称作流路 B)。
(C)第二维分离流路： 将六通阀 4-2切换至状态 4-2a (端口 1与端口 2连通， 端口 3与端口 4连通， 而端口 5与端口 6连通）， 三通阀 5-1切换至状态 5-la (端 口 1与端口 2连通）， 三通阀 5-2切换至状态 5-2a (端口 1与端口 2连通）， 三通阀 5-3切换状态 5-3b (端口 1与端口 3连通）， 三通阀 5-4切换至状态 5-4a (端口 1 与端口 2连通）， 从而形成流动相储罐、 四元梯度单元 1-1、 泵 A (3 )、 储液管组 10、 混合器 12、 色谱柱组 7/色谱饼组 14、 检测器 13和排液口 17-1依次连通并且 四元梯度单元 1-1、 泵 B (9) 和混合器 12依次连通的第二维分离流路。
一般而言， 在本发明的二维液相色谱分离系统处于第二维分离流路的情况下， 六通阀 4-2切换至非进样状态（端口 1与端口 6连通， 端口 2与端口 3连通， 而端 口 4与端口 5连通）， 从而形成根据本发明的不收集中间分离产物时的第二维分离 流路 （称作流路 C)。 常规液相色谱分离 （单维液相色谱分离）
按照以下步骤对图 2所示的根据本发明的 2D-LC分离系统进行操作， 可实现 蛋白样品的常规液相色谱分离 （一维液相色谱分离）：
(1) 按本领域技术人员共知的知识， 选择合适组成的流动相， 开启泵 A (3 )， 设置合适的梯度洗脱条件， 包括起始浓度， 线性， 还是非线性的梯度洗脱模式， 梯度的时间等。通过四元梯度单元 1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送合适 的溶剂 （例如分别从流动相储罐 1和流动相储罐 2取出并输送溶剂 1和溶剂 2)， 并且使分离装置处于连通任何一根色谱柱或色谱饼的状态， 使色谱系统进行必要 的平衡。
(2)进样：将六通进样阀 4-1设置成非进样状态（通常在进样阀上标有" load" 字样， 此时进样阀的端口 1与端口 6连通， 端口 2与端口 3连通， 而端口 4与端 口 5连通）， 向六通进样阀 4-1的端口 5送入混合蛋白样品 （例如 ΙΟΟμυ, 并使样 品容纳于样品环中。 接着就将进样阀的搬手转向标标有 "inject"字样处， 使样品 进入色谱分离装置。 这时进样阀设置成形成流路 AO (进样时的常规分离流路） 的 状态。与此同时，该 MD-LC系统的控制系统就会指令梯度洗脱系统同步开始工作。 依此方式完成进样。
(3 )常规液相色谱分离： 进样完成后， 将图 2所示的根据本发明的 2D-LC系 统分离系统设置又会到流路 A (未进样时的常规分离流路） 的状态， 通过梯度洗 脱使蛋白样品在该色谱柱或色谱饼中分离成具有不同保留时间的各个馏分， 并在 检测器 13中检测。 分离后的样品从排液口 17-1排出系统并收集。 在一个具体实施方案中， 上述步骤 （1 ) 中的梯度洗脱为线性梯度洗脱。
在一个具体实施方案中， 上述步骤 （1 ) 中的梯度洗脱为非线性梯度洗脱。 在一个具体实施方案中， 上述步骤 （1 ) 中的梯度洗脱为非同步进样条件下的 线性梯度洗脱。
根据需要进行分离的混合蛋白的性质， 本领域技术人员可容易地选择合适的 色谱柱类型， 并可容易地选择作为液相色谱分离中的流动相的溶剂。 以本领域的 公知方式， 本领域技术人员可容易地确定由泵 A (3 ) 输送溶剂的流量。
2D-LC分离流程
现以图 2 中的液相色谱分离系统为例， 具体说明通过本发明的液相色谱分离 系统来实施 2D-LC分离的操作流程。 临界迁移时间 fcMP和临界迁移洗脱剂浓度 CCMP的计算
现以图 1为例来说明 fcMP和 CCMP的计算方法。 图 1A显示了联苯 （其为一种 小分子有机物）、 图 1B显示了碳酸酐酶 （一种大分子的蛋白） 和图 1C显示了 15 肽（GEPPPGKPADDAGLV)在非同步进样条件下（即进样时间与梯度洗脱时间不 同， 在图 1 中， 后一次进样时间依次叫前一次进样推迟一分钟） 的梯度洗脱分离 (其中的液相色谱分离方法为常规液相色谱分离）。
图 1E显示了碳酸酐酶的保留时间 R与进样时间 ,·的关系曲线。为了定量计算 fcMP,规定在第/ ¾次进样时的保留时间为 ，第/ 次进样时的保留时间为 从第 1到第 次进样所得的 到 的 n-1个 tR的平均值为 tRa，标准偏差为 ±2σ。 当平均值标准偏差〉 2σ时， 表明蛋白在色谱柱上发生了显著移动。根据以上标准， 可确定蛋白发生显著移动的时刻应当落在 到 tR 1， 即在图 1D中垂直箭头所 指的两次进样之间的区间内。
对图 1D中垂直箭头右方的数据点进行拟合， 用于拟合的函数为：
¾ = a + b ί;· + c ti ' (式 3 )
其中 a、 b、 c为待拟合的常数， 其与蛋白本身的特性相关。拟合后得到式（4): tR = 0.0707 ti - 1.7985 + 32.652 (式 4)
其中 R2= 0.9992。
将 tR = tRa +2σ带入式 7， 此时所得的 ti即是临界迁移时间 fcMP。
随后， 利用式 （5 ) 和式 （6) 分别求出临界迁移洗脱剂浓度 CCMP :
CcMP = fcMPx tg (式 5 )
其中， g为线性梯度陡度，即单位时间内洗脱剂浓度的变化率，其计算方法为：
½ = y% / tT (式 6)
其中， ¥%为线性梯度洗脱中以体积分数表示的洗脱剂浓度变化量， 为 V% 所对应的该线性梯度洗脱的进行时间。 实际上， 二维分离的进样时间较 早 3-5 分钟， 这是因为其对该具体的实施例中的碳酸酐酶而言是合适的。 操作流程
(1)根据上文所述的方法， 确定蛋白样品中每种需要在第二维或更多维分离 中得以保留的蛋白的 CCMP。
(2) 选择合适组成的流动相， 开启泵 A (3)， 设置合适的梯度洗脱条件， 包 括起始浓度， 线性， 还是非线性的梯度洗脱模式， 梯度的时间等。 通过四元梯度 单元 1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送合适的溶剂（例如分别从流动相储 罐 1和流动相储罐 2取出并输送溶剂 1和溶剂 2)， 并且使分离装置处于连通任何 一根色谱柱或色谱饼的状态， 使色谱系统进行必要的平衡，
(3) 第一维分离： 将六通进样阀 4-1设置成 "load"状态 （端口 1与端口 6 连通， 端口 2与端口 3连通， 而端口 4与端口 5连通）， 向六通进样阀 4-1的端口 5送入混合蛋白样品 （例如 ΙΟΟμυ, 并使样品容纳于样品环中。 随后， 将图 1所 示的根据本发明的 2D-LC分离系统设置成形成流路 Β0 (进样时的第一维分离流路) 的状态， 开启泵 A (3)， 通过四元梯度单元 1-2以合适的流量从流动相储罐取出并 输送合适的溶剂， 从而使容纳于样品环中的样品进入根据本发明的 2D-LC分离系 统。 随后将图 2所示的根据本发明的 2D-LC分离系统设置成形成流路 B (非进样 时的第一维分离流路） 的状态， 开启泵 A (3)， 通过四元梯度单元 1-2以合适的流 量从流动相储罐取出并输送作为第一维液相色谱分离的流动相的合适溶剂 （例如 分别从储罐 1和储罐 2取出并输送溶剂 1和溶剂 2)， 并且通过多通阀 6-1和 6-2 使用于第一维色谱分离的色谱柱或色谱饼连通， 通过梯度洗脱使混合蛋白样品在 该色谱柱或色谱饼中分离成具有不同保留时间的各个馏分，并在检测器 13中检测。
(4) 收集和储存中间馏分： 对于需要进行第二维液相色谱分离的馏分， 通过 切换八通阀 11-1和八通阀 11-2使储液管 10-2至集存装置 10-8的任何一个被连通， 从而将该馏分收集并储存于该集存装置中。 对于不需要进行第二维液相色谱分离 的馏分，通过切换八通阀 11-1和八通阀 11-2使集存装置 10-1被连通，从而使该馏 分经过集存装置 10-1流过检测器 13，并从至排液口 17-2图中无标识排出系统。当 所有馏分均已储存于某个集存装置中或被排出系统后， 第一维液相色谱分离完成。
(5)第二维分离： 随后将图 1所示的根据本发明的 2D-LC分离系统设置成形 成流路 C (第二维分离流路） 的状态， 切换八通阀 11-1和八通阀 11-2以使得任何 一个装有经第一维液相色谱分离得到的中间馏分的集存装置被连通， 切换多通阀 6-1和 6-2使用于第二维色谱分离的色谱柱或色谱饼被连通。 开启泵 A (3)， 通过 四元梯度单元 1-2以合适的流量从流动相储罐取出并输送合适的溶剂（例如从储罐 3取出并输送溶剂 3)， 以使该集存装置中的中间级分流入混合器 12中， 同时开启 泵 B (9)， 通过四元梯度单元 1-1以合适的流量从流动相储罐取出并输送作为第二 维液相色谱分离的流动相的合适溶剂 （例如分别从储罐 3和储罐 4取出并输送溶 剂 3和溶剂 4)， 从而使所述中间级分与所述流动相混合得到第二维分离的进样混 合物， 将所述进样混合物进样至第二维分离的色谱柱中， 并且通过对泵 A (3 ) 和 四元梯度单元 1-2以及泵 B (9) 和四元梯度单元 1-1的流量进行调节， 使该进样 混合物中的洗脱剂浓度 C低于该中间馏分中的所有需要在第二维分离中得以保留 的蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而使这些蛋白保留于所述色谱柱或色谱饼中， 完成第二维进样。
随后， 通过梯度洗脱使所述进样混合物在所述色谱柱或色谱饼中分离成不同 的馏分并在检测器 13 中检测。 经过第二维液相色谱分离分离后的样品从排液口 17-2排出系统并收集于级分收集器 15中。
重复此步骤的操作， 使集存装置中所有需要进行第二维液相色谱分离的中间 级分都得以分离。
在一个具体实施方案中， 上述步骤 （4) 中的梯度洗脱为线性梯度洗脱。 在一个具体实施方案中， 上述步骤 （4) 中的梯度洗脱为非线性梯度洗脱。 根据需要进行分离的混合蛋白的性质， 本领域技术人员可容易地选择合适的 色谱柱或色谱饼用于第一维色谱分离和第二维色谱分离， 并可容易地选择作为第 一维色谱分离和第二维色谱分离中的流动相溶剂。 缓冲液交换
在前述二维液相色谱分离流程的步骤 （4) 中的第二维进样之前或进样过程中 完成后， 根据本发明的多维液相色谱分离方法或 2D-LC分离方法还可包括以下步 骤：
① 缓冲液交换： 将第二维分离中所用的流动相作为缓冲液 （例如流动相储罐 3和流动相储罐 4中的溶液 3和溶液 4)， 通过泵 A (3 ) 和 /或泵 B (9) 将该缓冲 液输送至第二维分离的色谱柱或色谱饼中， 其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度高或 低于所述中间馏分中所有需要在下一维分离得以保留的蛋白的临界迁移洗脱剂浓 度， 从而至少部分地置换所述色谱柱中原有的第一位分离的流动相 （如溶剂 1 和 溶剂 2)。
② 如将所收集的经前一维分离后的馏分作为流动相 X (X表明其组成已知， 但对不同蛋白而言， 组成均不相同）， 也将其视为缓冲液， 如上述的相同方式， 进 行缓冲液交换， 则第二次进样便与缓冲溶液交换同时进行。 随后再对所述中间馏 分进行第二维分离。
③ 在二次进样完成后， 将收集液从集存装置中推动出来的流动相如溶液 2又 与溶液 3或 4， 或以适当比例混合， 实现 2D-LC体系的再平衡。
④ 色谱柱须周期性的用强洗脱剂对其进行清洗，可用溶液泵 A或 B从贮液罐 中取出任何一种溶液清洗之。 更多维液相色谱分离系统
虽然前述具体实施方案是针对图 2所示的 2D-LC分离系统及其操作方法进行 说明， 本领域技术人员容易将其扩展至更多维液相色谱分离系统。
本领域技术人员应理解， 与图 2的 2D-LC分离系统相比， 更多维液相色谱分 离系统可包括更多的流动相储罐， 而其输液装置也相应地具有更多的输液通道。
根据本领域的公知常识， 本领域技术人员应当能对图 2的 2D-LC分离系统的 流路切换装置作适当的改变， 使得经过第二维分离后得到的需要进一步分离的馏 分不从系统中流出， 而是作为中间馏分而再次被收集并储存于集存装置中， 并在 后续的更多维分离中通过与前述第二维分离步骤相同的方式将该中间馏分进一步 分离。
以下是通过图 2的二维液相色谱分离系统来分离蛋白样品的实施例。 实施例 1 通过商品柱奥岚 WCX柱对 7种蛋白的 2D-LC (WCXX HIC) 分离 根据前述的二维液相色谱分离系统和二维液相色谱分离方法， 本实施例从含 肌红蛋白（Myo)、核糖核酸酶（RNase)、细胞色素 c (Cyt-c)、 α-糜原蛋白（a-Chy)、 溶菌酶 （Lys)、 碳酸酐酶 （Car) 和 α-淀粉酶 （α-Amy) 从该 7种蛋白的混合物 中完全分离出这。 其中， 第一维分离采用弱阳离子交换 （WCX) 分离模式， 而第 二维分离采用疏水相互作用 （HIC ) 分离模式。 此实施例中使用的色谱柱为商用 Shim-pack PA-CM的 WCX色谱柱， 实为 WCX/HIC混合模式色谱柱 （ 150毫米 X 7.9毫米）， 在 WCX模式的第一维分离和 HIC模式的第二维分离中均使用该色谱 柱。
分离结果如图 3 所示， 图中还给出了盐浓度随时间的变化曲线。 根据前文所 述的 2D-LC分离流程进行分离：
在 WCX模式的第一维分离中， 用泵 1输送用于 WCX模式（图 3的左边（图 3中左方的 3、 4峰）） 的流动相的盐溶液并进行梯度洗脱， 使 Myo、 RNase和 Lys 得到分离 （图 3左方的 1、 2、 5峰）， 而 Car和 α-Amy不保留 （图 3左方的 6、 7 峰）， Cyt-c和 a-Chy也不能完全分开（图 3左方的 3、 4峰）。 因此， 经第一维分离 得到了 Myo、 RNase和 Lys蛋白， 并将含 Car和 α-Amy的中间馏分以及含 Cyt-c 和 a-Chy的中间馏分分别收集在集存装置的储液管 10-2和储液管 10-3中。
第一维分离结束后， 提高盐的浓度， 根据前文所述的方法进行二次进样、 缓 冲液置换、 同时实施了第二维的 HIC分离系统的再平衡 （图 3中盐浓度曲线的平 台区域内）。 其方法是用泵 B (9) 向混合器 12中输送 HIC的 A液， 并通过调节泵 A (3 ) 和泵 B (9) 中液体的流量使得经混合后的浓度落在 Cyt-c和 a-Chy的临界 迁移洗脱剂浓度 CCMP以内 （该 CCMP准确数值已通过， 如图 1所示的常规液相色 谱分析而预先得到）。 在该二次进样、 缓冲液置换和第二维分离系统的再平衡后， 中间馏分 Cyt-c和 a-Chy会全部保留在该同一根色谱柱中。 随后通过梯度洗脱进行 HIC模式下的再下一步色谱维分离， Cyt-c和 oc-Chy被分离开来 （图 3中的 3'和 4' 峰）。
如上述方式将含有含 Car和 α-Amy的中间馏分再次进样次、 缓冲液交换， 第 三次系统 （但为第二次 HIC分离） 再平衡。 其方式为： 用泵 B ( 9) 向混合器 12 中输送 HIC的 A液， 并通过调节泵 A (3 ) 和泵 B (9) 中液体的流量使得经混合 后的洗脱剂浓度落在 Car和 α-Amy的临界迁移洗脱剂浓度 CCMP以内 （该 CCMP已 通过常规液相色谱分析而预先得到）。该上述的三个过程完成后，中间馏分中的 Car 和 α-Amy全部保留在色谱柱中。 随后通过梯度洗脱进行 HIC模式下的色谱分离， Car和 a- Amy被分离开来 （图 3中的 6'和 7'峰）。
如上所述， 利用根据本发明的液相色谱分离系统， 在 80分钟内完成了前述 7 种蛋白的完全分离。
此实施例中的色谱柱、 流动相以及色谱条件如下：
色谱柱： [西安奥岚科技开发公司生产的 WCX柱， 100 mm x 4.6 mm);
HIC流动相： A液 20 mmol/L KH2P04 + 3.0 mol/L (NH4)2S04 (pH = 6.5)； B液： 20 mmol/L KH2P04 (pH = 6.5)；
WCX流动相： A液 10 mmol/L KH2P04 (pH: 6.5)； B液： 10 mmol/L KH2P04 + 1 mol/L NaCl (pH = 6.5);
色谱条件：
0- 15分钟： 100% A-80% A(20% B)， 2.0 mL/min;
15-20分钟： 80% A (20% B)-50% A(50% B);
20-25分钟： 50% A(50% B)；
25-28分钟： 100% C， 4.0 mL /min;
28-33分钟： 100% C， 1.0 mL /min +混合泵： 100% C, 3.0 mL /min;
33-53分钟： 100% C-100% D， 2.0 mL /min;
53-56分钟： 100% C， 4.0 mL /min;
56-61分钟： 100% C， 1.0 mL /min +混合泵： 100% C， 3.0 mL /min;
61-81分钟： 100% C-100% D， 2.0 mL/min;
81分钟至结束： 100% D o
实施例 2 通 过 商 品 Shim-pack PA-CM 的 WCX 柱 禾 B 商 品
TSKgelG4000SWXLSEC柱共两色谱柱实施三维（多维） 3D-LC (WCX X HIC X SEC)对 α-糜原蛋白 (α-Chy)和胰蛋白酶（Try)同时进行纯化并除盐。 G4000SWXL 根据前述的 2D-LC分离系统和 2D-LC分离方法，本实施例从按常规方法制备 且除油后的牛胰腺提取液中同时提纯 α-Chy和 Try, 然后再对分离所得到的蛋白分 别除盐。 其中， 第一维分离采用 WCX模式， 第二维分离采用 HIC模式。 因二维 流出液体积较大且流出液中目标蛋白的浓度随时间在不断地变化， 加之并不能一 次性完全进样到 SEC柱上， 必须收集在椭圆形的储液管中， 并伴随着用振荡器的 搅拌使其混合均匀后， 分次进样到第三维采用 SEC模式除盐。 分离结果如图 4所 示， 图中还给出了盐浓度随时间的变化曲线。 根据前文所述的 2D-LC分离流程进 行分离：
在 WCX模式的第一维分离中， 用泵 A ( 3 ) 输送用于 WCX模式的流动相的 盐溶液并进行梯度洗脱， 使 α-Chy和 Try蛋白初步分离 （图 4中的 1、 2峰）， 然 而经初步分离后的纯度尚不能达到要求。 因此， 将初步分离后的含 α-Chy和 Try 蛋白的中间馏分别收集在储液装置的储液管 10-2和储液管 10-3中。
第一维分离结束后， 根据前文所述的方法将含 Try(l)和 a-Chy(2)蛋白的中间馏 分[ (在图 4中色谱峰 Try(l)和 α-Chy (2) ) 分别收集在两个集存装置内。 根据前文 所述的方法进行二次进样 a-Chy(2)、 缓冲液置换、 同时实施了第二维的 HIC分离 系统的再平衡（图 4中间所示的盐浓度曲线的平台区域部分）。其方法是用泵 B ( 9 ) 向混合器 12中输送用于 HIC分离模式的 A液， 并通过调节泵 A ( 3 ) 和泵 B ( 9 ) 中液体的流量使得经混合后的浓度落在 a-Chy 的临界迁移洗脱剂浓度 CCMP以内 (该 CCMP准确数值已通过， 如图 1所示的常规液相色谱分析而预先得到）。 在该 二次进样、缓冲液置换和第二维分离系统的再平衡后， 中间馏分 a-Chy会全部保留 在该同一根色谱柱中。 随后通过梯度洗脱进行 HIC分离模式下的再下一步色谱维 分离后以得到纯化后的 a-Chy ( 2' )。
根据前文所述的方法进行二次进样 Try(l)、缓冲液置换、 同时实施了下一维的 第二次 HIC分离系统的再平衡（图 4右方所示的盐浓度曲线的平台区域那）。其方 法是用泵 B ( 9 ) 向混合器 12中输送用于 HIC分离模式的 A液， 并通过调节泵 A ( 3 )和泵 B ( 9 ) 中液体的流量使得经混合后的浓度落在 Try(l)的临界迁移洗脱剂 浓度 CCMP以内 （该 CCMP准确数值已通过， 如图 1所示的常规液相色谱分析而预 先得到）。在该二次进样、缓冲液置换和第二维分离系统的再平衡后，中间馏分 Try(l) 会全部保留在该同一根色谱柱中。 随后通过梯度洗脱进行 HIC模式下的再下一步 色谱维分离后以得到纯化后的 Try(l ')。
将经二维色谱纯化后的 a-Chy和 Try分别收集在的一个， 椭圆形集、 储液管 中， 振荡 5min使所收集的样品混匀后分别进样到商品 TSKgelG4000SWxl SEC柱 中除盐。
如上所述， 利用根据本发明的液相色谱分离系统， 在 70分钟内完成了 ct-Chy 和 Try蛋白的分离提纯， 其纯度分别达 82%和 95%， 总质量回收率分别为 85.0% 和 83.5%， 活性回收率分别为 59.4%和 76.5%， 因在线收集、 储存， 和再进样机除 盐， 与通常的离线除盐后的质量和活性回收率 50〜70%比较， 除盐后该二蛋白的质 量和活性回收率大大地提高到 80〜90%。
分离中采用非线性梯度洗脱模式， 其中所用的色谱柱、 流动相以及色谱条件 如下： WCX色谱柱： 商品 Shim-pack PA-CM(100 mmx7.5 mm I.D)。
WCX用流动相： A液为 0.02 M的三羟甲基氨基甲烷 （Tris-HCl， pH 6.5 ); B 液为 0.02 M的 Tris-HCl + 1.0 M的氯化钠 （pH 6.5)；
HIC用流动相： C液由 3.0 M的硫酸铵 + 0.05 M的磷酸二氢钾（PBS， pH 7.0) 组成； D液为 0.02 M的 PBS (pH 7.0)。
SEC色谱柱： TSK-GEL G4000SWXL ( 300x7.8mm, I.D. 流动相： 0.02 mol/L NaCl溶液'。 流速： 1.0mL/min， 梯度洗脱条件：
0-20分钟： 100% A-50% A (50% B)， 1.0 mL /min;
20-25分钟： 50% C(50% D)， 3.0 mL /min;
25-30分钟： 50% C(50% D)， 1.0 mL /min +100% C， 1.0 mL /min;
30-40分钟： 50% C(50% D)-100% D， 1.0 mL /min;
40-45分钟： 50% C(50% D)， 3.0 mL /min;
45-50分钟： 50% C(50% D)， 1.0 mL /min + 100% C， 1.0 mL /min;
50-60分钟： 50% C(50% D) - 100% D， 1.0 mL /min;
60-65分钟: 100% D结束。
进样量： α-Chy 10 μ∑, Trypsin 20 μΐ, Trypsin和 α-Chy的蛋白浓度均为 10
实施例 3， 在线单柱二维液相色谱柱 （2D (WCX, HIC ) 快速纯化牛胰腺中 的细胞色素 c
首先从牛胰腺中粗提取细胞色素 c:将新鲜的牛胰脏去除油脂和结缔组织并洗 净后迅速放入 -20° C的冰箱中保存的；取冷冻牛胰腺切片后，用绞肉机绞成肉粉末， 然后加入 2倍体积经硫酸酸化 （pH = 4) 水在搅拌条件下提取， 每隔 3小时再用 lmo/L H2S04调节 pH—次， 使 pH稳定至 3.5-4.0之间， 在低温下 （4° C ) 搅拌提 取 12小时以上； 用 1.0 mol/L的 NH4OH调 pH至 6.5， 用四层纱布压挤过滤， 收集 滤液， 在 4° C下静置； 最后在 10,000 rpm转速下离心 20min， 收集上清液即为细 胞色素 c的粗提液。 所有操作应在 4° C进行， 滤液仍在 -20° C条件下保存备用。
此实施例所用的色谱方法为： 如图 5 所示， 在第一维色谱分离中， 在流动相 流速为 1.0 mL/min和 0至 1.0mol/L的 NaCl的线性梯度洗脱的洗脱条件下， 在 5.5-10.5min区间内， 在线收集含 Cyt c 的一维样品到定量环中保存。 接着利用 2.5 mL/min大流速， 使用 3.0 mol/L的硫酸铵快速平衡色谱系统 10 min， 然后以实施 例 3中所示的一维和二维的色谱分离方法的操作相同， 以流速为 1.0 mL/min, 将 一维收集液从集、 储环中排出， 并同时与从 B泵输送的， 在流速为 2.0 mL/min的 条件下送出 3.0 mol/L溶液在色谱仪的混合器中混合， 如此可将原来第一维收集液 中盐浓度从极低提高到 2.0 mol/L， 足以能在该相同 2D (WCX, HIC)柱中在 HIC 分离模式下具有足够强的保留能力， 该过程能在 7.0 min内完成。 最后将保留的蛋 白用 3.0 mol/L硫酸铵到进行线性梯度洗脱 10min， 并收集在 43.5-46.5 min时间范 围内的馏分。
此实施例中所用的色谱柱、 流动相以及色谱条件如下：
西安奥岚 -2D (WCX, HIC)色谱柱（硅胶基质， 颗粒直径， 5 μηι， 孔径 30 nm; 50 mmX 4.6 mm I.D) 。
IEC模式：溶液 1， 20 mmol/L KH2P04(pH = 6.5 )；溶液 2， 20 mmol/L KH2P04+1 mol/L NaCl (pH = 6.5 ) ；
HIC模式： 溶液 3， 20 mmol/L KH2PO4 +3.0 mol/L (NH4)2S04 (pH = 6.5 ) ； 溶 液 4， 20 mmol/L KH2P04 (pH = 6.5 ) 。
非线性梯度洗脱模式 （图 5中的虚线所示） ：
0-20分钟: 100%溶液 1， 0-100%； 溶液 2， 流速为 1.0 mL/min;
20-30分钟： 100%溶液 3， 流速为 2.5 mL/min;
30-37分钟： A泵 100%， 溶液 3， 1.0 mL/min + B泵 100%溶液 3， 2.0 mL/min;
37-47分钟： 100%溶液 3-100%溶液 4， 流速为 1.0 mL/min;
47-52分钟： 100% D。
将分别经 WCX和 HIC的一维，二维分离和收集的从牛胰腺的提取液中的 Cyt c样品， 在经处理后， 经过纯度扫描后各个电泳带中目标蛋白 Cyt c的纯度见表 1。
表 1 牛胰腺中 Cyt c分离纯化电泳薄层扫描数据
Figure imgf000036_0001
为将 IEC X HIC 二维液相色谱分离结果的检验还用反相液相色谱对 IEC- HIC二维液相色谱收集的 Cyt c的纯度进行了测定， 并对其纯度进行 RPLC色谱分 析， 经计算其纯度达到 97%以上。

Claims

权利要求书：
1、 一种用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 该多维液相色谱分离系统包 括检测装置， 其特征在于， 所述多维液相色谱分离系统包括流动相储罐、 第一输 液装置和第二输液装置、 第一进样装置和第二进样装置、 分离装置、 包括至少一 个集存器的集存装置、 至少两个排液装置以及流路切换装置， 其中：
1 ) 所述流动相储罐储存用于多维液相色谱分离的流动相；
2 )所述第一输液装置和第二输液装置彼此独立地从所述流动相储罐取出适用 于液相色谱分离的流动相并将该流动相输送至所述多维液相色谱分离系统的流路 中， 并且可彼此独立地调节和计量流量； 在第一维分离时， 所述第一输液装置将 适用于该第一维分离的流动相输送至第一进样装置； 在第二维或更多维分离时， 所述第一输液装置将适用于该第二维或更多维分离的流动相输送至所述集存装 置， 并推动储存于所述至少一个集存器中的中间馏分至所述第二进样装置， 与此 同时所述第二输液装置从所述流动相储罐取出适用于该第二维或更多维分离的流 动相输送至所述第二进样装置；
3 )所述第一进样装置从系统外引入原样并使其随来自第一输液装置的流动相 同时进入所述分离装置； 第二进样装置包括进样混合器， 该进样混合器使来自所 述集存装置中的至少一个集存器的中间馏分和流动相与来自所述第二输液装置的 流动相混合从而得到进样混合液， 并将该进样混合液送入所述下一维分离装置； 4 )所述分离装置包括色谱柱切换单元和 n根色谱柱， 或者包括具有分离模式 总数为 m的色谱柱，并通过所述色谱柱使进入分离装置的液体分离成不同的馏分， 其中所述色谱柱切换阀使进入所述分离装置的液体选择性地流入所述 n根色谱柱 中的一根色谱柱， n为非负整数， m为所述多维液相色谱分离系统中所用的不同分 离模式的个数， 并且 n与 m之间满足下式：
n (1)
m = n + qi (2)
其中， i为正整数， ¾为具有 i种分离模式的色谱柱个数；
5 ) 所述集存装置包括 p个集存器切换单元， 其中 p大于或等于 1， 所述集存 器切换单元使进入所述集存装置的液体选择性地流入所述集存装置中的至少一 个， 该集存器将经每一维分离后得到的不同馏分中需要进行进一步分离的中间馏 分收集并储存于至少一个集存装置中；
6) 所述至少两个排液装置将流路中的液体排出至系统外；
7) 所述流路切换装置， 其由与上述装置相连通的阀门和管路所组成， 通过对 所述流路切换装置中的阀门进行切换， 所述流路切换装置除了形成常规液相色谱 分离中的流路外， 还形成用于进行多维液相色谱分离的流路；
该多维液相色谱分离系统的特征还在于， 所述第一输液装置和第二输液装置 对其输送的用于第二维或更多维分离的流动相的量进行调节和计量， 从而对用于 第二维或更多维分离的所述进样混合液中的洗脱剂浓度进行调节， 在进样时， 所 述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中的所有需要 在该第二维或更多维分离中得以保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。
2、 根据权利要求 1所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 所述下一维分离装置为具有混合分离模式的分离装置， 或者为具有与上一维 分离模式不同的单一模式的分离装置。
3、 根据权利要求 2所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 所述具有混合分离模式的分离装置为具有二维分离模式的分离装置。
4、 根据权利要求 1所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 在周期性清洗色谱系统时， 将强洗脱液接入任何一个管路和装置中。
5、 根据权利要求 1所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 所述第一输液装置和所述第二输液装置分别由多元梯度单元和泵组成， 所述 多元梯度单元具有多个输液通道并且可输送和计量各通道的流量。
6、 根据权利要求 1所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 所述第一输液装置和所述第二输液装置分别为具有多个输液通道并且可输送 和计量各通道流量的第一泵和第二泵， 每个泵均能独立地输送的四种流动相。
7、 根据权利要求 6所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 对于分析型多维液相色谱分离系统， 所述泵为将液体加压至 40兆帕以上的高 压泵； 对于制备型和生产型多维液相色谱分离系统， 所述泵为将液体加压至 20兆 帕以上的高压泵。
8、 根据权利要求 7所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 所述多维液相色谱系统为整体式， 即所有硬件组装在一个壳体内， 并且其操 作由一个控制系统进行控制； 或者所述多维液相色谱系统为分体式， 即各个硬件 和自控系统安装于两个或两个以上的壳体内， 并且使用现有色谱仪的自控系统和 其他操作的自控系统。
9、 根据权利要求 6所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征在 于， 对于分析型多维液相色谱分离系统， 所述高压泵的流量范围优选地为 0.001至 10毫升 /分钟； 对于制备型多维液相色谱分离系统， 所述高压泵的流量范围优选地 为 0.01至 100毫升 /分钟； 对于生产型多维液相色谱分离系统， 所述高压泵的流量 范围优选地为 0.1至 10升 /分钟。
10、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述第一输液装置和 /或第二输液装置还包括脱气单元， 所述脱气单元除去 所述流动相液体中的气体。
11、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 在所述流动相储罐和所述输液装置之间设有储罐阀门， 所述储罐阀门用于 控制所述流动相储罐是否与所述输液装置连通。
12、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述第一输液装置和第二输液装置能够输送的流动相流量之和高于通过梯 度洗脱进行液相色谱分离时通常的单个输液装置输送的流动相流量。
13、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述第二进样装置中的进样混合器为混合罐或管道混合器。
14、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 连通所述第二进样装置与所述第二输液装置的管路上设有阀门， 所述阀门 用于控制所述第二进样装置与所述第二输液装置是否连通。
15、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述色谱柱中的一根或多根色谱柱或色谱饼。
16、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述色谱柱切换单元包括至少一个多通阀， 所述多通阀具有一个作为所述 分离装置入口的阀门入口和 n - ¾个与所述 n - ¾个色谱柱一一对应地连通的阀门 出口， 所述多通阀通过对 n - ¾个阀门出口进行切换而使进入所述分离装置的液体 选择性地流入所述色谱柱中的一根色谱柱。
17、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述多维液相色谱分离系统包括除盐装置， 该除盐装置用于从液体中除去 至少部分的盐。
18、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述检测装置从进入所述检测装置的流体中全部， 或分出 1/10至 1/1000用 于检 $
19、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述集存装置的集存器可为储液管、 储液罐、 储液槽或者相互串联的储液 管和 /或储液罐和 /或储液槽。
20、 根据权利要求 1或 19所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其 特征在于， 所述集存器的数量， 也等于中间馏分切换单元个数 p， 也等于能够收集 的最大中间馏分数， 并满足下式：
P^max (xj) (3)
式 (3)中的 Xj为第 j维分离时进行收集和储存以进一步分离的中间馏分数。
21、 根据权利要求 1或 19所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其 特征在于， 所述集存器的容积全部或部分地彼此不同。
22、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述集存装置的集存器切换单元包括第三多通阀和第四多通阀。
23、 根据权利要求 22所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述第三多通阀和第四多通阀均允许液体逆向地流过阀体。
24、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述液相色谱分离系统包括第一排液装置和第二排液装置， 其中所述第一 排液装置可将进原样时的废液， 或来自所述储液装置的液体排出至系统外； 所述 第二排液装置可将来自所述检测装置的液体排出至系统外。
25、 根据权利要求 24所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述液相色谱分离系统进一步包括第三排液装置， 所述第三排液装置为直 径大于检测池直径的支管， 与所述检测装置并联设置， 并从分离装置接收流动相。
26、 根据权利要求 25所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述支管的直径远大于检测池直径， 从而使得 90%以上的流动相能够从所 述第三排液装置排出。
27、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述流路切换装置以选择性地构成以下流路中任何一种的方式来切换流路: 常规分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述第一 进样装置、 所述分离装置、 所述检测装置和所述第一和二排液装置；
第一维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述分 离装置、 所述检测装置、 所述集存装置和所述第二排液装置；
收集中间馏分的第二维或更高维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所 述第一输液装置、 所述集存装置、 所述第二进样装置、 所述分离装置、 所述集存 装置、 所述集存装置以及所述第二排液装置， 并且依次连通所述流动相储罐、 所 述第二输液装置和所述第二进样装置；
不收集中间馏分的第二维或更高维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述集存装置、 所述第二进样装置、 所述分离装置、 所述检 测装置和所述第二排液装置， 并且依次连通所述流动相储罐、 所述第二输液装置 与所述第二进样装置。
28、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于其包括恒温装置， 所述恒温装置至少使所述集存装置保持在能够延长蛋白的 失活时间的恒温温度下。
29、 根据权利要求 23所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述恒温温度为 4°C。
30、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于其包括灭菌装置， 所述灭菌装置至少使存在于所述集存装置中的细菌被至少 部分地杀灭。
31、 根据权利要求 30所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述灭菌装置包括蒸汽发生装置和蒸汽注入装置， 所述蒸汽发生装置能够 产生温度为 140°C 以上的蒸汽， 所述蒸汽注入装置将所述蒸汽注入多维液相色谱 分离系统的集存装置。
32、 根据权利要求 30所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述灭菌装置包括电加热装置， 所述电加热装置通过电力直接进行加热， 或者通过电加热所产生的热风来进行加热。
33、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于其包括自动化控制装置， 该自动化控制装置除了完成本领域技术人员公知的 常规液相色谱自动化操作以外， 还对所述分离装置、 集存装置以及流路切换装置 中的阀门进行自动切换， 二者可合而为一作为一个自控系统， 也可分开为两个独 立的自控系统。
34、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于其包括常规液体混合装置， 所述常规液体混合装置使所述第一输送装置和 /或 第二输送装置的流出液中的各种流动相液体相互充分混合。
35、 根据权利要求 1 所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统， 其特征 在于其包括一个或多个壳体， 该一个或多个壳体容纳所述多维液相色谱分离系统 的部分或全部组件。
36、 一种用于蛋白分离的二维液相色谱分离系统， 该二维液相色谱分离系统 包括检测装置， 其特征在于， 所述二维液相色谱分离系统包括流动相储罐、 第一 输液装置和第二输液装置、 第一进样装置和第二进样装置、 分离装置、 包括至少 一个集存器的集存装置、 至少一个排液装置以及流路切换装置， 其中：
1 ) 所述流动相储罐储存用于二维液相色谱分离的流动相；
2)所述第一输液装置和第二输液装置彼此独立地从所述流动相储罐取出适用 于液相色谱分离的流动相并将该流动相输送至所述二维液相色谱分离系统的流路 中， 并且可彼此独立地调节和计量流量； 在第一维分离时， 所述第一输液装置将 适用于该第一维分离的流动相输送至第一进样装置； 在第二维分离时， 所述第一 输液装置将适用于该第二维分离的流动相输送至所述集存装置， 并使储存于所述 至少一个集存器中的全部中间馏分随着该流动相一同被输送至所述第二进样装 置， 所述第二输液装置从所述流动相储罐取出适用于该第二维分离的流动相并将 该流动相输送至所述第二进样装置；
3 )所述第一进样装置从系统外引入包含待分离蛋白的待分离样品并使其随来 自第一输液装置的流动相一同进入所述分离装置； 第二进样装置包括进样混合器， 该进样混合器使来自所述集存装置的至少一个集存器的中间馏分和流动相与来自 所述第二输液装置的流动相混合从而得到进样混合液， 并将该进样混合液送入所 述分离装置；
4)所述分离装置包括色谱柱切换单元和 n根色谱柱， 或者包括具有 m种以上 的分离功能的色谱柱， 并通过所述色谱柱使进入分离装置的液体分离成不同的馏 分， 其中所述色谱柱切换单元使进入所述分离装置的液体选择性地流入所述 n根 色谱柱中的一根色谱柱， n为非负整数， m为所述二维液相色谱分离系统中所用的 不同分离模式的数量， 并且 n与 m之间满足下式：
m ^ 2 (4)
5 ) 所述集存装置包括 p个集存器和集存器切换单元， 其中 p大于或等于 2， 所述集存器切换单元使进入所述集存装置的液体选择性地流入所述集存装置中的 至少一个集存器， 该集存装置将经每一维分离后得到的不同馏分中需要进行进一 步分离的中间馏分收集并储存于至少一个集存器中；
6) 所述至少两个排液装置将流路中的液体排出至系统外；
7) 所述流路切换装置， 其由与上述装置相连通的阀门和管路所组成， 通过对 所述流路切换装置中的阀门进行切换， 所述流路切换装置除了形成常规液相色谱 分离中的流路外， 还形成用于进行二维液相色谱分离的流路；
该二维液相色谱分离系统的特征还在于， 所述第一输液装置和第二输液装置 对其输送的用于第二维分离的流动相的量进行调节和计量， 从而使得用于第二维 分离的所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该进样混合液所包含的中间馏分中的 所有在该第二维分离中得以保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。
37、 根据权利要求 36所述的用于蛋白分离的二维液相色谱分离系统， 其特征 在于， 所述流路切换装置以选择性地构成以下流路中任何一种的方式来切换流路: 常规分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述第一 进样装置、 所述分离装置、 所述检测装置和所述第一排液装置；
第一维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述分 离装置、 所述检测装置、 所述集存装置和所述第二排液装置；
第二维分离流路， 其依次连通所述流动相储罐、 所述第一输液装置、 所述集 存装置、 所述第二进样装置、 所述分离装置、 所述检测装置和所述第一排液装置， 并且依次连通所述流动相储罐、 第二输液装置与所述第二进样装置。
38、 一种用于蛋白分离的多维液相色谱分离方法， 该多维液相色谱分离方法 包括以下步骤：
1 )预先准备： 确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维或更多维分离中得 以保留的目标蛋白在该第二维或更多维分离条件下的临界迁移洗脱剂浓度；
2) 第一维分离： 通过梯度洗脱对蛋白样品进行常规液相色谱分离， 从而得到 不同的馏分；
3 ) 收集和储存中间馏分： 收集并储存经上一维分离得到的馏分中需要进行进 一步分离的中间馏分；
4)第二维或更多维分离： 将一种需要进行下一维分离的全部或部分的中间馏 分与用于下一维分离的流动相混合从而得到下一维分离的进样混合物， 将所述进 样混合物进样至下一维分离的色谱柱中； 随后， 通过梯度洗脱， 将保留在所述步 骤 4)的下一维分离的色谱柱中的所述进样混合物进行第二维或更多维的液相色谱 分离， 从而再次得到不同的馏分； 对所有的由上一维分离得到且需要进行此维分 离的中间馏分进行上述分离；
5 ) 重复上述步骤 3 ) 和 4)， 从而得到所有的目标蛋白产物；
该多维液相色谱分离方法的特征在于， 在所述步骤 4) 中， 对用于所述下一维 分离的流动相的量进行调节和计量， 从而使得所述进样混合液中的洗脱剂浓度低 于该进样混合液所包含的目标蛋白的全部， 或部分中间馏分中的所有需要在该第 二维或更多维分离中得以保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。
39、 根据权利要求 38所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离方法， 其特征 在于， 在所述步骤 4) 中， 通过高流速的流动相而使所述中间馏分进样至所述色谱 柱中。
40、 根据权利要求 38所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离方法， 其特征 在于， 在所述步骤 4) 的进样之前或进样完成后， 所述方法还可包括以下的缓冲液 交换步骤：
将下一维分离中所用的流动相作为缓冲液， 并使所述缓冲液流过所述下一维 分离的色谱柱， 其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述目标蛋白的中间馏分中 所有需要在下一维分离得以保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而至少部 分地置换所述色谱柱中原有的流动相。
41、 根据权利要求 38或 39所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离方法， 其特征在于， 在所述步骤 4) 中， 将所述目标蛋白的中间馏分的进样至所述色谱柱 的时间少于该中间馏分的分离时间的一半。
42、 根据权利要求 38所述的用于蛋白分离的多维液相色谱分离方法， 其特征 在于， 所述缓冲液的流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时所通常采用的流 动相流速。
43、 一种用于蛋白分离的二维液相色谱分离方法， 该二维液相色谱分离方法 包括以下步骤：
1 )预先准备： 确定待分离的蛋白样品中所有需要在第二维分离中得以保留的 蛋白在该第二维分离条件下的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度；
2)第一维分离： 对蛋白样品进行第一维液相色谱分离， 从而得到不同的馏分; 3 ) 收集和储存中间馏分： 收集并储存经第一维分离得到的馏分中需要进行第 二维分离的中间馏分；
4) 第二维分离： 将所述全部， 或部分中间馏分与用于第二维分离的流动相混 合从而得到进样混合物， 将所述进样混合物进样至第二维分离的色谱柱中； 随后 将所述进样混合物进行第二维液相色谱分离， 从而得到目标蛋白产物； 对所有的 由第一维分离得到且需要进行第二维分离的中间馏分进行此步骤的分离；
该二维液相色谱分离方法的特征在于， 在所述步骤 4) 中， 对用于第二维分离 的流动相的量进行调节和计量， 从而使得所述进样混合液中的洗脱剂浓度低于该 进样混合液所包含的目标蛋白的中间馏分中的所有需要在该第二维分离中得以保 留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度。
44、 根据权利要求 43所述的用于蛋白分离的二维液相色谱分离方法， 其特征 在于， 在所述步骤 4) 的进样之前或进样完成后， 所述方法还可包括以下的缓冲液 交换步骤：
将下一维分离中所用的流动相作为缓冲液， 并使所述缓冲液流过所述下一维 分离的色谱柱， 其中所述缓冲液中的洗脱剂浓度低于所述目标蛋白的中间馏分中 所有需要在下一维分离得以保留的目标蛋白的临界迁移洗脱剂浓度， 从而至少部 分地置换所述色谱柱中原有的流动相。
45、 根据权利要求 43所述的用于蛋白分离的二维液相色谱分离方法， 其特征 在于， 所述缓冲液的流速高于通过梯度洗脱进行液相色谱分离时所通常采用的流 动相流速。
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