JP2018508793A - クロマトグラフィー適用におけるスウェプトボリュームおよびデッドボリュームを最小限にするための手段および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、フローセレクター、例えばロータリー弁と組み合わせられたクロマトグラフィーカラムを含む、バンドの広がりおよび分離された画分の再混合を防ぐためのデバイス、ならびに関連する方法に関し、ここで、前記のフローセレクターは、前記のカラムの遠位端に、ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が１０μＬ未満であるように接続されている。好ましくは、カラムは、ロータリー弁の入口中に直接差し込まれており、試料は、出口において分画される。【選択図】図２

Description

本発明は、（ａ）クロマトグラフィーカラム；および（ｂ）フローセレクターを含む、またはそれからなるデバイスに関し、ここで、前記のフローセレクターは、前記のカラムの遠位端に、ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が１０μＬ未満であるように接続されている。

本明細書において、特許出願および製造業者の説明書を含むいくつかの文献が、引用されている。これらの文献の開示は、本発明の特許性に関連するとは考えられないが、参照により本明細書にそのまま援用される。より具体的には、全ての参照される文献は、それぞれの個々の文献が具体的かつ個々に参照により援用されると示された場合と同程度まで、参照により援用される。

分画技術は、多くの科学研究および生産プロセス、例えば化学または生物学において見られる科学研究および生産プロセスにおいて用いられている。分画の目的は、対象の試料の複雑性を低減すること、または精製し、非特異的化合物を枯渇させることである。ほとんどの分画技術は、所望の化合物を試料の他の含有物から区別する化学的および／または物理的特性に基づく。特に、クロマトグラフィーシステム、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、直接的な分析のための、またはさらなる処理のための試料の分画および試料の収集のために用いられている。クロマトグラフィー分画の分画効率は、主にクロマトグラフィーマトリックスの化学的性質に依存する(Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography (2004))。しかし、特にポストカラムスウェプトボリュームおよびデッドボリュームが、乱流および分離された化合物の逆混合に寄与し、それにより分画性能を低下させる可能性がある。

特に、高速ＬＣシステムが、優秀な分画効率のために適用されており、スウェプトボリュームおよびデッドボリュームは、適用に対して有害であり得る。典型的には、増大した流速、ゼロデッドボリューム接続、および細く短い管類が、逆混合の機会および期間を減少させるために用いられる。しかし、適用によっては、長い管類が、時には避けられないこともあると考えられ、より小さい内径は、高い背圧をもたらし得る。例えば、ＬＣ分画システムと共に用いられる現状技術のフラクションコレクターシステムは、画分が収集されるバイアルに達するための長い管類を有する必要がある。これらのフラクションコレクターは、典型的には管類を試料が収集されるチューブの上または内側に配置するＸ−／Ｙ−ロボットアームまたは収集板からなる（図１）。空間および管類の長さの制限は、従来の分画収集システムに内在する問題である。

分画の特定の分野は、試料を分画するために様々な直交する化学を用いることにより優秀な分画を達成する多次元分画である。これらの方法は、高度に類似した化合物を含む非常に複雑な試料が分画されるべきである場合に、特に興味深い。その次元は、一般には画分を異なる物理化学的特性により分離するように選択される。例えば、第１次元としてのイオン交換クロマトグラフィーおよび第２次元としての逆相クロマトグラフィーが、化合物をまずそれらの電荷に従って、そしてその後それらの疎水性により分離するために、続いて実施される。これらの方法は、完全に自動化されることができ、多くのＬＣ製造業者により実施されている（例えば、Dionex Technical Note 85を参照；http://www.dionex.com/en-us/webdocs/77308-TN85-HPLC-ESI-MS-2D-Peptides-14Jul2009-LPN2256-01.pdfにおいても入手可能）。たとえ多くのクロマトグラフィー相が組み合わせられることができるとしても、最終的な効率は、より効率の悪い分画技術により強く影響を受ける。さらに、完全に直交性であることができる相はなく、従って、第１次元は、第２次元の分画効率に影響を及ぼす。限られた直交性の第１次元の多数の画分を混合して第２次元へのより少ない作用を達成するための連結スキームの開発は、直交性作用を低減するための比較的新しい概念である(Dwivedi et al., Anal. Chem., 80(18): 7036-42 (2008))。この方法は、類似のクロマトグラフィー相が用いられ、化合物の特性がそれらのｐＨまたは異なるクロマトグラフィー条件を用いた親和性に従って変化する場合に、特に有用である。連結スキームにおいて、多くの画分が、第１次元において生成される。次いで、その画分は、定められた互いに対する距離において混合される。例えば、６０の画分が、画分１、１１、２１、３１、４１、５１がプールされ、画分２、１２、２２、３２、４２、５２がプールされて（以下同様）最終的に１０の画分を得るように混合される。この方法は、画分１〜１０に及ぶために十分な直交性のみを必要とするが、逆混合を避けるために第１画分において非常に高い分画効率も必要とする。

国際公開第２００５／１１４１６８号は、試料分析のためのデバイスを記載している。デバイスは微少流体デバイスであるため、デバイスに含まれるカラムの後に継手は必要とされない。この文献は、画分の収集に関しては言及していない。

本発明の基礎となる技術的問題は、分析物のクロマトグラフィー分離のための向上した手段および方法の提供である。この問題は、特許請求の範囲の主題により解決される。

国際公開第２００５／１１４１６８号

Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography (2004) Dionex Technical Note 85 Dwivedi et al., Anal. Chem., 80(18): 7036-42 (2008)

従って、本発明は、（ａ）クロマトグラフィーカラム；および（ｂ）フローセレクターを含む、またはそれからなるデバイスに関し、ここで、前記のフローセレクターは、前記のカラムの遠位端に、ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が１０μＬ未満であるように接続されている。

当該技術で確立された画分収集システムの例。 流れの分割のためのローター弁。Ａ）模式的な２チャンネルローター弁の例。位置が９０°回転した場合、インライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）および現在遮断されているラインが連結される。Ｂ）多チャンネルローター弁の２つの例。ここで、インラインは、中心の口に連結されており、低体積チャンネルが出口チャンネルの放射状の口に連結されている（左：３チャンネル弁の例、右：９チャンネル弁の例）。 本セレクター分画システムを現状技術の分画の結果に対して比較する予備的な結果。Ａ）ナノフローで分画された１５μｇの出発物質を用いた本明細書において記載されたシステムの分画効率。最初の結果は、１７時間未満の測定時間における７，７９３のタンパク質同定のプロテオミクス深度を実証している。Ｂ）最近公開された方法論の論文において普通のオートサンプラーおよびミリリットル流を用いて達成された分画効率。このアプローチでは、２．５ｍｇより多くのペプチドが分画された。その論文は、６０時間の総測定時間で分析された７，８９７のタンパク質同定のプロテオミクス深度を報告している(Mertins et al., Nat Methods, 10(7): 634-7 (2013))。

第１側面に従うデバイスは、２つの構成要素、すなわちクロマトグラフィーカラム（満たされていることも空であることもできる）およびフローセレクターを含むか、またはそれからなる。フローセレクター自体は、当該技術で確立されたデバイスであり、それは、流体の入ってくる流れのいくつかの可能な出口（本明細書において“チャンネル（ｃｈａｎｎｅｌｓ）”とも呼ばれる）の内の１つへの方向付けを提供する。その好ましい実装は、下記でさらに詳述されるようなローター弁である。本発明に従う流体は、液体（好ましい）またはガスであることができる。

用語“上端”および“下端”は、カラム内の流れの方向が重力の方向と一致するように設計されているカラムを指す。より一般的に言えば、そして特に圧力下で操作されるカラムに関して、カラムは、近位および遠位端を有し、ここで、用語“近位端”および“上端”は、本明細書で用いられる際、試料がロードされる末端を示し、用語“遠位端”および“下端”は、分析物が互いに分離された、または部分的に分離された後にカラムを去る末端を示す。

重要なことだが、前記のクロマトグラフィーカラムおよび前記のフローセレクターの間の接続は、第１側面の必要条件が満たされることができるように本質的に直接的である。そのような実質的に直接的な接続の実施は、下記でさらに詳述される。本明細書において与えられる手引きを提供されれば、当業者は、第１側面の必要条件を苦もなく満たすことができる。一般的な法則として、前記のクロマトグラフィーカラムおよび前記のフローセレクターの間の接続がより短いほど、ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームはより小さいであろう。好ましくは、前記のカラムおよび前記のフローセレクターを連結するあらゆる管類が、避けられる。

フローセレクターは、カラムに対して外部にあることが、理解されている。
以下の記載から明らかであろうように、１０μＬ未満のポストカラムデッドボリュームおよびスウェプトボリュームの合計は、今までに達成されているポストカラムデッドボリュームおよびスウェプトボリュームの合計よりも小さい。この閾値未満の値が、本発明者らにより達成されている（下記参照）。

用語“ポストカラムスウェプトボリューム”は、本明細書において、カラムの遠位端から分画、すなわち前記のフローセレクターにおける画分の分割が行われる位置までの流路内の液体の割合として定義されている。用語“ポストカラムデッドボリューム”は、押し流されず（ｎｏｔ ｓｗｅｐｔ）、かつ直接流体の流路中にない、カラムの遠位端から分画、すなわち前記のフローセレクターにおける画分の分割が行われる位置までの体積を示す。ポストカラムデッドボリュームおよびスウェプトボリュームは、クロマトグラフィーカラムを去った後および前記の流体を収集するために用いられる容器（単数または複数）に入る前に分析物により達せられ得る体積である。デッドボリュームの場合、拡散は、分析物が入ることを可能にするプロセスの１つである。デッドボリュームおよびスウェプトボリュームがクロマトグラフィーカラムの遠位端により一方の末端に限定されるならば、それらは、“ポストカラム”デッド／スウェプトボリュームとも呼ばれる。上記から明らかであるように、スウェプトボリュームおよびデッドボリュームは、独立して最適化されることができる独立したパラメーターである。本発明は、デッドボリュームおよびスウェプトボリュームの合計を最小化することを目的としており、その合計は、“ポストカラムボリューム”または“総ポストカラムボリューム”とも呼ばれる。総ポストカラムボリュームは、クロマトグラフィーカラムの遠位端およびフローセレクターの出口により限定され、そうでなければ、前記のクロマトグラフィーカラムの遠位端および前記のフローセレクターの出口の間の分析物が接近できるあらゆる体積を占める。

スウェプトボリュームは、計算されることも測定されることもできる。計算は、クロマトグラフィーシステム（例えば、図１において示されているクロマトグラフィーシステム）の管類の長さおよび寸法に基づいて行われることができる。測定は、クロマトグラフィーを漏れがなくかつ好ましくはデッドボリュームもないシステムにおいて既知の流速で実施し、所与の予想される信号の遅延を決定することにより行われることができる。用語“漏れ”は、そのシステムが緊密ではなく、液体が流路中の穴を通って漏れることができることを意味する。これは、高圧が漏れを引き起こす高速クロマトグラフィーにおいて起こり得る。漏れは、システム全体の適切な緊密性に関してチェックすることにより回避されることができる。カラムのボイドボリュームおよび流速に基づいて、第１分析物（それはカラムにおいて遅延しないであろうと仮定する）がフローセレクターに到達するはずである時点が、計算されることができる。それからのあらゆる偏差は、ポストカラムスウェプトボリュームを示すものであり、その尺度である。デッドボリュームは、典型的には継手内で生じる。継手を適切に選択し、正しく使用することにより、デッドボリュームは最小化されることができる。

そのシステムは、高度に多用途であり、少数の化合物ならびに多数の画分の分画を向上させる。用語“画分”（複数）は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０の画分を指す。

さらに、本発明は、上記のような連結された分画に適している。その概念は、カラムの後の別々のチャンネルにおける溶離流の即時の能動的な分割に頼っており、それによりポストカラムスウェプトボリュームおよびデッドボリュームを低減またはさらには除去する。流れは、分画されるべき試料の適用および複雑性に応じて２以上のチャンネルにおいて分割されることができる。従来のデバイス（例えば図１において示されているデバイス）では、分画の位置は管類の末端にあることを特筆する。当該技術は、この分画の方法に内在する欠陥を認識することができなかった。しかし、本発明によれば、分画の位置は、フローセレクターの出口である。

本発明の典型的なナノフロー分画システムは、わずかおおよそ８０ｎＬのポストカラムスウェプトボリュームおよび１０ｎＬ未満のポストカラムデッドボリュームを有する。古典的な画分収集システムは、１０μＬ以上のポストカラムスウェプトボリュームおよびデッドボリュームの合計を有する。

流速、すなわち時間単位あたりの体積、例えば１分あたりの体積が、クロマトグラフィープロセスを特性付けるために当該技術において一般的に用いられている。前記のプロセスの過程において、それは、容易な方法で決定されることができる。

本発明は、非常に少ないシステムあたりの経費で優秀な性能を提供する。それは、複雑な試料に関する分画条件を最適化するための単純な方法である。それは、低マイクロおよびナノフロー適用に関して超高圧ナノフローポンプと共に用いられることができる。本発明は、優秀な分画および連結された分画スキームの自動化を可能にする。

第２側面において、本発明は、（ａ）クロマトグラフィーカラム；および（ｂ）フローセレクターを含む、またはそれからなるキットを提供し、ここで、前記のカラムおよび前記のフローセレクターは、ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が１０μＬ未満であるような前記のフローセレクターの前記のカラムの遠位端への接続のために設計されている。

第２側面に従うキットは、分離した形態の第１側面に従うデバイスの２つの構成要素を提供する。重要なことだが、その２つの構成要素は、第２側面により必要とされるように、すなわち本質的に直接的な接続のために設計されている。本質的に直接的な接続のために設計されているそのようなものの典型的かつ好ましい実施は、下記でさらに詳述されており、例えばねじ式継手またはフェルールを含む。

それと一致して、本発明のキットは、さらに第１側面に従うデバイスの組み立てに関する指示を含む説明書を含むことができる。
本発明の第１側面に従うデバイスおよび第２側面に従うキット両方の好ましい態様において、前記のクロマトグラフィーカラムは、（ａ）空であり；もしくは（ｂ）クロマトグラフィー材料で充填されており；かつ／または２ｍｍ未満の；好ましくは２５０μｍ以下の；もしくは２００μｍ以下の内径を有し、かつ／または２ｍＬ以下、１ｍＬ以下、５００μＬ以下、２００μＬ以下、好ましくは１００μＬ以下、５０μＬ以下、２０μＬ以下、もしくは１０μＬ以下の容積を有する。

カラムがクロマトグラフィー材料で充填されている限りにおいて、ビーズベースのカラムならびにモノリス型カラムが用いられることができることが、理解されている。ビーズが用いられる限りにおいて、３０μｍ未満、特に０．１〜１０μｍ、例えば１．０、１．５、１．９または２．０μｍのビーズサイズが、優先される。

カラムの“容積”という用語は、カラムの内容積、すなわちＶ＝πｄ^２Ｌを定義しており、ｄは、内径であり、Ｌは、円筒形のカラムの長さである。従って、その用語は、空である、すなわちクロマトグラフィー材料を有しない前記のカラムを指す。

カラムがクロマトグラフィー材料で充填されている限りにおいて、前記のクロマトグラフィー材料は、好ましくは逆相、イオン交換、順相、混合相、親水性相互作用、親和性およびサイズ排除材料から選択される。

上記の好ましい態様は、様々なクラスのクロマトグラフィー材料の使用を提供する。いずれのクラスにおいても、数多くの当該技術で確立された製品が存在する。少数の例を挙げると、逆相材料は、Ｃ１８、Ｃ８およびフェニル結合材料を含む。イオン交換材料は、ＳＣＸ、ＷＣＸ、ＳＡＸ、およびＷＡＸを含み、そして順相材料は、シリカを含む。シリカベースの材料の大部分は、酸性条件下でのみ安定である。好ましい混合相材料は、スルホン化ポリジビニルベンゼン（ＤＶＢ）およびスルホン化ポリスチレンジビニルベンゼン（ＳＤＢ）を含む。製造業者およびそれらの商業的に入手可能な製品は、Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国デラウェア州ニューアーク）のＧｅｎｅｒｉｋ ＢＣＸおよび３Ｍ（例えば３Ｍ Ｇｅｒｍａｎｙ、ノイス）のＳＤＢ−ＲＰＳを含む。さらなる製造業者は、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ（ドイツ）である。典型的な親水性相互作用材料（“前方相（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｈａｓｅ）”材料としても知られている）は、ＨＩＬＩＣおよびＥＲＬＩＣを含む。親和性材料は、免疫親和性材料、固定化金属イオン（ＩＭＡＣ）およびタンパク質相互作用に基づく材料を含む。サイズ排除材料は、アガロースおよびデキストランを含む。

本発明は、ナノフロー適用またはマイクロフロー適用のためのカラムを用いて実施されることができる。典型的には、用語“ナノフロー”は、１〜１０００ｎＬ／分の流れを指し、用語“マイクロフロー”は、１〜１０００μＬ／分の流速を指す。

好ましくは、前記のカラムは、液体クロマトグラフィーのためのものである。カラムが、マイクロフローまたはナノフローのための管からなる、またはそれを含むことも、好ましい。言い換えれば、内径は、好ましくは０．０５〜２ｍｍの範囲である。好ましい内径は、０．０５ｍｍ以下、０．０７５ｍｍ以下、０．１ｍｍ以下、０．２ｍｍ以下、０．２５ｍｍ以下、０．５ｍｍ以下、１．０ｍｍ以下、１．５ｍｍ以下および１．６ｍｍ以下である。

好ましいカラムの長さは、１ｃｍ〜１００ｃｍ、特に好ましくは１０ｃｍ〜５０ｃｍである。
本発明のデバイスおよびキット両方の好ましい態様において、前記のセレクターは、ｎ方ローター弁であり、ｎは、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４である。ｎのより一般的な値は、３、４、６、８、１０、１２、１８および２４である。ローター弁の製造業者は、Ｖｉｃｉ ＡＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む。

本発明のデバイスおよびキット両方のさらなる好ましい態様において、前記のカラムおよび前記のセレクターの間の接続は、（ａ）ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が、１μＬ未満、５００ｎＬ未満、２００ｎＬ未満、１００ｎＬ未満、５０ｎＬ未満、４０ｎＬ未満、３０ｎＬ未満、２０ｎＬ未満もしくは１０ｎＬ未満であるような接続であり；かつ／または（ｂ）（ｉ）好ましくはねじ式継手もしくはフェルールを用いて前記のカラムを前記のセレクターの入口（ｉｎ−ｐｏｒｔ）の中に直接差し込むか；もしくは（ｉｉ）好ましくはねじ式継手もしくはフェルールを用いて前記のカラムを検出器、例えば紫外／可視セルの中に直接差し込み；そして好ましくはねじ式継手もしくはフェルールを用いて前記の検出器を前記のセレクターの入口の中に直接差し込むことにより実施される。

この好ましい態様の項目（ａ）および（ｂ）は、本発明の第１および第２側面に従う特徴の特に好ましい制限またはそれをそれぞれ実施するための手段を提供する。
項目（ｂ）（ｉ）および（ｂ）（ｉｉ）は、好ましい実施を提供し、その好ましい実施は、ポストカラムボリュームの基準ならびに上記で示されたような項目（ａ）の基準を満たすことを可能にする。項目（ｂ）（ｉ）は、カラムの遠位端およびフローセレクターの入口の間の直接的な接続を必要とする。従って、項目（ｂ）（ｉ）に従う接続は、本質的に直接的であるだけでなく、単純に直接的である。項目（ｂ）（ｉｉ）は、さらなるデバイス、特に検出器、例えば紫外／可視セルが、カラムの遠位端およびフローセレクターのインポート（ｉｍｐｏｒｔ）の間に配置されることができる点で、“本質的に直接的”の実施である。そのようなデバイスがカラムおよびフローセレクターの間に配置されている場合、好ましくは余分な管類は用いられないことは、理解されている。代わりに、必要とされる接続、すなわちカラムおよび検出器の間の接続ならびに検出器およびフローセレクターの間の接続のそれぞれに関して、直接的な接続のための手段、例えばねじ式継手が、用いられる。

標準的なねじ式継手は、当該技術で既知であり、例えば１／３２”、１／１６”、１／８”等に関するＵＮＦねじ式継手を含む。ねじ式継手に対する代替案は、フェルール（例えばＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を含む。

本発明のデバイスおよびキットのさらなる好ましい態様において、前記のフローセレクターの１つ、より多く、または全ての出口が、容器に接続されている。容器（単数または複数）は、画分（単数または複数）を収集する役目を果たす。

第３側面において、本発明は、１種類以上の分析物の分離のための第１側面に従うデバイスまたは第２側面に従うキットの使用を提供する。
それに関して、本発明は、第４側面において、試料を分析する方法を提供し、前記の方法は、（ａ）本発明の第１側面に従うデバイスを用いて前記の試料の第１クロマトグラフィー工程を実施することを含み、ここで、画分が収集される。

用語“分析すること”は、その当該技術で確立された意味を有し、試料の構成要素を分離すること、少なくとも部分的に分離すること、および／またはそれらの同一性を決定することを含む。試料は、前記の試料が（未処理の形態または処理された形態のどちらかで）クロマトグラフィーカラムの近位端上にロードされることができる流体である限り、あらゆる試料であることができる。好ましい試料は、生物学的由来の試料および／または環境試料である。生物学的由来の試料は、体液、例えば哺乳類またはヒト由来の体液を含む。体液の例は、血漿、血清、血液および痰を含む。

句“第１クロマトグラフィー工程を実施すること”は、クロマトグラフィーカラムを用いて試料のクロマトグラフィー分離を実施するための当該技術で確立された手段を包含する（前記の手段は、ポストカラムスウェプトボリュームおよびデッドボリュームに関しては当該技術で確立されていないことは、理解されている）。液体クロマトグラフィーが用いられるべきである限りにおいて、１種類以上の緩衝液が、用いられることができる。特定の場合では、勾配が有用である可能性がある。特に、後者の場合において、欧州特許第２９４４９５５号において開示されている手段および方法が、用いられることができる。完全を期すために、我々は、Meyer（上記の引用箇所）を参照する。用語“第１工程”は、単に任意のさらなるクロマトグラフィー工程と区別するために用いられている。

好ましい態様において、前記の画分は、連結された画分を収集するために連結される。画分の連結自体は、本明細書において上記で背景の節において論じられている当該技術で確立された手順である。

第４側面に従う方法のさらなる好ましい態様において、前記の方法は、さらに（ｂ）本発明の第１側面に従うデバイスを前記の第１クロマトグラフィー工程から得られた画分と共に、または前記の第１クロマトグラフィー工程から得られた連結された画分と共に用いて第２クロマトグラフィー工程を実施すること（ここで画分が収集される）；および場合により（ｃ）本発明の第１側面に従うデバイスをそれぞれの先行するクロマトグラフィー工程から得られた画分と共に、またはそれぞれの先行するクロマトグラフィー工程から得られた連結された画分と共に用いて１以上のさらなるクロマトグラフィー工程を実施すること（ここで前記の１以上のさらなるクロマトグラフィー工程において画分が収集される）を含む。

この好ましい態様は、第２クロマトグラフィー工程および１以上の任意のさらなるクロマトグラフィー工程を提供する。好ましくは、様々なクロマトグラフィー工程において用いられる条件（例えばｐＨ値）および／またはクロマトグラフィー材料は、異なる。理想的には、直交性の分離条件が、用いられるべきである。用語“直交性の”は、２つの異なるクロマトグラフィー工程における物理化学的分離条件および／または選択性が、分析物が分離される方法が根本的に異なる、および／または溶離物が同じ順序で溶離されないように異なっている状況を指す。実際には、これは常に達成することが可能なわけではない。２つの異なるクロマトグラフィー工程を用いる方法の好ましい実施が、下記で記載される。

好ましい態様において、前記の第１クロマトグラフィー工程のために、および／または前記の第２クロマトグラフィー工程のために用いられるクロマトグラフィー材料は、逆相材料である。

特に好ましい態様において、前記の第１クロマトグラフィー工程のために、および前記の第２クロマトグラフィー工程のために用いられるクロマトグラフィー材料は、逆相材料であり、第１および第２クロマトグラフィー工程の一方は、中性またはアルカリ性条件下で、好ましくは７〜１０のｐＨにおいて達成され、他方は、酸性条件下で、好ましくは１〜４のｐＨで達成される。

さらなる好ましいアルカリ性条件は、８および９のｐＨ値を含む。さらなる好ましい酸性条件は、２および３のｐＨ値を含む。実際上は、我々は、酸性条件は常にそれらのそれぞれのｐＨ値の点で特性付けられるわけではなく、存在している酸の濃度（例えば０．０１％〜１％、好ましくは０．１％ギ酸；０．０１％〜１％、好ましくは０．１％トリフルオロ酢酸；または０．０１％〜１％、好ましくは０．１％酢酸）の点で特性付けられることを、特筆する。

下記の表１は、本発明に従う好ましいｐＨ調節剤を示す。

さらなる好ましい態様において、前記の第１クロマトグラフィー工程は、移動相調節剤の存在下で実施され、前記の移動相調節剤は、好ましくはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはトリエチルアミン（ＴＥＡ）である。

本発明に従う用語“移動相調節剤”は、クロマトグラフィーの性能（例えばピークの分離およびピークの形状）を向上させるのを助ける化合物の機能的特性付けである。移動相調節剤は、分析物に関するイオン対試薬（ｉｏｎ ｐａｒｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）の役目を果たすことができる。ＴＦＡまたはＴＥＡが移動相調節剤としても用いられる限りにおいて、それを第１クロマトグラフィー工程に関して用いることが、好ましい。

本発明の方法のさらなる好ましい態様において、前記の方法は、さらに（ｄ）１以上の画分の質量分析を含み、前記の画分は、前記の第１クロマトグラフィー工程ならびに／または存在する限りにおいて前記の第２および／もしくは前記のさらなるクロマトグラフィー工程（単数または複数）から得られる。

本発明の方法のさらなる好ましい態様において、前記のデバイスに含まれるフローセレクターは、検出器により制御されており、前記の検出器は、好ましくは紫外／可視セルまたは質量分析計である。

後者の好ましい態様は、信号依存性の分画を提供する。詳しく説明すると、検出器、例えばカラムの遠位端およびフローセレクターの間に配置された検出器、または別の方法では下流の検出器、例えば質量分析計が、ピークの位置および特性を決定するために用いられることができ、前記のピークは、対象の分析物に対応する。検出器により検出される信号の特性に応じて、フローセレクターは、特定の分析物の分離および／または収集が最適であるような様式で作動することができる。

本発明の方法のさらなる好ましい態様において、クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）である。
本発明の方法のさらなる好ましい態様において、前記の試料は、ペプチド、ポリペプチド、脂質および／または糖類を含み、またはそれからなり、ここで、前記のペプチドは、好ましくはタンパク質分解性の消化、好ましくはトリプシン消化の結果である。

当該技術で既知であるように、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を含む試料、完全なプロテオームを含むそのような試料は、好ましくはその後の質量分析のためにタンパク質分解的に消化される。好ましいタンパク質分解酵素は、トリプシンを含む。これらの態様において、クロマトグラフィーカラム上にロードされる試料は、生物学的系から引き出された一次試料と、それが前処理を受けている点で異なり、前記の前処理は、言及されたタンパク質分解性の消化を含むか、またはそれからなる。

一般的に言って、そしてそうではないことが明確に示されていない場合、好ましい態様は、連動して機能し得る。これが後者の２つの態様に適用される限りにおいて、オンラインＬＣ−ＭＳは、特に好ましい実施である。

本明細書において、特に特許請求の範囲において特性付けられた態様に関して、従属請求項において言及されたそれぞれの態様は、前記の従属請求項が従属するそれぞれの請求項（独立または従属）のそれぞれの態様と組み合わせられることが、意図されている。例えば、３つの代替物Ａ、ＢおよびＣを列挙している独立請求項１、３つの代替物Ｄ、ＥおよびＦを列挙している従属請求項２、ならびに請求項１および２に従属しており３つの代替物Ｇ、ＨおよびＩを列挙している請求項３の場合、本明細書は、別途そうではないと具体的に言及されない限り、組み合わせＡ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉに対応する態様を明確に開示していることは、理解されるべきである。

同様に、独立および／または従属請求項が代替物を列挙しない場合においても、従属請求項が複数の先行する請求項に戻って参照する場合、それにより含まれる主題のあらゆる組み合わせが明示的に開示されたと考えられることは、理解されている。例えば、独立請求項１、請求項１に戻って参照する従属請求項２、ならびに請求項２および１の両方に戻って参照する従属請求項３の場合、請求項３および１の主題の組み合わせは、明白かつ明確に開示されており、請求項３、２および１の主題の組み合わせも同様であることになる。請求項１〜３のいずれか１項を参照するさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４および１の、請求項４、２および１の、請求項４、３および１の、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組み合わせが、明白かつ明確に開示されていることになる。

上記の考えは、全ての添付された特許請求の範囲に必要な変更を加えて適用される。
図は、以下のことを示す：
図１：当該技術で確立された画分収集システムの例。

図２：流れの分割のためのローター弁。Ａ）模式的な２チャンネルローター弁の例。位置が９０°回転した場合、インライン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）および現在遮断されているラインが連結される。Ｂ）多チャンネルローター弁の２つの例。ここで、インラインは、中心の口に連結されており、低体積チャンネルが出口チャンネルの放射状の口に連結されている（左：３チャンネル弁の例、右：９チャンネル弁の例）。

図３：本セレクター分画システムを現状技術の分画の結果に対して比較する予備的な結果。Ａ）ナノフローで分画された１５μｇの出発物質を用いた本明細書において記載されたシステムの分画効率。最初の結果は、１７時間未満の測定時間における７，７９３のタンパク質同定のプロテオミクス深度を実証している。Ｂ）最近公開された方法論の論文において普通のオートサンプラーおよびミリリットル流を用いて達成された分画効率。このアプローチでは、２．５ｍｇより多くのペプチドが分画された。その論文は、６０時間の総測定時間で分析された７，８９７のタンパク質同定のプロテオミクス深度を報告している(Mertins et al., Nat Methods, 10(7): 634-7 (2013))。

実施例は、本発明を説明する。
実施例１：単一の化合物または単一の化合物群は、ほとんど量的な喪失を伴わずに、かつ高純度で精製されるべきである。この例では、システムは、２つ以上のチャンネルを用いて実施されることができ（図２ａ、ｂ）、ここで、溶離ピークは、別々のチャンネル中に直接向け直され、結果として有害な逆混合作用を伴わない完全にきれいな分離をもたらす。それにより、単一の化合物が、バルク流から分離されることができ、または多数の化合物が、１つまたは多数の別々のチャンネル中へと分割されることができる。

実施例２：複雑な試料は、試料の複雑性を低減するが化合物の量的な差を保持するために、画分の内容物の重複がほとんどない少数の画分へと分画されなければならない。この実施例では、多数のアウトライン（ｏｕｔ−ｌｉｎｅｓ）を有するローター弁が、用いられることができる（図２ｂ）。画分１が収集され、ローターは次のチャンネルへと切り替わり、次の画分が収集される（以下同様）。この自動化された様式では、少数の画分が、非常にきれいな分離でほとんど重複せずに分離されることができる。

実施例３：非常に複雑な試料は、画分の連結を伴う２Ｄスキームにより分画されるべきである。ここで、多数の出力を有するロータリー弁が、多数のチャンネルへと連結される多数の細画分へと分画するために用いられることができる。例えば、１０口弁が用いられる場合、ローター弁は、環状方式で連続的な様式で切り替わる。それにより、連結は、画分１がチャンネル１に入り、画分２がチャンネル２に入り（以下同様）、続いて画分１１、２１、３１、４１等もチャンネル１に入り、画分１２、２２、３２、４２等もチャンネル２に入るように自動的に実施される。その結果は、古典的なアプローチよりもはるかに効率のよい比較可能なプロテオミクスカバー度を実証している（図３）。

Claims (17)

1. 以下：
   （ａ）クロマトグラフィーカラム；および
   （ｂ）フローセレクター
   を含む、またはそれからなるデバイスであって、前記のフローセレクターが、前記のカラムの遠位端に、ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が１０μＬ未満であるように連結されているデバイス。
2. 以下：
   （ａ）クロマトグラフィーカラム；および
   （ｂ）フローセレクター
   を含む、またはそれからなるキットであって、前記のカラムおよび前記のフローセレクターが、ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が１０μＬ未満であるような前記のフローセレクターの前記のカラムの遠位端への接続のために設計されているキット。
3. 請求項２に記載のキットであって、さらに、請求項１に記載のデバイスの組み立てに関する指示を含む説明書を含むキット。
4. 請求項１に記載のデバイスまたは請求項２もしくは３に記載のキットであって、前記のクロマトグラフィーカラムが、
   （ａ）空であり；もしくは
   （ｂ）クロマトグラフィー材料で充填されており；
   かつ／または
   ２ｍｍ未満の；好ましくは２５０μｍ以下の；もしくは２００μｍ以下の内径を有し、
   かつ／または
   ２ｍＬ以下、好ましくは１００μＬ以下の容積を有する、デバイスまたはキット。
5. 請求項４（ｂ）に記載のデバイスまたはキットであって、前記のクロマトグラフィー材料が、逆相、イオン交換、順相、親水性相互作用、親和性およびサイズ排除材料から選択される、デバイスまたはキット。
6. 請求項１、４もしくは５のいずれか１項に記載のデバイス、または請求項２〜５のいずれか１項に記載のキットであって、前記のセレクターが、ｎ方ローター弁であり、ｎが、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４である、デバイスまたはキット。
7. 請求項１もしくは４〜６のいずれか１項に記載のデバイス、または請求項２〜６のいずれか１項に記載のキットであって、前記のカラムおよび前記のセレクターの間の接続が、
   （ａ）ポストカラムスウェプトボリュームおよびポストカラムデッドボリュームの合計が、１μＬ未満、５００ｎＬ未満、２００ｎＬ未満、１００ｎＬ未満、５０ｎＬ未満、４０ｎＬ未満、３０ｎＬ未満、２０ｎＬ未満もしくは１０ｎＬ未満であるような接続であり；
   かつ／または
   （ｂ）以下：
   （ｉ）好ましくはねじ式継手もしくはフェルールを用いて前記のカラムを前記のセレクターの入口の中に直接差し込むか；もしくは
   （ｉｉ）好ましくはねじ式継手もしくはフェルールを用いて前記のカラムを検出器、例えば紫外／可視セルの中に直接差し込み；そして前記の検出器を前記のセレクターの入口の中に直接差し込む；
   により実施される、デバイスまたはキット。
8. １種類以上の分析物の分離のための、請求項４（ｂ）または５〜７のいずれか１項に記載のデバイスまたはキットの使用。
9. 試料を分析する方法であって、前記の方法が、以下の工程：
   （ａ）請求項４（ｂ）または５〜７に記載のデバイスを用いて前記の試料の第１クロマトグラフィー工程を実施し、ここで画分が収集される；
   を含む方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記の画分が、連結された画分を収集するために連結される方法。
11. 請求項９または１０に記載の方法であって、さらに、以下の工程：
    （ｂ）請求項４（ｂ）または５〜７に記載のデバイスを、前記の第１クロマトグラフィー工程から得られた画分と共に、または前記の第１クロマトグラフィー工程から得られた連結された画分と共に用いて第２クロマトグラフィー工程を実施し、ここで、画分が収集され；そして場合により
    （ｃ）請求項４（ｂ）または５〜７に記載のデバイスを、それぞれの先行するクロマトグラフィー工程から得られた画分と共に、またはそれぞれの先行するクロマトグラフィー工程から得られた連結された画分と共に用いて１以上のさらなるクロマトグラフィー工程を実施し、ここで、画分が前記の１以上のさらなるクロマトグラフィー工程において収集される；
    を含む方法。
12. 請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、前記の第１クロマトグラフィー工程に関して、および／または前記の第２クロマトグラフィー工程に関して用いられるクロマトグラフィー材料が、逆相材料である方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記の第１クロマトグラフィー工程に関して、および前記の第２クロマトグラフィー工程に関して用いられるクロマトグラフィー材料が、逆相材料であり、第１および第２クロマトグラフィー工程の一方が、中性またはアルカリ性条件下で、好ましくは７〜１０のｐＨで達成され、他方が、酸性条件下で、好ましくは１〜４のｐＨで達成される方法。
14. 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、前記の第１クロマトグラフィー工程が、移動相調節剤の存在下で達成され、前記の移動相調節剤が、好ましくはトリフルオロ酢酸またはトリエチルアミンである方法。
15. 請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、さらに、以下の工程：
    （ｄ）１以上の画分の質量分析、前記の画分は、前記の第１クロマトグラフィー工程ならびに／または存在する限りにおいて前記の第２および／もしくは前記のさらなるクロマトグラフィー工程（単数または複数）から得られる；
    を含む方法。
16. 請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、前記のデバイスに含まれるフローセレクターが、検出器により制御され、前記の検出器が、好ましくは紫外／可視セルまたは質量分析計である方法。
17. 請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記の試料が、ペプチド、ポリペプチド、脂質および／または糖類を含み、またはそれからなり、前記のペプチドが、好ましくはタンパク質分解性の消化、好ましくはトリプシン消化の結果である方法。