CN113533558A - 一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统及分离方法 - Google Patents

一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统及分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统及分离方法。本发明使用两台二元色谱泵、一个多位分配阀、一个多通道分流器和一个四通阀,实现生物样品的在线高通量深度分离。含有蛋白质复合物的生物样品经过第一维离子交换色谱分离后进行在线交联衍生化反应,通过多位分配阀依次转移至多通道的第二维反相色谱捕集柱阵列进行捕集除盐。被捕集的蛋白质复合物通过反相色谱分离柱阵列得到深度分离并可进行后续分析鉴定。本发明方法可全自动完成蛋白质复合物的二维分离、在线衍生及馏分收集,其分离通量成倍于传统离线二维色谱方法,十分适合蛋白质组学及蛋白质相互作用研究所需的蛋白质复合物高通量深度分离。

Description

一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统 及分离方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域,具体涉及一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统及分离方法。
背景技术
蛋白质组学尤其是蛋白质-蛋白质相互作用研究可以深入揭示蛋白质在生命过程中所承担的工作,对于加深人类在生命本质、疾病发生机理和对于疾病的预防治疗方案开发中有着极为重要的意义。近年来全蛋白质相互作用组分析技术发展迅速,该技术需要对具有相互作用的蛋白质即蛋白质复合物使用液相色谱等方法进行深度分离以使不同蛋白质的流出行为得到区分,从中寻找出具有共流出行为的蛋白质,结合蛋白质相互作用数据库等信息,匹配得到蛋白质复合物架构及其中蛋白质相互作用。
多维液相色谱通过组合使用多种不同分离模式,充分利用不同分离模式之间的正交性,可以有效提高体系的分离能力。在蛋白质组学领域应用最多的多维色谱方法是二维色谱,其中常被使用的二维色谱分离模式包括离子交换-反相色谱、体积排阻-反相色谱、反相-反相色谱等。对于蛋白质复合物分离的多维色谱分离模式需要满足以下几个条件:1、可以对蛋白质复合物进行有效分离。2、在其分离过程中保持蛋白质复合物结构不被破坏。3、各维度分离模式之间具有较高的正交性。
现有大部分实用的在线二维色谱装置的结构多为第一维-检测器-第二维-检测器的串联构型,其运行时是将第一维色谱分离所得的馏分依次转移至第二维后进行再一次分离,分离总时间为二维分离时间之和。这类串联型的二维色谱模式的主要优势在于其结合两种正交分离模式,其峰容量最高可达两种分离模式峰容量之积。但就分离通量而言,虽然串联型的二维色谱已经具有很高的分离分析通量,但其上限受制于第一维的馏分需要依次在第二维中进行分离。对于蛋白质组学所需要鉴定的蛋白质以及蛋白质复合物等目标,其在室温甚至低温下存在缓慢降解并导致鉴定数量下降等困难,因此对于此类分析目标物需要进一步缩短分离时间,提高分离鉴定通量。为了充分发挥多维色谱的高效分离能力,阵列式多维色谱技术得到了进一步发展。以二维色谱为例,阵列式二维色谱在第二维中使用了多根色谱柱,形成多个第二维分离通道,将第一维分离所得馏分依次由第二维各通道进行捕集后,同时进行第二维分离,将第二维的分离时间直接成倍缩短,极大提升了多维色谱的实际分析通量。
发明内容
本发明的目的是提供了一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统。
本发明的另一目的是提供使用上述系统对包含蛋白质复合物的复杂生物样品进行深度分离的方法。
本发明使用两台色谱泵、一个多位分配阀、一个多通道分流器和一个二位四通阀,实现生物样品的在线高通量深度分离。含有蛋白质复合物的生物样品经过第一维离子交换色谱分离后进行在线交联衍生化反应,通过多位分配阀依次转移至多通道的第二维反相色谱捕集柱阵列进行捕集除盐。被捕集的蛋白质复合物通过反相色谱分离柱阵列得到深度分离并可进行后续分析鉴定。本发明方法可全自动完成蛋白质复合物的二维分离、在线衍生及馏分收集,其分离通量成倍于传统离线二维色谱方法,十分适合蛋白质组学及蛋白质相互作用研究所需的蛋白质复合物高通量深度分离。本发明的技术方案具体介绍如下。
本发明提供的一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统,其包括第一维色谱泵,第二维色谱泵,离子交换色谱柱,衍生补液注射器,衍生反应补液三通,衍生反应器,终止反应补液注射器,终止反应补液三通,终止反应器,多位分配阀,若干分流三通,反相捕集柱阵列,多通道分流器,二位四通阀,反相色谱柱组阵列,多通道馏分收集器;分流三通的数目和反相捕集柱阵列中的反相捕集柱的数目、反相色谱柱组阵列中的反相色谱柱的数目、多通道馏分收集器中的通道数相同;其中:
第一维色谱泵与离子交换色谱柱的入口端相连,离子交换色谱柱的出口端连接衍生反应补液三通的一个接口,衍生反应补液三通的另外两个接口分别连接衍生补液注射器、衍生反应器的入口;衍生反应器的出口连接终止反应补液三通的一个接口,终止反应补液三通的另外两个接口分别连接终止补液注射器、终止反应器的入口;终止反应器的出口与多位分配阀的入口相连;多位分配阀的两个出口分别连接废液及色谱堵头,其余出口分别连接不同分流三通的一个接口;
第二维色谱泵与二位四通阀的一个接口相连,二位四通阀的另外一个接口连接多通道分流器的入口,多通道分流器的不同出口分别连接反相捕集柱阵列中不同反相捕集柱的入口,反相捕集柱的出口分别和不同分流三通的第二个接口连接;分流三通的第三个接口分别与反相色谱柱阵列的不同反相色谱柱的入口相连,反相色谱柱的出口与多通道馏分收集器的入口相连。
本发明中,第一维及第二维色谱所使用的固定相均为超大孔填料,其孔径≥1000Å。由于蛋白质复合物体积较大,为了使蛋白质复合物在色谱固定相表面进行充分平衡,需要使用孔径较大的填料。绝大部分蛋白质复合物中包含2~5个蛋白质分子,其总分子量多大于80 kDa。常用于蛋白质分离的固定相填料一般选用300 Å孔径,对于蛋白质复合物分离过程无法进行有效传质,因此应当选用超大孔径(≥1000 Å)的固定相填料作为蛋白质复合物分离之用。
本发明中,第二维分离阵列被分为捕集柱阵列及分离柱阵列。其中捕集柱阵列使用较短的色谱柱,分离柱阵列使用较长的色谱柱,两者所使用的固定相填料相同。由于第一维色谱的流出液经过在线衍生后需要在第二维色谱柱中进行捕集除盐,在此过程中第一维与第二维色谱柱需要串联连接。为了避免两根色谱柱串联造成压力过高,第二维色谱柱被分为捕集柱和分离柱。在捕集过程中,第一维色谱柱与第二维捕集柱相连,第一维流出液中的蛋白质复合物在捕集柱柱头被捕集,其中的盐流过捕集柱并排入废液,色谱总压力较低;在第二维分离过程中,捕集柱阵列与分离柱阵列一一串联,使被捕集的蛋白质复合物被顺利洗脱分离。
本发明提供的一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离方法的具体步骤如下:
待测非变性生物样品通过第一维色谱泵自动进样至离子交换色谱柱;样品由第一维色谱泵泵出的盐溶液进行梯度洗脱;
衍生补液注射器泵出第一衍生液通过衍生反应补液三通与离子交换色谱柱洗脱所得流出液混合并进入衍生反应器进行反应;终止补液注射器泵出第二衍生液通过终止反应补液三通与衍生反应器流出液混合并进入终止反应器进行反应;终止反应器流出液通过多位分配阀及分流三通被依次分配至反相捕集柱阵列的所有通道进行捕集;各通道的流出液通过二位四通阀排入废液;切换二位四通阀并使用第二维色谱泵对反相捕集柱阵列的所有通道进行洗脱;洗脱液通过反相色谱柱阵列进行深度分离并通过多通道馏分收集器进行收集。
和现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明中,第一维色谱的馏分经过在线衍生。由于蛋白质复合物结构不稳定,需要对其进行在线交联衍生化反应后进行第二维分离。在线衍生分为衍生反应和终止反应2个步骤。在衍生反应中,衍生补液注射器泵出衍生试剂(甲醛溶液),衍生液通过衍生反应补液三通与离子交换色谱柱洗脱所得流出液混合,衍生液及流出液的流速接近使得其混合均匀。含有衍生试剂的混合液进入衍生反应器,反应器恒温于37℃以使得混合液中的蛋白质复合物进行交联反应;在终止反应中,终止补液注射器泵出终止试剂(甘氨酸溶液)通过终止反应补液三通与衍生反应器流出液混合并进入终止反应器,终止反应器被恒温于37℃并进行终止反应以猝灭多余的甲醛溶液。上述过程全部自动在线完成,因此操作简单、无污染。
本发明中,第一维色谱的流出液经过在线衍生后,通过多位分配阀进行分配,使其进入第二维色谱阵列的各个通道。在初始状态,多位分配阀的出口与废液相连,第一维色谱分离开始后,其流出液经过多位分配阀流入废液;当馏分需要开始收集时,多位分配阀切换至通道1,第一维流出液即被分配至第二维色谱阵列的通道1;多位分配阀依次切换位置,第一维流出液即被切割为多个馏分并进入各自通道;在馏分收集过程完成后,多位分配阀切换至堵头位置,以使系统中第一维分离及在线衍生部分与第二维分离部分隔绝。相比离线二维色谱的馏分切割及收集方式,使用自动化装置进行馏分切割及分配可以减少过程中的损失及污染,并提升整个分离系统方法的效率。
在本发明中,第二维阵列分离需要各通道同时且平均进行,各个通道的分离能力相同使得方法的重复性得到有效保证。通过在各通道中使用均一度较好的色谱柱,只需使用一台色谱泵,通过分流器即可同时对各个通道进行流动相供给,降低了该分离系统的复杂度及成本。
在本发明中,第二维分离过程使用阵列方式进行。第一维色谱馏分中的蛋白质复合物在第二维捕集柱阵列中被捕集后,第二维色谱泵泵出第二维流动相并通过多通道分流器均匀分配至各通道,使蛋白质复合物在第二维色谱柱阵列中被同时洗脱分离。由于各通道的分离同时进行,该二维色谱分离时间相较于离线方法可以成倍缩短,整体分离通量大幅增加。由于样品除盐及平衡过程已经在捕集步骤中预先完成,第二维洗脱梯度较快,进一步缩短了二维色谱整体分离时间。上述阵列分离过程全自动进行,降低了人工操作强度和时间消耗。
附图说明
图1为用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统示意图。
图2为第二维反相色谱阵列中各色谱柱的分离平行性。
图3为HeLa细胞非变性裂解液使用离子交换色谱分离的色谱图及馏分切割。
图4为HeLa细胞非变性裂解液的第二维反相分离的色谱图。
图5为HeLa细胞非变性裂解液二维阵列分离馏分的蛋白质定量结果。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明,而不是限制本发明的范围。
实施例中,采用如图1所示的阵列式二维液相色谱分离系统示意图进行蛋白质复合物分离;其包括一台第一维色谱泵1,一台第二维色谱泵2,一根离子交换色谱柱3,一支衍生补液注射器4,一个衍生反应补液三通5,一个衍生反应器6,一支终止反应补液注射器7,一个终止反应补液三通8,一个终止反应器9,一台多位分配阀10,八个分流三通11,八根反相捕集柱组成的阵列12,一个多通道分流器13,1个二位四通阀14,八根反相色谱柱组成的阵列15,八通道馏分收集器16组成。第一维色谱泵1与离子交换色谱柱3入口端相连;衍生反应补液三通5的三个接口分别连接离子交换色谱柱3出口端、衍生补液注射器4和衍生反应器6入口;终止反应补液三通8的三个接口分别连接衍生反应器6出口、终止补液注射器7和终止反应器9入口;终止反应器9出口与一台多位分配阀10入口相连;多位分配阀10的其中2个出口分别连接废液及色谱堵头;8个分流三通11的三个接口分别与多位分配阀10的其中8个出口、八根反相捕集柱组成的反相捕集柱阵列12的出口、八根反相色谱柱组成的反相色谱柱阵列15的入口相连;多通道分流器13的八个出口分别与八根反相捕集柱组成的反相捕集柱阵列12的入口相连;二位四通阀14的其中2个接口分别与第二维色谱泵2和多通道分流器13的入口相连;八根反相色谱柱组成的反相色谱柱阵列15的出口与八通道馏分收集器16入口相连。
实施例1
用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统的建立。
第一维色谱泵1及第二维色谱泵2均使用最大压力>40mPa的高压二元色谱泵。离子交换色谱3采用弱阴/弱阳混合离子交换色谱柱3(5 μm, 200 × 4.6 mm, 1000 Å)。第二维色谱泵2的固定相为苯乙烯基聚合物填料,反应捕集柱阵列12中的捕集柱采用(5 μm, 33×2.1 mm, 1000 Å)规格,反相色谱柱阵列15中的反相色谱柱采用(5 μm, 150× 2.1 mm,1000 Å)规格。衍生补液注射器4及终止补液注射器7使用最大量程为1000μL的玻璃平头注射器。衍生反应器6及终止反应器9使用总体积为2000μL的内径为500μm的不锈钢管制成。分离系统中所使用的管路均使用PEEK材质,内径为100μm。
实施例2
第二维液相色谱柱阵列平行性的考察。
将阵列式二维液相色谱分离系统中所使用的第二维液相色谱柱阵列中的每一根色谱柱单独进行分离效果考察,以确定第二维色谱柱阵列各通道的分离平行性。样品为HeLa细胞裂解液,浓度为10 mg/mL,上样量为100 μL。
流动相A为95%H2O,5%ACN,0.01%TFA;流动相B为5%H2O,95%ACN,0.01%TFA,流速为0.2mL/min,流动相梯度程序为0 min,5%B;1 min,5%B;40 min,70%B;42 min,100%B;50min,100%B;50.1min,0%B;75 min,0%B。色谱柱柱温25 ℃,使用紫外吸收检测器在215nm波长进行检测。
各通道的分离色谱图如图2所示,各通道的反相色谱柱均能对HeLa细胞裂解液进行有效分离,且各通道的分离色谱图相似,其主要色谱峰的保留时间相对平均偏差<2%。阵列式二维液相色谱分离系统中的第二维色谱柱阵列平行性可以实现多个通道的同时平行分离。
实施例3
使用所建立蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统进行HeLa细胞非变性裂解液分离分析。
在培养有HeLa细胞的培养皿中加入胰蛋白酶-EDTA溶液消解1 min后使用PBS漂洗获得细胞混悬液,1000 g离心10 min后获得细胞。使用非变性细胞裂解试剂(50 mM Tris,pH=7.5 + 150 mM NaCl + 10% 甘油 + 1% Triton-X-100 +5 mM EDTA,在使用前加入20×PMSF以使其终浓度为1 mM),按照每107个细胞加入500 μL上述非变性裂解试剂,4 ℃下混匀30 min,对细胞进行裂解以提取其中的蛋白质复合物。
所建立蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统平衡后,将含有4mg蛋白质总量的HeLa细胞非变性裂解液上样至离子交换色谱柱3。第一维色谱泵1使用流动相(流动相A:20 mM Tris-HCl,10%乙腈,pH=6.8;流动相B:20 mM Tris-HCl,1.5M NaCl,10%乙腈,pH=6.8)对其进行洗脱,流速为0.2 mL/min,柱温25 ℃。流动相梯度程序为0 min,0%B;10 min,0%B;80 min,45%B;100 min,60%B;105 min,100%B;120 min,100%B;120.1 min 0%B;150 min,0%B。使用紫外吸收检测器在215nm波长下对其进行检测。
衍生补液注射器4中加入37%甲醛,以0.2 mL/min流速泵出,使第一维流出液中的蛋白质复合物发生交联反应。终止补液注射器7中加入3mol/L甘氨酸,以0.2 mL/min流速泵出,猝灭交联反应。
HeLa细胞非变性裂解液使用离子交换色谱分离的色谱图及馏分切割情况如图3所示,主要包含蛋白质复合物的HeLa细胞非变性裂解液在离子交换色谱下得到有效分离。
多位分配阀10在初始状态下切换至废液位置。在40min时切换至通道1,此后每5min切换至下一通道,使衍生后的第一维流出液分配至各捕集柱,此后多位分配阀10切换至色谱堵头位置。此步骤分为两轮进行,在第一轮中,40min至80min的馏分被分别分配至第二维的通道1~8,命名为馏分A~H;在第二轮中,80min至120min的馏分被分别分配至第二维的通道1~8,命名为馏分I~P。
第二维色谱泵2使用流动相(流动相A:95%H2O,5%ACN,0.01%TFA;流动相B:5%H2O,95%ACN,0.01%TFA)对各捕集柱上的被捕集的蛋白质复合物其进行洗脱,总流速为1.6mL/min,分配至各通道的流速为0.2 mL/min,柱温25 ℃。流动相梯度程序为0 min,5%B;1 min,5%B;40 min,70%B;42 min,100%B;50 min,100%B;50.1min,0%B;75 min,0%B。使用紫外吸收检测器在215nm波长下对其进行检测。
第二维各通道的分离色谱图如图4所示,各馏分的主要物质流出时间均控制在16~40min之间。可见HeLa细胞非变性裂解液的第一维分离馏分在第二维色谱中分别得到了有效的分离,且各第一维馏分的第二维分离色谱图相差较大,其二维分离正交性较好。
第二维阵列分离的馏分使用多通道馏分收集器16进行同时收集,馏分收集间隔为1min,每个馏分的体积为200 μL。取出各通道的16~40min馏分,经过冻干、重溶后使用BCA蛋白质定量方法对其中所含的蛋白质复合物进行定量分析。各馏分的蛋白质定量结果如图5所示,可见各馏分内均含有一定的蛋白质复合物及蛋白质,相邻馏分之间的蛋白质浓度关系符合色谱峰流出规律,体现了阵列式二维液相色谱分离系统对于蛋白质复合物的深度高通量分离能力。

Claims (8)

1.一种用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统,其特征在于,其包括第一维色谱泵(1),第二维色谱泵(2),离子交换色谱柱(3),衍生补液注射器(4),衍生反应补液三通(5),衍生反应器(6),终止反应补液注射器(7),终止反应补液三通(8),终止反应器(9),多位分配阀(10),若干分流三通(11),反相捕集柱阵列(12),多通道分流器(13),二位四通阀(14),反相色谱柱组阵列(15),多通道馏分收集器(16);分流三通(11)的数目和反相捕集柱阵列(12)中的反相捕集柱的数目、反相色谱柱组阵列(15)中的反相色谱柱的数目、多通道馏分收集器(16)中的通道数相同;其中:
第一维色谱泵(1)与离子交换色谱柱(3)的入口端相连,离子交换色谱柱(3)的出口端连接衍生反应补液三通(5)的一个接口,衍生反应补液三通(5)的另外两个接口分别连接衍生补液注射器(4)、衍生反应器(6)的入口;衍生反应器(6)的出口连接终止反应补液三通(8)的一个接口,终止反应补液三通(8)的另外两个接口分别连接终止补液注射器(7)、终止反应器(9)的入口;终止反应器(9)的出口与多位分配阀(10)的入口相连;多位分配阀(10)的两个出口分别连接废液及色谱堵头,其余出口分别连接不同分流三通(11)的一个接口;
第二维色谱泵(2)与二位四通阀(14)的一个接口相连,二位四通阀(14)的另外一个接口连接多通道分流器(13)的入口,多通道分流器(13)的不同出口分别连接反相捕集柱阵列(12)中不同反相捕集柱的入口,反相捕集柱的出口分别和不同分流三通(11)的第二个接口连接;分流三通(11)的第三个接口分别与反相色谱柱阵列(15)的不同反相色谱柱的入口相连,反相色谱柱的出口与多通道馏分收集器(16)的入口相连。
2.根据权利要求1所述的阵列式二维液相色谱分离系统,其特征在于,第一维色谱泵(1),第二维色谱泵(2)所使用的固定相填料的孔径≥1000 Å。
3.根据权利要求1所述的阵列式二维液相色谱分离系统,其特征在于,反相捕集柱阵列(12)中的反相捕集柱的根数为2-48根。
4.根据权利要求3所述的阵列式二维液相色谱分离系统,其特征在于,反相捕集柱阵列(12)中的反相捕集柱的根数为8-30根。
5.根据权利要求1所述的阵列式二维液相色谱分离系统,其特征在于,反相色谱柱的长度大于反相捕集柱的长度。
6.一种利用权利要求1所述的用于蛋白质复合物分离的阵列式二维液相色谱分离系统进行色谱分离的方法,其特征在于,具体步骤如下:
待测非变性生物样品通过第一维色谱泵(1)自动进样至离子交换色谱柱(3);样品由第一维色谱泵(1)泵出的盐溶液进行梯度洗脱;
衍生补液注射器(4)泵出衍生试剂通过衍生反应补液三通(5)与离子交换色谱柱(3)洗脱所得流出液混合并进入衍生反应器(6)进行反应;终止补液注射器(7)泵出终止试剂通过终止反应补液三通(8)与衍生反应器(6)流出液混合并进入终止反应器(9)进行反应;终止反应器(9)流出液通过多位分配阀(10)及分流三通(11)被依次分配至反相捕集柱阵列(12)的所有通道进行捕集;各通道的流出液通过二位四通阀(14)排入废液;切换二位四通阀(14)并使用第二维色谱泵(2)对反相捕集柱阵列(12)的所有通道进行洗脱;洗脱液通过反相色谱柱阵列(15)进行深度分离并通过多通道馏分收集器(16)进行收集。
7.根据权利要求6所述的阵列式二维液相色谱分离系统,其特征在于,衍生试剂为甲醛溶液;终止试剂为甘氨酸溶液。
8.根据权利要求6所述的阵列式二维液相色谱分离系统,其特征在于,衍生反应器(6)、终止反应器(9)内混合液的温度为37℃。
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