CN106645506B - 一种三维液相色谱分离系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三维高效液相色谱分离系统，包括高效液相色谱泵，自动进样器，液相色谱柱，柱温箱，二位多通阀，捕集柱，梯度混合器和检测器。本发明通过引入第一维高效液相色谱泵和第一维液相色谱柱，实现了复杂样品体系的简化，结合后续全二维液相色谱分离，实现三维高效液相色谱系统卓越的分离能力。其特点在于第一维选择合适的色谱柱固定相实现复杂样品体系的预分离。第二维分离在低流速下进行，与第三维分离速度相协调。第三维使用短柱，在高流速下实现快速梯度分离。各维分离通过捕集柱连接，并使用稀释液辅助化合物捕集。本发明通过选择不同的色谱柱固定相和流动相组合，实现对复杂体系如植物，环境，血样，尿样，组织等样品高效分离。
Description
技术领域
本发明属于一种高效液相色谱分离系统，具体涉及一种三维超高效液相色谱分离系统。
背景技术
随着分离技术的发展，探寻并分离复杂样品体系中的成分已成为热点研究领域。多维液相色谱正是基于这一研究热点发展起来的分离技术。与传统的一维液相色谱分析方法相比，多维液相色谱技术通过提高峰容量有效改善复杂样品成分分离的分离度。由于技术限制，目前最常见的为二维液相色谱系统。根据感兴趣组份的不同，二维液相色谱方法包括全二维和中心切割两种模式。全二维液相色谱是指样品体系中的全部组份均经历两次不同模式的色谱分离，而中心切割二维液相色谱是指第一维分离后对部分组份进行收集并进入第二维进行分离。
最常见的二维液相色谱接口技术有3种：基于样品环的接口技术；基于捕集柱的接口技术；基于停留模式的接口技术。基于样品环的接口技术是最常用的接口技术，但是，为了与第二维分析速度匹配，样品环的体积即第二维的进样体积通常很大，造成很严重的溶剂效应。基于捕集柱的接口技术通过在保留化合物的同时去除溶剂，有效的避免了这一问题，但是由于溶剂不兼容，化合物在捕集过程中的丢失是这种接口技术最大的弊端。停留模式可以避免第二维分离速度对第一维分析的影响，但是使用这种接口技术进行全二维分析十分费时。
实际样品中化合物组成十分复杂且性质差别非常大。对于不同的第一维馏分，第二维分离时使用等度或者相同梯度条件往往不能得到很好的分离。虽然第二维使用逐渐变化的梯度模式可以在一定程度上改善方法的分辨率，但是这种梯度模式不仅构建比较困难，对于正交性较好的二维液相色谱系统可行性较小。基于二维液相色谱系统以上所述问题，本发明构建了一种三维液相色谱系统，在复杂样品进入全二维系统分析前，选择合适的色谱柱将其根据性质不同分为几个馏分，然后根据每个馏分的性质针对性的建立全二维的方法，那么可以进一步提高方法的分辨率。此外，采用捕集柱收集色谱分离所得的馏分，并在化合物进入捕集柱前引入稀释液以提高捕集效率。
综上所述，本发明所构建的三维液相色谱系统，适用于复杂样品体系如植物提取物，血样，尿样等的分离。根据被分析样品的不同选择不同的色谱柱组合，系统构建灵活。与质谱联用可进一步提高分辨率，在复杂体系分离分析中有非常广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是基于上述多维液相色谱现有技术中存在的一些问题，提供一种三维超高效液相色谱装置。使用停留模式与中心切割技术相结合，引入第一维预分离，将复杂样品预分离成几个性质相近的馏分，结合后续全二维液相色谱分离，实现复杂样品组份的高效分离。此外通过引入稀释液提高化合物在捕集柱上的捕集效率。
本发明涉及的三维高效液相色谱装置包括包括自动进样器、混合器1、混合器2，稀释液泵、液相色谱泵1、液相色谱泵2、液相色谱泵3、液相色谱柱1、液相色谱柱2、液相色谱柱3、捕集柱1、捕集柱2、捕集柱3、八通阀或六通阀(9)、八通阀(24)、十通阀(38)、和检测器；
通过控制二位多通阀的位置，这种三维液相色谱分离系统分为上样位和洗脱位；在上样位，作为第1维液相泵的液相色谱泵1输出端流经自动进样器后与作为第1维色谱柱的液相色谱柱1输入端连接，液相色谱柱1输出端与混合器1的一个输入端连接；稀释液泵的输出端与八通阀或六通阀(9)的5号位连接，八通阀或六通阀的6号位与混合器1的另一输入端连接；混合器1的输出端与八通阀(24)的16号位连接，八通阀的17号位与捕集柱1的输入端相连，捕集柱1的输出端与八通阀(24)的20号位连接，八通阀的21号位为废液口；作为第2维液相泵的液相色谱泵2输出端与八通阀(24)的19号位连接，八通阀的18号位与液相色谱柱2的输入端连接，液相色谱柱2的输出端与混合器2的一个输入端连接；混合器2的另一输入端与八通阀或六通阀(9)的4号位连接，八通阀或六通阀的3号位用塞子堵死；混合器2的输出端与十通阀(38)的28号位连接，十通阀的29号位与34号位通过管线连接，35号位与捕集柱3的输入端连接，捕集柱3的输出端与十通阀(38)的33号位连接，十通阀的32号位为废液口。作为第3维液相泵的液相色谱泵3输出端与十通阀(38)的36号位连接，十通阀的37号位与捕集柱2的输入端连接，捕集柱2的输出端与十通阀(38)的31号位连接，十通阀的30号位与液相色谱柱3的输入端连接，液相色谱柱3的输出端接入检测器；上述十通阀(38)每0.5分钟至2分钟切换一次；
在洗脱位，作为第1维液相泵的液相色谱泵1输出端流经自动进样器后与作为第1维色谱柱的液相色谱柱1输入端连接，液相色谱柱1输出端与混合器1的一个输入端连接；混合器1的另一输入端与八通阀或六通阀(9)的6号位连接，八通阀或六通阀的7号位用塞子堵死；混合器1的输出端接入八通阀(24)的16号位连接，八通阀的23号位用塞子堵死，同时液相色谱泵1停止给液；作为第二维液相泵的液相色谱泵2输出端与八通阀(24)的19号位连接，八通阀的20号位与捕集柱1的输入端连接，捕集柱1的输出端与八通阀(24)的17号位连接，八通阀的18号位与色谱柱2的输入端相连，色谱柱2的输出端接入混合器2的一个输入端；稀释液泵的输出端与八通阀或六通阀(9)的5号位连接，八通阀或六通阀的4号位与混合器2的另一输入端连接，混合器2的输出端与十通阀(38)的28号位连接，十通阀的29号位与34号位通过管线连接，35号位与捕集柱3的输入端连接，捕集柱3的输出端与十通阀(38)的33号位连接，十通阀的32号位为废液口；作为第3维液相泵的液相色谱泵3的输出端与十通阀(38)的36号位连接，十通阀的37号位与捕集柱2的输入端连接，捕集柱2的输出端与与十通阀(38)的31号位连接，十通阀的30号位与液相色谱柱3连接，液相色谱柱3的输出端接入检测器；上述十通阀(38)每0.5至2分钟切换一次。
所述液相色谱泵1、液相色谱泵2、液相色谱泵3均为高效液相色谱泵，为单泵或者二元泵。
所述八通阀或六通阀(9)的3号位和7号位，八通阀(24)的22号位和23号位，均使用塞子堵死。
所述检测器为：质谱检测器，具体为离子阱-飞行时间质谱。
上样位所述稀释液辅助化合物在捕集柱1上的保留，洗脱位所述稀释液辅助化合物在捕集柱2和捕集柱3上的保留。
混合器1可以根据色谱柱1和上样位所述稀释液的流速选择合适的体积。混合器2可以根据色谱柱2和洗脱位所述稀释液的流速选择合适的体积。
第1维液相色谱分离通过中心切割的方式简化复杂样品体系。
第1维液相色谱系统通过停留模式与后续全二维液相色谱体系相连。
本发明最核心的过程是：复杂样品体系中的化合物经第一维预分离后与稀释液混合并有效的保留在捕集柱上，然后通过二位八通阀切换到后续第二维和第三维色谱柱所构建的全二维系统中进一步分离。
根据本发明提供的三维液相色谱系统，选择不同固定相和流动相组合，可以实现对复杂体系如植物，环境，血样，尿样，组织等样品的高效分离。
附图说明
图1为本发明提供的三维液相色谱系统的装置图；
图2为本发明系统装置图及上样位流程图；
图3为本发明系统装置图及洗脱位流程图；
图1-图3中，9为六通阀或八通阀，1-8为六通阀或八通阀的接口，10为液相色谱泵1，11为自动进样器，12为液相色谱柱1，13为混合器1，14为稀释液泵，15为捕集柱1，24为八通阀，16-23为八通阀接口，25为液相色谱泵2，26为液相色谱柱2，27为混合器2，38为十通阀，28-37为十通阀接口，39为液相色谱泵3，40为捕集柱2，41为捕集柱3，42为液相色谱柱3，43为检测器。
图4为本发明系统对大豆提取物进行分离，其第一个馏分的色谱图(见实施例)。图中横坐标为第二维保留时间(min)，纵坐标为第三维保留时间(s)。
图5为本发明系统对大豆提取物进行分离，其第二个馏分的色谱图(见实施例)。图中横坐标为第二维保留时间(min)，纵坐标为第三维保留时间(s)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1：三维高效液相色谱体系构建
本发明系统装置包括自动进样器、混合器1、混合器2，稀释液泵、液相色谱泵1、液相色谱泵2、液相色谱泵3、液相色谱柱1、液相色谱柱2、液相色谱柱3、捕集柱1、捕集柱2、捕集柱3、八通阀(9)、八通阀(24)、十通阀、和离子阱-飞行时间质谱。通过控制二位多通阀的位置，这种三维液相色谱分离系统分为上样位和洗脱位。
如图2所示为上样位，作为第1维液相泵的液相色谱泵1输出端流经自动进样器后与作为第1维色谱柱的液相色谱柱1输入端连接，液相色谱柱1输出端与混合器1的一个输入端连接；稀释液泵的输出端与八通阀(9)的5号位连接，八通阀的6号位与混合器1的另一输入端连接；混合器1的输出端与八通阀(24)的16号位连接，八通阀的17号位与捕集柱1的输入端相连，捕集柱1的输出端与八通阀(24)的20号位连接，八通阀的21号位为废液口；作为第2维液相泵的液相色谱泵2输出端与八通阀(24)的19号位连接，八通阀的18号位与液相色谱柱2的输入端连接，液相色谱柱2的输出端与混合器2的一个输入端连接；混合器2的另一输入端与八通阀(9)的4号位连接，八通阀的3号位用塞子堵死；混合器2的输出端与十通阀(38)的28号位连接，十通阀的29号位与34号位通过管线连接，35号位与捕集柱3的输入端连接，捕集柱3的输出端与十通阀(38)的33号位连接，十通阀的32号位为废液口。作为第3维液相泵的液相色谱泵3输出端与十通阀(38)的36号位连接，十通阀的37号位与捕集柱2的输入端连接，捕集柱2的输出端与十通阀(38)的31号位连接，十通阀的30号位与液相色谱柱3的输入端连接，液相色谱柱3的输出端接入检测器；上述十通阀38每1分钟切换一次；
如图3所示为洗脱位，作为第1维液相泵的液相色谱泵1输出端流经自动进样器后与作为第1维色谱柱的液相色谱柱1输入端连接，液相色谱柱1输出端与混合器1的一个输入端连接；混合器1的另一输入端与八通阀(9)的6号位连接，八通阀的7号位用塞子堵死；混合器1的输出端接入八通阀(24)的16号位连接，八通阀的23号位用塞子堵死，同时液相色谱泵1停止给液；作为第二维液相泵的液相色谱泵2输出端与八通阀(24)的19号位连接，八通阀的20号位与捕集柱1的输入端连接，捕集柱1的输出端与八通阀(24)的17号位连接，八通阀的18号位与色谱柱2的输入端相连，色谱柱2的输出端接入混合器2的一个输入端；稀释液泵的输出端与八通阀(9)的5号位连接，八通阀的4号位与混合器2的另一输入端连接，混合器2的输出端与十通阀(38)的28号位连接，十通阀的29号位与34号位通过管线连接，35号位与捕集柱3的输入端连接，捕集柱3的输出端与十通阀(38)的33号位连接，十通阀的32号位为废液口；作为第3维液相泵的液相色谱泵3的输出端与十通阀(38)的36号位连接，十通阀的37号位与捕集柱2的输入端连接，捕集柱2的输出端与与十通阀(38)的31号位连接，十通阀的30号位与液相色谱柱3连接，液相色谱柱3的输出端接入检测器；上述十通阀每1分钟切换一次。
在本实施例中，液相色谱泵1为二元高效液相色谱泵，液相色谱泵2为两个高效液相色谱单泵组合，液相色谱泵3为两个超高效液相色谱泵组合，稀释液泵为一个高效液相色谱单泵。混合器1的体积为100μL。混合器1的体积为20μL。
实施例2：复杂样品体系分离
样品：大豆80％甲醇提取物。
具体提取过程如下：准确称量大豆干粉60mg，加入1.5mL 80％甲醇，涡旋10分钟，超声1小时；4℃下以14000rpm的速度离心15分钟；取1.4mL上层清液真空冷冻干燥。进样前使用400μL 80％甲醇复溶；进样量为10μL。
第一维液相色谱参数：液相色谱柱1：BEH Amide柱(1.7μm，2.1×100mm)。流动相A1为含有10mM甲酸铵的乙腈/水溶液(乙腈/水＝40/60，v/v)，流动相B1为含有10mM甲酸铵的乙腈/水溶液(乙腈/水＝95/5，v/v)。流速0.15mL/min。柱温为室温。
第二维液相色谱参数：液相色谱柱2：Fluoro-Phenyl柱(3.5μm，2.1×50mm)。流动相A2为含有体积分数0.1％甲酸的水溶液，流动相B2为含有体积分数0.1％甲酸的乙腈。流速0.025mL/min。柱温为室温。
第三维液相色谱参数：液相色谱柱3：SB-C18柱(1.8μm，2.1×50mm)。流动相A3为含有体积分数0.1％甲酸的水溶液，流动相B3为含有体积分数0.1％甲酸的甲醇。流速1mL/min。柱温为90℃。
捕集柱1、2、3参数：BEH C18柱(1.7μm，2.1×5mm)。其中捕集柱1为两根C18柱串联，捕集柱2和3为单根C18捕集柱。
稀释液泵中的稀释液为含有体积分数0.1％甲酸的水溶液。在上样位，稀释液流速为2mL/min，在洗脱位，稀释液流速为0.5mL/min。
本实施例中复杂样品体系大豆提取物经过第一维预分离后被分为两个馏分并被保留在捕集柱1上。其中馏分1为在柱1上不保留的非极性化合物。馏分2为中等极性和强极性化合物。
三维液相色谱梯度条件如下表所示：
经GCImage软件处理后，馏分1的二维色谱图如图4所示，馏分2的二维色谱图如图5所示。
Claims (4)
1.一种三维液相色谱分离系统，其特征在于：
包括自动进样器（11）、混合器1（13）、混合器2（27），稀释液泵（14）、液相色谱泵1（10）、液相色谱泵2（25）、液相色谱泵3（39）、液相色谱柱1（12）、液相色谱柱2（26）、液相色谱柱3（42）、捕集柱1（15）、捕集柱2（40）、捕集柱3（41）、八通阀a或六通阀（9）、八通阀b（24）、十通阀（38）、和检测器（43）；
通过控制二位多通阀的位置，这种三维液相色谱分离系统分为上样位和洗脱位；在上样位，作为第1维液相泵的液相色谱泵1输出端流经自动进样器后与作为第1维色谱柱的液相色谱柱1输入端连接，液相色谱柱1输出端与混合器1的一个输入端连接；稀释液泵的输出端与八通阀a或六通阀（9）的5号位连接，八通阀a或六通阀的6号位与混合器1的另一输入端连接；混合器1的输出端与八通阀b（24）的16号位连接，八通阀b的17号位与捕集柱1的输入端相连，捕集柱1的输出端与八通阀b（24）的20号位连接，八通阀b的21号位为废液口；作为第2维液相泵的液相色谱泵2输出端与八通阀b（24）的19号位连接，八通阀b的18号位与液相色谱柱2的输入端连接，液相色谱柱2的输出端与混合器2的一个输入端连接；混合器2的另一输入端与八通阀a或六通阀（9）的4号位连接，八通阀a或六通阀的3号位用塞子堵死；混合器2的输出端与十通阀（38）的28号位连接，十通阀的29号位与34号位通过管线连接，35号位与捕集柱3的输入端连接，捕集柱3的输出端与十通阀（38）的33号位连接，十通阀的32号位为废液口；作为第3维液相泵的液相色谱泵3输出端与十通阀（38）的36号位连接，十通阀的37号位与捕集柱2的输入端连接，捕集柱2的输出端与十通阀（38）的31号位连接，十通阀的30号位与液相色谱柱3的输入端连接，液相色谱柱3的输出端接入检测器；上述十通阀（38）每0.5分钟至2分钟切换一次；
在洗脱位，作为第1维液相泵的液相色谱泵1输出端流经自动进样器后与作为第1维色谱柱的液相色谱柱1输入端连接，液相色谱柱1输出端与混合器1的一个输入端连接；混合器1的另一输入端与八通阀a或六通阀（9）的6号位连接，八通阀a或六通阀的7号位用塞子堵死；混合器1的输出端接入八通阀b（24）的16号位连接，八通阀b的23号位用塞子堵死，同时液相色谱泵1停止给液；作为第二维液相泵的液相色谱泵2输出端与八通阀b（24）的19号位连接，八通阀b的20号位与捕集柱1的输入端连接，捕集柱1的输出端与八通阀b（24）的17号位连接，八通阀b的18号位与色谱柱2的输入端相连，色谱柱2的输出端接入混合器2的一个输入端；稀释液泵的输出端与八通阀a或六通阀（9）的5号位连接，八通阀a或六通阀的4号位与混合器2的另一输入端连接，混合器2的输出端与十通阀（38）的28号位连接，十通阀的29号位与34号位通过管线连接，35号位与捕集柱3的输入端连接，捕集柱3的输出端与十通阀（38）的33号位连接，十通阀的32号位为废液口；作为第3维液相泵的液相色谱泵3的输出端与十通阀（38）的36号位连接，十通阀的37号位与捕集柱2的输入端连接，捕集柱2的输出端与与十通阀（38）的31号位连接，十通阀的30号位与液相色谱柱3连接，液相色谱柱3的输出端接入检测器；上述十通阀（38）每0.5至2分钟切换一次。
2.如权利要求1所述的三维液相色谱分离系统，其特征在于：所述液相色谱泵1（10）、液相色谱泵2（25）、液相色谱泵3（39）均为高效液相色谱泵，为单泵或者二元泵。
3.如权利要求1所述的三维液相色谱分离系统，其特征在于：所述八通阀a或六通阀（9）的3号位和7号位，八通阀b（24）的22号位和23号位，均使用塞子堵死。
4.如权利要求1所述的三维液相色谱分离系统，其特征在于：所述检测器（43）为：质谱检测器。
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