CN109030686B - 一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法，包括三套输液泵系统、三支色谱柱、两个切换阀。本发明将三种不同保留机制色谱柱在线联用，通过对切换阀的控制，使目标蛋白质选择性通过三支色谱柱逐级纯化，从而制备高纯度蛋白质。本发明集三种保留机制色谱柱于一体，可以连续操作，自动化程度高，重现性好。实现一次进样，一步到位纯化出高纯度目标蛋白质。相对传统的离线分离模式，既避免了样品分次分别收集、富集、再进样等处理过程中的损失，又降低了样品在处理过程中变性、被污染等风险，还大大节省了分步处理的时间及人工成本。

Description

一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法

技术领域

本发明属于生物医药纯化装置领域，具体涉及一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法。

背景技术

基因工程药物、单克隆抗体、重组疫苗等药物本质上均为蛋白质，生物药相对传统小分子药，具有活性强、特异性强、生物功能明确等优点。蛋白提取过程难以控制，提纯产量低是生物药开发的瓶颈。据报道，生物药下游工艺成本占药物生产成本的80％，可见纯化工艺对生物药的推广影响重大。近年来，生物医药产业迅猛发展，蛋白纯化技术的瓶颈也日益凸显。生物药作为一类大分子提取物，其免疫原性较小分子化合物更为明显，因此生物药的纯度直接关联其品质，而目前对生物药精制最好的手段是色谱法。利用凝胶过滤、离子交换色谱、吸附色谱、亲和色谱等对蛋白进行多重的分离纯化，可精制出高纯度的蛋白药物。但色谱分离方法耗时较长；产量较低；多种保留机制色谱的使用，需要对样品进行多次富集、进样操作，样品损失大；纯化过程自动化程度低；工作量大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法，来解决目前蛋白色谱纯化过程中，多重离线纯化工艺繁琐、耗时耗力等问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种三维液相色谱蛋白纯化装置，包括：第一切换阀、第二切换阀、第一色谱柱、第二色谱柱、第三色谱柱、第一泵系统、第二泵系统、第三泵系统、废液池和馏分池，

所述第一泵系统的出口端通过管路连接第一色谱柱的进口端，所述第一切换阀的1号位通过管路与所述第一色谱柱的出口端连接，2号位通过管路与所述第二色谱柱的进口端连接，3号位通过管路与所述第二泵系统的出口端连接，4号位通过管路与所述第二切换阀的1号位连接，5号位通过管路与所述第二色谱柱的出口端连接，6号位通过管路与所述废液池的进口端连接，

所述第二切换阀的1号位通过管路与所述第一切换阀的4号位连接，2号位通过管路与所述第三色谱柱的进口端连接，3号位通过管路与所述第三泵系统的出口端连接，4号位通过管路与所述废液池的进口端或所述馏分池的进口端连接，5号位通过管路与所述第三色谱柱的出口端连接，6号位通过管路与所述废液池的进口端连接。

作为本发明所述一种三维液相色谱蛋白纯化装置的一种优选方案，所述三维液相色谱蛋白纯化装置还包括第三切换阀，所述第三切换阀设置在与所述第二切换阀的4号位连接的管路上，通过所述第三切换阀控制液体流向所述废液池的进口端或所述馏分池的进口端。

作为本发明所述一种三维液相色谱蛋白纯化装置的一种优选方案，所述第一切换阀和第二切换阀为六通阀、八通阀或十通阀中的任意一种。

作为本发明所述一种三维液相色谱蛋白纯化装置的一种优选方案，所述第一色谱柱、第二色谱柱和第三色谱柱的基质材料为硅胶、葡聚糖、琼脂糖或聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。

作为本发明所述一种三维液相色谱蛋白纯化装置的一种优选方案，所述第一色谱柱、第二色谱柱和第三色谱柱为疏水相互作用色谱柱、离子交换色谱柱或体积排阻色谱柱中的任意一种。

作为本发明所述一种三维液相色谱蛋白纯化装置的一种优选方案，所述疏水相互作用色谱柱的键合相为C18、C8、C4、苯基中的任意一种。

作为本发明所述一种三维液相色谱蛋白纯化装置的一种优选方案，所述离子交换色谱柱为强阳离子交换色谱柱、强阴离子交换色谱柱、弱阳离子交换色谱柱或弱阴离子交换色谱柱中的任意一种。

作为本发明所述一种三维液相色谱蛋白纯化装置的一种优选方案，所述第一泵系统、第二泵系统和第三泵系统为高压恒流泵、中压恒流泵、柱塞泵、注射泵或隔膜泵中的任意一种，所述第一泵系统、第二泵系统和第三泵系统为单个泵等度运行或者两个泵组成梯度运行。

本发明还提供一种三维液相色谱蛋白纯化装置的使用方法，包括步骤：

(1)当第一切换阀的1号位与6号位连通、2号位与3号位连通、4号位与5号位连通时，第一切换阀处于A位置，当第二切换阀的1号位与6号位连通、2号位与3号位连通、4号位与5号位连通时，第二切换阀处于A位置，设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于上样状态，第二色谱柱和第三色谱柱处于柱平衡状态，第一泵系统输送液体经第一色谱柱入第一切换阀的1号位，经6号位直接流入废液池；

(2)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于除前杂状态，第二色谱柱和第三色谱柱处于柱平衡状态，维持此状态直至第一色谱柱上的前杂蛋白洗脱完毕；

(3)当第一切换阀的1号位与2号位连通、3号位与4号位连通、5号位与6号位连通时，第一切换阀处于B位置,设置第一切换阀处于B位置，第二切换阀处于A位置,第一色谱柱处于洗脱状态，第二色谱柱处于富集状态，第三色谱柱处于平衡状态，当第一泵系统输出的液体浓度逐渐降低，第一色谱柱上目的蛋白开始洗脱出来，第一切换阀置于位置B，第一色谱柱与第一切换阀的1号位相连，流动相经2号位流入第二色谱柱，再经第一切换阀的5号位，从第一切换阀的6号位直接流入废液池，第二泵系统输出流动相进入第一切换阀的3号位，经第一切换阀的4号位流出至第二切换阀的1号位，第二切换阀置于位置A，经第二切换阀的6号位直接流入废液池；

(4)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于除后杂状态，第二色谱柱处于除前杂状态，第三色谱柱处于平衡状态，当第二色谱柱富集完毕，第一切换阀置于位置A，第一色谱柱洗脱的后杂蛋白直接流入废液池，同时启动第二泵系统，第二切换阀置于位置A，第二泵系统输出流动相从第一切换阀的3号位经2号位，流入第二色谱柱，第二色谱柱洗脱的前杂蛋白经第一切换阀的5号位从4号位流出，流入第二切换阀的1号位，经第二切换阀的6号位直接流入废液池；

(5)当第二切换阀的1号位与2号位连通、3号位与4号位连通、5号位与6号位连通时，第二切换阀处于B位置，设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于B位置,第一色谱柱处于平衡状态，第二色谱柱处于洗脱状态，第三色谱柱处于富集状态，当第二色谱柱中前杂蛋白洗脱完毕，第二切换阀切换至位置B，第二色谱柱洗脱的目的蛋白经第一切换阀的3号位流出，流经第二切换阀的1号位，并从第二切换阀的2号位流入第三色谱柱，进一步进行分子排阻纯化，此时第一切换阀仍置于位置A，对第一色谱柱进行再生及平衡处理；

(6)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于上样状态，第二色谱柱处于除后杂状态，第三色谱柱处于除前杂状态，第二色谱柱上目的蛋白洗脱完毕，第二切换阀置于状态A，第二色谱柱洗脱的后杂蛋白经第二切换阀的6号位直接流入废液池，启动第三泵系统，第三泵系统输出流动相纯水从第二切换阀的3号位经2号位流入第三色谱柱，对目的蛋白进一步洗脱纯化，第三色谱柱洗脱的前杂蛋白流入废液池，此时，第一色谱柱再生完毕，再次进样；

(7)设置第一切换阀处于B位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于除前杂状态，第二色谱柱处于平衡状态，第三色谱柱处于洗脱状态，再次进样后第一切换阀置于位置B，第一色谱柱洗脱前杂蛋白经第二色谱柱后直接流入废液池，第二切换阀置于位置A，第三色谱柱洗脱的目的蛋白进入馏分池进行收集，同时对第二色谱柱进行再生及平衡处理；

(8)设置第一切换阀处于B位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于洗脱状态，第二色谱柱处于富集状态，第三色谱柱处于除后杂状态，待第一色谱柱中第二次进样的目的蛋白开始洗脱，第一切换阀置于位置B，蛋白流入第二色谱柱进行富集，同时第三色谱柱继续在第三泵系统流动相的淋洗下进行后杂蛋白的洗脱；

(9)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置；第一色谱柱处于除后杂状态，第二色谱柱处于除前杂状态，第三色谱柱处于平衡状态，待第一色谱柱目的蛋白洗脱完毕，将第一切换阀切换至位置A，第二切换阀仍置于位置A，第一色谱柱后杂蛋白经第一切换阀4号位流入第二切换阀的1号位，经6号位直接流入废液池，同时对第三色谱柱进行再生及平衡处理；

(10)连续上样运行，重复步骤(4)-(8)。

与现有技术相比，本发明提出的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法，一次进样，在线依序多重色谱纯化，实现目的蛋白的快速、高效纯化，具有耗时少、重现性好、纯度高、污染低等优点，与现有离线分离纯化技术相比，本发明具有明显的优势：

(1)本发明将多种保留机制的色谱柱串联，实现一次进样，在线多重色谱分离纯化，一步到位制备出高纯度目的蛋白；

(2)各级色谱柱可交替换成富集、洗脱、再生等过程，支持连续进样；

(3)本发明一体化装置，节省离线多级纯化进样、集样、浓缩等操作的时间及人工成本，并有效避免人工操作带来的污染和样品的损失；

(4)本发明实现目的蛋白在线自动多级纯化，操作更便捷，产率更高，结合连续进样的特点，能极大提高蛋白纯化的产量。

(5)本发明一步到位，自动化程度高，有更高的重现性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，

图1为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤1、2的连接状态示意图；

图2为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤3的连接状态示意图；

图3为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤4的连接状态示意图；

图4为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤5的连接状态示意图；

图5为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤6的连接状态示意图；

图6为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤7的连接状态示意图；

图7为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤8的连接状态示意图；

图8为本发明的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法在实施例1中的步骤9的连接状态示意图。

其中：V1为第一切换阀、V2为第二切换阀、V3为第三切换阀、P1为第一泵系统、P2为第二泵系统、P3为第三泵系统、Z1为第一色谱柱、Z2为第二色谱柱、Z3为第三色谱柱、W为废液池、T为馏分池。

具体实施方式

本发明所述的一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法，将多种不同保留机制色谱在线联用，各色谱柱进样后可依序再生实现循环使用。通过阀的切换对目的蛋白进行多级纯化，实现一次进样，在线依次多级纯化，一步到位式地有效纯化出高纯度的目的蛋白，其中第一级纯化机理为疏水相互作用层析。高离子强度流动相条件下，增进蛋白质与疏水性色谱填料的疏水相互作用，继而降低流动相离子强度，削弱蛋白质分子与层析介质的疏水作用，实现目的蛋白的分离。第二级纯化机理为离子交换层析。通过疏水相互作用层析纯化后的目的蛋白，在不同pH缓冲液条件下所带净电荷不同，在离子交换色谱柱中表现出不同的色谱保留行为。第三级纯化机理可为凝胶过滤层析，依次经过疏水相互作用层析和离子交换层析的目的蛋白，因蛋白分子量大小的差异，可在凝胶过滤层析色谱中实现较好的分离，从而实现高纯目的蛋白的提取。

同时，根据纯化的需求，不同保留机制的色谱柱可依序进行平衡、保留、洗脱、再生操作，保证系统能连续多次进样。三套液相系统提供三支色谱柱样品洗脱、色谱柱再生等功能所需流动相的动力系统。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，表示一种三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法结构的示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

实施例1

第一色谱柱Z1为苯基琼脂糖疏水相互作用层析柱，规格310*26mm；第二色谱柱Z2为二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖凝胶弱阴离子交换柱，规格310*26mm；第三色谱柱Z3为葡聚糖和环氧氯丙烷交联分子排阻层析柱，规格310*26mm。在线多级纯化蛋白装置如图1所示，包括第一泵系统P1(A相、B相分别为P1A和P1B)、第二泵系统P2(A相、B相分别为P2A和P2B)、第三泵系统P3三套泵系统；第一切换阀V1和第二切换阀V2，其中切换阀各有1-6号共6个连接位点，并有A和B两种工作位置。其中第一泵系统P1与第一色谱柱Z1相连，第一色谱柱Z1与第一切换阀V1的1号位相连；第二泵系统P2与第一切换阀V1的3号位相连；第三泵系统P3与第二切换阀V2的3号位相连。当第一切换阀V1置于位置A时，1号位与6号位相连、2号位与3号位连通、4号位与5号位连通；当第一切换阀V1置于位置B时，1号位与2号位相连，3号位与4号位连通、5号位与6号位连通；液体流经第二色谱柱Z2回到第一切换阀V1的5号位，最后从4号位流出，注入第二切换阀V2的1号位。第二切换阀V2置于位置A，1号位与6号位相连、2号位与3号位连通、4号位与5号位连通；当第二切换阀V2置于位置B，1号位与2号位相连、3号位与4号位连通、5号位与6号位连通，流经第三色谱柱Z3回到第二切换阀V2的5号位，最后从3号位或4号位流出，注入馏分池或废液池。

上述装置的运行方式如下：

步骤1.如图1所示，第一切换阀V1处于A位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于上样状态，第二色谱柱Z2和第三色谱柱Z3处于柱平衡状态。第一泵系统P1输送高浓度磷酸盐缓冲盐，第一切换阀V1置于位置A，第一色谱柱Z1与第一切换阀V1的1号位相连，流动相经第一色谱柱Z1后流经第一切换阀V1的1号位和6号位直接流入废液池W。

步骤2.如图1所示，第一切换阀V1处于A位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于除前杂状态，第二切换阀V2和第三色谱柱Z3处于柱平衡状态。维持此状态直至第一色谱柱Z1上的前杂蛋白洗脱完毕。

步骤3.如图2所示，第一切换阀V1处于B位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于洗脱状态，第二色谱柱Z2处于富集状态，第三色谱柱Z3处于平衡状态。当P1A和P1B输出缓冲盐浓度逐渐降低，第一色谱柱Z1上目的蛋白开始洗脱出来，此时将第一切换阀V1置于位置B，第一色谱柱Z1与第一切换阀V1的1号位相连，流动相经第一色谱柱Z1后流经第一切换阀V1的1号位和2号位，流入第二色谱柱Z2，最后经第一切换阀V1的5号位，从6号位流出，直接流入废液池。P2A和P2B输出的液体经3号位流入第一切换阀V1，并从第一切换阀V1的4号位注入第二切换阀V2的1号位。第一泵系统P1输出的流动相带着目的蛋白经第一切换阀V1流入第二色谱柱Z2，第二色谱柱Z2可对目的蛋白进行有效保留。将第二切换阀V2置于位置A，P1A和P1B输出流动相从第二切换阀V2的1号位，经第二切换阀V2的6号位直接流入废液池。

步骤4.如图3所示，第一切换阀V1处于A位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于除后杂状态，第二色谱柱Z2处于除前杂状态，第三色谱柱Z3处于平衡状态。当第二色谱柱Z2富集完毕，将第一切换阀V1置于位置A，第一色谱柱Z1洗脱的后杂蛋白直接流入废液池；同时启动第二泵系统P2，将第二切换阀V2置于位置A，P2A和P2B输出流动相从第一切换阀V1的3号位流经第一切换阀V1的2号位，流入第二色谱柱Z2，第二色谱柱Z2洗脱的前杂蛋白经第一切换阀V1的5号位从4号位流出，流入第二切换阀V2的1号位，经第二切换阀V2的6号位直接流入废液池W。

步骤5.如图4所示，第一切换阀V1处于A位置，第二切换阀V2处于B位置；第一色谱柱Z1处于平衡状态，第二色谱柱Z2处于洗脱状态，第三色谱柱Z3处于富集状态。当第二色谱柱Z2中前杂蛋白洗脱完毕，将第二切换阀V2切换至位置B，第二色谱柱Z2洗脱的目的蛋白从第一切换阀V1的5号位流入由第一切换阀V1的3号位流出，流经第二切换阀V2的1号位，并从第二切换阀V2的2号位流入第三色谱柱Z3，进一步进行分子排阻纯化，此时第一切换阀V1仍置于位置A，可对第一色谱柱Z1进行再生及平衡处理。

步骤6.如图5所示，第一切换阀V1处于A位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于上样状态，第二色谱柱Z2处于除后杂状态，第三色谱柱Z3处于除前杂状态。第二色谱柱Z2上目的蛋白洗脱完毕，将第二切换阀V2置于状态A，第二色谱柱Z2洗脱的后杂蛋白经第二切换阀V2的6号位直接流入废液池。启动泵3，P3输出流动相纯水从第二切换阀V2的3号位经第二切换阀V2的2号位流入第三色谱柱Z3，对目的蛋白进一步洗脱纯化，第三色谱柱Z3洗脱的前杂蛋白流入废液池。此时，第一色谱柱Z1再生完毕，可再次进样。

步骤7.如图6所示，第一切换阀V1处于B位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于除前杂状态，第二色谱柱Z2处于平衡状态，第三色谱柱Z3处于洗脱状态。再次进样后将第一切换阀V1置于位置B，第一色谱柱Z1洗脱前杂蛋白直接流入废液池；第二切换阀V2置于位置A，第三色谱柱Z3洗脱的目的蛋白进入集样池进行收集，同时，可对第二色谱柱Z2进行再生及平衡处理。

步骤8.如图7所示，第一切换阀V1处于B位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于洗脱状态，第二色谱柱Z2处于富集状态，第三色谱柱Z3处于除后杂状态。待第一色谱柱Z1中第二次进样的目的蛋白开始洗脱，第一切换阀V1置于位置B，蛋白流入第二色谱柱Z2进行富集，同时，第三色谱柱Z3继续在第三泵系统P3流动相的淋洗下进行后杂蛋白的洗脱。

步骤9.如图8所示，第一切换阀V1处于A位置，第二切换阀V2处于A位置；第一色谱柱Z1处于除后杂状态，第二色谱柱Z2处于除前杂状态，第三色谱柱Z3处于平衡状态。待第一色谱柱Z1目的蛋白洗脱完毕，将第一切换阀V1切换至位置A，第二切换阀V2仍置于位置A，第一色谱柱Z1后杂蛋白经第一切换阀V1的1号位流入第一切换阀V1的6号位，直接流入废液池，同时对第三色谱柱Z3进行再生及平衡处理。

如此，三根色谱柱均完成了一个完整的进样、富集、洗脱、再生的过程，连续上样，重复步骤4-8。可照此操作循环往复，持续进行蛋白的多级纯化。

实施例2

第一色谱柱Z1为丁基葡聚糖凝胶疏水相互作用层析柱，规格310*26mm；第二色谱柱Z2为羧甲基琼脂糖凝胶弱阳离子交换柱，规格310*26mm；第三色谱柱Z3为烯丙基葡聚糖和N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联分子排阻层析柱，规格310*26mm。装置连接方式如实施例1，第一色谱柱Z1流动相为磷酸盐缓冲液，第二色谱柱Z2流动相为甲酸铵缓冲盐，第三色谱柱Z3流动相为纯水。起始第一切换阀V1-置于位置A，第一色谱柱Z1前杂蛋白直接流入废液池。待目的蛋白开始洗脱，将第一切换阀V1切换到位置B，此时第一泵系统P1和第二泵系统P2输出的流动相带着目的蛋白经第一切换阀V1流入第二色谱柱Z2。待第二色谱柱Z2对目的蛋白富集完毕，启动第二泵系统P2，将第二切换阀V2置于位置A，P2A和P2B输出流动相将第二色谱柱Z2前杂蛋白洗脱，并流入废液池W。当第二色谱柱Z2目的蛋白开始洗脱，将第二切换阀V2置于位置B，第二色谱柱Z2洗脱产物流入第三色谱柱Z3进行进一步的分离纯化。

在整个纯化过程中，利用对第二色谱柱Z2进行洗脱的时间，第一切换阀V1置于位置A，可对第一色谱柱Z1后杂蛋白进行洗脱，并完成第一色谱柱Z1再生、二次进样、二次进样除“前杂”等操作。利用对第三色谱柱Z3进行洗脱的时间，第二切换阀V2置于位置A，可将第二色谱柱Z2目的蛋白“后杂”进行洗脱，并完成第二色谱柱Z2再生、二次进样除“前杂”、以及二次进样目的蛋白富集等操作。第三色谱柱Z3的“后杂”洗脱及再生过程在二次进样第二色谱柱Z2除“前杂”、富集、第二色谱柱Z2除“后杂”等系列过程中进行。具体操作步骤如实施例1。

实施例3

第一色谱柱Z1为抗原多肽柱，规格310*26mm；第二色谱柱Z2为羧甲基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物弱阳离子交换柱，规格310*26mm；第三色谱柱Z3为高交联琼脂糖分子排阻层析柱，规格310*26mm。

装置连接方式如实施例1，第一色谱柱Z1流动相为Tris-HCl盐缓冲液，第二色谱柱Z2流动相为乙酸铵缓冲盐，第三色谱柱Z3流动相为纯水。操作原理及步骤如实施例1。

所属领域内的普通技术人员应该能够理解的是，本发明的特点或目的之一在于：本发明提出的三维液相色谱蛋白纯化装置及其使用方法，便捷、高效，集多种纯化机制色谱于一体，并实现多种色谱串联应用，可在线依次纯化目的蛋白，该发明一次进样，一步到位纯化出高纯度目的蛋白，且可连续操作，相对传统的离线分离模式，既避免了样品在富集过程中的损失，又节省了多次富集的时间及成本，还能避免人工操作带来的污染，且纯化重现性更好。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种三维液相色谱蛋白纯化装置，其特征是，包括：第一切换阀、第二切换阀、第一色谱柱、第二色谱柱、第三色谱柱、第一泵系统、第二泵系统、第三泵系统、废液池和馏分池，

所述第一泵系统的出口端通过管路连接第一色谱柱的进口端，所述第一切换阀的1号位通过管路与所述第一色谱柱的出口端连接，2号位通过管路与所述第二色谱柱的进口端连接，3号位通过管路与所述第二泵系统的出口端连接，4号位通过管路与所述第二切换阀的1号位连接，5号位通过管路与所述第二色谱柱的出口端连接，6号位通过管路与所述废液池的进口端连接，

所述第二切换阀的1号位通过管路与所述第一切换阀的4号位连接，2号位通过管路与所述第三色谱柱的进口端连接，3号位通过管路与所述第三泵系统的出口端连接，4号位通过管路与所述废液池的进口端或所述馏分池的进口端连接，5号位通过管路与所述第三色谱柱的出口端连接，6号位通过管路与所述废液池的进口端连接，

所述三维液相色谱蛋白纯化装置还包括第三切换阀，所述第三切换阀设置在与所述第二切换阀的4号位连接的管路上，通过所述第三切换阀控制液体流向所述废液池的进口端或所述馏分池的进口端，

其使用方法，包括步骤：

(1)当第一切换阀的1号位与6号位连通、2号位与3号位连通、4号位与5号位连通时，第一切换阀处于A位置，当第二切换阀的1号位与6号位连通、2号位与3号位连通、4号位与5号位连通时，第二切换阀处于A位置，设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于上样状态，第二色谱柱和第三色谱柱处于柱平衡状态，第一泵系统输送液体经第一色谱柱入第一切换阀的1号位，经6号位直接流入废液池；

(2)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于除前杂状态，第二色谱柱和第三色谱柱处于柱平衡状态，维持此状态直至第一色谱柱上的前杂蛋白洗脱完毕；

(3)当第一切换阀的1号位与2号位连通、3号位与4号位连通、5号位与6号位连通时，第一切换阀处于B位置,设置第一切换阀处于B位置，第二切换阀处于A位置,第一色谱柱处于洗脱状态，第二色谱柱处于富集状态，第三色谱柱处于平衡状态，当第一泵系统输出的液体浓度逐渐降低，第一色谱柱上目的蛋白开始洗脱出来，第一切换阀置于位置B，第一色谱柱与第一切换阀的1号位相连，流动相经2号位流入第二色谱柱，再经第一切换阀的5号位，从第一切换阀的6号位直接流入废液池，第二泵系统输出流动相进入第一切换阀的3号位，经第一切换阀的4号位流出至第二切换阀的1号位，第二切换阀置于位置A，经第二切换阀的6号位直接流入废液池；

(4)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于除后杂状态，第二色谱柱处于除前杂状态，第三色谱柱处于平衡状态，当第二色谱柱富集完毕，第一切换阀置于位置A，第一色谱柱洗脱的后杂蛋白直接流入废液池，同时启动第二泵系统，第二切换阀置于位置A，第二泵系统输出流动相从第一切换阀的3号位经2号位，流入第二色谱柱，第二色谱柱洗脱的前杂蛋白经第一切换阀的5号位从4号位流出，流入第二切换阀的1号位，经第二切换阀的6号位直接流入废液池；

(5)当第二切换阀的1号位与2号位连通、3号位与4号位连通、5号位与6号位连通时，第二切换阀处于B位置，设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于B位置,第一色谱柱处于平衡状态，第二色谱柱处于洗脱状态，第三色谱柱处于富集状态，当第二色谱柱中前杂蛋白洗脱完毕，第二切换阀切换至位置B，第二色谱柱洗脱的目的蛋白经第一切换阀的3号位流出，流经第二切换阀的1号位，并从第二切换阀的2号位流入第三色谱柱，进一步进行分子排阻纯化，此时第一切换阀仍置于位置A，对第一色谱柱进行再生及平衡处理；

(6)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于上样状态，第二色谱柱处于除后杂状态，第三色谱柱处于除前杂状态，第二色谱柱上目的蛋白洗脱完毕，第二切换阀置于状态A，第二色谱柱洗脱的后杂蛋白经第二切换阀的6号位直接流入废液池，启动第三泵系统，第三泵系统输出流动相纯水从第二切换阀的3号位经2号位流入第三色谱柱，对目的蛋白进一步洗脱纯化，第三色谱柱洗脱的前杂蛋白流入废液池，此时，第一色谱柱再生完毕，再次进样；

(7)设置第一切换阀处于B位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于除前杂状态，第二色谱柱处于平衡状态，第三色谱柱处于洗脱状态，再次进样后第一切换阀置于位置B，第一色谱柱洗脱前杂蛋白经第二色谱柱后直接流入废液池，第二切换阀置于位置A，第三色谱柱洗脱的目的蛋白进入馏分池进行收集，同时对第二色谱柱进行再生及平衡处理；

(8)设置第一切换阀处于B位置，第二切换阀处于A位置，第一色谱柱处于洗脱状态，第二色谱柱处于富集状态，第三色谱柱处于除后杂状态，待第一色谱柱中第二次进样的目的蛋白开始洗脱，第一切换阀置于位置B，蛋白流入第二色谱柱进行富集，同时第三色谱柱继续在第三泵系统流动相的淋洗下进行后杂蛋白的洗脱；

(9)设置第一切换阀处于A位置，第二切换阀处于A位置；第一色谱柱处于除后杂状态，第二色谱柱处于除前杂状态，第三色谱柱处于平衡状态，待第一色谱柱目的蛋白洗脱完毕，将第一切换阀切换至位置A，第二切换阀仍置于位置A，第一色谱柱后杂蛋白经第一切换阀4号位流入第二切换阀的1号位，经6号位直接流入废液池，同时对第三色谱柱进行再生及平衡处理；

(10)连续上样运行，重复步骤(4)-(8)。

2.如权利要求1所述的三维液相色谱蛋白纯化装置，其特征是：所述第一切换阀和第二切换阀为六通阀、八通阀或十通阀中的任意一种。

3.如权利要求1所述的三维液相色谱蛋白纯化装置，其特征是：所述第一色谱柱、第二色谱柱和第三色谱柱的基质材料为硅胶、葡聚糖、琼脂糖或聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。

4.如权利要求1所述的三维液相色谱蛋白纯化装置，其特征是：所述第一色谱柱、第二色谱柱和第三色谱柱为疏水相互作用色谱柱、离子交换色谱柱或体积排阻色谱柱中的任意一种。

5.如权利要求4所述的三维液相色谱蛋白纯化装置，其特征是：所述疏水相互作用色谱柱的键合相为C18、C8、C4、苯基中的任意一种。

6.如权利要求4所述的三维液相色谱蛋白纯化装置，其特征是：所述离子交换色谱柱为强阳离子交换色谱柱、强阴离子交换色谱柱、弱阳离子交换色谱柱或弱阴离子交换色谱柱中的任意一种。

7.如权利要求1所述的三维液相色谱蛋白纯化装置，其特征是：所述第一泵系统、第二泵系统和第三泵系统为高压恒流泵、中压恒流泵、柱塞泵、注射泵或隔膜泵中的任意一种，所述第一泵系统、第二泵系统和第三泵系统为单个泵等度运行或者两个泵组成梯度运行。

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