CN115287282A - 一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用 - Google Patents

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CN115287282A CN202210893586.3A CN202210893586A CN115287282A CN 115287282 A CN115287282 A CN 115287282A CN 202210893586 A CN202210893586 A CN 202210893586A CN 115287282 A CN115287282 A CN 115287282A
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金百胜
夏平安
陈阳雪
王程
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase

Abstract

本发明提供一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用，所述mRNA工业化分离纯化方法包括以下步骤：将mRNA IVT反应液依次进行亲和层析和疏水层析处理，得到纯化的mRNA。本发明将亲和层析和疏水层析两步法纯化工艺用于mRNA产品的纯化，不仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化mRNA的总回收率，并符合药用标准。

Description

一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种mRNA工业化分离纯化方法 及其应用。
背景技术
mRNA基于自身优势，理论上能够表达任何蛋白质，可以探索治疗几乎所 有基于蛋白质的疾病。目前，mRNA技术在新冠疫苗的研发充分体现出其蛋白 表达能力强，研发周期短的独特优势。并且mRNA技术现已逐步推进至蛋白替 代疗法，细胞治疗等领域，其未来产业化应用场景十分丰富。
目前国内已基本形成mRNA相关药物研发生态圈，作为一项较新的技术， mRNA生产技术在快速发展，针对mRNA层析技术的方案也在不断优化。特别 是mRNA在治疗领域应用过程中，其纯度控制对于疗效至关重要。业内常用的 mRNA纯化方法包括反相、离子交换和分子筛等，反向色谱是使用最为广泛的 方法，常常需要加入离子对，该方法的载量低，并需要使用易燃、有毒的溶剂。 而离子交换层析和分子筛广泛应用却受限于较差的选择性和较低的载量。
因此，如何提供一种mRNA工业化分离纯化方法，使其具有优异的纯化效 果，较高的载量，并且重复性强，操作简单，成为目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种mRNA工业化分离纯化 方法及其应用。本发明提供的mRNA工业化分离纯化方法，具有优异的纯化效 果，较高的载量，并且重复性强，操作简单。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种mRNA工业化分离纯化方法，所述mRNA工业 化分离纯化方法包括以下步骤：将mRNAIVT反应液依次进行亲和层析和疏水 层析处理，得到纯化的mRNA。
本发明将亲和层析和疏水层析两步法纯化工艺用于mRNA产品的纯化，不 仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化mRNA的总回收率，并 符合药用标准。本发明提供的纯化方法纯化效果好，重复性强，操作简单，可 满足工业产业化纯化生产要求，大大降低了生产成本。
在本发明中，所述亲和层析采用的亲和层析填料包括NanoGel dT20。
本发明采用NanoGel dT20亲和层析填料，该填料载量高，耐受高盐、耐高 pH和高温，使用简单，不需要使用任何易燃、有毒试剂。该亲和层析可去除工 艺相关杂质，如线性化DNA模板，RNA聚合酶等；可去除产品相关杂质，如 无polyAd的mRNA。
优选地，所述疏水层析采用的疏水层析填料包括UniHR Butyl 30L。
本发明采用UniHR Butyl 30L疏水层析填料，去除dsRNA和未加帽RNA； 去除RNA二级结构杂质。
在本发明中，所述mRNA工业化分离纯化方法具体包括以下步骤：
(1)将mRNA IVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱中，然后使用洗杂缓 冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；
(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱中，然后 使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第二洗脱液。
在本发明中，步骤(1)中，所述亲和层析柱采用4-6个柱体积(例如可以 是4个柱体积、5个柱体积、6个柱体积等)的平衡缓冲液进行平衡。
优选地，所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM(例如可以是8mM、 9mM、10mM、11mM、12mM等)Tris-HCl、0.3-0.7M(例如可以是0.3M、 0.4M、0.5M、0.6M、0.7M等)NaCl和0.8-1.2mM(例如可以是0.8mM、0.9 mM、1mM、1.1mM、1.2mM等)EDTA，pH为7.2-7.7(例如可以是7.2、7.3、 7.4、7.5、7.6、7.7等)，溶剂为水。
在本发明中，步骤(1)中，所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM(例 如可以是8mM、9mM、10mM、11mM、12mM等)Tris-HCl、0.3-0.7M(例 如可以是0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M等)NaCl和0.8-1.2mM(例如可 以是0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM等)EDTA，pH为7.2-7.7(例 如可以是7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7等)，溶剂为水。
优选地，步骤(1)中，使用4-6个柱体积(例如可以是4个柱体积、5个 柱体积、6个柱体积等)的洗杂缓冲液冲进行洗杂。
优选地，步骤(1)中，所述洗脱缓冲液包括去离子水。
优选地，步骤(1)中，使用4-6个柱体积(例如可以是4个柱体积、5个 柱体积、6个柱体积等)的洗脱缓冲液进行洗脱。
在本发明中，步骤(2)中，所述疏水层析柱采用4-6个柱体积(例如可以 是4个柱体积、5个柱体积、6个柱体积等)的平衡缓冲液进行平衡。
优选地，所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M(例如可以是1.2M、 1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M等)硫酸铵和45-55mM(例如可 以是45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53 mM、54mM、55mM等)Tris-HCl，pH为7-7.4(例如可以是7、7.1、7.2、7.3、 7.4等)，溶剂为水。
在本发明中，步骤(2)中，所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M(例 如可以是1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M等)硫酸铵和45-55 mM(例如可以是45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、 52mM、53mM、54mM、55mM等)Tris-HCl，pH为7-7.4(例如可以是7、 7.1、7.2、7.3、7.4等)，溶剂为水。
优选地，步骤(2)中，使用4-6个柱体积(例如可以是4个柱体积、5个 柱体积、6个柱体积等)的洗杂缓冲液进行洗杂。
在本发明中，步骤(2)中，所述洗脱缓冲液包括第一洗脱缓冲液和第二洗 脱缓冲液。
优选地，所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M(例如可以是1.2 M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M等)硫酸铵和45-55mM(例 如可以是45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、 53mM、54mM、55mM等)Tris-HCl，pH为7-7.4(例如可以是7、7.1、7.2、 7.3、7.4等)，溶剂为水。
优选地，所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括48-52mM(例如可以是48 mM、49mM、50mM、51mM、52mM等)Tris-HCl，pH为7-7.4(例如可以 是7、7.1、7.2、7.3、7.4等)，溶剂为水。
优选地，步骤(2)中，所述洗脱包括依次进行地第一洗脱和第二洗脱。
优选地，所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱采用第一洗脱 缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲 液和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％。
优选地，所述第一洗脱采用12-17个柱体积(例如可以是12个柱体积、13 个柱体积、14个柱体积、15个柱体积、16个柱体积、17个柱体积等)的洗脱 缓冲液进行洗脱。
优选地，所述第二洗脱采用第二洗脱缓冲液进行洗脱。
优选地，所述第二洗脱采用3-7个柱体积(例如可以是3个柱体积、4个柱 体积、5个柱体积、6个柱体积、7个柱体积等)的洗脱缓冲液进行洗脱。
作为本发明优选地技术方案，所述mRNA工业化分离纯化方法包括如下步 骤：
(1)将mRNA IVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱中，然后使用洗杂缓 冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；
其中，所述亲和层析柱采用4-6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM Tris-HCl、0.3-0.7M NaCl和0.8-1.2mM EDTA，pH为7.2-7.7，溶剂为水；所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM Tris-HCl、0.3-0.7M NaCl和0.8-1.2mM EDTA，pH为7.2-7.7，溶剂为水；所述 洗脱缓冲液包括去离子水；
(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱中，然后 使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用第一洗脱缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行第一 洗脱，使用第二洗脱缓冲液进行第二洗脱，收集第二洗脱液；
其中，所述疏水层析柱采用4-6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4， 溶剂为水；所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；
所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括48-52 mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；
所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲液 和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的mRNA工业化分离纯化方 法在制备mRNA药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明将亲和层析和疏水层析两步法纯化工艺用于mRNA产品的纯化，不 仅操作简便易放大，减少了操作步骤，同时提高了纯化mRNA的总回收率，并 符合药用标准。mRNAIVT反应液最初纯度为69％，经第一步亲和层析纯化回 收率达到87.1-88.3％，纯度达到89.9-93％，第二步疏水纯化UniHR Phenyl-30L 回收率达89.5-92％，纯度到达94.3-96.5％。表明本发明提供的纯化方法纯化效 果好，重复性强，操作简单，可满足工业产业化纯化生产要求，大大降低了生 产成本。
附图说明
图1是实施例1中采用亲和层析填料NanoGel dT20的层析图谱。
图2是实施例1中第一洗脱液的SEC图谱。
图3是实施例1中采用疏水层析填料UniHR Butyl 30L的层析图谱。
图4是实施例1中第二洗脱液的SEC图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员 应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中亲和层析填料为NanoGel dT20，厂家为纳微科技，货号为 17030-050150-1001；疏水层析填料为UniHR Butyl 30L，厂家为纳微科技，货号 为06132-030100。
实施例1
本实施例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，所述mRNA工业化分离纯 化方法包括以下步骤：
(1)将mRNA IVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱(填料为NanoGel dT20)中，然后使用5个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂，使用5个柱体积的洗 脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；
其中，所述亲和层析柱采用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括10mM Tris-HCl、0.5M NaCl和1mM EDTA，pH为 7.4，溶剂为水；
所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括10mM Tris-HCl、0.5M NaCl和1mM EDTA，pH为7.4，溶剂为水；
所述洗脱缓冲液包括去离子水；
(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱(填料为 UniHRButyl 30L)中，然后使用5个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂，使用15个 柱体积的第一洗脱缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行第一洗脱，使用5个柱体积 的第二洗脱缓冲液进行第二洗脱，收集第二洗脱液；
其中，所述疏水层析柱采用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括1.5M硫酸铵和50mM Tris-HCl，pH为7.2，溶剂为水； 所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.5M硫酸铵和50mM Tris-HCl，pH为7.2， 溶剂为水；
所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.5M硫酸铵和50mM Tris-HCl，pH 为7.2，溶剂为水；所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括50mM Tris-HCl，pH 为7.2，溶剂为水；
所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲液 和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％。
mRNAIVT反应液经SEC图谱分析，可以算出mRNA IVT反应液的纯度为 69％。
图1为实施例1中采用亲和层析填料NanoGel dT20的层析图谱，从图中可 以看出NanoGel dT20可以有效地将mRNA分离；如图2为实施例1中第一洗 脱液的SEC图谱，可以算出第一洗脱液中的mRNA纯度为93％。
图3是实施例1中采用疏水层析填料UniHR Butyl 30L的层析图谱，从图中 可以看出随着电导的降低，mRNA逐渐被洗脱；图4为实施例1中第二洗脱液 的SEC图谱，可以算出mRNA IVT反应液的纯度为96.5％。
实施例2
本实施例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，所述mRNA工业化分离纯 化方法包括以下步骤：
(1)将mRNA IVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱(填料为NanoGel dT20)中，然后使用4个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂，使用4个柱体积的洗 脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；
其中，所述亲和层析柱采用4个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括8mM Tris-HCl、0.7M NaCl和0.8mM EDTA，pH为 7.2，溶剂为水；
所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括8mM Tris-HCl、0.7M NaCl和0.8mM EDTA，pH为7.2，溶剂为水；
所述洗脱缓冲液包括去离子水；
(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱(填料为 UniHRButyl 30L)中，然后使用4个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂，使用12个 柱体积的第一洗脱缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行第一洗脱，使用7个柱体积 的第二洗脱缓冲液进行第二洗脱，收集第二洗脱液；
其中，所述疏水层析柱采用4个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括1.2M硫酸铵和55mM Tris-HCl，pH为7.1，溶剂为水； 所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.2M硫酸铵和55mM Tris-HCl，pH为7.1， 溶剂为水；
所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.2M硫酸铵和55mM Tris-HCl，pH 为7.1，溶剂为水；所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括48mM Tris-HCl，pH 为7.1，溶剂为水；
所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲液 和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％。
实施例3
本实施例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，所述mRNA工业化分离纯 化方法包括以下步骤：
(1)将mRNA IVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱(填料为NanoGel dT20)中，然后使用6个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂，使用6个柱体积的洗 脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；
其中，所述亲和层析柱采用6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括12mM Tris-HCl、0.3M NaCl和1.2mM EDTA，pH为 7.6，溶剂为水；
所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括12mM Tris-HCl、0.3M NaCl和1.2mM EDTA，pH为7.6，溶剂为水；
所述洗脱缓冲液包括去离子水；
(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱(填料为 UniHRButyl 30L)中，然后使用6个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂，使用17个 柱体积的第一洗脱缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行第一洗脱，使用3个柱体积 的第二洗脱缓冲液进行第二洗脱，收集第二洗脱液；
其中，所述疏水层析柱采用6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括1.8M硫酸铵和45mM Tris-HCl，pH为7.3，溶剂为水； 所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.8M硫酸铵和45mM Tris-HCl，pH为7.3， 溶剂为水；
所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.8M硫酸铵和45mM Tris-HCl，pH 为7.3，溶剂为水；所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括55mM Tris-HCl，pH 为7.3，溶剂为水；
所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲液 和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％。
实施例4
本实施例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 步骤(1)中，将亲和层析柱采用的填料替换为Monomix dT20(厂家赛分科技， 货号283030950)，其他步骤同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 步骤(2)中，将疏水层析柱采用的填料替换为Capto Butyl(厂家GE，货号 17545901)，其他步骤同实施例1。
实施例6
本实施例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 步骤(2)中，所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗 脱缓冲液和第一洗脱缓冲液的体积分数比为30％:70％→100％:0％，其他步骤同 实施例1。
实施例7
本实施例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 步骤(2)中，所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗 脱缓冲液和第一洗脱缓冲液的体积分数比为70％:30％→100％:0％，其他步骤同 实施例1。
对比例1
本对比例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 先进行疏水层析，再进行亲和层析，其他步骤同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 将步骤(1)中的亲和层析替换为离子层析，所述离子层析包括以下步骤：
将mRNAIVT反应液上样至平衡后的离子层析柱(填料为UniGel-30DEAE， 厂家为纳微科技，货号为04083-030100)中，然后使用5个柱体积的洗杂缓冲 液进行洗杂，使用5个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱缓冲液；
其中，所述离子层析柱采用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡 缓冲液按摩尔浓度计包括50mM Tris-Hcl和10mM EDTA，pH为7.2，溶剂为 水；
所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括50mM Tris-Hcl和10mM EDTA，pH为 7.2，溶剂为水；
所述洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括50mM Tris-Hcl，0.5M NaCl和10mM EDTA，pH为7.2；
其他步骤同实施例1。
对比例3
本对比例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 将步骤(2)中的疏水层析替换为凝胶过滤层析，所述凝胶过滤层析包括以下步 骤：
将步骤(1)得到的洗脱缓冲液上样至平衡后的凝胶过滤层析柱中(填料为 NWRose 6FF，厂家为纳微科技，货号为60012-014900)，然后使用5个柱体积 的平衡缓冲液进行洗脱，收集洗脱缓冲液；
其中，所述NW Rose 6FF层析柱采用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡； 所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括2.1M(NH4)2SO4，10mM EDTA和100mM Tris-HCl，pH为8.0，溶剂为水；
所述洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括2.1M(NH4)2SO4，10mM EDTA和 100mM Tris-HCl，pH为8.0；
其他步骤同实施例1。
对比例4
本对比例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 连续使用两次亲和层析进行纯化，第一次亲和层析和第一次亲和层析的步骤均 同实施例1中步骤(1)。
对比例5
本对比例提供一种mRNA工业化分离纯化方法，与实施例1的区别仅在于， 连续使用两次疏水层析进行纯化，第一次疏水层析和第二次疏水层析的步骤均 同实施例1中步骤(2)。
测试例
回收率和纯度测试
mRNAIVT反应液最初纯度为69％。
测试样本：实施例1-9和对比例1-5提供的第一洗脱液和第二洗脱液。
测试方法：采用SEC凝胶渗透层析分析洗脱液中mRNA的纯度，mRNA回 收率的计算公式如下所示：
mRNA回收率(％)＝【(C上样液V上样液)/(C洗脱液V洗脱液)】×100％。
检测结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003768521530000131
Figure BDA0003768521530000141
由表1数据可知，作为本发明优选地技术方案(实施例1-3)，经第一步亲 和层析NanoGel dT20纯化回收率87.1-88.3％，纯度89.9-93％，第二步疏水纯化 UniHR Phenyl-30L回收率达到89.5-92％，纯度达到94.3-96.5％。这表明两步法 mRNA纯化工艺可以高效得到高质量mRNA样品。
通过实施例1和实施例4-5的对比可知，改变亲和层析或疏水层析所用的填 料会导致mRNA的纯化效果变差。
通过实施例1和实施例6-7的对比可知，改变疏水层析过程中洗脱缓冲液的 梯度，不利于mRNA的纯化。
通过实施例1和对比例1-4的对比可知，更换亲和层析和疏水层析的顺序、 将亲和层析或疏水层析替换为替他类型的层析类型、连续使用两次亲和层析或 连续使用两次疏水层析均会导致最终得到的洗脱液中mRNA纯化回收率降低， mRNA纯度降低。
本发明提供的mRNA的分离纯化方法，仅需两步层析分离纯化mRNA，不 仅纯度高、收率稳定，而且操作简单方便，纯化周期比较短，大大降低了成本。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明 并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原 料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述mRNA工业化分离纯化方法包括以下步骤：将mRNA IVT反应液依次进行亲和层析和疏水层析处理，得到纯化的mRNA。
2.根据权利要求1所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用的亲和层析填料包括NanoGel dT20；
优选地，所述疏水层析采用的疏水层析填料包括UniHR Butyl 30L。
3.根据权利要求1或2所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述mRNA工业化分离纯化方法具体包括以下步骤：
(1)将mRNA IVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱中，然后使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；
(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱中，然后使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第二洗脱液。
4.根据权利要求3所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述亲和层析柱采用4-6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；
优选地，所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM Tris-HCl、0.3-0.7M NaCl和0.8-1.2mM EDTA，pH为7.2-7.7，溶剂为水。
5.根据权利要求3或4所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM Tris-HCl、0.3-0.7M NaCl和0.8-1.2mM EDTA，pH为7.2-7.7，溶剂为水；
优选地，步骤(1)中，使用4-6个柱体积的洗杂缓冲液冲进行洗杂；
优选地，步骤(1)中，所述洗脱缓冲液包括去离子水；
优选地，步骤(1)中，使用4-6个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述疏水层析柱采用4-6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；
优选地，所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；
优选地，步骤(2)中，使用4-6个柱体积的洗杂缓冲液进行洗杂。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述洗脱缓冲液包括第一洗脱缓冲液和第二洗脱缓冲液；
优选地，所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；
优选地，所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括48-52mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；
优选地，步骤(2)中，所述洗脱包括依次进行地第一洗脱和第二洗脱；
优选地，所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱采用第一洗脱缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲液和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％；
优选地，所述第一洗脱采用12-17个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱；
优选地，所述第二洗脱采用第二洗脱缓冲液进行洗脱；
优选地，所述第二洗脱采用3-7个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将mRNA IVT反应液上样至平衡后的亲和层析柱中，然后使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液；
其中，所述亲和层析柱采用4-6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM Tris-HCl、0.3-0.7M NaCl和0.8-1.2mM EDTA，pH为7.2-7.7，溶剂为水；所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括8-12mM Tris-HCl、0.3-0.7M NaCl和0.8-1.2mMEDTA，pH为7.2-7.7，溶剂为水；所述洗脱缓冲液包括去离子水；
(2)将步骤(1)得到的第一洗脱液上样至平衡后的疏水层析柱中，然后使用洗杂缓冲液进行洗杂，使用第一洗脱缓冲液和/或第二洗脱缓冲液进行第一洗脱，使用第二洗脱缓冲液进行第二洗脱，收集第二洗脱液；
其中，所述疏水层析柱采用4-6个柱体积的平衡缓冲液进行平衡；所述平衡缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；所述洗杂缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；
所述第一洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括1.2-1.8M硫酸铵和45-55mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；所述第二洗脱缓冲液按摩尔浓度计包括48-52mM Tris-HCl，pH为7-7.4，溶剂为水；
所述第一洗脱为线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱过程中第二洗脱缓冲液和第一洗脱缓冲液的体积分数比为0％:100％→100％:0％。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的mRNA工业化分离纯化方法在制备mRNA药物中的应用。
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