CN105938130A - 一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪及其工作方法 - Google Patents

Abstract

一种集分离方法开发、在线分离‑富集于一体的天然药物二维制备色谱仪及其工作方法，属于天然药物成分分离技术领域，应用于中药、植物药、海洋药物等的研发领域。该色谱仪包括控制系统、泵入系统、进样系统、检测系统、一维色谱柱系统、二维色谱柱系统和二位八通阀。在同一台仪器上实现分离方法开发与优化、天然药物的二维正交色谱分离制备。将复杂的天然产物分离成18个可重复获得的组分或有效部位，二维分离使其进一步分离得到单体化合物，全部的分离工作在计算机控制下工作，极大的提高了中药等天然药物系统性分离制备的效率，为中药、植物药、海洋药物有效部位、成分的制备分离、活性筛选提供了高效、可靠的平台。

Description

一种集分离方法开发、在线分离 - 富集于一体的天然药物二维制备色谱仪及其工作方法

技术领域

本发明涉及一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪及其工作方法，属于天然药物成分分离技术领域，应用于植物药、中药、海洋药物等的研发领域。

背景技术

色谱分离技术对于分离制备来自植物、海洋生物、中药及生物工程等的天然产物用于创新药物、精细化学品研究的重要性已勿容置疑。基于传统中药创制新药以及中药药理活性成分的发现、机理研究的关键是中药有效成分的可重复、系统性的分离制备。

天然药物组成复杂，单次色谱分离效果有限，需要经过多次分离，在分离过程中使用不同色谱分离模式可以达到满意结果。在以往的天然产物研究过程中，虽然已积累了丰富的经验，但对于系统性研究中药等天然药物成分仍有缺乏有效的装备。近年来，二维色谱技术的发展，采用几种模式填料的互补性性分离无疑对于解决这一问题铺平了道路。而将其实现自动化，在实现部位分离并进行在线富集后直接进行纯化合物制备可以简化分离制备过程，最大限度的提高工作效率。邵平（CN101791491A）设计了一套低、中、高压结合的二维制备色谱系统，通过六通阀和软件将两套制备色谱系统连接起来，完成样品的二维色谱分离，适合于分离已知成分和用于解决过载进样和分离能力间的矛盾，并不不适合中药等复杂体系。张维冰设计了一种准动态二维制备色谱系统及物质分离方法（CN102914610A，CN202870047U），通过三通阀将两根制备色谱柱连接，通过阀切换将第一维制备色谱柱分离的组分转移到第二维制备色谱柱进行分离。李贺然、肖红斌公开了（CN102961892A、CN104713973A）采用2位10通阀和多个2位六通阀的在线富集色谱仪分离天然药物成分的方法。在一定程度上解决了问题，但在分离方法开发、分离效率及可重复获得有效部位、有效部位的系统性分离及分离过程的自动化控制上仍存在不足。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪及其工作方法，该装置是对中药、植物药、海洋药物等复杂物质体系进行系统性、规模化及连续化分离制备的智能化系统，在有效进行样品分离方法开发与优化的基础上，采用计算机控制，过渡到样品的分离制备，增加了分离效率和针对性，一维、二维色谱的正交性分离和分离后样品富集模式的设计，极大地提高了制备色谱对于诸如中药等复杂物质体系的分离制备能力，可重复获得的有效部位、有效成分单体，对于中药新药开发，药理活性研究具有重要意义。

本发明提供的的技术方案是：一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪

该分离装置由3台高压泵、1个两位六通阀进样器、1个两位八通阀、1个六通阀，3个十通阀、1个紫外检测器、1个混合器、2个可供选择的一维分离柱、2个可供选择的二维分离柱、1个用于方法开发的色谱柱，18个一维富集柱、9个二维富集柱、控制软件、馏分收集仪和连接管线组成。

其中两位八通阀负责分离方法开发、一、二维分离-富集模式的切换；六通阀进行分离方法开发柱，一维分离色谱柱、二维分离色谱柱选择性切换；3个十通阀实现一维、二维富集柱选择；紫外检测器监测方法开发、分离制备的色谱过程；馏分收集仪用来收集分离制备的馏分。

它包括控制系统、泵入系统、进样系统、检测系统、一维色谱柱系统、二维色谱柱系统和二位八通阀，所述二位八通阀包括A口、B口、C口、D口、E口、F口、G口和H口，所述泵入系统包括第一泵、第二泵和混合器，混合器连接有泵入系统输出管，所述进样系统包括进样系统输入管、二位六通进样阀、进样系统输出管，所述检测系统包括依次设置的检测系统输入管、六通柱选择阀、检测仪、三通混合器和检测系统输出管；所述一维色谱柱系统包括一维色谱柱输入管、一维色谱柱和一维色谱柱输出管；所述二维色谱柱系统包括二维色谱柱输入管、二维色谱柱和馏分收集器；稀释液泵连接至三通混合器；控制系统与第一泵、第二泵、稀释液泵、二位八通阀、二位六通进样阀、三个十通柱选择阀、检测仪进行电连接，控制系统控制第一泵、第二泵和稀释液泵的开启和停止，控制系统控制二位八通阀、二位六通进样阀、十通阀的通断切换；

所述色谱仪通过控制二位八通阀的连接呈第一连接状态或第二连接状态，实现分离方法开发、样品一维和二维色谱分离；

所述第一连接状态实现样品分离方法开发、样品的一维色谱分离，其中样品分离方法开发实验时为泵入系统输入管与A口连接，经B口与进样系统输入管连接，C口与进样系统输出管连接，D口与检测系统输入管连接，经六通柱选择阀的进入检测系统，经3通、支管、进入G口后由H口经支管、、进入F口，经E口进入十通阀的于馏分收集器的废液口排出。

样品1维分离的二位八通阀连接状态和分离方法开发相同，区别是进样后的六通选择阀的流路是选择5个分离柱中的1个串联，同时，十通选择阀选择1个富集色谱柱串联在流路上，稀释液泵将稀释液通过三通混合器注入稀释液。

所述样品2维分离的二位八通阀第二连接状态为泵入系统输入管与A口连接，经H口与分离系统输入管连接，再经10通选择阀选择串联18个1级富集柱的其中1个作为上样柱，经进入E口，D口经与六通柱选择阀的其中1个色谱柱串联后分离，进入检测系统，经3通、支管、进入G口后由F口经支管和十通选择阀选择的其中1个二级富集柱串联富集后于馏分收集器的废液口排出；

该仪器分离功能的执行均有计算机控制，将分离方法开发、样品的二维液相色谱制备分离实现一体化。分离方法开发柱、一维、二维分离色谱柱的选择性切换由一个六通阀实现，且对一维、二维分离有两个可选择不同填料的色谱柱，以实现对分离对象的二维色谱正交分离。一维和二维色谱分离的馏分经紫外检测器检测后，在和第三个高压泵提供的稀释液混合后，经过十通阀分别富集在串联于其上的色谱柱中，其中，一维色谱可富集18个馏分，二维色谱可富集9个馏分，可以使复杂的天然产物分离得到18个组分，每个组分可以继续分离，得到9个化合物或组分。

一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪的工作方法，包括以下步骤：

1）分离方法开发

所述色谱仪通过控制二位八通阀处于第一连接状态，将样品注入二位六通进样阀，开启第一泵和第二泵组成梯度洗脱的液相色谱系统，样品进入分离方法开发柱，由检测仪采集色谱图，调整液相色谱流动相比例和洗脱程序，色谱仪执行方法优化模式，使样品实现最大程度的分离后；所得分离条件置入控制系统中；流动相废液通过二位八通阀的Ｈ号口后，由一维色谱柱和二维色谱柱的公共通路流出；

2）一维分离

所述色谱仪通过控制二位八通阀处于第一连接状态，将样品注入二位六通进样阀，六通阀选择一维分离色谱柱，开启第一泵和第二泵组成梯度洗脱的液相色谱系统，由检测仪采集色谱图，色谱仪执行一维分离模式，使用已置入控制系统中的分离条件进行分离；开启稀释液泵注入选定的稀释液，按照时间程序将对象分离成18个馏分；各馏分通过二位八通阀的H口后，富集于18个一维色谱柱中，流动相废液经二维色谱柱公共通路流出；

3）二维分离

所述色谱仪通过控制二位八通阀处于第二连接状态，分离对象为富集在一维色谱柱中的18个组分，六通阀选择二维分离色谱柱，开启第一泵和第二泵组成可梯度洗脱的液相色谱系统，由检测仪采集色谱图，色谱仪执行二维分离模式，使用已置入控制系统中的分离条件进行分离，开启稀释液泵注入选定的稀释液，按照色谱峰收集模式将18个富集柱中的组分分别分离成单体化合物；各成分通过二位八通阀的F口后，分别富集于9个二维色谱柱中，流动相废液经二维色谱柱后流出；

4）馏分回收

一维分离后获取18个馏分和18个馏分进一步分离得到单体化合物的回收过程均可以在分离完成后独立或分别进行。采用开启稀释液泵，输入洗脱剂作为流动相，使目标成分解析溶解在小体积流动相中，回收样品于馏分收集器中；

所述稀释剂为水、盐溶液、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇或正构烷烃溶剂；所述洗脱剂为甲醇、乙腈、乙醇、水及其混合物、正构烷烃等常用有机溶剂；

在应用中，一维色谱柱选用与分离方法开发所用相同的填料，减小了分离制备放大实验的难度，可选择硅胶、反相硅胶基质填料如C18、Xion、C8、CN基、氨基，大孔吸附树脂等。二维色谱选择与一维色谱具有良好正交性分离的填料。富集柱选择与分离柱相同的填料。富集过程选择的稀释液为有利于增强样品在捕集柱中保留的溶剂，包括，水、盐溶液、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、正构烷烃溶剂或其他洗脱能力小、且挥发性高的溶剂。

本发明仪器的有益效果是：在同一台仪器上实现分离方法开发与优化、天然药物的二维正交色谱分离制备。将复杂的天然产物分离成18个可重复获得的组分或有效部位，二维分离可以使18个部位进一步分离得到单体化合物，全部的分离工作在计算机控制下工作。使原本数周甚至数月才能完成的工作在几天内完成，极大的提高了中药等天然药物系统性分离制备的效率，为中药、植物药、海洋药物有效部位、成分的制备分离、活性筛选提供了高效、可靠的平台。

附图说明

图1 是集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪的第一连接状态图。

图2是色谱仪第一连接状体中二位八通阀的连接图。

图3是集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪的第二连接状态图。

图4是色谱仪第二连接状体中二位八通阀的连接图。

图中：1、第一泵，2、第二泵，3、稀释液泵，4、混合器，5、二位六通进样阀，5a、进样系统输入管，5b、进样系统输出管，6、六通柱选择阀，6a、检测系统输入管，6b、色谱柱，6c、六通柱选择阀支管， 7、检测仪，8、三通混合器，8a、检测系统输出管，9、一维色谱富集柱，9a、一维色谱柱输入管，9b、一维色谱柱输出管，9c、一维色谱柱公共通路，9d、一维十通柱选择阀，10、二维色谱柱，10a、二维色谱柱输入管，10b、二维色谱柱公共通路，10c、二维十通柱选择阀，11、馏分收集器，12、二位八通阀。

具体实施方式

实施例：中药甘草水溶性物质的系统性二维色谱分离制备

本实施例仅限于对本发明做进一步详细说明，而非对本发明的限定。

强极性化合物的分离是中药化学成分分离的难点，鉴于反相C18色谱应用的广泛性和亲水色谱常被用作反相色谱的补充而用于强极性化合物的分离，利用两者色谱分离的正交性，对中药甘草的水溶性成分进行系统性分离制备。。

本实施例采用XIon/C18二维在线分离模式分离甘草水溶性样品，具体过程如下：

1）分离方法开发

1.1 两位八通阀处于第一状态，每次将甘草水溶性样品甲醇溶液5mg/ml 500ul注入六通进样器，六通阀选择方法开发色谱柱 XION (10mm×150mm，10μm)。开启泵A、B组成可梯度洗脱的液相色谱系统，以甲醇/水（95/100—5/100）为流动相进行分离，色谱工作站执行方法开发模式，在全波长UV230II紫外检测器采集色谱图，根据分离的情况，调整液相色谱流动相比例和洗脱程序，使样品实现最大程度的分离后，确定分离条件为：A为水，B为甲醇，梯度洗脱：0-13 min，95％～85％B；13～33 min，85％～60％B；33～80 min，60％～5％B；流速为8 mL／min；紫外检测波长为254 nm。将获得分离条件置入一维制备程序内。

1.2采用选定的流动相条件，按照1.1的流程选择一维分离柱为XION (20mm×250mm，10μm)进行分离制备，分离的流动相通过两位八通阀的H口后，由3个十通阀的公共通路流出进入馏分收集仪，每15分钟收集1个馏分，共收集18个馏分。

1.3 选择反相C18分离方法开发色谱柱 (10mm×150mm，10μm) ，紫外检测波长254nm，色谱条件：流动相：A为水，B为甲醇，梯度洗脱：0～60min，5％～95％B间进行色谱分离方法实验，进样量为100μL，对1.2得到的馏分进行分离方法选择与优化。优化的每个方法置入二维分离方法软件内。

1.4 两位八通阀处于第一状态，六通阀选择一维色谱分离柱XIon (250mm×20mm，10μm)，调入一维分离程序即高压泵：A为水，B为甲醇，梯度洗脱：0-13 min，95％～85％B；13～33 min，85％～60％B；33～80 min，60％～5％B；流速为10 mL／min；紫外检测波长为254 nm，一维富集柱为18支XIon (20mm ×80mm，10μm)，甘草水溶性样品进样量为50mg/ml，4ml。稀释液泵C的溶剂为甲醇，10ml/min，每隔15min一维富集柱阀切换1次，将样品分为18个馏分，富集在18个一维富集柱上。流动相废液经二维富集柱十通阀的公共通路流出。

1.5 对18个馏分的组分分别采用C18柱进行二维分离。

将两位八通阀置于第二状态，将一维富集柱中的18个组分作为样品，采用方法开发中获得的二维柱分离条件，依次对富集在一维富集柱中的样品进行分离，以峰收集模式将各单体化合物富集在二维富集柱中。二维色谱分离柱C18 (20mm×250mm，10μm) ，紫外检测波长254nm，二维富集柱为C18(20mm×80mm，10μm)，色谱条件：流动相：A为水，B为甲醇，洗脱程序依据1.3确定的各馏分条件。稀释液泵C的溶剂为水，10ml/min。

1.6 样品回收：18个馏分的每个组分完成分离后，开启泵C，用200-300ml甲醇溶液通过二维富集十通阀，洗脱富集在二维富集柱上的单体化合物进入馏分收集仪中，浓缩后鉴定化合物的纯度和结构。

分离后，经TLC和HPLC同时检测后合并浓缩，共得到4.9mg到55mg不等的32个组分，其中含量90%以上单体化合物29个，两个化合物的简单组分3个。

Claims (4)

1.一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪，它包括控制系统，其特征在于：它包括泵入系统、进样系统、检测系统、一维色谱柱系统、二维色谱柱系统和二位八通阀（12），所述二位八通阀（12）包括A口、B口、C口、D口、E口、F口、G口和H口；所述泵入系统包括第一泵（1）、第二泵（2）和混合器（4），混合器（4）连接有泵入系统输出管（4a）；所述进样系统包括进样系统输入管（5a）、二位六通进样阀（5）、进样系统输出管（5b）；所述检测系统包括依次设置的检测系统输入管（6a）、六通柱选择阀（6）的六通柱选择阀支管（6c）、检测仪（7）、三通混合器（8）和检测系统输出管（8a）；所述一维色谱柱分离系统采用连接在六通柱选择阀（6）的5个色谱柱（6b）之一作为分离柱、再依次连接一维色谱柱输入管（9a）、两个串联的一维十通柱选择阀（9d）、18个一维色谱富集柱（9）和一维色谱柱输出管（9b）；所述二维色谱柱系统采用18个一维色谱富集柱（9）之一作为上样柱、连接在六通柱选择阀（6）的5个色谱柱（6b）之一作为分离柱、再依次连接二维色谱柱输入管（10a）、二维十通柱选择阀（10c）及9个二维色谱富集柱（10）和馏分收集器（11）；稀释液泵（3）连接至三通混合器（8）；控制系统与第一泵（1）、第二泵（2）、稀释液泵（3）、二位八通阀（12）、二位六通进样阀（5）、六通柱选择阀（6）、检测仪（7）一维十通柱选择阀（9d）、二维十通柱选择阀（10c）进行电连接，控制系统控制第一泵（1）、第二泵（2）和稀释液泵（3）的开启和停止，控制系统控制二位八通阀（12）、二位六通进样阀（5）、六通柱选择阀（6）、一维十通柱选择阀（9d）、二维十通柱选择阀（10c）的通断切换；

所述色谱仪通过控制二位八通阀（12）的连接呈第一连接状态或第二连接状态，实现分离方法开发、样品一维和二维色谱分离；

所述第一连接状态分为样品分离方法开发状态与样品的一维色谱分离状态；样品分离方法开发状态为泵入系统输入管（4a）与A口连接，经B口与进样系统输入管（5a）连接，C口与进样系统输出管（5b）连接，D口与检测系统输入管（6a）连接，六通柱选择阀（6）的六通柱选择阀支管（6c）进入检测系统，经三通混合器（8）、检测系统输出管（8a）、进入G口后由H口经一维色谱柱输出管（9a）、一维色谱柱公共通路（9c）和一维色谱柱输出管（9b）进入F口，经E口进入二维十通选择阀（10c）的二维色谱柱公共通路（10b）连接至馏分收集器（11）；

样品的一维色谱分离状态为泵入系统输入管（4a）与A口连接，经B口与进样系统输入管（5a）连接，C口与进样系统输出管（5b）连接，D口与检测系统输入管（6a）连接，六通柱选择阀（6）的5个色谱柱（6b）之一进入检测系统，经三通混合器（8）、检测系统输出管（8a）进入G口后由H口经一维色谱柱输出管（9a）、由一维十通选择阀（9d）选择的1个一维色谱富集柱（9）和一维色谱柱输出管（9b）进入F口，经E口进入二维十通选择阀（10c）的二维色谱柱公共通路（10b）连接至馏分收集器（11）；同时，稀释液泵（3）、三通混合器（8）、检测系统输出管（8a）连接至G口；

所述第二连接状态为泵入系统输入管（4a）与A口连接，经H口与一维色谱柱输入管（9a）连接，再经一维十通选择阀（9d）选择串联18个一维色谱富集柱（9）的其中1个作为上样柱，经一维色谱柱输出管（9b）进入E口，D口经检测系统输出管（6a）与六通柱选择阀（6）的其中1个色谱柱（6b）串联后分离，进入检测系统（7），经三通混合器（8）、检测系统输出管（8a）、进入G口后由F口经二维色谱柱输入管（10a）和由二维十通选择阀（10c）选择的1个二级富集柱（10）串联富集后连接至馏分收集器（11）。

2.根据权利要求1 所述的一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪的工作方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）分离方法开发

所述色谱仪通过控制二位八通阀处于第一连接状态，采用样品分离方法开发状态，将样品注入二位六通进样阀（5），开启第一泵（1）和第二泵（2）组成梯度洗脱的液相色谱系统，样品进入分离方法开发柱，由检测仪（7）采集色谱图，调整液相色谱流动相比例和洗脱程序，色谱仪执行方法优化模式，使样品实现最大程度的分离后；所得分离条件置入控制系统中；流动相废液通过二位八通阀（12）的Ｈ号口后，由一维色谱柱和二维色谱柱的公共通路流出；

2）一维分离

所述色谱仪通过控制二位八通阀处于第一连接状态，采用样品的一维色谱分离状态，将样品注入二位六通进样阀（5），六通阀选择一维分离色谱柱，开启第一泵（1）和第二泵（2）组成梯度洗脱的液相色谱系统，由检测仪（７）采集色谱图，色谱仪执行一维分离模式，使用已置入控制系统中的分离条件进行分离；开启稀释液泵（３）注入选定的稀释液，按照时间程序将对象分离成18个馏分；各馏分通过二位八通阀（12）的H口后，富集于18个一维色谱富集柱（9）中，流动相废液经二维色谱柱公共通路流出；

3）二维分离

所述色谱仪通过控制二位八通阀处于第二连接状态，分离对象为富集在一维色谱柱中的18个组分，六通阀选择二维分离色谱柱，开启第一泵（1）和第二泵（2）组成可梯度洗脱的液相色谱系统，由检测仪（7）采集色谱图，色谱仪执行二维分离模式，使用已置入控制系统中的分离条件进行分离，开启稀释液泵（3）注入选定的稀释液，按照色谱峰收集模式将18个富集柱中的组分分别分离成单体化合物；各成分通过二位八通阀（12）的F口后，分别富集于9个二维色谱柱中，流动相废液经二维色谱柱后流出；

4）馏分回收

一维分离后获取18个馏分和18个馏分进一步分离得到单体化合物的回收过程均可以在分离完成后独立或分别进行。

3.采用开启稀释液泵（3），输入洗脱剂作为流动相，使目标成分解析溶解在小体积流动相中，回收样品于馏分收集器（11）中；

所述稀释剂为水、盐溶液、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇或正构烷烃溶剂；所述洗脱剂为甲醇、乙腈、乙醇、水、正构烷烃中的一种或多种。

4.根据权利要求1 或2所述的一种集分离方法开发、在线分离-富集于一体的天然药物二维制备色谱仪，其特征在于：一维色谱富集柱选用与分离方法开发柱相同的填料，所述填料为正向硅胶、带有C18、Xion、C8、氰基或氨基的反相硅胶基质填料或大孔吸附树脂。