KR20230012003A - 상승된 온도에서의 핵산의 단리 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 환원제, 바람직하게는 화학식 (I)의 환원제, 음이온성 세제 및 완충 물질을 포함하는 용액을 사용하여 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 환원제, 바람직하게는 화학식 (I)의 환원제, 음이온성 세제 및 완충 물질을 포함하는 용액; 뿐만 아니라 상기 용액을 포함하는 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 승온에서 환원제, 완충 물질 및 음이온성 세제를 포함하는 용액을 사용하여 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 성분들을 포함하는 용액 및 상기 용액을 포함하는 키트에 관한 것이다. 무엇보다도, 본 발명의 방법 및 조성물은 상이한 세포 샘플들로부터 충분한 순도 및 완전성을 갖는 핵산의 매우 빠르고 신뢰할 수 있는 단리에 적합하다.
핵산을 추출하는 다양한 방법은 오래전부터 알려져 왔다. 처음에는 페놀 및 클로로포름과 같은 독성 시약을 기반으로 한 화학적 방법만 사용되었다. 이러한 방법은 특히 실험실 안전(독성, 화재 위험, 화학물질 폐기)에 대한 높은 요구와 노동 집약적이고 시간 소모적인 실행이 특징이었다.
1980년대 실리카 기술의 출현으로, 최종 사용자가 방법을 수행하기가 더 쉬워지면서 이것이 변경되었다. 그러나, 실리카 기반 핵산 추출에 사용되는 화학물질(카오트로픽 염, 알코올)은 여전히 안전한 취급 및 분리 폐기가 필요한 유해 물질이다. 또한, 실리카 기술은 긴 배양 시간이 특징인 많은 샘플 유형에 대해 프로테이나제 K를 사용한 효소 분해를 사용한다.
WO 2006/138444 A2호는 세제로서 비이온성 계면활성제 Triton X-100을 사용하는 용해 및 안정화 완충제를 기재하고 있다. 그러나, 비이온성 세제 Triton X-100은 불량한 핵산 양을 제공하며 매우 불순하고 A260/280 및 A260/230 비율이 좋지 않은 것을 특징으로 한다. WO 2006/138444 A2호의 저자는 핵산 농도를 정량화하지 않았으며 얻은 핵산의 순도에 대한 정보도 제공하지 않았기 때문에 이러한 결핍을 인식할 수 없었다.
따라서, 생물학적 샘플과 같은 샘플로부터 핵산을 단리하는 다양한 방법이 알려져 있다. 그러나 여전히 대체 방법이 필요하다. 특히, 다양한 샘플로부터 핵산을 신속하게 단리할 수 있고 획득한 핵산의 양과 품질이 RT-PCR, qPCR, 시퀀싱 방법, 예컨대 차세대 시퀀싱, 클로닝 방법 등과 같은 핵산 증폭 방법과 같은 다양한 다운스트림 적용에 대해 충분한 방법이 필요하다. 특히, 시간 소모적인 효소 분해 단계를 적용할 필요 없이 샘플로부터 신속한 핵산 단리를 가능하게 하는 방법이 필요하다.
본 발명은 무엇보다도 상이한 세포 샘플로부터 충분한 순도 및 완전성을 갖는 핵산의 매우 빠르고 신뢰할 수 있는 단리를 위해 적합한 조성물, 용도 및 방법을 제공함으로써 이러한 필요를 해결한다.
본 발명자의 연구 활동 범위 내에서 핵산의 단리를 위한 다양한 신규 용해 방법이 개발되었다. 놀랍게도, 예를 들어 승온에서 화학적 TCEP(또는 유사한 포스핀 화합물)와 같은 환원제 및 SDS와 같은 음이온성 세제(둘 모두 저독성의 화학물질이 연관되어 있음)를 기반으로 한 무효소(순전히 화학적) 방법이 확인되었으며, 이는 매우 효율적이고 빠르고 쉽게 수행할 수 있으며 충분한 순도와 완전성을 갖는 핵산을 생성한다. 이 새로운 방법은 핵산 단리 시간을 15분 미만으로 줄여 최종 사용자에게 최신 기술에 비해 엄청난 이점을 제공한다.
본 발명의 방안은 하기에서 기술되고, 실시예에서 예시되고, 도면에 예시되고 청구범위에 반영된다.
본 발명은
(a) 완충 물질, 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 더욱 바람직하게는 pH 약 4 내지 11 또는 4 내지 10, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질; 및
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제:
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 바람직하게는 음이온성 세제를 포함하며,
적어도 약 60℃의 온도에서, 바람직하게는 적어도 10 초 동안 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한, "용액"(이하, "본 발명의 용액"이라고도 함)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 본 발명의 용액을 사용한다.
본 발명은 또한 선택적으로 (d) 1M 미만의 카오트로픽 염(CAO) 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아를 추가로 포함하는, 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 본 발명의 용액의 용도에 관한 것이다. 또한 (d) 1M 미만의 카오트로픽 염(CAO) 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아를 선택적으로 추가로 포함하는 상기 본 발명의 용액은 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 본 발명의 시험관내 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 용액 및 추가로 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법 또는 용도에 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 용액에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법 또는 용도에 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 용액에 관한 것으로, 여기서 본 발명의 용액은 선택적으로 1M 미만의 카오트로픽 염(CAO) 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 용액은 적어도 약 60℃의 온도를 갖는다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액, 특히 본 발명의 용액을 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1은 도 1에 도시된 실시예 1에 사용된 상이한 샘플로 수행된 겔 전기영동을 나타낸다. 도 1A의 겔은 샘플 1 및 2에 의해 수득된 핵산을 반영한다. 도 1B에 도시된 겔은 샘플 3, 4, 5, 6 및 7에 의해 수득된 핵산을 보여준다. 도 1에서 명백한 바와 같이 모든 샘플은 저분자량 도말(smear)이 없는 고분자량 밴드를 제공하며, 이는 시험된 샘플에 분해된 핵산의 양이 적거나 전혀 없음을 나타낸다.
도 2는 실시예 2에서 수득된 핵산에 대한 겔 전기영동을 나타낸다. 이 실험에 사용된 상이한 샘플로 수행된 겔 전기영동에 의해 수득된 겔이 도 2에 도시되어 있다(각 레인에서 샘플 1, 2, 3, 4, 5, 및 6에 의해 수득된 핵산). 도 2에서 명백한 바와 같이 모든 샘플은 시험된 샘플에 온전한(비분해된) 핵산이 존재함을 나타내는 고분자량 밴드를 제공한다. 저분자량 도말은 알칼리성 조건보다 산성 조건에서 더 높은 것으로 보인다. 따라서, 분해된 핵산의 양은 알칼리성 조건보다 산성 조건에서 더 높을 수 있다.
도 3은 실시예 3에서 수득된 핵산의 겔 전기영동을 나타낸다. 이 실험에 사용된 상이한 샘플로 수행된 겔 전기영동에 의해 수득된 겔은 도 3a에 도시되어 있다(각 레인에서 샘플 1, 2, 3, 4, 5, 및 6에 의해 수득된 핵산). 도 3a에서 명백한 바와 같이 모든 샘플은 시험된 샘플에 온전한(비분해된) 핵산이 존재함을 나타내는 고분자량 밴드를 제공한다. 또한, TCEP 용해에 의해 수득된 핵산의 양은 효소 분해를 포함하는 용해에 의해 수득되는 양보다 분명히 더 높다. 이에 따른 PCR 그래프는 도 3b에 도시되어 있다. 실시예 3에서 수득된 핵산에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 이들 데이터는 "TCEP 용해"에 의해 수득된 핵산의 양이 효소 분해 단계를 포함하는 표준 용해에 의해 수득가능한 핵산의 양보다 많다는 것을 확인시켜준다.
도 4는 그람 음성균에 대해 실시예 14에서 수행된 광도 측정을 나타낸다. 그람 음성균에 대한 실시예 14의 샘플 1 내지 4에 대해, 각각의 광도 측정이 도 4a에 도시되어 있다. 그람 음성균에 대한 실시예 14의 샘플 5 내지 8에 대해, 각각의 광도 측정이 도 4b에 도시되어 있다. 그람 음성균에 대한 실시예 14의 샘플 9 내지 12에 대해, 각각의 광도 측정이 도 4c에 도시되어 있다.
도 5는 실시예 14에서 수행된 그람 음성균에 대한 겔 전기영동 결과를 나타낸다. 다음 넘버링이 적용된다. 1 내지 4 라인: 나트륨-도데실설페이트(SDS); 5 내지 8 라인: 리튬-도데실설페이트(LiDS); 9 내지 12 라인: Triton X-100; 및 13 라인: DNA Ladder GeneRuler 1KB+.
도 6은 인간 혈액에 대해 실시예 14에서 수행된 광도 측정을 나타낸다. 인간 혈액에 대한 실시예 14의 샘플 1 내지 4에 대해, 각각의 광도 측정이 도 6a에 도시되어 있다. 인간 혈액에 대한 실시예 14의 샘플 5 내지 8에 대해, 각각의 광도 측정이 도 6b에 도시되어 있다. 인간 혈액에 대한 실시예 14의 샘플 9 내지 12에 대해, 각각의 광도 측정이 도 6c에 도시되어 있다.
도 7은 인간 혈액에 대해 실시예 14에서 수행된 겔 전기영동 결과를 나타낸다. 다음 넘버링이 적용된다. 1 내지 4 라인: 나트륨-도데실설페이트(SDS); 5 내지 8 라인: 리튬-도데실설페이트(LiDS); 9 내지 12 라인: Triton X-100; 및 13 라인: DNA Ladder GeneRuler 1KB+.
도 2는 실시예 2에서 수득된 핵산에 대한 겔 전기영동을 나타낸다. 이 실험에 사용된 상이한 샘플로 수행된 겔 전기영동에 의해 수득된 겔이 도 2에 도시되어 있다(각 레인에서 샘플 1, 2, 3, 4, 5, 및 6에 의해 수득된 핵산). 도 2에서 명백한 바와 같이 모든 샘플은 시험된 샘플에 온전한(비분해된) 핵산이 존재함을 나타내는 고분자량 밴드를 제공한다. 저분자량 도말은 알칼리성 조건보다 산성 조건에서 더 높은 것으로 보인다. 따라서, 분해된 핵산의 양은 알칼리성 조건보다 산성 조건에서 더 높을 수 있다.
도 3은 실시예 3에서 수득된 핵산의 겔 전기영동을 나타낸다. 이 실험에 사용된 상이한 샘플로 수행된 겔 전기영동에 의해 수득된 겔은 도 3a에 도시되어 있다(각 레인에서 샘플 1, 2, 3, 4, 5, 및 6에 의해 수득된 핵산). 도 3a에서 명백한 바와 같이 모든 샘플은 시험된 샘플에 온전한(비분해된) 핵산이 존재함을 나타내는 고분자량 밴드를 제공한다. 또한, TCEP 용해에 의해 수득된 핵산의 양은 효소 분해를 포함하는 용해에 의해 수득되는 양보다 분명히 더 높다. 이에 따른 PCR 그래프는 도 3b에 도시되어 있다. 실시예 3에서 수득된 핵산에 대해 RT-PCR을 수행하였다. 이들 데이터는 "TCEP 용해"에 의해 수득된 핵산의 양이 효소 분해 단계를 포함하는 표준 용해에 의해 수득가능한 핵산의 양보다 많다는 것을 확인시켜준다.
도 4는 그람 음성균에 대해 실시예 14에서 수행된 광도 측정을 나타낸다. 그람 음성균에 대한 실시예 14의 샘플 1 내지 4에 대해, 각각의 광도 측정이 도 4a에 도시되어 있다. 그람 음성균에 대한 실시예 14의 샘플 5 내지 8에 대해, 각각의 광도 측정이 도 4b에 도시되어 있다. 그람 음성균에 대한 실시예 14의 샘플 9 내지 12에 대해, 각각의 광도 측정이 도 4c에 도시되어 있다.
도 5는 실시예 14에서 수행된 그람 음성균에 대한 겔 전기영동 결과를 나타낸다. 다음 넘버링이 적용된다. 1 내지 4 라인: 나트륨-도데실설페이트(SDS); 5 내지 8 라인: 리튬-도데실설페이트(LiDS); 9 내지 12 라인: Triton X-100; 및 13 라인: DNA Ladder GeneRuler 1KB+.
도 6은 인간 혈액에 대해 실시예 14에서 수행된 광도 측정을 나타낸다. 인간 혈액에 대한 실시예 14의 샘플 1 내지 4에 대해, 각각의 광도 측정이 도 6a에 도시되어 있다. 인간 혈액에 대한 실시예 14의 샘플 5 내지 8에 대해, 각각의 광도 측정이 도 6b에 도시되어 있다. 인간 혈액에 대한 실시예 14의 샘플 9 내지 12에 대해, 각각의 광도 측정이 도 6c에 도시되어 있다.
도 7은 인간 혈액에 대해 실시예 14에서 수행된 겔 전기영동 결과를 나타낸다. 다음 넘버링이 적용된다. 1 내지 4 라인: 나트륨-도데실설페이트(SDS); 5 내지 8 라인: 리튬-도데실설페이트(LiDS); 9 내지 12 라인: Triton X-100; 및 13 라인: DNA Ladder GeneRuler 1KB+.
놀랍게도, 본 명세서에 개시된 바와 같은 환원제 (b), 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충 물질 (a) 및 음이온성 세제 (c)를 포함하는 용액을 사용할 때, 핵산이 다양한 유형의 샘플로부터 충분한 양으로 약 15분 이하, 바람직하게는 10분 이하, 더욱 바람직하게는 5분 이하 내에 우수한 품질로 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다. 완충 물질 (a)은 바람직하게는 pH 약 6 내지 9, 바람직하게는 약 7.5에서 용액을 완충시키기 위한 것이다.
값과 관련하여 "약"이라는 용어는 값 자체도 포함하는 것으로 이해될 것이다. pH 값의 맥락에서 용어 "약"은 그 자체의 값 및 + 또는 - 또는 +/- 10%를 지칭하는 것으로 추가로 이해될 것이다.
환원제 (b)는 약 20 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 약 50 mM의 농도로 용액에 존재하는 것으로 생각된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 용액 중의 샘플은 약 60℃ 이상, 바람직하게는 약 60℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 약 80℃에서 인큐베이션될 수 있다. 바람직한 환원제 (b)는 TCEP인 한편, SDS 및 LiDS는 바람직한 음이온성 세제(c)이다. 본 발명의 용도 및 방법 및 키트의 맥락에서, 클리어링 용액 (h)이 용액에 첨가될 수 있는 것이 추가로 바람직하며, 여기서 상기 클리어링 용액(clearing solution)은 음이온성 세제를 침전시키는 것이다. 따라서, 상기 클리어링 용액은 K+, Rb+, Cs+, Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 양이온은 Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++일 수 있다. 보다 바람직하게는, 양이온은 Ca++, Sr++ 또는 Ba++일 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 양이온성 이온은 Ca++ 또는 Sr++일 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 양이온은 Sr++이다. 또 다른 바람직한 구현예에서 클리어링 용액은 SrCl을 포함한다. 클리어링 용액의 첨가는 음이온성 세제를 침전시키는 화합물의 첨가를 목적으로 하는 것으로 이해될 것이며, 따라서 용어 "클리어링 용액"은 또한 고체 침전 화합물, 예를 들어, SrCl의 첨가를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
추가로, 본 명세서에 기재되고 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에 사용되는 용액, 특히 본 발명의 용액은 카오트로픽 염 (d), 착화제 (e), 용액에 OH- 이온을 제공하는 화합물 (f) 및/또는 DNA 안정제 (g)와 같은 추가의 선택적 성분을 포함하는 것이 바람직하다.
상이한 유형의 샘플로부터 핵산을 단리하기 위해 시간이 많이 소요되는 프로테아제 분해 단계가 본 명세서에 기재된 방법에서는 생략될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었으며, 이는 상이한 세포 샘플들로부터 충분한 순도 및 완전성을 갖는 핵산의 매우 빠르고 신뢰할 수 있는 단리를 초래한다. 첨부된 실시예의 표 12는 샘플의 용해가 약 60℃ 이상의 온도에서 본 발명의 용액으로 수행될 때 충분한 양 및 품질의 핵산이 수득됨을 예시한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액 중의 샘플은 약 60℃ 이상의 온도, 보다 바람직하게는 약 60℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도, 더욱 더 바람직하게는 약 80℃의 온도에서 인큐베이션하는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서 그리고 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약" 다음에 나오는 온도 값은 그 온도 값의 +/- 5℃, 바람직하게는 +/- 2℃, 더욱 바람직하게는 +/- 1℃와 같은 온도 값을 의미한다.
이러한 방식으로, 핵산은 짧은 시간, 예를 들어 약 15분 이하, 바람직하게는 약 10분 이하 동안에 충분한 품질 및 양으로 수득될 수 있다. 특히, 환원제와 열과의 조합은 실시예 10에 더 상세히 기술된 바와 같이 본 발명의 방법 및 용도에 의해 수득될 수 있는 핵산의 양을 극적으로 증가시킨다. 대부분의 경우, 핵산의 양은 온도를 40℃에서 60℃ 또는 80℃로 증가시킬 때 6배 이상 증가할 수 있다. 이러한 데이터는 환원제와 온도의 증가가 핵산의 단리를 상승적으로 개선함을 시사한다. 샘플을 포함하는 용액이 열과 함께 인큐베이션될 때, 용액 내 카오트로픽 염(CAO) 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아의 존재는 핵산을 얻는데 필수적이지 않다.
카오트로픽 염 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아의 존재는 선택적이며, 이러한 성분이 본 발명의 용도, 방법, 용액 및 키트에 대해 필수적이지 않더라도 허용될 수 있다(카오트로픽의 양이 음이온성 세제를 침전시키지 않는 경우에 한함). 따라서, 용액이 카오트로픽 염 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아를 포함하는 경우 핵산이 단리되는 것도 또한 가능하다(그러나 덜 바람직함).
상기 및 다른 곳에서 이미 언급한 바와 같이, 상이한 유형의 샘플로부터 핵산을 단리하기 위해 시간이 많이 소요되는 프로테아제 분해 단계를 생략할 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 따라서 본 명세서에 기재된 방법 및 용도는 샘플을 핵산 단리 방법의 맥락에서 당업계에서 전형적으로 사용되는 (본 명세서에 더 상세히 기술된 것과 같은) 효소와 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 본 발명의 용액 및 키트는 이러한 효소를 포함하지 않을 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도는 효소를 이용해 용해를 수행하는 단계를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
언급된 "효소"는 프로테아제, 라이소자임, 리파아제, 셀룰라아제, 가수분해효소, 키티나아제, 아밀라아제 또는 글루카나아제와 같은 핵산 단리 방법에 일반적으로 사용되는 효소를 포함한다.
예시적인 프로테아제는 서브틸리신, 서브틸라제 및 알칼리성 세린 프로테아제를 포함한다. 예시적인 서브틸리신은 프로테이나제 K, 프로테이나제 R, 프로테이나제 T, 서브틸리신 A, 서브틸리신 B 또는 테르미타제를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법/용도는 30분 미만, 바람직하게는 15분 미만, 보다 바람직하게는 10분 미만, 예컨대 5분 미만, 4분 미만, 3분 미만, 2분 미만, 1분 미만, 또는 심지어 30초 미만 내에 핵산의 단리를 가능하게 한다.
따라서, 방법/용도는 10분 이내에 핵산의 단리를 허용하는 것이 바람직하고, 방법/용도는 5분 이내에 핵산의 단리를 허용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 시간 제한은 본 발명의 용도/방법의 용해 단계에 관한 것이 바람직하다. 따라서 시간 제한의 측정은 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같은 용액과 샘플의 접촉 시작부터 계산된다.
또한, 본 발명의 방법/용도는 샘플을 100mM 또는 200mM 또는 그 이상의 농도의 카오트로픽 염 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아와 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것으로 예상된다. 충분한 양 및 충분한 품질의 핵산을 얻기 위한 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해 용액은 카오트로픽 염 또는 우레아의 존재를 전혀 필요로 하지 않는다.
용액에서 OH- 이온을 제공하는 화합물(화합물 (f))의 첨가에 대해서도 마찬가지이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 용액 (f)에서 OH- 이온을 제공하는 화합물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
또한, 단리될 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같은 모든 방법 단계 또는 용도 동안 용액에 남아 있는 것이 고려된다. 결과적으로, 핵산이 단계 (iii)에 의해 얻어진 용출액에 존재하는 것이 추가로 고려된다. 단계 (iii)은 하기 본 명세서에서 추가로 상세히 설명되는 바와 같이 핵산으로부터 비핵산 성분을 단리하는 단계이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법/용도에 의해 수득된 핵산의 양 및 품질은 이러한 핵산이 다양한 다운스트림 적용에 사용될 수 있을 정도로 충분하다. 따라서, 단리된 핵산/용출액(용액 중 단리된 핵산 포함)은 예를 들어 PCR, 차세대 시퀀싱, SNP 유전자형 분석, qPCR 또는 RT-PCR과 같은 모든 기존의 분자 기법에 의해 분석될 수 있다. 따라서 단리된 핵산은 추가 단리 단계 없이 PCR 차세대 시퀀싱, SNP 유전자형 분석 또는 RT-PCR과 같은 방법으로 분석될 수 있다.
핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법/용도에서 유기 용매의 첨가에 의해 침전되지 않는 것이 추가로 고려된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법/용도는 샘플을 유기 용매와 접촉시키는 단계를 포함하지 않을 수 있다. 핵산의 침전에 영향을 미치는 유기 용매는 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 메탄올, 에탄올 또는 프로판올과 같은 알코올을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 핵산의 "단리함" 또는 "단리"(또는 이와 유사한 것)라는 용어는 핵산의 정제를 의미한다. 예를 들어, 단리함 또는 단리는 핵산이 샘플에서 추출됨을 의미할 수 있다. 샘플로부터 핵산의 추출은 핵산을 용액으로 만드는 것을 포함할 수 있다고 생각된다. "용액으로 만드는 것"이라는 용어는 핵산이 샘플, 예를 들어 세포, 세포 핵 또는 단백질로부터 단리되고 용액 내 이러한 구성성분과 별도로(적어도 부분적으로) 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 핵산의 "단리함" 또는 "단리"라는 용어는 세포 샘플의 단순한 용해는 배제하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산은 임의의 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 RNA 또는 DNA, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 dRNA는 임의의 RNA를 의미할 수 있다. RNA는 mRNA, tRNA, 또는 rRNA일 수 있다. DNA는 게놈 DNA, 순환 DNA 또는 플라스미드 DNA일 수 있다.
본 방법/용도는 샘플로부터의 핵산의 단리와 관련된다. 샘플은 임의의 적절한 샘플일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 핵산을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플은 세포, 바이러스, 바이로이드 또는 플라스미드를 포함하거나 포함하는 것으로 추측되는 샘플일 수 있다.
따라서 샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 이와 같이 샘플은 동물, 식물, 미생물, 바이러스, 원생동물, 크로미스타 또는 진균으로부터 얻은 샘플일 수 있다. 또한 샘플은 혈액 샘플, 바람직하게는 인간 혈액 샘플, 또는 조직 샘플, 바람직하게는 근육 샘플, 정자 샘플, 식물 샘플, 세포 샘플, 점막 샘플, 예를 들어 구강 점막 샘플 또는 세균 샘플, 바람직하게는 그람 음성균 샘플인 것으로 고려된다.
또한 환경적 샘플이 고려된다. 환경적 샘플은 물 샘플, 토양 샘플, 공기 샘플일 수 있으며, 바람직하게는 이러한 샘플은 세포, 바이러스, 바이로이드 또는 플라스미드를 포함하거나 포함하는 것으로 추측된다.
샘플은 (a) 완충 물질 (BU), (b) 환원제 (RA) 및 (c) 바람직하게는 음이온성 세제; 및 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 추가 구성성분을 포함하는 용액과 접촉되는 것으로 기술된다.
환원제 (b)는 하기 화학식 (I)에 따른 화합물, 및 이의 염인 것이 바람직하다:
상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알킬레닐-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법/용도는 샘플을 특히 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (b), 바람직하게는 화학식 (I)의 환원제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, 임의의 적합한 환원제, 바람직하게는 화학식 (I)인 환원제가 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해 용액에 사용될 수 있다. 당업자는 화학식 (I)을 갖는 적합한 환원제를 알고 있다.
또한, 화학식 (I)에서 하기인 것이 바람직하다:
i)
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H, 바람직하게는 H, -OH, 및 -COOH로 이루어진 군으로부터 선택됨, 및/또는
ii)
R4 내지 R10 은 -H임, 및/또는
iii)
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C9)알킬렌-, -(C3-C9)사이클로알킬렌-, -(C2-C9)알케닐렌-, 바람직하게는 -(C1-C5)알킬렌-, -(C3-C6)사이클로알킬렌-, 및 -(C2-C5)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택됨, 및/또는
iv)
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C9)알킬렌- 및 -(C2-C9)알케닐렌-, 바람직하게는 -(C1-C5)알킬렌-, 및 -(C2-C5)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택됨, 및/또는
v)
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4 또는 -(C1-C15)알킬, 바람직하게는 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨.
추가 구현예에서, 화학식 (I)에서, R1, R2 및 R3는 독립적으로 H, -OR4 및 -COOR5로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4 및 R5는 독립적으로 -H, 및 -(C1-C10)알킬, 바람직하게는 -(C1-C5)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고; A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C5)알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 구현예에서, 화학식 (I)에서, R1, R2 및 R3는 독립적으로 H, -OR4 및 -COOR5로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4 및 R5는 H이고; A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C5)알킬렌-, 바람직하게는 -(C1-C3)알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 화학식 (I)에 따른 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 트리스(하이드록시메틸)포스핀, 트리스(하이드록시에틸)포스핀 및 트리스(하이드록시프로필)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 것이 고려된다.
바람직한 구현예에서, 화학식 (I)에서, R1, R2 및 R3는 각각 COOH이고, A1, A2 및 A3는 -(C1-C5)알킬렌-, 바람직하게는 -(C1-C3)알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 화학식 (I)에서, R1, R2 및 R3는 각각 COOH이고, A1, A2 및 A3는 각각 -(CH2)2-이다.
따라서, 가장 바람직한 구현예에서, 화학식 (I)에 따른 환원제 (b)는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)이다.
용어 "알킬"은 포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소의 모노라디칼을 지칭한다. 바람직하게는, 알킬 기는 1 내지 15개(예: 1 내지 10개)의 탄소 원자, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 15개의 탄소 원자를 포함한다. 예를 들어, 용어 "(C1-C15)알킬"은 탄소수 1 내지 15의 알킬 기를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 1 내지 5개의 탄소 원자, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 예시적인 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소-펜틸, sec-펜틸, 네오-펜틸, 1,2-디메틸-프로필, 이소-아밀, n-헥실, 이소-헥실, sec-헥실, n-헵틸, 이소-헵틸, n-옥틸, 2-에틸-헥실, n-노닐, n-데실, n-운데실, n-도데실 등을 포함한다.
용어 "알킬렌"은 포화된 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소의 2라디칼을 지칭한다. 바람직하게는, 알킬렌은 1 내지 15개의 탄소 원자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 15개의 탄소 원자를 포함한다. 예를 들어, 용어 "(C1-C15)알킬렌-"은 탄소수 1 내지 15의 알킬렌 기를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 알킬렌 기는 1 내지 9개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함한다. 예시적인 알킬렌 기는 메틸렌, 에틸렌(즉, 1,1-에틸렌, 1,2-에틸렌), 프로필렌(즉, 1,1-프로필렌, 1,2-프로필렌(-CH(CH3)CH2-), 2,2-프로필렌(-C(CH3)2-) 및 1,3-프로필렌), 부틸렌 이성질체(예: 1,1-부틸렌, 1,2-부틸렌, 2,2-부틸렌, 1,3-부틸렌 , 2,3-부틸렌(시스 또는 트랜스 또는 이들의 혼합물), 1,4-부틸렌, 1,1-이소-부틸렌, 1,2-이소-부틸렌 및 1,3-이소-부틸렌), 펜틸렌 이성질체(예: 1,1-펜틸렌, 1,2-펜틸렌, 1,3-펜틸렌, 1,4-펜틸렌, 1,5-펜틸렌, 1,1-이소-펜틸렌, 1,1-sec-펜틸, 1,1-네오-펜틸), 헥실렌 이성질체(예: 1,1-헥실렌, 1,2-헥실렌, 1,3-헥실렌, 1,4-헥실렌, 1,5-헥실렌, 1,6-헥실렌, 및 1,1-이소헥실렌) 등을 포함한다.
용어 "사이클로알킬렌"은 포화 또는 부분 불포화 사이클릭 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소의 비방향족 2라디칼을 지칭한다. 바람직하게는, 사이클로알킬렌은 3 내지 10개의 탄소 원자, 즉 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 탄소 원자를 포함한다. 예를 들어, 용어 "(C1-C10)사이클로알킬렌-"은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 사이클로알킬렌 기를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 사이클로알킬렌 기는 3 내지 9개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 3 내지 6개의 탄소 원자를 포함한다. 예시적인 사이클로알킬 기는 사이클로프로필렌, 사이클로프로페닐렌, 사이클로부틸렌, 사이클로부테닐렌, 사이클로펜틸렌, 사이클로펜테닐렌, 사이클로헥실렌, 사이클로헥세닐렌, 사이클로헵틸렌, 사이클로헵테닐렌, 사이클로옥틸렌, 사이클로옥테닐렌, 사이클로노닐렌, 사이클로노네닐렌, 사이클로데실렌, 사이클로데세닐렌, 및 아다만틸을 포함한다. 용어 "사이클로알킬렌"은 또한 이의 2환식 및 3환식 버전을 포함하는 것을 의미한다. 2환식 고리가 형성되는 경우, 각각의 고리는 2개의 인접한 탄소 원자에서 서로 연결되는 것이 바람직하지만, 대안적으로 2개의 고리가 동일한 탄소 원자를 통해 연결되며, 즉 이들은 스피로 고리 시스템을 형성하거나 "가교된" 고리 시스템을 형성한다. 사이클로알킬렌의 바람직한 예는 -(C3-C9)사이클로알킬렌, 특히 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 스피로[3,3]헵틸, 스피로[3,4]옥틸, 스피로[4,3]옥틸, 바이사이클로[4.1.0]헵틸, 바이사이클로[3.2.0]헵틸, 바이사이클로[2.2.1]헵틸, 바이사이클로[2.2.2]옥틸, 바이사이클로[5.1.0]옥틸, 및 바이사이클로[4.2.0]옥틸을 포함한다.
용어 "알케닐렌"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소의 2라디칼을 지칭한다. 일반적으로, 알케닐렌 기의 탄소-탄소 이중 결합의 최대 수는 알케닐렌 기의 탄소 원자 수를 2로 나누어 계산한 정수와 같을 수 있으며, 알케닐렌 기의 탄소 원자 수가 홀수라면 나누기 결과를 다음 정수로 내림한다. 예를 들어, 9개의 탄소 원자를 갖는 알케닐렌 기의 경우, 탄소-탄소 이중 결합의 최대 수는 4이다. 바람직하게는, 알케닐렌 기는 1 내지 4, 즉 1, 2, 3 또는 4개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는다. 바람직하게는, 알케닐렌 기는 2 내지 15개의 탄소 원자, 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 탄소 원자를 포함한다. 예를 들어, 용어 "(C2-C15)알케닐렌-"은 2 내지 15개의 탄소 원자를 갖는 알케닐렌 기를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 알케닐렌 기는 2 내지 9개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 2 내지 5개의 탄소 원자, 특히 바람직하게는 2 내지 3개의 탄소 원자를 포함한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 알케닐렌 기는 2 내지 15개의 탄소 원자 및 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고, 보다 바람직하게는 2 내지 9개의 탄소 원자 및 1, 2, 3 또는 4개의 탄소-탄소 이중 결합, 가장 바람직하게는 2 내지 5개의 탄소 원자 및 1 또는 2개의 탄소-탄소 이중 결합, 특히 바람직하게는 2 내지 3개의 탄소 원자 및 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함한다. 탄소-탄소 이중 결합(들)은 시스(Z) 또는 트랜스(E) 배열일 수 있다. 예시적인 알케닐렌 기는 에텐-1,2-디일, 비닐리덴, 1-프로펜-1,2-디일, 1-프로펜-1,3-디일, 1-프로펜-2,3-디일, 알릴리덴, 1-부텐-1,2-디일, 1-부텐-1,3-디일, 1-부텐-1,4-디일, 1-부텐-2,3-디일, 1-부텐-2,4-디일, 1-부텐-3,4-디일, 2-부텐-1,2-디일, 2-부텐-1,3-디일, 2-부텐-1,4-디일, 2-부텐-2,3-디일, 2-부텐-2,4-디일, 2-부텐-3,4-디일 등을 포함한다.
환원제 (RA)는 임의의 적합한 양으로 용액에 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 사용되는 환원제는 적어도 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 500 mM 또는 그 이상의 온도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 약 1 mM 내지 500 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 약 1 mM 내지 약 200 mM 또는 2 mM 내지 150 mM의 농도로, 바람직하게는 5 mM 내지 140 mM의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있으며, 더욱 더 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 50 mM 또는 10 mM 내지 40 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 약 5 mM 내지 100 mM의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도, 가장 바람직하게는 약 10 mM 내지 50 mM의 농도로, 더욱 더 바람직하게는 약 20 mM 내지 40 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 약 1 mM 내지 약 200 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 약 30 mM 내지 약 50 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 20 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 30 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 40 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 50 mM의 농도로 존재할 수 있다. 환원제는 또한 100 mM의 농도로 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법에 사용된 환원제 (b)는 약 20 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 환원제 (b)는 약 50 mM의 농도로 존재한다.
또한 샘플은 용액과 접촉되는 것으로 고려되며, 상기 용액은 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충 물질, 환원제 및 바람직하게는 음이온성 세제를 포함하는 것이다.
완충 물질 (BU)은 임의의 적합한 완충 물질일 수 있다. 기본적으로, 완충 물질은 희석 또는 소량의 산 또는 알칼리 첨가 시 pH의 특정 변화를 저지한다. 완충제는 예를 들어 pH 약 1 내지 13, 바람직하게는 2 내지 13, 더욱 바람직하게는 4 내지 11 또는 4 내지 10, 더욱 더 바람직하게는 4 내지 7 또는 5 내지 8 또는 6 내지 9의 pH 범위에서 완충시킬 수 있다. 완충제는 또한 약 3 내지 약 11의 pH 범위, 바람직하게는 약 4 내지 약 10의 pH 범위에서 완충시킬 수 있다. 완충 물질이 약 6 내지 약 9의 pH 범위, 가장 바람직하게는 약 7.5의 pH에서 완충시킬 수 있는 것이 바람직하다. 상기의 pH 값 범위가 본 발명의 모든 구현예에서 사용될 수 있음은 물론이다.
완충 물질 (BU)은 당업자에게 잘 알려져 있으며, TRIS, 예를 들어 TRIS-HCl, 타르트레이트 완충제, 보레이트 완충제, 카보네이트 완충제, 시트레이트 완충제, HEPES, HPPS, MES ([2-(N-모르필리노)에탄설폰산]), ADA (N-2-아세트아미도-2-이미노디아세트산), AMP, AMPSO, CAPSO, CAPS, CABS, CHES, PIPES, ACES, MOPSO, MOPS, BES, TES, DIPSO, TAPSO, TEA, EPS, HEPBS, POPSO, HEPPSO, HEPPS, TAPS, 염화콜라민 완충제, 아세트아미도글리신 완충제, 트리신 완충제, 글리신아미드 완충제, 글리실글리신 완충제, 비스-트리스 메탄 완충제, 바이신 완충제, 또는 임의의 암모니아 완충제를 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게 완충 물질은 TRIS, 바람직하게는 TRIS-HCl 또는 타르트레이트 완충제, 바람직하게는 타르타르산나트륨이다.
바람직한 일 구현예에서, 완충 물질 (BU)은 TRIS이다.
더욱 바람직한 일 구현예에서, 완충 물질 (BU)은 TRIS-HCl이다.
바람직한 일 구현예에서, 완충 물질 (BU)은 타르트레이트 완충제이다.
더욱 바람직한 일 구현예에서, 완충 물질 (BU)은 타르타르산나트륨이다.
샘플은 완충 물질 (a)을 임의의 적절한 양으로 포함하는 용액과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 완충 물질 (a)은 적어도 약 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM 또는 그 이상의 농도로 존재할 수 있다. 완충 물질 (BU)은 약 2 mM 내지 약 50 mM의 농도, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 40 mM의 농도, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 30 mM의 농도로 존재할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 예를 들어, 완충 물질은 약 20 mM 또는 50 mM의 농도로 존재할 수 있다. 따라서, 완충 물질 (BU)은 TRIS-HCl과 같은 TRIS일 수 있고, 여기서 TRIS는 약 2 mM 내지 약 50 mM의 농도, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 40 mM의 농도, 보다 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 30 mM의 농도로 존재한다.
완충 물질은 (이전에 본 명세서 언급된 바와 같은) 타르트레이트일 수 있다. 타르트레이트는 약 2 mM 내지 약 50 mM의 농도로, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 40 mM의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 30 mM, 가장 바람직하게는 약 20 mM의 농도로 존재할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 또한 세제 (c)를 포함한다.
본 발명의 모든 구현예의 맥락에서 사용되는 세제는 임의의 적합한 세제, 특히 임의의 적합한 음이온성 세제일 수 있다.
세제의 비제한적인 예는 나트륨 도데실 설페이트 (SDS, 또는 때때로 NaDS로도 표시됨), 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) 및 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
음이온성 세제의 비제한적인 예는 리튬 도데실 설페이트(LiDS), NaDS, 나트륨 옥틸 설페이트, 데실트리메틸암모늄 클로라이드, 칼륨 올레에이트, 나트륨 펜탄설포네이트, 나트륨 도데실 설페이트, 부틸나프탈렌설폰산 나트륨염, 4-모르폴린에탄설폰산, 나트륨 데실 설페이트, 리그노설폰산 칼슘염, 나트륨 1-부탄설포네이트, 나트륨 도데실벤젠설포네이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 1-도데칸설폰산 나트륨염, 나트륨 알릴설포네이트, 3-(N,N-디메틸팔미틸암모니오)프로판설포네이트, 설폰화 피마자유, 2,6-디모르폴린-4-일피리미딘-4-카르복실산, 2나트륨 메틸렌비스나프탈렌설포네이트, 나트륨 알킬벤젠 설포네이트, 하이드록시알루미늄 디스테아레이트, 나트륨 에틸 2-설포라우레이트, 나트륨 디아이소부틸 설포석시네이트, 도데실벤젠설폰산 나트륨염, 디사이클로헥실 설포석시네이트 나트륨염, 2나트륨 4-도데실-2,4'-옥시디벤젠설포네이트, 설폰화 지방족 폴리에스테르, 나트륨-n-메틸-n-올레일 타우레이트, 디-n-나트륨 설포석시네이트, 2염기성 스테아르산납, 나트륨 n-옥틸설포네이트, 도데실 트리에탄올아민 설페이트, 나트륨 디아밀 설포석시네이트, 스테아르산망간, 칼슘 도데실벤젠 설포네이트, 2나트륨 4-[2-[(1-옥소운데스-10-에닐)아미노]에틸] 2-설포나토석시네이트, 나트륨 폴리[(나프탈렌포름알데하이드)설포네이트], 1-헥사데칸설폰산 나트륨염, 암모늄 라우릴 설페이트, 1-펜탄설폰산 나트륨염 1수화물, 나트륨 리그노설포네이트, 도데실벤젠설폰산, 나트륨 라우릴 폴리옥시에틸렌 에테르 설페이트, 나트륨 노닐페놀 폴리에틸렌 에테르 설페이트, 나트륨 도데실 설페이트, 지방 알코올 암모늄 설페이트, 나트륨 올레일 사르코시네이트, 라우릴 폴리옥시에틸렌 에테르 트리에탄올 아민염, 도데실 페닐 암모늄 설페이트, 나트륨 피롤리돈 카르보네이트, n-아실 글루타메이트 칼륨염, 나트륨 폴리알킬 페닐 폴리옥시에틸렌 에테르 설페이트, 스테아릴톨루엔 나트륨 설포네이트, 노닐페닐 폴리옥시에틸렌 에테르 설페이트 트리에탄올아민, 글리세릴 에테르카르복실산염, 칼슘 스테아릴 락테이트, 모노에탄올아민 도데실 설페이트, 알콕시 에탄올아미도 설포석시네이트 나트륨염, 암모늄 도데실벤젠설포네이트, 도데실 디에탄올 아민 설페이트, 나트륨 디벤질 아민 벤젠 설포네이트 또는 나트륨 디벤질 아민 벤젠 설포네이트를 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 용도, 방법 또는 용액의 더욱 바람직한 일 구현예에서, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 암모늄 도데실 설페이트, 모노에탄올아민 도데실 설페이트, 디에탄올아민 도데실 설페이트, 또는 트리에탄올아민 도데실 설페이트이다.
본 명세서에 기재된 임의의 용도, 방법 또는 용액의 더욱 더 바람직한 구현예에서, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 암모늄 도데실 설페이트, 모노에탄올아민 도데실 설페이트, 또는 트리에탄올아민 도데실 설페이트이다.
본 명세서에 기재된 임의의 용도, 방법 또는 용액의 더욱 더 바람직한 일 구현예에서, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 또는 암모늄 도데실 설페이트이다.
본 명세서에 기재된 임의의 용도, 방법 또는 용액의 더욱 더 바람직한 일 구현예에서, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 또는 리튬 도데실 설페이트(LiDS)이다.
본 명세서에 기재된 임의의 용도, 방법 또는 용액의 더욱 더 바람직한 일 구현예에서, 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)이다.
샘플이 세제, 예를 들어 음이온성 세제와 1M 미만, 900 mM 미만, 800 mM 미만, 700 mM 미만, 600 mM 미만, 500 mM 미만, 400 mM 미만, 300 mM 미만, 200 mM 미만, 190 mM 미만, 180 mM 미만, 170 mM 미만, 160 mM 미만, 150 mM 미만, 140 mM 미만, 130 mM 미만, 120 mM 미만, 110 mM 미만, 100 mM 미만 90 mM 미만, 80 mM 미만, 70 mM 미만, 60 mM 미만, 50 mM 미만, 40 mM 미만, 30 mM 미만, 20 mM 미만, 10 mM 미만, 5 mM 미만, 4 mM 미만, 3 mM 미만 또는 그 이하의 농도로 접촉하는 것으로 고려된다.
세제, 예를 들어 음이온성 세제는 또한 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 2 mM 내지 약 140 mM, 약 3 mM 내지 약 130 mM, 약 4 mM 내지 약 120 mM, 약 5 mM 내지 약 110 mM, 또는 약 7 mM 내지 약 110 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있다. 세제는 또한 약 20 mM 내지 약 100 mM의 농도로 존재할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 환원제 (b) 및 완충 물질 (a) 외에 선택적으로 착화제 (e)를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도에서 샘플은 착화제 (e)를 추가로 포함하는 이러한 용액과 접촉될 수 있다. 착화제는 바람직하게는 킬레이트제이다. 착화제는 임의의 적합한 착화제일 수 있다. 킬레이트제와의 착물화는 여러자리(다중 결합) 리간드와 단일 중심 원자 사이에 2개 이상의 개별 배위 결합의 형성 또는 존재를 포함한다.
착화제는 DNase 활성을 억제하기 위해 용해 용액에 첨가될 수 있다.
착화제의 비제한적인 예는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 및 에틸렌 디아민 디아세트산(EDDS)을 포함한다. 또한, 착화제는 타르타르산, 또는 타르타르산나트륨과 같은 이의 염일 수 있다.
바람직한 일 구현예에서, 착화제는 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)이다.
바람직한 일 구현예에서, 착화제는 에틸렌 디아민 디아세트산(EDDS)이다.
바람직한 일 구현예에서, 착화제는 타르타르산나트륨이다.
착화제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)인 것이 가장 바람직하다.
착화제는 임의의 적절한 농도로 존재할 수 있다. 예를 들어, 착화제는 10 mM 미만, 9 mM 미만, 8 mM 미만, 7 mM 미만, 6 mM 미만, 5 mM 미만, 4 mM 미만, 3 mM 미만, 2 mM 미만, 1 mM 미만, 0.9 mM 미만, 0.8 mM 미만, 0.7 mM 미만, 0.6 mM 미만, 0.5 mM 미만, 0.4 mM 미만, 0.3 mM 미만, 0.2 mM 미만, 0.1 mM 미만, 0.05 mM 미만 또는 그 이하의 농도로 존재할 수 있다. 또한 착화제는 약 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.025 mM 내지 약 0.75 mM, 약 0.05 mM 내지 약 0.5 mM, 약 0.075 mM 내지 약 0.25 mM, 또는 약 0.1 mM의 농도로 존재할 수 있는 것으로 또한 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 용액은 환원제 (b), 완충 물질 (a), 세제 (c) 및 선택적으로 착화제 (e) 이외에 선택적으로 카오트로픽 염(CAO) 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아(본 명세서에 기재된 임의의 화합물(d))을 포함한다.
카오트로픽 염(CAO)은 임의의 적합한 카오트로픽 염일 수 있다. 유사하게, 우레아는 임의의 적합한 우레아일 수 있다. 카오트로픽 염은 일반적으로 수소 결합, 반 데르 발스 힘과 같은 비공유력, 및 소수성 효과에 의해 매개되는 분자간 상호 작용을 방해하여 단백질 및 핵산(예: DNA 및 RNA)과 같은 거대분자의 구조를 파괴하고 변성시키는 화합물이다. 우레아에 대해서도 유사한 효과가 예상된다.
카오트로픽 염은 NO3 -, Br-, ClO4 -, ClO3 -, Cl3CCOO-, SCN-, K+, Ba+, Li+, NH4 +, Mg2+, Ca2+, 및 구아니디늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 이온을 포함하거나 제공할 수 있다. 바람직하게는, 카오트로픽 염은 NO3 -, Br-, ClO4 -, ClO3 -, Cl3CCOO-, SCN-, Li+, NH4 +, Mg2+, 및 구아니디늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온을 포함하거나 제공할 수 있다. 더 바람직하게는, 카오트로픽 염은 NO3 -, Br-, ClO4 -, ClO3 -, Cl3CCOO-, SCN-, Li+, NH4 +, 및 구아니디늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 음이온을 포함하거나 제공할 수 있다.
카오트로픽 염(CAO)의 비제한적인 예는 NaBr, NaI, NaSCN, LiCl, LiBr, NH4Ac, NaCl, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 하이드로클로라이드, 과염소산리튬, 과염소산나트륨, 아세트산리튬, 염화마그네슘, 구아니디늄 이소티오시아네이트 또는 구아니디늄 이소시아네이트(GuSCN)를 포함한다. 바람직하게는, 카오트로픽 염은 NaBr, NaI, NaSCN, LiCl, LiBr, NH4Ac, NaCl, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 하이드로클로라이드, 과염소산리늄, 과염소산나트륨, 아세트산리튬, 구아니디늄 이소티오시아네이트 또는 구아니디늄 이소시아네이트(GuSCN)를 포함할 수 있다.
우레아의 비제한적인 예는 우레아 또는 이의 염을 포함한다.
또한, 샘플은 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해 용액이 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 상이한 카오트로픽 염 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아와 접촉되는 것으로 고려된다.
카오트로픽 염 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아 (c)는 0.9 M 미만, 0.8 M 미만, 0.7 M 미만, 0.6 M 미만, 0.5 M 미만, 0.4 M 미만, 0.3 M 미만, 0.2 M 미만, 0.1 M 미만, 0.09 M 미만, 0.08 M 미만, 0.07 M 미만, 0.06 M 미만, 0.05 M 미만, 0.04 M 미만, 0.03 M 미만, 0.02 M 미만, 0.01 M 미만, 0.009 M 미만, 0.008 M 미만, 0.007 M 미만, 0.006 M 미만, 0.005 M 미만, 0.004 M 미만, 0.003 M 미만, 0.002 M 미만, 0.001 M 미만 또는 그 이하의 농도로 존재하는 것으로 고려된다.
또한 샘플은 카오트로픽 염 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아와 접촉되지 않는 것으로 고려된다. 따라서, 또한 용액은 카오트로픽 염 및/또는 우레아 및/또는 티오우레아를 포함하지 않는 것으로 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 방법/용도, 특히 용해 단계에서 샘플을 효소와 접촉시키는 것은 선택적이다.
이와 관련하여, 상기 본 명세서에서 이미 기술된 바와 같이, 샘플을 효소와 접촉시키지 않으면서 방법 및 용도를 수행하는 것이 바람직하다는 것을 다시 주목한다. 예를 들어, 핵산을 단리한 후 효소가 첨가될 수 있다. 따라서, 환원제 (b), 완충 물질 (a), 음이온성 세제 (c) 및 선택적으로 (d) 내지 (h) 중 하나 이상을 포함하는 용액은 효소를 포함하지 않는 것으로 추가로 고려된다.
또한 용액은 용액 내 OH- 이온을 제공하는 화합물(본 명세서 기재된 용해 용액 중의 선택적인 화합물 (f))을 추가로 포함하는 것으로 고려된다. 용액 내 OH- 이온을 제공하는 화합물은 용액 내 OH- 이온을 제공하는 임의의 적합한 화합물일 수 있다. 예를 들어, 용액 내 OH- 이온을 제공하는 화합물은 NaOH일 수 있다. 예를 들어, 필요한 경우 용액 내 OH- 이온을 제공하는 화합물을 사용하여 pH를 조정할 수 있다.
그러나, 이 화합물은 바람직하게는 소량으로만 존재해야 한다. 따라서, 용액은 용액 내 OH- 이온을 제공하는 화합물 (f)을 포함할 수 있으며, 여기서 이 화합물은 0.1 M, 0.05 M, 0.005 M, 0.0005 M 미만의 농도를 갖는다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 용액 내 OH- 이온을 제공하는 화합물(선택적인 성분)을 포함하지 않을 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 하기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (RA), 바람직하게는 화학식 (I)에 따른 환원제 (RA);
(b) 완충 물질 (BU), 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 보다 바람직하게는 pH 약 4 내지 11, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질;
(c) 음이온성 세제, 바람직하게는 SDS; 및
(e) 선택적으로 착화제 (CA).
보다 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 하기를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (RA), 바람직하게는 화학식 (I)에 따른 환원제 (RA);
(b) 완충 물질 (BU), 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 보다 바람직하게는 pH 약 4 내지 11, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질;
(c) 음이온성 세제로서, 상기 음이온성 세제는 SDS인 것; 및
(e) 선택적으로 착화제 (CA).
또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (RA), 바람직하게는 화학식 (I)에 따른 환원제 (RA);
(b) 완충 물질 (BU), 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 보다 바람직하게는 pH 약 4 내지 11, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질;
(e) 선택적으로 착화제 (CA);
(d) 선택적으로 카오트로픽 염 (CAO); 및 추가로
(c) 음이온성 세제, 바람직하게는 SDS
를 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며;
선택적으로 이 용액은 약 1 내지 13의 pH, 바람직하게는 약 2 내지 13의 pH, 보다 바람직하게는 약 4 내지 11의 pH, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH, 가장 바람직하게는 약 7.5 내지 8의 pH를 갖는 것이 고려된다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (RA), 바람직하게는 화학식 (I)에 따른 환원제 (RA);
(b) 완충 물질 (BU), 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 보다 바람직하게는 pH 약 4 내지 11, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질;
(e) 선택적으로 착화제 (CA);
(d) 선택적으로 카오트로픽 염 (CAO); 및
(c) 음이온성 세제, 바람직하게는 SDS
를 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며;
선택적으로 이 용액은 약 1 내지 13의 pH, 바람직하게는 약 2 내지 13의 pH, 보다 바람직하게는 약 4 내지 11의 pH, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH, 가장 바람직하게는 약 7.5 내지 8의 pH를 갖는 것이 고려된다.
보다 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (RA), 바람직하게는 화학식 (I)에 따른 환원제 (RA);
(b) 완충 물질 (BU), 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 보다 바람직하게는 pH 약 4 내지 11, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질;
(e) 선택적으로 착화제 (CA);
(d) 선택적으로 카오트로픽 염 (CAO); 및
(c) 음이온성 세제로서, 상기 음이온성 세제는 SDS인 것
를 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며;
선택적으로 이 용액은 약 1 내지 13의 pH, 바람직하게는 약 2 내지 13의 pH, 보다 바람직하게는 약 4 내지 11의 pH, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH, 가장 바람직하게는 약 7.5 내지 8의 pH를 갖는다.
또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 DNA 안정화제 (g)를 추가로 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 따라서, 샘플은 DNA 안정화제 (g)와 접촉될 수 있다. DNA 안정화제는 임의의 적합한 DNA 안정화제일 수 있다. DNA 안정화제는 암모늄 염(들), 예를 들어 염화암모늄, 황산암모늄 염(들), 또는 염화칼슘(CaCl2)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 염화암모늄이 DNA 안정화제로 사용된다.
DNA 안정화제는 적어도 1 M, 적어도 2 M, 적어도 5 M, 적어도 7.5 M, 적어도 10 M, 또는 적어도 15 M 또는 그 이상의 농도로 용액에 존재할 수 있다. 또한, DNA 안정화제는 적어도 20 M, 적어도 25 M, 적어도 30 M, 적어도 40 M, 적어도 15 M 또는 그 이상의 농도로 존재할 수 있다. 용액은 또한 500 mM 미만, 450 mM 미만, 400 mM 미만, 350 mM 미만, 300 mM 미만, 250 mM 미만, 200 mM 미만, 150 mM 미만, 100 mM 미만, 75mM 미만, 또는 그 미만의 농도로 DNA 안정화제를 포함할 수 있다. DNA 안정화제는 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 5 mM 내지 약 400 mM, 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 20 mM 내지 약 120 mM, 약 25 mM 내지 약 75 mM의 농도를 갖는 것으로 또한 고려된다. 바람직하게는, DNA 안정화제는 용액 중 약 50 mM의 농도를 갖는다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (RA), 바람직하게는 화학식 (I)의 환원제;
(b) 완충 물질 (BU), 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 보다 바람직하게는 pH 약 4 내지 11, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질;
(e) 선택적으로 착화제 (CA);
(c) 음이온성 세제, 보다 바람직하게는 SDS; 및
(g) 선택적으로 DNA 안정화제.
또한, 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은 하기를 포함할 수 있다:
(a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 환원제 (RA), 바람직하게는 화학식 (I)의 환원제;
(b) 완충 물질 (BU), 바람직하게는 pH 약 1 내지 13, 보다 바람직하게는 pH 약 4 내지 11, 더욱 더 바람직하게는 pH 약 6 내지 9에서 용액을 완충시키기 위한 완충 물질;
(e) 착화제 (CA);
(d) 선택적으로 카오트로픽 염 (CAO);
(g) 선택적으로 DNA 안정화제; 및
(c) 음이온성 세제, 보다 바람직하게는 SDS.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용액은 핵산 서열을 단리하기에 적합한 임의의 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 용액은 약 1 내지 13의 pH, 바람직하게는 약 2 내지 13의 pH, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 11의 pH, 더욱 더 바람직하게는 약 5 내지 8의 pH, 가장 바람직하게는 약 7.5 내지 8의 pH를 가질 수 있다. 또한 용액은 약 5 내지 9의 pH, 바람직하게는 약 6 내지 8의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7(6.5 내지 7.5)의 pH를 가질 수 있는 것이 고려된다. 또한 용액은 약 7.5 내지 8.0의 pH를 가질 수 있는 것이 고려된다. 또한, 용액은 2 내지 13, 바람직하게는 4 내지 11의 pH를 가질 수 있는 것이 고려된다. 바람직한 구현예에서, 용액은 약 4 내지 7의 pH를 가질 수 있다. 또한, 용액은 5 내지 9, 바람직하게는 5 내지 8의 pH를 가질 수 있고, 보다 바람직하게는 pH는 약 7(6.5 내지 7.5)일 수 있는 것이 고려된다. 또한, 용액은 3 내지 6의 pH를 가질 수 있는 것이 고려된다. 또한, 용액은 8 내지 10의 pH를 가질 수 있는 것이 고려된다.
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액은 약 1 내지 500 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 2 내지 13의 pH를 갖는다.
보다 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액은 약 1 내지 500 mM, 더욱 더 바람직하게는 약 5 내지 100 mM의 환원제를 포함하고/하거나 약 4 내지 11의 pH를 갖는다.
보다 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액은 약 5 내지 100 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 2 내지 13, 더욱 더 바람직하게는 약 4 내지 11의 pH를 갖는다.
더욱 더 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액은 약 5 내지 100 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 5 내지 8의 pH를 갖는다.
더욱 더 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액은 약 10 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 2 내지 13의 pH, 더욱 더 바람직하게는 약 4 내지 11의 pH를 갖는다.
더욱 더 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액은 약 10 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 5 내지 8의 pH를 갖는다.
따라서 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM, 바람직하게는 약 50 mM의 완충 물질, 바람직하게는 TRIS;
(b) 1 내지 500 mM, 바람직하게는 5 내지 100 mM, 보다 바람직하게는 20 내지 40 mM, 가장 바람직하게는 약 50 mM의 본 명세서에 개시된 바와 같은 환원제, 바람직하게는 TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM, 바람직하게는 약 0.1 mM의 착화제, 바람직하게는 EDTA;
(c) 1 내지 100 mM, 바람직하게는 20 내지 100 mM, 더욱 바람직하게는 약 70 mM의 음이온성 세제, 바람직하게는 SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM, 바람직하게는 약 50 mM의 본 명세서에 개시된 바와 같은 DNA 안정화제, 바람직하게는 염화암모늄을 포함할 수 있고,
선택적으로, 이 용액은 약 1 내지 13의 pH, 바람직하게는 약 2 내지 13의 pH, 보다 바람직하게는 약 4 내지 11, 가장 바람직하게는 약 5 내지 8의 pH를 가진다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM, 바람직하게는 약 50 mM의 완충 물질로서, 상기 완충 물질은 TRIS인 것;
(b) 1 내지 500 mM, 바람직하게는 5 내지 100 mM, 보다 바람직하게는 20 내지 40 mM, 가장 바람직하게는 약 50 mM의 환원제로서, 상기 환원제는 TCEP인 것;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM, 바람직하게는 약 0.1 mM의 착화제로서, 상기 착화제는 EDTA인 것;
(c) 1 내지 100 mM, 바람직하게는 20 내지 100 mM, 더욱 바람직하게는 약 70 mM의 음이온성 세제로서, 상기 세제는 SDS인 것; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM, 바람직하게는 약 50 mM의 DNA 안정화제로서, 상기 DNA 안정화게는 염화암모늄인 것을 포함하고,
선택적으로, 이 용액은 약 1 내지 13의 pH, 바람직하게는 약 2 내지 13의 pH, 보다 바람직하게는 약 4 내지 11, 가장 바람직하게는 약 5 내지 8의 pH를 가진다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM TRIS;
(b) 1 내지 500 mM TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM EDTA;
(c) 1 내지 100 mM SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM 염화암모늄을 포함하고,
선택적으로, 이 용액은 약 1 내지 13의 pH, 바람직하게는 약 2 내지 13의 pH, 보다 바람직하게는 약 4 내지 11, 가장 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH를 가진다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM TRIS;
(b) 1 내지 500 mM TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM EDTA;
(c) 1 내지 100 mM SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM 염화암모늄을 포함하고,
여기서, 이 용액은 약 1 내지 13의 pH를 가진다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM TRIS;
(b) 1 내지 500 mM TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM EDTA;
(c) 1 내지 100 mM SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM 염화암모늄을 포함하고,
여기서, 이 용액은 약 2 내지 13의 pH를 가진다.
더욱 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM TRIS;
(b) 1 내지 500 mM TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM EDTA;
(c) 1 내지 100 mM SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM 염화암모늄을 포함하고,
여기서, 이 용액은 약 4 내지 11의 pH를 가진다.
더욱 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM TRIS;
(b) 1 내지 500 mM TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM EDTA;
(c) 1 내지 100 mM SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM 염화암모늄을 포함하고,
여기서, 이 용액은 약 6 내지 9의 pH를 가진다.
더욱 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM TRIS;
(b) 1 내지 500 mM TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM EDTA;
(c) 1 내지 100 mM SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM 염화암모늄을 포함하고,
여기서, 이 용액은 약 5 내지 8의 pH를 가진다.
더욱 바람직하게는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 용액은
(a) 10 내지 80 mM TRIS;
(b) 1 내지 500 mM TCEP;
(e) 선택적으로 0.001 내지 1 mM EDTA;
(c) 1 내지 100 mM SDS; 및
(g) 선택적으로 10 내지 75 mM 염화암모늄을 포함하고,
여기서, 이 용액은 약 7.5 내지 8의 pH를 가진다.
상기 기재된 바와 같이, 샘플로부터 핵산의 단리는 적어도 약 60℃의 온도, 바람직하게는 약 60℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도, 보다 바람직하게는 약 80℃의 온도에서, 바람직하게는 적어도 10초 동안인 것이 고려된다.
특히, 온도는 상온 및 상압(NTP)에서 측정된다. NTP에서는 20℃(293.15K, 68°F)의 온도와 1 atm(14.696 psi, 101.325 kPa)의 절대 압력이 존재한다. 압력은 기압계로 측정될 수 있다. 온도는 온도계로 측정될 수 있다.
단계 (ii)에서의 인큐베이션 또는 샘플로부터 핵산의 단리는 적어도 약 60℃의 온도, 적어도 약 70℃의 온도, 적어도 약 75℃의 온도 또는 적어도 약 80℃의 온도에서일 수 있는 것이 또한 고려된다. 단계 (ii)에서의 인큐베이션 또는 샘플로부터 핵산의 단리는 적어도 약 60℃ 내지 약 90℃, 또는 약 75℃ 내지 약 85℃의 온도에서일 수 있는 것이 또한 고려된다.
단계 (ii)에서의 인큐베이션 또는 샘플로부터 핵산의 단리는 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 12분, 15분, 17분, 20분, 25분, 30분, 40분, 50분 또는 1시간 이상 동안일 수 있다. 또한, 단계 (ii)에서의 인큐베이션 또는 샘플로부터 핵산의 단리는 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 분, 8분, 9분, 10분, 12분, 15분, 17분, 20분, 25분, 30분, 40분, 50분 또는 1시간 이상 동안일 수 있는 것이 고려된다.
단계 (ii)에서의 인큐베이션 또는 샘플로부터 핵산의 단리는 최대 1시간, 50분, 40분, 30분, 25분, 20분, 17분, 15분, 12분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분 또는 1분 동안일 수 있다. 또한, 단계 (ii)에서의 인큐베이션 또는 샘플로부터 핵산의 단리는 최대 1시간, 50분, 40분, 30분, 25분, 20분, 17분, 15분, 12분, 12분, 10분, 9분, 8분, 7분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분 또는 1분 동안일 수 있는 것이 고려된다.
단계 (ii)에서의 인큐베이션 또는 샘플로부터 핵산의 단리는 적어도 10초, 적어도 30초, 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분, 적어도 5분, 적어도 7분, 적어도 10분, 적어도 30분 및/또는 최대 1시간 동안일 수 있거나 또는 여기서 샘플로부터 핵산의 단리는 적어도 40℃의 온도에서 적어도 10초, 적어도 30초, 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분, 적어도 5분, 적어도 7분, 적어도 10분, 적어도 30분 동안 수행된다.
따라서 또한 샘플을 포함하는 용액을 적어도 약 60℃의 온도에서 적어도 10초 동안 인큐베이션하거나 샘플로부터 핵산을 단리하는 것이 적어도 약 60℃의 온도에서 적어도 10초 동안인 것이 고려된다. 추가로 샘플을 포함하는 용액은 적어도 약 60℃의 온도를, 바람직하게는 적어도 10초 동안 갖는 것이 고려된다.
또한 샘플을 포함하는 용액을 적어도 약 60℃의 온도에서 적어도 10분, 적어도 15분 또는 적어도 30분 동안 인큐베이션하거나 샘플로부터 핵산을 단리하는 것이 적어도 약 60℃의 온도에서 적어도 10분, 적어도 15분 또는 적어도 30분 및 선택적으로 최대 1시간 동안인 것이 고려된다.
또한 샘플을 포함하는 용액이 적어도 약 60℃의 온도에서 10 내지 60분, 15 내지 60분, 15 내지 40분 동안 또는 적어도 약 60℃에서 적어도 10 내지 60분, 적어도 15 내지 60분, 15 내지 40분 또는 15 내지 30분 동안 인큐베이션되는 것이 고려된다.
또한 샘플을 포함하는 용액이 적어도 약 60℃의 온도에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 5분, 10분, 15분 또는 그 이상 동안 또는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 40분, 보다 바람직하게는 1분 내지 30분, 가장 바람직하게는 1분 내지 20분 동안 인큐베이션되거나 샘플로부터 핵산을 단리하는 것이 적어도 약 60℃의 온도에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 5분, 10분, 15분 또는 그 이상 동안 또는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 40분, 보다 바람직하게는 1분 내지 30분, 가장 바람직하게는 1분 내지 10분 동안 수행되고, 여기서 용액은 선택적으로 약 1 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 500 mM 환원제, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 환원제, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 선택적으로 약 2 내지 13, 바람직하게는 약 4 내지 11 또는 약 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH를 갖는 것이 고려된다.
추가로 샘플을 포함하는 용액이 적어도 약 60℃에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 5분, 10분, 15분 또는 그 이상 동안, 바람직하게는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 40분, 보다 바람직하게는 1분 내지 30분, 가장 바람직하게는 1분 내지 10분 동안을 갖고, 여기서 용액은 선택적으로 약 1 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 500 mM 환원제, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 환원제, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 선택적으로 약 2 내지 13, 바람직하게는 약 4 내지 11 또는 약 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH를 갖는 것이 고려된다.
또한 샘플을 포함하는 용액이 적어도 약 70℃의 온도에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 5분, 10분, 15분 또는 그 이상 동안 또는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 40분, 보다 바람직하게는 1분 내지 30분, 가장 바람직하게는 1분 내지 10분 동안 인큐베이션되거나 샘플로부터 핵산을 단리하는 것이 적어도 약 70℃의 온도에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 5분, 10분, 15분 또는 그 이상 동안 또는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 40분, 보다 바람직하게는 1분 내지 30분, 가장 바람직하게는 1분 내지 10분 동안 수행되고, 여기서 용액은 선택적으로 약 1 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 500 mM 환원제, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 환원제, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 선택적으로 약 2 내지 13, 바람직하게는 약 4 내지 11 또는 약 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH를 갖는 것이 고려된다.
추가로 샘플을 포함하는 용액이 적어도 약 70℃에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 5분, 10분, 15분 또는 그 이상 동안, 바람직하게는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 40분, 보다 바람직하게는 1분 내지 30분, 가장 바람직하게는 1분 내지 10분 동안을 갖고, 여기서 용액은 선택적으로 약 1 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 500 mM 환원제, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 환원제, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 선택적으로 약 2 내지 13, 바람직하게는 약 4 내지 11 또는 약 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH를 갖는 것이 고려된다.
또한 샘플을 포함하는 용액이 적어도 약 75℃, 80℃ 또는 85℃의 온도에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 또는 그 이상 동안 또는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 10분, 보다 바람직하게는 1분 내지 10분, 가장 바람직하게는 3분 내지 5분 동안 인큐베이션되거나 샘플로부터 핵산을 단리하는 것이 적어도 약 75℃, 80℃ 또는 85℃의 온도에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 또는 그 이상 동안 또는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 10분, 보다 바람직하게는 1분 내지 10분, 가장 바람직하게는 3분 내지 5분 동안 수행되고, 여기서 용액은 선택적으로 약 1 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 500 mM 환원제, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 환원제, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 선택적으로 약 2 내지 13, 바람직하게는 약 4 내지 11 또는 약 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH를 갖는 것이 고려된다.
추가로 샘플을 포함하는 용액이 적어도 약 75℃, 80℃ 또는 85℃의 온도에서 적어도 10초 동안, 적어도 30초 동안, 또는 적어도 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 또는 그 이상 동안 또는 적어도 10초 내지 1시간, 바람직하게는 10초 내지 10분, 보다 바람직하게는 1분 내지 10분, 가장 바람직하게는 3분 내지 5분 동안을 갖고, 여기서 용액은 선택적으로 약 1 mM 내지 500 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 500 mM 환원제, 더욱 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 환원제, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 선택적으로 약 2 내지 13, 바람직하게는 약 4 내지 11 또는 약 4 내지 10, 더욱 바람직하게는 약 6 내지 9의 pH를 갖는 것이 고려된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 샘플을 포함하는 용액은 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 1분 내지 30분 동안 인큐베이션되거나 샘플로부터 핵산의 단리는 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 1분 내지 10분 동안 수행된다. 추가로 샘플을 포함하는 용액이 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 1분 내지 10분 동안 인큐베이션하는 것이 고려된다.
또한 샘플을 포함하는 용액은 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 1분 내지 30분 동안 인큐베이션되거나 샘플로부터 핵산의 단리는 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 1분 내지 10분 동안 수행되고, 여기서 용액은 선택적으로 5 mM 내지 100 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 4 내지 11의 pH를 갖는 것이 고려된다. 추가로 샘플을 포함하는 용액은 약 60℃ 내지 약 95℃의 온도에서 1분 내지 10분 동안 인큐베이션되고, 여기서 용액은 선택적으로 5 mM 내지 100 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 4 내지 11, 또는 약 4 내지 10, 보다 바람직하게는 악 6 내지 9의 pH를 갖는 것이 고려된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 샘플을 포함하는 용액은 약 75℃ 내지 약 85℃, 바람직하게는 약 80℃ 내지 약 85℃의 온도에서 약 3 내지 5분 동안 인큐베이션되거나 샘플로부터 핵산의 단리는 약 75℃ 내지 약 85℃의 온도에서 약 3 내지 5분 동안 수행된다. 추가로 샘플을 포함하는 용액이 약 75℃ 내지 약 85℃, 바람직하게는 약 80℃ 내지 약 85℃의 온도에서 약 3 내지 5분 동안 인큐베이션하는 것이 고려된다.
또한 샘플을 포함하는 용액은 약 75℃ 내지 약 85℃의 온도에서, 바람직하게는 약 80℃ 내지 약 85℃의 온도에서 약 3 내지 5분 동안 인큐베이션되거나 샘플로부터 핵산의 단리는 약 75℃ 내지 약 85℃의 온도에서, 바람직하게는 약 80℃ 내지 약 85℃의 온도에서 약 3 내지 5분 동안 수행되고, 여기서 용액은 선택적으로 5 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 10 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 4 내지 11, 바람직하게는 약 5 내지 8의 pH를 갖는 것이 고려된다. 추가로 샘플을 포함하는 용액은 약 75℃ 내지 약 85℃의 온도에서 약 3 내지 5분 동안 인큐베이션되고, 여기서 용액은 선택적으로 5 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 10 내지 40 mM 환원제를 포함하고/하거나 약 4 내지 11, 바람직하게는 약 4 내지 10, 보다 바람직하게는 약 6 내지 9, 또는 약 5 내지 8의 pH를 갖는 것이 고려된다.
숙련자는 특정 온도에서 용액을 인큐베이션하는 방법을 알고 있다. 또한 실험실에서는 Eppendorf 튜브 등과 같은 표준 용기가 사용된다는 것이 분명하다. 이러한 표준 튜브 및 그 안의 용액은 온도/열이 열 진탕기를 통해 가해질 때 즉시 원하는 온도, 예를 들어 100℃까지 가열될 것으로 예상된다.
열 진탕기는 적어도 800 rpm, 보다 바람직하게는 1400 rpm으로 진탕시키는 것이 바람직하다.
기본적으로 당업자는 온도, 온도가 적용되는/존재하는 시간 및/또는 환원제의 양이 실시예에 또한 기재된 바와 같이 상호관련된 인자일 수 있음을 이해한다. 이와 같이, 온도가 높을수록 온도가 적용될 수 있는 시간 및/또는 환원제의 농도가 줄어들 수 있다.
샘플의 인큐베이션 또는 단리는 본 명세서에 개시된 바와 같은 상이한 온도에서 일어난다. 기본적으로 온도는 다양한 방법으로 달성될 수 있다.
한편, 용액 및 샘플은 예를 들어 60℃의 온도에서 또는 본 명세서에 지시된 임의의 다른 온도에서 준비한 다음 서로 접촉할 수 있다. 그 후, 샘플이 포함된 용액을 일정 시간 동안 동일한 온도로 예열된 열 진탕기에 도입한다.
한편, 용액과 샘플은 약 20℃의 실온에서 준비한 다음 서로 접촉할 수 있다. 그 후, 샘플을 포함하는 용액을 특정 기간 동안 예를 들어 60℃의 온도 또는 본 명세서에 지시된 임의의 다른 온도로 예열된 열 진탕기에 도입할 수 있다.
추가 옵션은 용액과 샘플을 약 90℃의 온도에서 준비한 다음 서로 접촉할 수 있다. 그 후, 샘플을 포함하는 용액을 관심 온도, 예컨대 60℃에 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 다른 온도에 도달할 때까지 실온에, 예를 들어 20℃에 놓아 둔다.
방법/용도는 추가로 또는 대안적으로 (i01) 샘플의 기계적 균질화 단계를 포함할 수 있음이 추가로 고려된다. 당업자는 샘플을 기계적으로 균질화하는 방법을 알고 있으며, 그 중 일부는 특히 문헌[Burden (2008) "Guide to the Homogenization of Biological Samples" Random Primers, Issue No. 7, Sept. 2008, page 1-14]에 기술되어 있다. 일반적으로 기계적 균질화는 샘플의 파괴를 의미한다. 예를 들어, 샘플은 그라인딩(grinding), 전단(shearing), 비팅(beating), 충격 또는 이들의 조합에 의해 기계적으로 균질화될 수 있다.
그라인딩은 샘플을 곡물 그라인더, 커피 그라인더, 볼텍서, 비드 비터 또는 유리 균질화기와 접촉시켜 수행할 수 있다. 그라인딩은 서로 미끄러지는 두 개의 단단한 표면 사이에 샘플을 끼워 마찰을 생성하는 것에 의존한다.
전단은 샘플을 혼합기 또는 회전자-고정자와 접촉시켜 수행할 수 있다. 전단시 접선력이 샘플에 가해지고 있다.
비팅은 발사체를 사용하여 샘플을 치는 것과 관련이 있다. 대부분의 비드 비팅 방법은 샘플과 비드를 튜브에 넣고 빠르게 앞뒤로 흔드는 방식에 의존한다. 예를 들어, 샘플의 기계적 균질화는 이러한 건식 비드비팅 또는 습식 비드비팅에 의해 달성될 수 있다.
충격(압력)에는 특히 샘플을 방해하는 데 사용되는 충격파, 예컨대 초음파를 포함한다.
샘플의 기계적 균질화 단계는 단계 (i)에서 샘플과 접촉하기 전에 일어나는 것으로 고려된다.
본 방법/용도는 추가로 또는 대안적으로 샘플을 효소와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 효소 분해 단계는 예를 들어, 단계 (i) 이전, 즉 본 명세서의 샘플과 접촉하기 전 또는 단계 (i) 이후에 일어날 수 있다.
따라서, 방법/용도는 단계 (i)에서 샘플을 접촉시키기 전에 샘플을 효소와 접촉시키는 단계 (i02)를 추가로 포함할 수 있다. 그러나, 방법은 단계 (i)에서 수득한 (용해) 샘플을 효소와 접촉시키는 단계 (i1)를 추가로 포함하는 것이 또한 고려된다.
단계 (i02) 및 (i1)은 일반적으로 약 60℃의 온도에서 인큐베이션을 필요로 한다. 따라서, 단계 (a02) 및 (a1)은 약 60℃에서 수행될 수 있다. 효소는 온도를 약 80℃ 또는 심지어 90℃까지 올리면 비활성화될 수 있다. 단계 (i) 이전에 단계 (i02)가 수행되는 경우 샘플과 접촉된 용액을 가열(40℃ 이상에서 인큐베이션)하면 효소가 비활성화된다. 단계 (i)이 단계 (i) 후에 수행되는 경우, 방법은 추가 인큐베이션 단계(최대 80℃ 또는 90℃)를 포함할 수 있다.
본 방법/용도는 추가로 또는 대안적으로 샘플을 포함하는 용액을 클리어링 용액 (h)와 접촉시키는 단계 (ii1)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 용액, 특히 본 발명의 용액은 클리어링 용액 (h)를 추가로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
클리어링 용액은 음이온성 세제가 침전될 수 있는 효과를 가진다. 따라서, 클리어링 용액은 일반적으로 샘플이 예컨대 (용해) 용액 내에서 음이온성 세제와 접촉된 방법에 추가된다.
따라서, 적합한 세제가 음이온성 세제인 경우, 클리어링 용액은 상기 세제의 침전을 위한 양이온성 이온을 포함할 수 있다. 적합한 양이온성 이온은 K+, Rb+, Cs+, Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온은 K+, Rb+ 또는 Cs+일 수 있다. 바람직하게는, 양이온은 Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++일 수 있다. 보다 바람직하게는, 양이온은 Ca++, Sr++ 또는 Ba++일 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 양이온성 이온은 Ca++ 또는 Sr++일 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 양이온은 Sr++이다. 또한 양이온성 이온은 Al, Zn, Sn 또는 Fe인 것으로 생각된다. 바람직하게는, 이들 구현예 중 어느 하나에서, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 암모늄 도데실 설페이트, 모노에탄올아민 도데실 설페이트, 디에탄올아민 도데실 설페이트, 또는 트리에탄올아민 도데실 설페이트이다. 보다 바람직하게는, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 암모늄 도데실 설페이트, 모노에탄올아민 도데실 설페이트, 또는 트리에탄올아민 도데실 설페이트이다. 더욱 더 바람직하게는, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 또는 암모늄 도데실 설페이트이다. 더욱 더 바람직하게는, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 또는 리튬 도데실 설페이트(LiDS)이다. 훨씬 더 바람직하게는, 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)이다.
따라서, 클리어링 용액은 KCl, KBr, KI, RbCl, RbBr, RbI, CsCl, CsBr, CsI, MgCl2, MgBr2, MgI2, CaCl2, CaBr2, CaI2, SrCl2, SrBr2, SrI2, BaCl2, BaBr2, 또는 BaI2를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 클리어링 용액은 KCl, KBr, KI, RbCl, RbBr, RbI, CsCl, CsBr 또는 CsI를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 클리어링 용액은 KCl, KBr, KI, RbCl, RbBr, 또는 RbI를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 클리어링 용액은 MgCl2, MgBr2, MgI2, CaCl2, CaBr2, CaI2, SrCl2, SrBr2, SrI2, BaCl2, BaBr2, 또는 BaI2를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 클리어링 용액은 CaCl2, CaBr2, CaI2, SrCl2, SrBr2, SrI2, BaCl2, BaBr2 또는 BaI2를 포함할 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 클리어링 용액은 CaCl2 또는 SrCl2를 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 클리어링 용액은 SrCl2를 포함할 수 있다.
예를 들어, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 K+, Rb+, Cs+, Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++를 포함하는 염을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 K+, Rb+ 또는 Cs+를 포함하는 염을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++를 포함하는 염을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 이하의 Ca++, Sr++ 또는 Ba++를 포함하는 염을 포함할 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 Ca++ 또는 Sr++를 포함하는 염을 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 Sr++를 포함하는 염을 포함할 수 있다.
클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 KCl, KBr, KI, RbCl, RbBr, RbI, CsCl, CsBr, CsI, MgCl2, MgBr2, MgI2, CaCl2, CaBr2, CaI2, SrCl2, SrBr2, SrI2, BaCl2, BaBr2, 또는 BaI2를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 KCl, KBr, KI, RbCl, RbBr, RbI, CsCl, CsBr 또는 CsI를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 KCl, KBr, KI, RbCl, RbBr, 또는 RbI를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 MgCl2, MgBr2, MgI2, CaCl2, CaBr2, CaI2, SrCl2, SrBr2, SrI2, BaCl2, BaBr2, 또는 BaI2를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 CaCl2, CaBr2, CaI2, SrCl2, SrBr2, SrI2, BaCl2, BaBr2, 또는 BaI2를 포함할 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 CaCl2 또는 SrCl2를 포함할 수 있다. 훨씬 더 바람직하게는, 클리어링 용액은 6M, 5M, 4M, 3M, 2M, 1M, 0.5M, 0.25M 또는 그 이하의 SrCl2를 포함할 수 있다. 따라서, 클리어링 용액은 1 또는 2M SrCl2를 포함할 수 있다. 클리어링 용액은 pH 8의 증류수 중 또는 20 mM Tris HCl 중의 1 또는 2M SrCl2를 포함할 수 있다.
본 방법/용도는 추가로 또는 대안적으로 단계 (iii), 즉 핵산으로부터 비핵산 화합물을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 당업자는 비핵산 화합물이 무엇인지 알고 있다.
예를 들어, 비핵산 성분은 단계 (i), (i1), (ii) 또는 (ii1)에서 얻은 용액의 모든 비핵산 화합물이다. 비핵산 성분은 예를 들어 단백질, 염, 카오트로픽 염, 세제, 유기 또는 무기 용매, 염료, 대사산물, 샘플 파편, 저분자 분자, 바람직하게는 뉴클레오티드 및/또는 PCR 억제제일 수 있다. 따라서 비핵산 성분에는 단백질, 염, 카오트로픽 염, 세제, 유기 또는 무기 용매, 염료, 대사산물 및 뉴클레오티드가 포함된다.
예를 들어, 분리는 핵산 침전을 포함할 수 있다. 이러한 침전은 핵산에 대한 결합을 포함할 수 있다.
예를 들어, 적합한 조건하에서 핵산에 결합할 수 있는 고체상 성분(고체상이라고도 함)을 사용하여 핵산을 침전시킬 수 있다. 예시적인 고체상 성분은 실리카 입자, 이산화규소, 규조토, 유리, 알루미늄 실리케이트, 보로실리케이트, 니트로셀룰로스, 디아조화 종이, 나일론, 금속 산화물, 지르코니아, 알루미나, 소수성 크로마토그래피 수지를 포함한다.
따라서, 단계 (iii) 핵산으로부터 비핵산 화합물을 분리하는 단계는 핵산에 결합할 수 있는 고체상 성분의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산에 결합할 수 있는 고체상 성분의 사용 없이 단리된다.
또한, 특정 중합체는 핵산을 침전시킬 수 있다. 따라서, 핵산으로부터 비핵산 화합물을 분리하는 단계 (iii)은 핵산에 결합할 수 있는 중합체의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 중합체의 예는 폴리에틸렌이민, DEAE 덱스트란, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리히스티딘이다. 그러나, 일부 구현예에서 핵산은 본 명세서에 기재된 중합체의 사용 없이 단리된다.
또한 특정 알코올은 핵산을 침전시킬 수 있다. 예시적인 알코올은 에탄올, 프로판올 또는 부탄올을 포함한다. 따라서, 핵산으로부터 비핵산 화합물을 분리하는 단계 (iii)은 알코올의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법은 단계 (a)의 용해 샘플을 알코올과 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것이 또한 고려된다.
핵산으로부터 비핵산 화합물을 분리하는 단계 (iii)은 수용액으로부터 핵산의 분리를 포함할 수 있음이 추가로 고려된다. 이러한 핵산의 단리는 단계 (i), (i1), (ii) 또는 (ii1)의 샘플을 포함하는 용액을 유기 용매와 접촉시키는 것에 의한 것을 포함할 수 있다. 유기 용매의 예는 페놀, 페놀과 클로로포름의 조합 등을 포함할 수 있다.
분리는 단계 (i), (i1), (ii) 또는 (ii1)의 샘플을 포함하는 제품/시료/용액을 핵산을 통과시키지만 비핵산 성분은 유지할 수 있는 매트릭스로 옮기는 것을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 매트릭스는 예를 들어 임의의 겔 여과 매트릭스(겔 여과 크로마토그래피 매트릭스)일 수 있다. 예를 들어, 매트릭스는 세파크릴 수지 또는 히드록실화된 메타크릴 중합체를 포함하는 매트릭스일 수 있다. 세파크릴 수지의 예는 Sephacryl S100, Sephacryl S200, Sephacryl S300, Sephacryl S400 or Sephacryl S500, 바람직하게는 Sephacryl S400 이다. 따라서 매트릭스는 세파크릴 수지인 것으로 고려된다. 히드록실화된 메타크릴 중합체를 포함하는 예시적인 매트릭스는 메타크릴레이트(에틸렌 글리콜/메타크릴레이트 공중합체(들))를 포함하는 매트릭스이다. 예를 들어, 이러한 매트릭스는 HW-40, HW-50, HW-55, HW-65 또는 HW-70 매트릭스일 수 있다. 또한 매트릭스가 HW65S인 것으로 고려된다. 이러한 HW-매트릭스는 특히 Tosoh Haas에서 입수할 수 있다. 또한, 매트릭스는 실리카 막 또는 이온 교환 수지인 것으로 고려된다. 그러나, 일부 구현예에서 핵산은 매트릭스를 사용하지 않고 단리된다.
본 발명은 또한 본 발명의 용액 (a) 및 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 클리어링 용액을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 (b) 효소 분해 수단; 및/또는 (c) 핵산으로부터 비핵산 성분을 단리하기 위한 매트릭스, 바람직하게는 핵산으로부터 비핵산 성분을 단리하기 위한 수지와 같은 수단을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 용액은 용해 용액일 수 있다.
또한, 환원제가 하기 화학식 (II)에 따른 화합물 및 그의 염, 착물, 라세미 혼합물, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체, 호변이성질체, 또는 동위원소 농축(isotopically enriched) 형태인 것이 상기 본 명세서에 기재된 방법, 용도, 키트 및 용액에 대해 고려된다:
상기 식에서, B는 
또는 
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 R1 은 -H, -C(=O)(C1-C15)알킬, 및 -C(=O)(CH2)n1C(H)(N(R3)R4)COOR5로 이루어진 군으로부터 선택되고,
n1 은 1 내지 15이고,
R2 는 -H, -C(=O)NH(CH2)n2COOR6, -(C1-C15)알킬, -OR7, -COOR8, 및 -N(R9)R10 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
n2 는 1 내지 15이고,
R3 내지 R10 은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화학식 (II)에 따른 이러한 환원제 (b)는 본 발명의 모든 구현예에서 사용될 수 있음은 물론이다. 따라서, 일부 구현예에서, 화학식 (II)에 따른 환원제 (b)는 화학식 (I)의 환원제에 추가로 사용될 수 있다. 대안적으로, 화학식 (II)에 따른 환원제 (b)는 화학식 (I)의 환원제 대신에 사용될 수 있다(즉, 화학식 (II)에 따른 환원제 (b)는 식 (I)의 환원제를 대체할 수 있다).
따라서, 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은 또한 샘플을 용해 용액과 접촉시켜 특히 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 (II)의 환원제를 포함하는 용해 샘플을 수득하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 화학식 (II)의 임의의 적합한 환원제가 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해 용액에 사용될 수 있다. 숙련자는 화학식 (II)를 갖는 적합한 환원제를 알고 있다.
화학식 (II)에서, 하기인 것이 바람직하다.
i) R2 는 H, -C(=O)NH(CH2)n2COOR6, -(C1-C15)알킬, -OR7, 및 -COOR8, 바람직하게는 H, 및 -C(=O)NH(CH2)n2COOR6 로 이루어진 군으로부터 선택됨, 및/또는
ii) R3 내지 R10 은 독립적으로 -H 로 이루어진 군으로부터 선택됨, 및/또는
iii) n1 은 1 내지 5, 바람직하게는 2 임, 및/또는
iv) n2 는 1 내지 5, 바람직하게는 1 임.
화학식 (II)에 따른 환원제가 시스테인, 글루타티온, 암모늄 티오글리콜레이트 및 N-아세틸시스테아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하다.
따라서, 또 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법/용도는 샘플을 특히 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 (II)의 환원제를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다.
환원제가 일 구현예에서 용액 내 SO3 2- 이온 또는 S2O4 2- 를 제공하는 화합물인 상기 본 명세서에 기재된 방법, 용도 및 용액에 대해 또한 고려된다. 이러한 환원제는 본 발명의 모든 구현예에서 사용될 수 있음은 물론이다. 따라서, 일부 구현예에서, 용액 내 SO3 2- 이온 또는 S2O4 2- 를 제공하는 화합물이 화학식 (I)의 환원제에 추가하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 용액 내 SO3 2- 이온 또는 S2O4 2- 를 제공하는 화합물이 화학식 (I)의 환원제 대신에 사용될 수 있다(즉, 용액 내 SO3 2- 이온 또는 S2O4 2- 를 제공하는 화합물은 화학식 (I)의 환원제를 대체할 수 있다). SO3 2- 는 아황산 음이온이다.
S2O4 2-는 아디티온산 음이온이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법은 또한 특히 용액 내 SO3 2- 이온 또는 S2O4 2- 를 제공하는 화합물을 환원제로서 포함하는 용해 샘플을 수득하기 위해 샘플을 용해 용액과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로, 용액 내 SO3 2- 이온 또는 S2O4 2- 를 제공하는 임의의 적합한 환원제가 본 명세서에 기재된 바와 같이 용해 용액에 사용될 수 있다. 당업자는 용액 내 SO3 2- 이온 또는 S2O4 2- 를 제공하는 적절한 환원제를 알고 있다.
용액 내 SO3 2- 이온을 제공하는 제제는 또한 아황산수소를 포함하는 것이 바람직하다. 아황산수소는 바람직하게는 Na2SO3, KHSO3, NaHSO3, K2SO3, ZnSO3, CuSO3, CdSO3, SrSO3, MgSO3, CaSO3, BaSO3; PbSO3; 보다 바람직하게는 Na2SO3, NaHSO3 K2SO3, ZnSO3, MgSO3, CaSO3 로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나, 용액 내 S2O4 2- 이온을 제공하는 제제는 Na2S2O4, K2S2O4, ZnS2O4, CuS2O4, CdS2O4, CaS2O4, SrS2O4, BaS2O4, PbS2O4, MgS2O4; 보다 바람직하게는 Na2S2O4, K2S2O4, ZnS2O4, CaS2O4, MgS2O4 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
환원제가 아황산수소나트륨, 차아황산나트륨 또는 아황산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하다.
본 명세서에 사용된 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 점에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 그러한 상이한 시약 중 하나 이상을 포함하고 "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재된 방법을 수정하거나 대체할 수 있는 당업자에게 알려진 균등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 전부 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
용어 "미만" 또는 결국에는 "적어도"는 구체적인 숫자를 포함하지 않는다.
예를 들어, 20 미만은 지시된 수 미만을 의미한다. 유사하게, 적어도 또는 보다 큼은 지시된 수 이상 또는 그보다 큼을 의미한다. 예를 들어, 80% 이상은 지시된 수의 80% 이상 또는 그 보다 큼을 의미한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 이 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전체에 걸쳐 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹은 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는" 은 "함유하는" 또는 "포함하는"이라는 용어로 대체될 수 있거나, 또는 때때로 본 명세서에서 사용되는 경우 "갖는"이라는 용어로 대체될 수 있다. 본 명세서에서 "~로 이루어지는"은 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다.
용어 "포함하는" 은 "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다. "포함하는"과 "포함하지만 이에 제한되지 않는"은 같은 의미로 사용된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "약"은 주어진 값의 최대 5%, 최대 10%일 수 있는 각각의 값 또는 범위(예: pH, 농도, 백분율, 몰 농도, 아미노산 수, 시간 등)에 변동이 있을 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 제형이 약 5 mg/ml의 화합물을 포함하는 경우, 이는 제형이 4.5 내지 5.5 mg/ml를 가질 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 재료, 시약, 및 물질 등에 제한되지 않고 다양할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 범위가 특허청구범위에 의해서만 정의되는 것이 아니다.
상기 또는 하기의 본 명세서의 텍스트 전체에 걸쳐 인용된 모든 간행물(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 지침 등 포함)은 그 전체가 참고로 여기에 포함된다. 본 명세서의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 개시보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 경우 명세서는 그러한 자료를 대체할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 특허 문헌의 내용은 그 전체가 참고로 포함된다.
본 발명 및 이의 이점에 대한 더 나은 이해는 단지 예시적인 목적으로 제공된 다음 실시예로부터 얻어질 것이다. 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 표준 프로토콜과 비교하여 상이한 TCEP 농도를 사용한 용해
Fraunhofer Institute에서 입수한 CHO 세포를 두 가지 다른 용해 프로토콜을 사용하여 용해시켰다.
한편으로는, 106개의 CHO 세포를 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O), 50 mM 염화암모늄의 용해 용액(용해 용액 LS)을 사용하여 용해시켰다. 이 완충제의 pH는 NaOH를 첨가하여 pH 8로 설정되었다.
이 실험 설정에서 용해는 다음 단계를 포함하였다:
1. 1.5 ml 반응 튜브에서 2000 x g에서 원심분리하여 세포를 수확하고 상층액을 제거한다.
2. 용해 용액 LS 55 μl 및 프로테아제 25 μl를 추가하고 펄스-볼텍싱에 의해 세포 펠렛을 완전히 재현탁시킨다(pH = 10).
3. 반응 튜브를 열 진탕기에 넣고, 최대 10분 동안 60℃에서 인큐베이션한다.
4. 10 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 추가로 20.165 ml/L의 15% HCl 첨가) 및 RNase 1 μl를 각 용해된 샘플에 첨가하고 각각 10초의 4개의 펄스로 격렬하게 볼텍싱시킨다. 샘플이 흐려진다.
5. 실온에서 2분 동안 인큐베이션하여 RNA를 제거한다.
6. 최대 속도로 2분 동안 원심분리한다.
7. DNA가 포함된 용해 상층액(최대 100 μl)을 스핀 컬럼으로 옮긴다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 이 수지는 염, 펩타이드, 고체의 잔류물, 예를 들어 색상, 침전되지 않은 SDS 또는 가용화된 SDS 잔류물을 여과시킨다.
8. 1000 x g에서 1분 동안 원심분리한다. 상층액은 1000 x g에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 정제된 게놈 DNA는 1.5 ml 용출 튜브로 용출되며 다운스트림 적용에 즉시 적용될 수 있다.
다른 한편으로는, 펠렛화된 106개의 CHO 세포를 재현탁시키고, 80 μl의 이하의 성분의 용해 용액을 이용하여 용해시켰다: 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM 또는 50 mM TCEP, 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O) 및 50 mM 염화암모늄. 염화암모늄은 DNA의 용해도를 증가시켜 DNA 수율도 증가시킨다. 이 완충제의 pH는 NaOH/HCl을 첨가하여 7로 설정되었다. 튜브를 열 진탕기에 도입하기 전에 80℃로 미리 데운 열 진탕기에서 1.5 ml 안전 잠금 Eppendorf 튜브에서 80℃에서 3분 동안 용해를 수행했다. 인큐베이션은 1400 rpm에서 수행되었다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
그 후, 용해된 세포를 15 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 추가로 15% HCl 20.165 ml/L의 첨가)과 접촉시켰다. 클리어링 용액의 첨가는 음이온성 세제가 침전되는 효과가 있다. 그 다음 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼 위로 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x g에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다.
DNA/RNA(핵산) 농도는 상이한 방법에 의해 평가될 수 있다. 다음에서 흡광도(광학 밀도) 및 아가로스 겔 전기영동 측정은 수득한 핵산의 수득된 품질에 대한 지표로 기술된다.
먼저, 수득한 핵산을 광도 측정으로 분석하였다. 여기서 원리는 핵산이 뉴클레오티드의 헤테로고리 고리로 인해 자외(UV)광을 흡수하는 반면, 당-인산 골격은 흡수에 기여하지 않는다는 것이다. DNA와 RNA 모두 최대 흡수 파장은 260 nm(λmax = 260 nm)이며 각 염기에 대한 특성 값을 갖는다. DNA의 흡수 특성은 검출, 정량 및 순도 평가에 사용할 수 있다. λmax는 일정하지만, 핵산의 흡광 계수는 환경에 따라 달라진다.
아래 표 1에서 두 가지 상이한 측정이 수행되었다, 즉 260 nm의 파장에서 흡광도의 단일 측정(A260; 7번째 열), 280 nm의 파장에서의 흡광도의 단일 측정(A260, 8번째 열)이 수행되었다. 또한, 260 nm 및 280 nm의 파장에서 검출된 흡광도의 비율(A260/A280의 비율)과 260 nm 및 230 nm의 파장에서 검출된 흡광도의 비율(A260/A230의 비율)이 제시되어 있다.
일반적으로 260 nm에서의 흡광도는 핵산의 농도를 계산하는데 사용되며, 50 μg/ml의 농도 및 1 cm 경로 길이*에서 dsDNA는 A260 nm = 1을 갖는다. 흡광도 값은 저변색성으로 인한 DNA의 2차 구조의 양에 따라 달라진다. 신뢰할 수 있는 분광광도계 DNA 정량화를 위해 A260 판독값은 0.1과 1.0 사이에 있어야 한다.
DNA의 순도는 A260/A280 비율로 검출할 수 있다. 이것은 이 비율이 단백질 오염의 지표를 제공하기 때문이다. 그러나 A260/A280 비율은 정확한 답이 아니라 순도를 나타내는 지표일 뿐이다. 순수한 DNA 제제는 1.8 이상의 A260/A280 비율을 갖는다. 순수한 RNA의 A260/A280 비율은 2.0이므로 DNA 샘플의 A260/A280 비율이 1.8보다 크면 RNA의 존재를 암시할 수 있다.
A260/A230 비율은 핵산 순도의 이차 척도이다. 순수한 샘플에 대한 A260/A230 비율 값은 종종 각각의 A260/A280 비율 값보다 높다. 230 nm 부근의 강한 흡광도는 정제된 핵산에 유기 화합물 또는 카오트로픽 염이 존재함을 나타낼 수 있다. 230 nm에 대한 260 nm의 비율은 정제된 핵산에서 염 캐리오버 수준을 평가하는 데 도움이 될 수 있다. 비율이 낮을수록 존재하는 염의 양이 많아진다. 가이드라인으로 A260/A230 비율은 1.5보다 커야 하며 이상적으로는 1.8에 근접해야 한다.
이들 측정의 결과를 하기 표에 나타낸다.
표 1: 상이한 샘플의 분광광도계 핵산 정량화에 대해 얻은 결과.
표 1에서 얻을 수 있는 바와 같이, A260 판독값(표 1의 7번째 열)의 분광광도계 핵산 정량은 모두 0.1과 1.0 사이에 있다. 따라서 이러한 측정은 신뢰할 수 있다. 이 측정은 표 1의 4번째 열에 제시된 바와 같은 수득된 핵산의 최종 농도를 결정하는 데 사용되었다.
또한, A260/A280의 비율로 나타낸 바와 같이, 모든 샘플은 1.8에 가까운 비율을 제공한다. 순수한 DNA 제제는 1.8 이상의 A260/A280 비율을 가지므로 샘플 1 내지 7 중 어느 것도 적절한 양의 추가 RNA를 포함하지 않는다고 가정한다.
상이한 용해에 의해 수득된 핵산의 순도를 결정하기 위해 A260/A230 비율을 결정하였다(표 1의 6번째 열). 상기 표 1에 나타난 바와 같이 A260/A230 비율은 모든 샘플에 대해 1.5보다 컸다. 이것은 핵산의 순도가 양호하고 비핵산 성분이 있더라도 소량으로만 존재한다는 것을 나타낸다.
보다 구체적으로, 표 1은 표준 프로토콜 및 TCEP에 의한 용해 모두가 충분한 양의 비분해 DNA를 초래함을 나타낸다. 10 mM 농도의 TCEP가 포함된 용해 완충제를 사용하여 가장 낮은 양의 핵산을 얻었다. 또한, 20 mM, 30 mM, 40 mM 및 50 mM의 TCEP 농도는 유사한 DNA 양을 제공했다. 50 mM 및 30 mM의 TCEP 농도(92.883 ng/μL 핵산 및 81.311 ng/μL 핵산)를 사용한 용해는 표준 프로토콜(66.587 ng/μL 핵산 및 74.483 ng/μL 핵산)을 사용할 때 얻은 핵산 양보다 더 많은 핵산 양을 생성했다.
광도 측정은 다양한 시험된 용해 프로토콜에 의해 핵산이 추가 분석을 허용하기에 충분한 양으로 고순도로 얻어질 수 있음을 증명한다.
또한, 얻어진 핵산을 겔 전기영동으로 분석하였다. 아가로스 겔의 핵산을 시각화하려면 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 또는 SYBR Green과 같은 끼어들기(intercalating) 염료로 염색해야 한다. 겔을 실행하는 한 가지 이유는 핵산 품질에 액세스하기 위한 것이다. 1 내지 1.5% 아가로스 겔에서 온전한 게놈 DNA는 저분자량 도말 없이 조밀한 고분자량 밴드로 나타나야 한다. 분해된 DNA는 편향된 라벨링을 초래한다.
이 실험에 사용된 상이한 샘플로 수행된 겔 전기영동이 도 1에 도시되어 있다. 여기에 기재된 실험에서, 0.8% 아가로스 겔과 염료 GelRed가 사용되었다. 도 1A의 겔은 샘플 1 및 2에서 얻은 핵산을 반영한다. 도 1B에 도시된 겔은 샘플 3, 4, 5, 6 및 7에서 얻은 핵산을 보여준다.
도 1로부터 명백한 바와 같이, 모든 샘플은 저분자량 도말이 없는 고분자량 밴드를 제공하는데, 이는 시험된 샘플에 분해된 핵산의 양이 적거나 전혀 존재하지 않음을 나타내는 것이다.
실시예 2: 상이한 pH의 TCEP를 사용한 용해
TCEP를 사용하여 용해에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 샘플로서의 200 μl 전혈을 적혈구 용해 완충제(10 mM 중탄산나트륨(NaHCO3), 155 mM 염화암모늄, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.3)으로 1회 세척하였다. 이 세척을 위해 1.3 ml의 적혈구 용해 완충제를 샘플에 첨가하였다. 인큐베이션은 약 20℃의 실온에서 3분 동안 수행하였다. 그 후, 샘플을 2000 g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하였다.
그 다음, 펠렛을 재현탁시키고, 80 μl의 이하의 성분의 용해 용액(용해 완충제)에 80℃에서 10분 동안 용해시켰다: 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O) 및 50 mM TCEP. 이 완충제의 pH는 8 내지 9(샘플 1 내지 3)의 pH를 가졌다. 다른 샘플은 pH가 3 내지 4인 용해 용액과 접촉되었다(샘플 4 내지 6). 타르타르산을 사용하여 pH를 조정하였다.
가열 단계는 튜브를 열 진탕기에 도입하기 전에 80℃로 예열된 열 진탕기의 1.5 ml 안전 잠금 Eppendorf 튜브에서 수행되었다. 인큐베이션은 10분 동안 1400 rpm에서 수행되었다. 중요하게도, 이러한 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
그 후, 각각의 용해 샘플을 15 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 20.165 ml/L 15% HCl 포함)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다.
수득된 핵산을 광도 측정 및 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과를 아래 표 2에 나타낸다.
표 2: 상이한 샘플의 분광광도계 핵산 정량화에 대해 얻은 결과.
표 2에서 얻을 수 있는 바와 같이, A260 판독값(표 1의 7번째 열)의 분광광도계 핵산 정량화는 모두 0.1과 1.0 사이에 있다. 따라서 이러한 측정은 신뢰할 수 있다. 이 측정은 표 2의 4번째 열에 제시된 바와 같은 수득된 핵산의 최종 농도를 결정하는 데 사용되었다.
또한, A260/A280의 비율로 나타낸 바와 같이, 모든 샘플은 1.8에 가까운 비율을 제공한다. 순수한 DNA 제제는 1.8 이상의 A260/A280 비율을 가지므로 샘플 1 내지 6 중 어느 것도 적절한 양의 추가 RNA를 포함하지 않는다고 가정한다.
상이한 용해에 의해 수득된 핵산의 순도를 결정하기 위해 A260/A230 비율을 결정하였다(표 2의 6번째 열). 상기 표 2에 나타난 바와 같이 A260/A230 비율은 모든 샘플에 대해 1.5보다 컸다. 이것은 핵산의 순도가 양호하고 비핵산 성분이 있더라도 소량으로만 존재한다는 것을 나타낸다.
보다 구체적으로, 표 2는 일반적으로 충분히 정제된 핵산이 TCEP를 사용한 알칼리성 및 산성 용해 모두에 의해 얻어질 수 있음을 보여준다. TCEP를 사용한 산성 용해는 A260/A230 비율에서 알 수 있듯이 핵산의 순도가 약간 더 높아졌다.
또한, 얻어진 핵산을 겔 전기영동으로 분석하였다. 겔 전기영동으로 얻은 겔은 도 2에 도시된 바와 같이 이 실험에 사용된 상이한 샘플(각 레인에서 샘플 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 얻은 핵산)로 수행되었다.
도 2에서 명백한 바와 같이, 모든 샘플은 시험된 샘플에 온전한(비분해) 핵산이 존재함을 나타내는 고분자량 밴드를 제공한다. 저분자량 도말은 알칼리성 조건보다 산성 조건에서 더 높은 것으로 보인다. 따라서, 분해된 핵산의 양은 알칼리성 조건보다 산성 조건에서 더 높을 수 있다.
실시예 3: 표준 프로토콜과 비교하여 중성 pH의 TCEP 농도를 사용한 용해
200 μl의 전혈을 샘플로 사용한다. 샘플을 적혈구 용해 완충제(10 mM 중탄산나트륨(NaHCO3), 155 mM 염화암모늄, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.3)로 1회 세척하였다. 이 세척을 위해 1.3 ml의 적혈구 용해 완충제를 샘플에 첨가하였다. 인큐베이션은 실온에서 3분 동안 수행하였다. 그 후, 샘플을 2000 x g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하였다. 펠렛은 추가 제조에 사용되었다.
이 첫 번째 실험 설정에서, 용해는 다음 단계를 포함하였다:
1. 1.5 ml 반응 튜브에서 2000 x g에서 원심분리하여 세포를 수확하고 상층액을 제거한다.
2. 상기 기술된 바와 같은 용해 용액 LS 55 μl 및 프로테아제 25 μl를 추가하고 펄스-볼텍싱에 의해 세포 펠렛을 완전히 재현탁시킨다.
3. 반응 튜브를 열 진탕기에 넣고 진탕하에 최대 10분 동안 60℃에서 인큐베이션한다.
4. 각 용해된 샘플에 10 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 20.165 ml/L 15% HCl 포함)을 첨가하고 각각 10초씩 4번의 펄스로 격렬하게 소용돌이시킨다. 샘플이 흐려진다.
5. 최대 속도로 2분 동안 원심분리시킨다.
6. DNA가 포함된 용해 상층액(최대 100μl)을 스핀 컬럼으로 옮긴다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다.
8. 1000 x G에서 1분 동안 원심분리한다. 정제된 게놈 DNA는 1.5 ml 용출 튜브로 용출되며 다운스트림 적용에 즉시 적용할 수 있다.
한편, 두 번째 실험 설정에서, 샘플로서의 200 μl 전혈을 적혈구 용해 완충제(10 mM 중탄산나트륨(NaHCO3), 155 mM 염화암모늄, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.3)로 1회 세척하였다. 이 세척을 위해 1.3 ml의 적혈구 용해 완충제를 샘플에 첨가하였다. 인큐베이션은 실온에서 3분 동안 수행하였다. 그 후, 샘플을 2000 x g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하였다.
그 다음, 펠렛을 재현탁시키고 80 μl의 이하의 성분의 용액(용해 용액)에서 80℃에서 10분 동안 용해시켰다: 50 mM Tris(C4H11NO3), 70 mM SDS(C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA(C10H14N2Na2O8*2H2O) 및 50 mM TCEP. 이 완충제의 pH는 7.5였다. 타르타르산을 사용하여 pH를 조정하였다.
튜브를 열 진탕기에 도입하기 전에 80℃로 예열된 열 진탕기에서 1.5 ml 안전 잠금 Eppendorf 튜브에서 80℃에서 3분 동안 용해를 수행하였다. 인큐베이션은 1400 rpm에서 수행되었다.
그 후, 용해된 세포를 15 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 20.165 ml/L 15% HCl 포함)과 접촉시켰다. 그런 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x g에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정 및 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 3에 제시된다.
표 3: 상이한 샘플의 분광광도계 핵산 정량화에 대해 얻은 결과.
표 3에서 얻을 수 있는 바와 같이, A260 판독값(표 1의 7번째 열)의 분광광도계 핵산 정량화는 모두 0.1과 1.0 사이에 있다. 따라서 이러한 측정은 신뢰할 수 있다. 이 측정은 표 3의 4번째 열에 제시된 바와 같은 수득된 핵산의 최종 농도를 결정하는 데 사용되었다. 중요한 것은, "TCEP 용해"에 의해 얻은 핵산의 양이 효소 분해 단계를 포함하는 표준 용해에 의해 얻을 수 있는 핵산의 양보다 훨씬 많다.
또한 A260/A280의 비율은 샘플이 TCEP로 용해되었을 때(1.68; 1.731 또는 1.669 (평균 1.693))가 효소 분해 처리된 샘플(1.663, 1.449, 1.568 (평균 1.56))보다 더 높다. 따라서, TCEP 용해를 사용하여 얻은 핵산은 효소 분해를 포함하는 용해로 처리된 샘플보다 품질이 높다.
상이한 용해에 의해 수득된 핵산의 순도를 추가로 결정하기 위해 A260/A230 비율을 추가로 결정하였다(표 3의 6번째 열). 상기 표 3에 나타낸 바와 같이, A260/A230 비율은 TCEP 용해로 처리된 샘플(1.164, 1.095 및 0.9 (평균 1.053))이 효소 분해 처리된 샘플(1.22, 0.66, 1.09 (평균 0.99))보다 더 높았다. 따라서 TCEP 용액을 사용하여 얻은 핵산은 효소 분해를 포함한 용해로 처리된 샘플보다 순도가 높다.
따라서, 표 3은 효소 분해를 사용하지 않고 용해 용액을 포함하는 TCEP를 사용한 용해가 효소 분해 단계를 포함하는 표준 용해 절차를 능가한다는 것을 보여준다. 또한, 효소 분해가 필요한 표준 프로토콜에 필요한 시간 30분에 비해 용해는 단 3분 만에 달성할 수 있다.
또한, 얻어진 핵산을 겔 전기영동으로 분석하였다. 이 실험에 사용된 상이한 샘플로 수행된 겔 전기영동에 의해 얻은 겔은 도 3a에 도시되어 있다(각 레인에서 샘플 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 얻은 핵산).
도 3a에서 명백한 바와 같이, 모든 샘플은 시험된 샘플에 온전한(비분해) 핵산이 존재함을 나타내는 고분자량 밴드를 제공한다. 또한, TCEP 용해에 의해 수득된 핵산의 양은 효소 분해를 포함하는 용해에 의해 수득되는 핵산의 양보다 분명히 더 많다.
용해 후 얻은 용출액을 추가 변경 없이 실시간 PCR(RT-PCR)로 추가적으로 직접 분석했다. 실시간 PCR 분석에서 양성 반응은 형광 신호의 축적에 의해 검출된다. Ct(주기 임계값)는 형광 신호가 임계값을 교차하는 데 필요한 주기 수로 정의된다(즉, 배경 수준 초과). Ct 수준은 샘플 내의 표적 핵산의 양에 반비례한다(즉, Ct 수준이 낮을수록 샘플 내의 표적 핵산의 양이 많아짐). 전형적으로, Cts < 29는 샘플에 풍부한 표적 핵산을 나타내는 강한 양성 반응이고, 30 내지 37의 Cts는 적절한 양의 표적 핵산을 나타내는 양성 반응이고, 38 내지 40의 Cts는 최소량의 표적 핵산을 나타내는 약한 반응이다.
이 실험에서는 하기 표 4에 제시된 바와 같은 Ct 값을 얻었다.
표 4: 상이한 샘플의 RT-PCR에 대해 얻은 결과.
이에 따른 PCR 그래프는 도 3b에 도시되어 있다. RT-PCR 데이터는 "TCEP 용해"에 의해 얻은 핵산의 양이 효소 분해 단계를 포함하는 표준 용해에 의해 얻을 수 있는 핵산의 양보다 더 높고 품질/순도가 더 우수함을 확인해 준다.
실시예 4: 근육 조직에서도 효율적인 TCEP 용해
추가 샘플에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해를 시험하기 위해 하기 실험을 수행하였다. 30 mg 쥐 근육 조직의 일부 샘플을 100 μl의 비드비팅 완충제(20 mM Tris, 0.1 mM Na2EDTA, 100 mM TCEP, pH 7.5)과 혼합했다. 바로 직후에 25 mM TRIS (C4H11NO3), 70 mM SDS, 50 mM 염화암모늄 및 0.1 mM Na2EDTA, pH 8의 (pH는 HCl로 조정됨) 성분의 용액(용해 완충제) 100 μl를 첨가하였다.
30 mg의 쥐 근육 조직을 함유하는 다른 샘플을 100 μl의 비드비팅 완충제(20 mM Tris, 0.1 mM Na2EDTA, 100 mM TCEP, pH 7.5)과 혼합했다. 그 다음, 비드비팅을 수행하였다. 그 다음, 25 mM TRIS (C4H11NO3), 70 mM SDS, 50 mM 염화암모늄 및 0.1 mM Na2EDTA, pH 8의 (pH는 HCl로 조정됨) 성분의 용액(용해 용액) 100 μl를 첨가하였다.
튜브를 열 진탕기에 도입하기 전에 80℃로 예열된 열 진탕기에서 1.5 ml 안전 잠금 Eppendorf 튜브에서 80℃에서 3분 동안 인큐베이션을 수행하였다. 인큐베이션은 1400 rpm에서 수행하였다.
그 후, 용해된 세포를 25 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 20.165 ml/L 15% HCl 포함)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x g에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 5a 및 5b에 제시된다.
[표 5a]
[표 5b]
표 5:비드비팅이 없는(표 5a) 및 비드비팅이 있는(표 5b) TCEP를 포함하는 용해 완충제으로 용해에 대해 얻은 결과.
표 5에서 얻을 수 있는 바와 같이, A260 판독값(표 1의 7번째 열)의 분광광도계 핵산 정량화는 본질적으로 모두 0.1과 1.0 사이에 있다. 따라서 이러한 측정은 신뢰할 수 있다. 이 측정은 표 5의 4번째 열에 제시된 바와 같은 수득된 핵산의 최종 농도를 결정하는 데 사용되었다. 따라서 표 5는 효소 분해를 사용하지 않고 용해 용액을 포함하는 TCEP를 사용한 용해도 근육 조직을 용해하기 위해 사용할 수 있음을 보여준다.
실시예 5: 정자 샘플에서도 효율적인 TCEP 용해
추가 샘플에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해를 시험하기 위해 다음 실험을 수행하였다. 상이한 용해 용액(용해 완충제)을 사용하여 30 μl 돼지 정자를 용해시켰다.
30 μl의 정자를 실시예 2에 개시된 바와 같은 1.3 적혈구 용해 완충제와 접촉시키고 실온에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 샘플을 2000 g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하였다.
펠렛화된 정자를 재현탁시키고, 80 μl의 이하의 성분의 용액(용해 용액)을 사용하여 용해시켰다: 50 mM TCEP, 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O), 50 mM 염화암모늄, pH 10, 9, 8 또는 7. 필요한 경우 NaOH로 pH를 조정하였다. 튜브를 열 진탕기에 도입하기 전에 80℃로 예열된 열 진탕기에서 1.5 ml 안전 잠금 Eppendorf 튜브에서 80℃에서 10분 동안 용해를 수행했다. 인큐베이션은 1400 rpm에서 수행되었다.
그 후, 용해된 세포를 15 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 20.165 ml/L 15% HCl 포함)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x g에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 6에 제시된다.
표 6: 효소 분해 없이 TCEP를 포함하는 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과.
표 6은 A260 판독값의 분광광도계 핵산 정량화(표 1의 7번째 열)가 모두 0.1과 1.0 사이에 있음을 보여준다. 따라서 이러한 측정은 신뢰할 수 있다. 이 측정은 표 6의 4번째 열에 제시된 바와 같은 수득된 핵산의 최종 농도를 결정하는 데 사용되었다.
따라서, 표 6은 효소 분해를 사용하지 않고 TCEP 포함 용해 용액을 사용한 용해가 정자 용해에 사용될 수 있음을 나타내며, 여기서 용해 완충제는 상이한 pH에서 사용될 수 있다.
실시예 6: 식물 샘플에서도 효율적인 TCEP 용해
추가 샘플에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 용해를 시험하기 위해, 다음 실험을 수행하였다. 약 10 mg의 신선한 감자 자엽을 100 μl 비팅 완충제(20 mM TRIS, 0.1 mM Na2EDTA, 100 mM TCEP, pH 7.5)와 접촉시킨 다음 샘플을 5분 동안 비드비팅시켰다. 그 후, 샘플을 1000 g에서 1분 동안 원심분리하였다. 그 다음 샘플을 96 웰 플레이트에서 80 μl의 이하의 성분의 용해 용액(용해 완충제)을 이용해 용해시켰다: 25 mM TRIS (C4H11NO3), 70 mM SDS, 50 mM 염화암모늄 및 0.1 mM Na2EDTA, pH 8 (pH는 HCl로 조정하였음).
튜브를 열 진탕기에 도입하기 전에 80℃로 예열된 열 진탕기에서 1.5 ml 안전 잠금 Eppendorf 튜브에서 80℃에서 10분 또는 15분 동안 용해를 수행했다. 인큐베이션은 1400 rpm에서 수행되었다.
그 후, 용해된 세포를 50 μl의 클리어링 용액(20 mM Tris 중의 2M SrCl2 및 20.165 ml/L 15% HCl 포함)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 7에 제시된다.
|
함량
[ng/μL] |
비율 A260/230 | 비율 A260/280 | |
| 50mM TCEP, 10 분, 80℃ | 22.55 | 0.90 | 1.61 |
| 50mM TCEP, 15 분, 80℃ | 36.14 | 1.00 | 1.77 |
표 7: 효소 분해 없이 TCEP를 포함하는 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과.
표 7은 TCEP 용해를 사용할 때 식물 샘플에서도 핵산을 얻을 수 있음을 보여준다. 80℃에서 더 오랫동안의 용해가 핵산의 수득량을 증가시켰다.
실시예 7: TCEP 이외의 환원제 사용
용해 완충제에서의 TCEP의 긍정적인 효과가 다른 환원제에서도 관찰될 수 있는지 이해하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
박테리아(P. fluorescence) 샘플을 원심분리했다. 그 후, 샘플을 100 μl의 이하의 성분의 용해 용액(용해 용액)에 재현탁시켰다: 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O) 및 50 mM 염화암모늄. 이 완충제의 pH는 HCl을 첨가하여 8로 설정되었다. 샘플을 튜브를 열 진탕기에 도입하기 전에 80℃로 예열된 열 진탕기에서 1.5 ml 안전 잠금 Eppendorf 튜브를 80℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션은 1400 rpm에서 수행되었다.
그 후, 용해된 세포를 10 μl의 클리어링 용액(pH 8의 20 mM Tris 중의 1M SrCl2)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 8에 제시된다.
표 8: 효소 분해 없이 상이한 환원제를 포함하는 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과.
표 8에서 알 수 있는 바와 같이, A260/A280의 비율과 A260/A230 비율은 용해에 사용된 모든 환원제에 대해 유사하다. 따라서 상이한 용해 용액(상이한 환원제 포함)으로 얻은 핵산의 순도와 품질도 유사한 것으로 보인다. TCEP를 사용한 용해는 핵산의 가장 높은 총량을 산출했다. 이 값은 100%로 설정되었다. 추가로 테스트된 용해 용액에 의해 얻은 핵산의 총 수율은 이 100% 수율과 비교하여 계산되었다. 충분한 수율을 위한 임계값은 25% 이상으로 설정되었다. 이것은 또한 실시예 9에 설명된 바와 같이 환원제 첨가제 없이 수득된 결과의 관점에서 이루어졌다. 표 8에 따르면, 환원제 TCEP, N-아세틸시스테아민, 차아황산나트륨(Na-하이드로설파이트) 및 글루타티온(L-글루타티온 레드.)은 충분한 양의 핵산을 제공했다(TCEP를 사용할 때 얻어진 수율의 25% 이상의 수율). 반면, 환원제인 티오황산나트륨 5수화물(Na-티오설페이트 5수화물) 및 1-프로판티올은 충분한 양의 핵산(25% 미만)을 제공하지 못하였다.
A260/A230 로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 상이한 환원제를 사용한 용해는 핵산의 높은 순도/품질을 초래하였다(모두 1.8에 가까운 비율을 가짐).
실시예 8: TCEP 이외의 환원제 사용
용해 용액(완충제)에서 TCEP의 긍정적인 효과가 다른 환원제에서도 관찰될 수 있는지 이해하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
박테리아(P. fluorescence) 샘플을 원심분리했다. 그 다음 샘플을 100 μl의 이하의 성분의 용해 용액(용해 완충제)에 재현탁시켰다: 20 mM 의 지시된 환원제, 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O), 50 mM 염화암모늄. 이 완충제의 pH는 HCl을 첨가하여 8로 설정되었다. 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같이 80℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
그 후, 용해된 세포를 10 μl의 클리어링 용액(pH 8의 20 mM Tris 중의 1M SrCl2)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 9에 제시된다.
표 9: 효소 분해 없이 상이한 환원제를 포함하는 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과.
표 9에서 알 수 있는 바와 같이, A260/A280의 비율과 A260/A230 비율은 용해에 사용된 모든 환원제에 대해 유사하다. 따라서 다른 용해 용액(다른 환원제 포함)으로 얻은 핵산의 순도와 품질도 유사한 것으로 보인다. A260/A230 으로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 상이한 환원제를 사용한 용해는 핵산의 높은 순도/품질을 초래하였다(모두 1.8에 가까운 비율을 가짐).
TCEP를 사용한 용해는 핵산의 가장 높은 총량을 산출했다. 이 값은 100%로 설정되었다. 추가로 테스트된 용해 용액에 의해 얻은 핵산의 총 수율은 이 100% 수율과 비교하여 계산되었다. 충분한 수율을 위한 임계값은 25% 이상으로 설정되었다. 이것은 또한 실시예 9에 설명된 바와 같이 환원제 첨가제 없이 수득된 결과의 관점에서 이루어졌다.
표 9에 따르면, 환원제 TCEP 및 L-시스테인 염산염은 충분한 양의 핵산을 제공했다(TCEP를 사용할 때 수율의 25% 이상의 수율). 반면, 환원제인 티오글리콜산암모늄, 티오글리콜산나트륨(Na 티오글리콜레이트) 및 DTT는 충분한 양의 핵산(25% 미만)을 제공하지 못하였다.
실시예 9: 연장된 용해와 함께 TCEP 이외의 환원제 사용
용해 완충제에서 TCEP의 긍정적인 효과가 더 오랫동안의 용해 하에서 다른 환원제와 함께 제공될 수도 있는지 이해하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
박테리아(P. fluorescence) 샘플을 원심분리했다. 그 다음 샘플을 100 μl의 이하의 성분의 용해 용액(용해 완충제)에 재현탁시켰다: 20 mM의 지시된 환원제, 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O) 및 50 mM 염화암모늄. 이 완충제의 pH는 HCl을 첨가하여 8로 설정되었다. 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같이 80℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
그 후, 용해된 세포를 10 μl의 클리어링 용액(pH 8의 20 mM Tris 중의 1M SrCl2)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 10에 제시된다.
표 10: 효소 분해 없이 상이한 환원제를 포함하는 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과.
표 9에서 알 수 있는 바와 같이, A260/A280의 비율과 A260/A230 비율은 용해에 사용된 모든 환원제에 대해 유사하다. 따라서 다른 용해 용액(다른 환원제 포함)으로 얻은 핵산의 순도와 품질도 유사한 것으로 보인다. A260/A230 으로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 상이한 환원제를 사용한 용해는 핵산의 높은 순도/품질을 초래하였다(모두 1.8에 가까운 비율을 가짐).
TCEP를 사용한 용해는 핵산의 가장 높은 총량을 산출했다. 이 값은 100%로 설정되었다. 추가로 테스트된 용해 용액에 의해 얻은 핵산의 총 수율은 이 100% 수율과 비교하여 계산되었다. 충분한 수율을 위한 임계값은 25% 이상으로 설정되었다. 이것은 또한 실시예 9에 설명된 바와 같이 환원제 첨가제 없이 수득된 결과의 관점에서 이루어졌다.
표 10에 따르면, 환원제 TCEP, 차아황산나트륨(Na-하이드로설파이트), 글루타티온(L-글루타티온 레드.), 티오글리콜산암모늄, L-시스테인 염산염 및 아황산나트륨(Na-설파이트)은 충분한 양의 핵산을 제공하였다(TCEP를 사용할 때 수율의 25% 이상의 수율). 반면, 환원제 N-아세틸시스테아민 및 티오황산나트륨(Na-티오설파이트)은 더 긴 용해 시간을 사용하여도 충분한 양의 핵산(25% 미만)을 제공하지 못하였다.
실시예 10: TCEP와 결합된 용해 효율에 대한 SDS의 영향
본 명세서에 기재된 바와 같은 환원제를 포함하는 용해 용액에서 SDS가 요구된다는 것을 이해하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
상이한 용해 용액을 제조하였다. 20 mM의 TCEP 및 0.1 mM EDTA, pH 7로 이루어진 용해 용액 TCEP TE-BE; 20 mM의 TCEP, 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O) 및 50 mM 염화암모늄으로 이루어진 세포 완충제 용해 용액 TCEP; 25 mM의 TCEP, 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O) 및 50 mM 염화암모늄으로 이루어진 세포 완충제 용해 용액. 이러한 완충제의 pH는 HCl을 첨가하여 7 내지 8로 설정하였다.
그 후, 용해된 세포를 10 μl의 클리어링 용액(pH 8의 20 mM Tris 중의 1M SrCl2)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표 11에 제시된다.
표 11은 환원제(여기서는 TCEP)가 세제(예: SDS)와 함께 사용될 때 가장 많은 양의 핵산이 얻어짐을 보여준다. 세제(환원제를 세제와 함께 사용할 때 얻은 양(100%)의 63.33%) 또는 환원제(환원제를 세제와 함께 사용할 때 얻은 양(100%)의 30.28%)를 빼면 핵산 수득량이 줄어든다.
A260/A230 비율에서 알 수 있는 바와 같이, 용해는 핵산의 높은 순도/품질을 초래했다(모두 1.8에 가까운 비율을 가짐).
실시예 11: 상이한 조건으로 용해 수행
상이한 매개변수, 특히 온도가 용해에 미치는 영향을 이해하기 위해 상이한 실험 설정을 비교했다. 구체적으로, 온도는 80℃, 60℃에서 40℃로, pH는 pH 10, pH 7에서 pH 4로, TCEP 농도는 50 mM에서 5 mM로, 용해 샘플의 인큐베이션 시간은 특정 온도에서 10분이었다.
슈도모나스 플로우레센스(Pseudomonas flourescens) 배양액 1 ml를 원심분리하였다. 펠렛을 90 μl의 상이한 용해 용액에 재현탁시켰다. 상이한 양의 TCEP(5 mM 및 50 mM)를 25 mM TRIS, 70 mM SDS, 50 mM 염화암모늄, 0.1 mM Na2EDTA에 용해시켰다. 그 후, HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 10, 7 또는 4로 조정하였다.
그 후, 용해된 세포를 10 μl의 클리어링 용액(20.165 ml/L HCl 중의 20 mM Tris 중의 2M SrCl2)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
얻어진 결과는 하기 표 12에 요약되어 있다.
| # | 온도(℃) | pH | TCEP (mM) |
용해
시간 |
핵산 수득량[ng/μL] | 동일 조건 하에 40℃ 수율과 비교한 수율 |
| 1 | Temp 80 | pH 10 | 50 | Min 10 | 996.695 | 863.78 % |
| 2 | Temp 80 | pH 10 | 5 | Min 10 | 687.075 | 647.43 % |
| 3 | Temp 80 | pH 7 | 50 | Min 10 | 919.083 | 921.57 % |
| 4 | Temp 80 | pH 7 | 5 | Min 10 | 972.796 | 677.91 % |
| 5 | Temp 80 | pH 4 | 50 | Min 10 | 880.269 | 691.56 % |
| 6 | Temp 80 | pH 4 | 5 | Min 10 | 937.582 | 756.57 % |
| 7 | Temp 60 | pH 10 | 50 | Min 10 | ND | ND |
| 8 | Temp 60 | pH 10 | 5 | Min 10 | 145.043 | 136.67 % |
| 9 | Temp 60 | pH 7 | 50 | Min 10 | 912.469 | 914.94 % |
| 10 | Temp 60 | pH 7 | 5 | Min 10 | 929.714 | 647.88 % |
| 11 | Temp 60 | pH 4 | 50 | Min 10 | 866.391 | 680.66 % |
| 12 | Temp 60 | pH 4 | 5 | Min 10 | 739.235 | 596.51 % |
| 13 | Temp 40 | pH 10 | 50 | Min 10 | 115.387 | 100 % |
| 14 | Temp 40 | pH 10 | 5 | Min 10 | 106.123 | 100 % |
| 15 | Temp 40 | pH 7 | 50 | Min 10 | 99.73 | 100 % |
| 16 | Temp 40 | pH 7 | 5 | Min 10 | 143.5 | 100 % |
| 17 | Temp 40 | pH 4 | 50 | Min 10 | 127.287 | 100 % |
| 18 | Temp 40 | pH 4 | 5 | Min 10 | 123.926 | 100 % |
표 12: 상이한 매개변수의 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과.
표 12는 용해가 60℃ 또는 80℃의 온도에서 수행될 때 가장 많은 양의 핵산이 수득됨을 나타낸다. 용해가 40℃에서 수행될 때 훨씬 적은 양의 핵산이 수득된다. 따라서, 적어도 약 60℃ 이상의 용해 온도에서 충분한 양의 핵산을 얻을 수 있다. 요약하면 표 12는 다음을 나타낸다:
- 더 높은 온도(60 및 80℃)는 예기치 않게 많은 양의 핵산을 생성함;
- 용해 시간이 길수록 얻어지는 핵산의 양이 증가할 수 있음;
- 중성 또는 산성 pH는 특히 온도, 용해 시간이 최적으로 선택되지 않은 경우 수득된 핵산의 양을 증가시킬 수 있음. #7의 데이터 포인트는 올바르지 않으며(잘못된 측정) 따라서 삭제되었음.
실시예 12: TCEP와 구조적 유사성을 갖는 환원제 사용
P. fluorescence 및 A. Bohemicus 의 하룻밤 배양액 1 ml를 세척하고 원심분리하여 세포 펠렛을 형성했다. pH 8의, 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O), 50 mM 염화암모늄 및 20 mM 트리스(하이드록시 메틸)포스핀, 트리스(하이드록시 에틸)포스핀 또는 트리스(하이드록시프로필)포스핀을 포함하는 용해 용액을 제조했다. 그 다음, 80 μl 용해 용액을 상기 기재된 세포 배양액의 세포 펠렛에 첨가하였다. 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 80℃에서 3분 동안 용해를 수행하였다.
그 후, 용해된 세포를 15 μl의 클리어링 용액(증류수 중의 2M SrCl2)과 접촉시켰다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
수득된 핵산을 광도 측정에 의해 분석하였다. 이러한 측정의 결과는 아래 표에 제시된다.
얻어진 결과는 하기 표 13에 요약되어 있다.
표 13: 다양한 환원제를 포함하는 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과.
표 13은 이 실험에서 시도된 모든 환원제가 양질의 핵산을 제공한다는 것을 보여준다.
실시예 13: TCEP와 비교한 트리스(하이드록시메틸)포스핀을 사용한 용해 및 후속 PCR 분석
M. luteus 또는 B. subtilis의 하룻밤 배양액 1 ml를 세척하고 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 pH 8의, 50 mM Tris (C4H11NO3), 70 mM SDS (C12H25NaO4S), 0.1 mM Na2EDTA (C10H14N2Na2O8*2 H2O), 50 mM 염화암모늄 및 20 mM 트리스(하이드록시 메틸)포스핀 또는 TCEP를 포함하는 90 μl의 용해 용액에 재현탁시켰다. 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 80℃에서 3분 동안 용해를 실시하였다.
대안적으로, 용해 효소를 사용하여 용해를 수행하였다. 샘플을 TE-Bioecho에서 10 mg/ml 라이소자임 150 μl에 재현탁시켰다. 효소 용해는 37℃에서 5분 동안 실시되었다. 그 후, 샘플을 2000 x G에서 3분 동안 원심분리했다. 상청액을 제거하고 펠렛을 용해 용액과 접촉시키고 상기 기재된 바와 같이 처리하였다.
그 후, 용해된 세포를 15 μl의 클리어링 용액(증류수 중의 2 M SrCl2)과 접촉시켰다. 클리어링 용액의 첨가는 음이온성 세제가 침전되는 효과가 있다. 그 다음, 샘플을 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액은 1000 x G에서 1분 동안 원심분리에 의해 컬럼을 통해 가압된다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았다.
얻어진 결과는 하기 표 14에 요약되어 있다.
표 14: 상이한 환원제를 포함하는 용해 완충제를 사용한 용해에 대해 얻은 결과. Lys는 추가 라이소자임 단계가 존재했음을 의미함.
표 14는 이 실험에서 시도된 제제가 양질의 핵산을 제공함을 보여준다. 추가적인 효소 분해 단계는 수득된 핵산의 수율을 약간 증가시켰다. B. subtilis 샘플에 대해 수득된 핵산을 후속적으로 PCR에 의해 분석하였다. 결과는 또한 상기 표 14에 요약되어 있다.
실시예 14: 음이온성 세제와 비이온성 세제의 비교
음이온성 세제와 비이온성 세제에 대한 결과를 비교할 수 있도록 다음 실험 설정을 설정했다.
그람 음성균의 경우:
용해 완충제 조성은 다음과 같았다:
70 mM 세제(음이온성: SDS, Li-DS; 비이온성: Triton X-100),
50 mM TCEP,
0,1 mM EDTA,
25 mM TRIS, 및
50 mM 염화암모늄,
pH = 7.5 (NaOH 로 조정함).
적용된 클리어링 용액은 하기 성분을 포함하였다:
2 M SrCl2, 및
20 mM TRIS,
20.165 ml/L 15% HCl로 조정됨.
다음 프로토콜이 수행되었다:
대장균 배양액 1 ml를 5000 x g에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하였다. 그 다음 펠렛을 100 μL 용해 완충제에 재현탁하고 80℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. SDS 또는 LiDS 포함 용해 완충제의 경우, 인큐베이션 후에 클리어링 용액 15 μL를 첨가하였다. Triton X-100 포함 용해 완충제의 경우 증류수 15 μL만 첨가하였다.
그 후, 샘플을 20000 x g에서 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액을 1000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 컬럼을 통해 처리하였다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았으며, 효소 분해 단계가 필요한 설정에 비해 필요한 시간이 크게 단축되었다.
수득된 핵산을 광도 측정 및 겔 전기영동에 의해 분석하였다(다음 분석 참조).
광도 측정:
표 15: 핵산 농도, A260/A280 및 A260/A230과 관련하여 상이한 세제를 사용한 샘플에 대해 얻은 결과.
샘플 1 내지 8(음이온성 세제 SDS 및 LiDS)은 높은 핵산 농도 및 높은 순도(A260/280 비율 및 A260/230 비율)를 보여주었다. 또한, 샘플 1 내지 8의 흡광도 스펙트럼은 260 nm에서 깨끗한 핵산 피크를 보여 고순도 핵산 샘플을 나타내었다.
샘플 9 내지 12(비이온성 세제 Triton X-100)는 매우 불순한 샘플(매우 낮은 A260/280 비율 및 매우 낮은 A260/230 비율)을 보여주었다. 또한, 흡광도 스펙트럼은 260 nm에서 전혀 핵산 피크를 나타내지 않았다. 더욱이, 260 nm 내지 290 nm 및 230 nm에서 강한 불순물이 존재하였다. 다른 모든 용해 완충제 성분은 변하지 않았기 때문에 이 불순물은 단리 중에 제대로 제거되지 않은 샘플 내 Triton X-100으로 인해 야기되었다. 따라서 샘플 내 Triton X-100이 오염되면 다운스트림 적용(예: 효소 반응)에서 원치 않는 문제가 발생할 수 있다.
따라서, 실시예 14의 이 실험에 의해 얻어진 결과에 의해 Triton X-100을 포함하는 용해 완충제는 핵산의 단리에 적합하지 않다는 것이 명백하다.
샘플 1 내지 4의 경우, 각각의 광도 측정이 도 4a에 도시되어 있다. 샘플 5 내지 8의 경우 각각의 광도 측정이 도 4b에 도시되어 있다. 샘플 9 내지 12의 경우 각각의 광도 측정이 도 4c에 도시되어 있다.
겔 전기영동:
도 5에 도시된 각각의 겔 전기영동은 샘플 1 내지 8이 강력한 게놈 DNA 밴드(빨간색으로 표시됨)를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 음이온성 세제(SDS 및 LiDS)를 사용한 박테리아에서의 성공적인 DNA 단리를 시사한다. 대조적으로, 샘플 9 내지 12는 게놈 DNA의 매우 얇고 약한 밴드(빨간색으로 표시됨)만 보였으며, 약하고 부분적인 DNA 단리만을 시사한다.
따라서 결과는 Triton X-100을 세제로서 포함하는 용해 완충제가 그람 음성균에서 핵산을 단리하는 데 적합하지 않음을 나타낸다.
인간 혈액의 경우:
용해 완충제 조성은 다음과 같았다:
70 mM 세제 (음이온성 SDS 또는 음이온성 LiDS 또는 비이온성: Triton X-100),
50 mM TCEP,
0.1 mM EDTA,
25 mM TRIS, 및
50 mM 염화암모늄,
pH = 7.5 (NaOH로 조정됨).
적용된 클리어링 용액은 하기 성분을 포함하였다:
2 M SrCl2,
20 mM TRIS, 및
20.165 ml/L 15% HCl로 조정됨.
다음 프로토콜이 수행되었다:
500 μl의 전혈을 샘플로 사용하였다. 샘플을 적혈구 용해 완충제(10 mM 중탄산나트륨(NaHCO3), 155 mM 염화암모늄, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.3)로 1회 세척하였다. 이 세척을 위해 1.3 ml의 적혈구 용해 완충제를 샘플에 첨가하였다. 인큐베이션은 실온에서 3분 동안 수행하였다. 그 후, 샘플을 2000 x g에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하였다. 펠렛은 추가 제조에 사용되었다. 그 후, 펠렛을 100 μL 용해 완충제에 재현탁시키고 80℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. SDS 또는 LiDS 포함 용해 완충제의 경우, 인큐베이션 후에 클리어링 용액 15 μL를 첨가하였다. Triton X-100 포함 용해 완충제의 경우 증류수 15 μL만 첨가하였다.
그 후, 샘플을 20000 x g에서 원심분리하고 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액을 1000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 컬럼을 통해 처리하였다. 중요한 것은, 이 실험 설정에는 효소 분해 단계의 사용이 포함되지 않았으며, 효소 분해 단계가 필요한 설정에 비해 필요한 시간이 크게 단축되었다.
수득된 핵산을 광도 측정 및 겔 전기영동에 의해 분석하였다(다음 분석 참조).
광도 측정:
표 16: 핵산 농도, A260/A280 및 A260/A230과 관련하여 상이한 세제를 사용한 샘플에 대해 얻은 결과.
샘플 1 내지 8(음이온성 세제 SDS 및 LiDS)은 높은 핵산 농도 및 높은 순도(A260/280 비율 및 A260/230 비율)를 보여주었다. 또한, 샘플 1 내지 8의 흡광도 스펙트럼은 260 nm에서 깨끗한 핵산 피크를 보여 고순도 핵산 샘플을 나타내었다.
샘플 9 내지 12(비이온성 세제 Triton X-100)는 매우 불순한 샘플(매우 낮은 A260/280 비율 및 매우 낮은 A260/230 비율)을 보여주었다. 또한, 흡광도 스펙트럼은 260 nm에서 전혀 핵산 피크를 나타내지 않았다. 더욱이, 260 nm 내지 290 nm 및 230 nm에서 강한 불순물이 존재하였다. 다른 모든 용해 완충제 성분은 변하지 않았기 때문에 이 불순물은 단리 중에 제대로 제거되지 않은 샘플 내 Triton X-100으로 인해 발생하였다. 따라서 샘플 내 Triton X-100이 오염되면 다운스트림 적용(예: 효소 반응)에서 원치 않는 문제가 발생할 수 있다.
따라서, 실시예 14의 이 실험에 의해 얻어진 결과에 의해 Triton X-100을 포함하는 용해 완충제는 핵산의 단리에 적합하지 않다는 것이 명백하다.
샘플 1 내지 4의 경우, 각각의 광도 측정이 도 6a에 도시되어 있다. 샘플 5 내지 8의 경우 각각의 광도 측정이 도 6b에 도시되어 있다. 샘플 9 내지 12의 경우 각각의 광도 측정이 도 6c에 도시되어 있다.
겔 전기영동:
각각의 겔 전기영동은 샘플 1 내지 8이 강력한 게놈 DNA 밴드(빨간색으로 표시됨)를 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 음이온성 세제(SDS 및 LiDS)를 사용한 박테리아에서의 성공적인 DNA 단리를 시사한다. 대조적으로, 샘플 9 내지 12는 게놈 DNA의 밴드를 전혀 나타내지 않았으며(또한 빨간색으로 표시됨), 매우 약하거나 누락된 DNA 단리만을 나타낸다.
따라서 결과는 Triton X-100을 세제로서 포함하는 용해 완충제가 그람 음성균에서 핵산을 단리하는 데 적합하지 않음을 나타낸다.
실시예 14의 요약:
실시예 14의 두 실험(그람 음성균 및 인간 혈액의 핵산 단리)은 TCEP와 함께 한 Triton X-100(비이온성 세제)이 만족스러운 용해에 부적합하다는 것을 분명히 보여준다. 결과는 Triton X-100을 사용한 용해 완충제에 대하여 낮은 용해 효율을 나타내어, 감도 및 수율을 큰 손실을 야기한다. 또한 Triton X-100을 사용하면 용출액이 심하게 오염되어 시퀀싱, PCR, 결찰, 제한 또는 기타 생화학적 응용과 같은 후속 적용에 치명적인 결과를 초래할 수 있다. 절대 측광 정량화도 Triton X-100 오염으로 인해 불가능하며, 이는 다운스트림 적용에도 매우 불리하다.
실시예 15: 핵산 분리를 위한 프로토콜
사용된 재료:
용해 완충제 조성물:
70 mM 나트륨 - 도데실설페이트 (SDS),
50 mM TCEP,
0.1 mM EDTA,
25 mM TRIS, 및
50 mM 염화암모늄,
pH = 7.5 (NaOH로 조정됨)
클리어링 용액:
2 M SrCl2, 및
20 mM TRIS,
20.165 ml/L 15% HCl로 조정됨.
프로토콜:
대장균 배양액 1 ml를 5000 x g에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하였다. 그 후, 펠렛을 100 μL 용해 완충제에 재현탁하고 80℃에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 15 μL의 클리어링 용액을 첨가하였다.
그 후, 샘플을 20000 x g에서 원심분리하고, 100 μL의 상층액을 컬럼에 통과시켰다. 컬럼은 Resin Sephacryl S400으로 만들어진 필터/수지를 포함한다. 상층액을 1000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 컬럼을 통해 처리하였다.
생성된 용출액은 단리된 DNA/RNA를 함유하고 후속 다운스트림 적용에 용이하게 사용될 수 있다.
참고문헌 목록
Burden (2008) "Guide to the Homogenization of Biological Samples" Random Primers, Issue No. 7, Sept. 2008, Page 1-14
Claims (19)
- 적어도 약 60℃의 온도에서 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한, 하기를 포함하는 용액의 용도:
(a) 완충 물질; 및
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제:
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 음이온성 세제. - 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한, 하기를 포함하는 용액의 용도:
(a) 완충 물질; 및
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제:
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 음이온성 세제. - 하기 단계를 포함하는, 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 시험관내 방법:
(i) 샘플을 하기를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계:
(a) 완충 물질;
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제:
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 음이온성 세제; 및
(ii) 샘플을 포함하는 용액을 약 60℃ 이상의 온도에서 인큐베이션하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 시험관내 방법:
(i) 샘플을 하기를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계:
(a) 완충 물질;
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제:
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 음이온성 세제. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법 또는 용도는 샘플을 효소와 접촉시키는 단계를 포함하지 않는 것인, 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 모든 방법 단계 동안 용액에 남아 있는 것인, 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 핵산이 PCR, 차세대 시퀀싱, SNP 유전자형 분석 또는 RT-PCR에 의해 분석되는 것인, 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
i) R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H, 바람직하게는 H, -OH, 및 -COOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
ii) R4 내지 R10은 -H 이고/이거나;
iii) A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C9)알킬렌-, -(C3-C9)사이클로알킬렌-, -(C2-C9)알케닐렌-, 바람직하게는 -(C1-C5)알킬렌-, -(C3-C6)사이클로알킬렌-, -(C2-C5)알케닐렌- 으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
iv) A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C9)알킬렌- 및 -(C2-C9)알케닐렌-, 바람직하게는 -(C1-C5)알킬렌-, 및 -(C2-C5)알케닐렌)-, 보다 바람직하게는 -(C1-C3)알킬렌-, 및 -(C2-C3)알케닐렌- 으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나;
v) A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, 또는 -(C1-C15)알킬, 바람직하게는 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환되는, 방법 또는 용도. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 착화제를 추가로 포함하는, 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 또는 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 바람직하게는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)인, 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법 또는 용도는 샘플을 클리어링 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 클리어링 용액은 양이온성 이온을 포함하고, 바람직하게는 상기 양이온성 이온은 K+, Rb+, Cs+, Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++인, 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터 핵산을 단리하는 것은 약 80℃ 이상의 온도에서 10초 이상 동안 수행되거나 상기 인큐베이션하는 것은 약 80℃ 이상의 온도에서 10초 이상 동안 수행되는, 방법 또는 용도.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법 또는 용도에 사용하기 위한 용액으로서, 상기 용액은
(a) 완충 물질 (BU); 및
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제 (RA):
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 음이온성 세제를 포함하며,
상기 용액은 약 60℃ 이상의 온도를 갖는 것인, 용액. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법 또는 용도에 사용하기 위한 샘플을 포함하는 용액으로서, 상기 용액은
(a) 완충 물질 (BU); 및
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제 (RA):
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 음이온성 세제,
상기 용액은 약 60℃ 이상의 온도를 갖는 것인, 용액. - 제13항의 방법 또는 용도에 사용하기 위한 용액 또는 제14항의 방법 또는 용도에 사용하기 위한 샘플을 포함하는 용액으로서, 상기 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 또는 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 바람직하게는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)인, 용액.
- 하기 단계를 포함하는, 샘플로부터 핵산을 단리하기 위한 시험관내 방법:
(i) 샘플을 하기를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계:
(a) 완충 물질;
(b) 화학식 (I) 및 이의 염에 따른 환원제:
(상기 식에서,
R1, R2 및 R3는 독립적으로 -H, -OR4, -COOR5, -P(O)(OR6)OR7, -N(R8)R9, -S(O)0-2R10, 및 -SO3H로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R4 내지 R10은 독립적으로 -H, 및 -(C1-C15)알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 독립적으로 -(C1-C15)알킬렌-, -(C3-C10)사이클로알킬렌-, -(C2-C15)알케닐렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A1, A2 및 A3는 선택적으로 -OR4, -COOR5, 및 -(C1-C15)알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 추가로 치환됨); 및
(c) 음이온성 세제;
상기 샘플을 포함하는 용액은 약 60℃ 이상의 온도를 갖는, 방법, - 제16항에 있어서, 상기 음이온성 세제는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 또는 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 바람직하게는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)인, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 방법은 샘플을 클리어링 용액과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 클리어링 용액은 양이온성 이온을 포함하고, 바람직하게는 상기 양이온성 이온은 K+, Rb+, Cs+, Mg++, Ca++, Sr++ 또는 Ba++인, 방법.
- 하기를 포함하는 키트:
(a) 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 용액,
(b) 선택적으로 효소 분해 수단; 바람직하게는 효소 및/또는
(c) 선택적으로 핵산으로부터 비핵산 성분을 분리하기 위한 수단, 바람직하게는 핵산으로부터 비핵산 성분을 분리하기 위한 매트릭스.
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