CN102822339A - 在核酸存在下沉淀阴离子表面活性剂离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从含阴离子表面活性剂离子和核酸的液体样品中选择性沉淀阴离子表面活性剂离子的方法，以及分离和纯化核酸的试剂盒。

Description

在核酸存在下沉淀阴离子表面活性剂离子的方法

高品质核酸的分离是现代分子生物学中很多不同技术的前提，例如PCR扩增、印迹分析和基因组文库构建，用于如分子诊断等领域。特别是当核酸获自含细胞材料的生物样品时，必须将它们与污染物如蛋白质、脂质和其它细胞成分相分离，否则这些污染物可能干扰下游应用中所使用的限制性酶、连接酶和/或耐热DNA聚合酶。此外，必须去除存在于生物样品中的RNA核酸酶(RNA酶)和特定DNA核酸酶(DNA酶)以避免DNA降解。

已开发了多种不同方法用于从含细胞组分的生物样品中分离基因组DNA。所有这些方法都包括通过破坏细胞膜来使起始材料破裂和裂解并释放其内容物至溶液中的步骤。所获得的混合物称为裂解物。在后续步骤中，从所述裂解物中去除蛋白质尤其是核酸酶，以及混合物的污染物和/或所用溶液，并最终回收(或多或少)经纯化的DNA(综述可见凯杰公司(QIAGEN)关于“Genomic DNAPurification(基因组DNA纯化)”的手册)。所述DNA纯化步骤至关重要，因为混合物或缓冲液污染物如盐、去污剂、有机溶剂特别是酚和乙醇的残留往往抑制DNA在下游应用中的性能。

已知阴离子表面活性剂具有优秀的蛋白变性和溶解特性。具体地，十二烷基硫酸钠（SDS）是各种裂解缓冲液中用作活性试剂的阴离子表面活性剂。另一方面，将其从样品中几乎完全移除非常困难但很必要，这是由于即使少量残余的SDS会严重干扰下游应用如PCR扩增和色谱方法如高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）等。

然而，含获自细胞裂解物并用本领域已知过程纯化的样品的许多核酸仍含有相当量的十二烷基硫酸根离子（DS^-）或污染物如用于从十二烷基硫酸根离子中分离所述核酸的盐或有机溶剂以及其他缓冲液或细胞组分。

用于从细胞裂解物分离基因组DNA的一种非常简单快速的技术是将细胞裂解物在高温如90°C下孵育约20分钟或在额外的蛋白酶消化后直接使用所述裂解物。虽然用该过程灭活核酸酶，但获得的裂解液仍含有缓冲液组分如十二烷基硫酸根离子和盐，他们在下游应用如PCR等中会作为酶抑制剂。因此这些快速但粗糙的技术仅适用于有限范围的应用。

称作盐析的方法是用于将DNA与细胞裂解物中存在的其它细胞组分相分离的公知技术，其中通过添加含有高浓度盐如乙酸钾或乙酸铵的溶液来从粗提细胞裂解物中沉淀出蛋白质和其它污染物。然后通过离心将所形成的沉淀从含有DNA的溶液中去除，并通过在后续步骤中用醇沉淀来从上清液回收DNA。在这些方法中，蛋白质(尤其是核酸酶)和其它污染物的去除往往很低效，需要额外的RNA酶处理、透析和/或反复醇沉淀来获得足够纯的DNA以用于下游应用，使得这些方法繁复且费时。

将核酸与细胞裂解物中存在的其它化合物相分离的另一可能性是用有机溶剂萃取污染物。在第一步中，通常用去污剂裂解细胞，然后用溶剂如酚、氯仿和异戊醇萃取裂解物以去除污染物。这些方法的一个缺点是所用溶剂的毒性。此外，还需特别留意pH和盐浓度以确保多数污染物被萃取入有机相，而核酸保留在水相。然后通过醇沉淀从水相回收所述核酸。尽管有机萃取方法非常耗时，用这些方法所分离的核酸通常含有残留的酚和/或氯仿，会在下游应用如PCR中成为抑制剂。此外，所产生有毒废弃物的处置必须遵守公害废料指南(Hazardous waste guideline)。

近年来，开发了基于离子交换，亲和性和/或疏水性相互作用的吸着过程以尽可能降低纯化过程中的DNA降解。这些吸着(sorption)过程中，由于DNA和含树脂或基质的固定固相之间的特异性相互作用而将DNA或多或少地特异性“吸着”，可以是吸附、吸收或化学结合于所述固相，而污染物与固相的相互作用程度不同于DNA，因此可通过如清洗步骤来将污染物和所吸着的DNA分离。一旦去除污染物后，需通过洗脱步骤从固相回收DNA，洗脱步骤通常包括用溶液(流动相)淋洗固相的步骤，所述溶液中包含尽可能降低固相和DNA间相互作用的化合物，从而将DNA从固相移除。然后收集包含DNA(洗脱液)的流动相。这些基于固相的方法使DNA的分离纯化过程能自动化。此外，还能用这些方法可靠地处理相当微量的DNA。

阴离子交换方法是基于核酸的带负电磷酸和阴离子交换载体上的带正电表面分子之间的相互作用(Forcic等，J.Chromatogr.A2005,1065(1),115-120)。在低盐条件下溶液中存在的DNA选择性结合固定相，而杂质如RNA、细胞蛋白质和代谢物可用中盐缓冲液从固定相洗出。下一步中，DNA可用含有高盐浓度的缓冲液从固相洗脱。然后通过醇沉淀从洗脱液回收经纯化的DNA。

在基于二氧化硅的方法中，核酸在高浓度离液盐存在下选择性吸着于硅胶膜(Hanselle等，Leg Med(东京)2003,5Supp.1,S145-S149)。RNA、细胞蛋白质和代谢物从膜上洗去，然后用低盐缓冲液将DNA从硅胶膜上洗脱。

本领域也已知基于DNA和作为固定相的磁性颗粒之间的相互作用的固相方法(Prodělalová等，J.Chromatogr.A2004,1056,43-48)。

尽管吸着方法可分离高品质DNA，这些"结合-清洗-洗脱"程序中要进行的步骤数量仍相对较高并因而费时。此外，由于其优秀的溶解特性，SDS显著影响根据保留时间、分离效率等分离的组分混合物的色谱性能，且甚至样品中SDS浓度的少量变化可导致不同的色谱结果。此外，SDS可结合任何阴离子交换树脂，干扰DNA结合或在洗脱步骤与DNA一起被洗脱。

为此，需要一种存在核酸时从样品溶液中移除阴离子表面活性剂离子的快速简单且可靠的方法，其中核酸且具体是DNA基本留在溶液中。此外，应可能将移除阴离子表面活性剂离子的该方法纳入从生物样品如组织和血液中分离纯化核酸尤其是DNA和特定基因组DNA的方法中，其中获取经纯化核酸的步骤数量相对已知吸着过程如阴离子交换和基于二氧化硅的方法有所减少，但不影响所得核酸的纯度。根据本发明，术语“核酸”包含任意种类的DNA或RNA以及任意类型DNA与RNA的混合物。具体而言，取决于所用条件和步骤，可获得DNA与RNA的混合物或者可制得高度纯化的DNA，该DNA还与RNA分离。若下文中使用术语“DNA”，含DNA的经纯化核酸样品是指含RNA或者与RNA分离。优选本方法的条件产生高度纯化的DNA，基本不含RNA。

对从含细胞的生物样品中分离和纯化核酸尤其是DNA的已知方法，即从所述样品中移除污染物如阴离子表面活性剂离子的方法的详细分析说明显示这些方法都面临所述核酸在整个分离和纯化过程期间不留在溶液中的问题。作为替代，所述核酸必须在分离/纯化过程中沉淀或结合、吸附或附着在固体基质上，从而移除细胞裂解物中存在的或分离和纯化过程引入的污染物。因此，必须有额外步骤将核酸从沉淀物中重溶，或者将其从固相上洗脱，这使所有上述方法或多或少较为耗时。

之前实验中发现SDS的浓度高于312μmol/L显著抑制PCR反应。为了能在后续PCR反应中直接使用该样品，获得碱性或中性pH的纯化样品溶液从而避免中和所述样品溶液的步骤是有用的。

因此本发明的目的是提供用于在核酸存在时于中性或碱性pH下移除阴离子表面活性剂离子的快速有效方法，其中所述核酸特别是DNA优选在所述移除过程中基本留在溶液中。

本发明中令人惊讶地发现，选自下组Rb⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺或其混合物（优选由其组成）的碱金属的单价离子和/或碱土金属的二价离子可用于从含阴离子表面活性剂离子和核酸的溶液中选择性沉淀该离子，而所述核酸尤其是DNA基本留在溶液中。

因此，本发明提供从含阴离子表面活性剂离子和核酸的液体样品混合物中选择性沉淀该离子的方法，所述方法包括步骤：1.向样品混合物中添加溶液(沉淀溶液)，所述溶液包含碱金属的单价离子和/或碱土金属的二价离子，所述离子选自下组Rb⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺或其混合物，优选由其组成，和2.任选孵育含有样品混合物和所述沉淀溶液的混合物以确保沉淀形成的完全性。在优选实施方式中，所述沉淀溶液包含碱土金属的二价离子，在特别优选的实施方式中，包含Sr²⁺离子。

根据本发明所述，阴离子表面活性剂是例如硫酸盐、磺酸盐和羧酸盐，优选烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、烷磺酸盐、烷基苯磺酸盐和烷基羧酸盐。特别优选能提供显示与十二烷基硫酸根(DS^-)相似沉淀性质的表面活性剂离子的表面活性剂，更优选能提供硫酸根离子的表面活性剂，且最优选提供十二烷基硫酸根离子源的表面活性剂。作为十二烷基硫酸根离子源，可使用溶于水后能释放十二烷基硫酸根离子(H₃C(CH₂)₁₁SO₄ ^-)入溶液中的任何化合物。十二烷基硫酸根离子源优选选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵和十二烷基硫酸锂，且最优选十二烷基硫酸钠。

本发明中，沉淀溶液是包含碱金属和/或碱土金属水溶性盐的溶液，例如RbCl、SrCl₂、CaCl₂或BaCl₂，其在溶于水时提供碱金属的单价离子和/或碱土金属的二价离子。在中性或碱性pH的水溶液或在水性缓冲液中，这些离子与表面活性剂离子形成复合物，例如与十二烷基硫酸根离子形成不溶于水的复合物，这导致沉淀形成，从而从溶液中去除所溶解的表面活性剂离子。

沉淀溶液中单价和/或二价金属离子的浓度优选范围是0.1～10mol/L，优选0.5～5mol/L，更优选0.75～2.5mol/L，最优选0.9～1.2mol/L。沉淀溶液中金属离子优选这种相当高的浓度以允许小体积添加并因此避免液体样品的过高稀释。

向一定体积样品混合物(裂解物)添加的沉淀溶液体积取决于该样品混合物中的表面活性剂离子浓度。在优选实施方式中，液体样品对沉淀溶液的体积比范围为4:1～12:1，优选5:1～11:1，更优选6:1～10:1，且最优选7:1～9:1。所述液体样品（裂解物）中表面活性剂离子的浓度优选约10-50mmol/L。若例如含约25mmol/L十二烷基硫酸根离子的80μL裂解物用作样品，则优选添加10μL 1M的沉淀溶液以沉淀该样品中的十二烷基硫酸根离子。

在一个优选实施方式中，通过向所述样品混合物中添加所述沉淀溶液而获得的混合物在所述沉淀溶液加入到所述样品混合物后于–10°C～10°C孵育，优选–5°C～5°C，更优选–2.5°C～2.5°C，最优选–1°C～1°C。孵育温度越低，沉淀完成越快。但是，孵育温度应高于混合物的凝固点以避免全部混合物凝固。特定样品混合物的凝固点取决于该混合物中所溶解的盐量，这是本领域技术人员熟知的，并相应选择孵育温度。孵育步骤优选进行3～60分钟，优选5～30分钟，且最优选约10分钟。优选混合物在冰浴中保持静置一段给定的时间，以确保沉淀形成的完全性。所述沉淀可在另一步骤中从所述样品中移除，优选通过离心或过滤，更优选通过凝胶过滤色谱。若所述沉淀通过除凝胶过滤色谱之外的任何其他过程移除，则优选将液体剩余物(例如，离心后的上清液或过滤后的洗脱液)通过凝胶过滤色谱来进一步纯化。

为此，优选相同申请人于本申请同日提交的题为“chromatographicdevice and method for isolating and purifying nucleic acids(用于分离和纯化核酸的色谱装置与方法)”的共同待审申请中所述的色谱设备，其包含至少一个色谱单元，含有：1.具有入口和出口的中空主体，该中空主体包含提供尺寸排阻特性的固体基质，优选形成凝胶床；2.置于出口与固体基质之间用以使固体基质保持在色谱单元内的多孔玻璃料、滤器、毛网或膜，但优选允许任意大小的核酸通过；3.置于多孔玻璃料、滤器、毛网或膜与基质之间的无孔环，密封所述玻璃料、滤器、毛网或膜的外区以避免流动相进入玻璃料、滤器、毛网或膜而不经过基质；4.可选有至少一个可移除的闭合装置以封闭色谱单元的入口和/或出口；以及5.可选有至少一个收集管以收集通过基质后的流动相(洗脱液)，其中在优选实施方式中，所述固体基质在优选实施方式中为成凝胶聚合物，其尺寸排阻限度为150～500个碱基对(bp)，优选200～400bp，且最优选250～300bp。优选所述成凝胶聚合物的相应尺寸排阻限度为10～10000KDa，更优选20～8000kDa。

该装置允许“阴性”色谱，这不同于色谱纯化核酸常规使用的其它色谱方法，固体基质吸着/保留的并非核酸而是污染物，从而允许在单次淋洗步骤中进行色谱纯化。该色谱装置不但去除小分子量的污染物，还能作为深度滤器用于固体材料特别是表面活性剂离子和单价碱金属离子或二价碱土金属离子所形成的沉淀物。所述沉淀物不进入凝胶床，而是保留在其上表面。更意外的是，由于固体材料通常易于堵塞凝胶的孔，从而妨碍或扰乱色谱。联用所述色谱装置与本发明所述沉淀表面活性剂离子的方法，可获得含有高度纯化的脱盐核酸的样品，具体包括DNA且特别是基本不含残留表面活性剂离子的gDNA。

所述色谱设备不限于特殊形状。可使用色谱中常用的任何设备。所述色谱设备可选自但不限于用于抽气或压力柱色谱的常规柱、离心柱或多孔板。通常，使用的所谓色谱柱具有圆形横截面，直径小于其长度。所述柱可为例如圆柱型或圆锥型或其组合。

上述色谱装置特别适用于尺寸排阻色谱(SEC)。若有机溶剂用作洗脱液（移动相），SEC也称为凝胶渗透色谱（GPC）。为了纯化核酸，优选水基流动相，例如用水、水性有机溶剂或水性缓冲液/溶液作为流动相。这种情形中，SEC也称作凝胶过滤色谱。尺寸排阻色谱是一种色谱方法，其中分子基于其尺寸而分离，或更精确说是基于其流体力学体积而分离。通常，悬浮在水性介质中时能形成凝胶床的固体基质如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或其混合物可悬浮于缓冲液中并堆积在柱的中空主体内，所述柱由玻璃、塑料、特氟隆或者与流动相和分析物都不反应的任意其它材料制成。然后将待纯化的样品施加到凝胶床上表面的中心，然后使其经由重力或由离心或加压推动流过凝胶。优选施加离心力将流动相沿柱下移，其中柱在离心机内离心(称为离心柱技术)。由于凝胶中的交联，凝胶内存在一定尺寸的孔。小分子能穿过这些孔，并因而较慢地移动通过凝胶床，随着它们通过柱而被持留，而大分子不能穿过这些孔并较快地沿柱下移。通过柱以后，随即在柱出口处收集含已纯化分析物的流动相(现称为洗脱液)。为了将固体基质保持在柱的中空主体内，优选在柱出口和固体基质之间放置多孔玻璃料、滤器、毛网或膜。

SEC中，尺寸排阻限度限定了分子量，过大的分子将被截留在固定相。固体基质的尺寸排阻限度可通过凝胶的交联度来调节。能形成具有不同交联度凝胶床的各种固体基质可以市售获得。

凝胶过滤色谱，特别是采用离心柱的凝胶过滤色谱中的常见问题是，流动相可能沿柱的内壁向下流，因此进入玻璃料、滤器、毛网或膜而不通过固体基质。在高通量应用中并非所有待纯化的样品混合物都恰好施加到凝胶床平整表面的中心或者样品被快速施加时尤为如此。流动相不进入凝胶床时，不发生色谱分离，且得到带污染的洗脱液。为克服这一问题，所述色谱装置优选在多孔玻璃料、滤器、毛网或膜与基质之间配有无孔环。该环封闭所述玻璃料、滤器、毛网或膜的外区，从而避免流动相不通过基质而进入所述玻璃料、滤器、毛网或膜。此外，柱内流动相的速度减慢，从而改善选择性。

所述色谱设备可任选含至少一个可移除的闭合装置以封闭色谱单元的入口和/或出口。若所述入口和出口配有该可移除的闭合装置，则用于密封所述入口的闭合装置和用于密封所述出口的那些可相同或不同。

所述色谱设备还可包括至少一个收集管以收集通过基质后的流动相(洗脱液)。其还可在每色谱单元配有一个收集管，即若所述色谱设备仅含一个色谱单元，则优选仅包括一个收集管。另一方面，若所述色谱设备含数种色谱单元例如多孔板形式的24、48或96种色谱单元，则也可包括多于一个收集管，也优选采用多孔板的形式。可补充其他收集管用于收集预离心期间从所述柱排出的液体。

成凝胶聚合物优选选自葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或其混合物，更优选为葡聚糖和聚丙烯酰胺的混合物。尺寸排阻限度不同的这些成凝胶聚合物可市售获得，例如商标为Sephacryl、Sephadex或Sepharose。一种特别优选的固体基质是S-400HR Sephacryl树脂，可从GE医疗保健公司(GE-Healthcare)市售获得，该产品是球形烯丙基葡聚糖/N，N'-亚甲基双丙烯酰胺基质，尺寸排阻限度为271bp(对应于20-8000kDa)。其它合适的成凝胶聚合物可具有甲基丙烯酸基料，例如羟基化甲基丙烯酸聚合物，如可从托索生物科学集团(TosohBiosciences LLP(前身为TosoHaas))获得的Toyopearl HW 65，其尺寸排阻限度为40-5000kDa。

所述可移除的闭合装置优选代表选自下组的一次性闭合装置：盖箔、封条和可脱末端（break-away end），或者选自下组的可重新紧闭的闭合装置：螺帽和搭锁帽。若所述色谱单元的入口和出口用所述可移除的闭合装置密封，则以预溶胀在溶剂中的凝胶形式提供所述固体基质，所述溶剂选自所述闭合色谱设备内的水、有机溶剂与水的均相混合物，或者水性缓冲液。在此情况中，优选在临使用前通过离心(预离心)从色谱单元中排除溶剂，而同时建立基质床。

所述色谱设备还可包括平行形式的多个色谱单元，这些色谱单元优选是多孔板的形式，其中多孔板的各孔含有一个单独的色谱单元。

包含由表面活性剂离子和碱金属或碱土金属的离子相互作用形成的固体材料，以及不溶于裂解缓冲液的其他固体材料的沉淀物在凝胶过滤步骤之前或期间去除，例如络合的十二烷基硫酸根离子或其衍生物、沉淀的蛋白质等等。本发明方法的其他优点是由于使用尺寸排阻色谱代替简单过滤或离心步骤，不仅是固体材料与所述溶解核酸分离。此外，通常存在于生物样品中的已溶解污染物如蛋白、残留的核酸小片段、代谢物、脂质和其他组分在单一步骤中移除。

凝胶过滤色谱优选用上述色谱设备进行且包括下述步骤：1.通过离心(预离心)在色谱单元内建立基质床，2.将含溶解核酸和表面活性剂离子如十二烷基硫酸根离子与碱金属或碱土金属离子所形成沉淀的样品应用于基质床上表面(的中心)和最后3.通过离心从色谱单元洗脱核酸并同时收集洗脱液。

预离心步骤优选通过将所述装置在500～900x g离心1～7分钟进行，优选在700x g离心2~5分钟，且最优选在700x g离心3分钟。

色谱单元内基质床的体积优选为100μL～2mL范围，更优选500μL～1mL范围，且最优选700～800μL。优选以成凝胶聚合物的分散剂来提供所述基质，所述分散剂溶于水，盐溶液如0.9%NaCl，或适当缓冲液例如TE、TAE、PBS等等，或溶于稀释的缓冲液，而所述分散剂优选包含60-90%，更优选70-80%且特别是75%的成凝胶聚合物。色谱单元内基质床的装填水平优选为0.5cm～2.0cm范围，更优选1.0～1.5cm。在标准96孔板中，基质床的体积优选为约0.8mL。所用凝胶床的确切体积和填充水平取决于由柱所限定的中空主体的尺寸和形状，以及待纯化样品的种类和用量，这是本领域技术人员所熟知的。优选将最多100μL的样品体积施加到装填有600μL～800μl基质床或装填水平为1.0cm～1.5cm基质床的柱中。

将DNA从色谱单元上洗脱的步骤优选通过将所述装置在500～900x g离心1～7分钟进行，优选在700x g离心2~5分钟，且最优选在700x g离心3分钟。优选所用的时间和离心力对应于预离心所用时间和离心力(见上文)。

尽管本发明选择性沉淀表面活性剂离子的方法可用于含表面活性剂离子和核酸的任何样品混合物，但所述液体样品优选是通过用裂解缓冲液处理所述样品获自含细胞生物样品的裂解物。裂解缓冲液是水溶液，包含活性组分如去污剂（表面活性剂），用以破坏和/或破碎细胞的细胞膜，导致胞内组分如DNA、RNA、蛋白质、脂质、代谢物等释放入溶液。包含先前胞内组分的所获混合物被称为裂解物。裂解缓冲液优选能够在低盐裂解条件下进行快速裂解过程，因为裂解物中的高含量盐会额外使纯化过程复杂化。若裂解缓冲液的其它组分不干扰本发明方法或随后下游应用的任意后续步骤，或者能通过简单且快速的纯化步骤来去除潜在干扰组分，而核酸特别是DNA基本保留在溶液中，则更有利。

在特别优选的实施方式中，所述样品混合物优选通过用裂解缓冲液处理所述样品而获自含细胞生物样品的裂解物，如相同申请人于本申请同日提交的题为“method for precipitating anionic surfactant ions in the presence ofnucleic acids(在核酸存在下沉淀阴离子表面活性剂的方法)”的共同待审申请中所述，所述裂解缓冲液含表面活性剂离子源、优选硫酸根离子、特别优选十二烷基硫酸根离子(DS^-)，但优选基本不含任何螯合或络合剂如乙二胺四乙酸（EDTA）。所述裂解缓冲液优选含缓冲物质H₂SO₄和表面活性剂离子源，pH为7.5–10，优选8–9，且最优选8.5，并优选基本不含任何螯合或络合剂以及Mg²⁺离子。该缓冲液使样品材料在低盐裂解条件即低渗条件下快速裂解，其中所述缓冲溶液中的总离子浓度低于待裂解细胞内的总离子浓度。例如，在NaCl的情形中，包含低于0.9wt%NaCl (约155mmol NaCl，对应于310μmol/L溶解离子)的水溶液是低渗的。用该缓冲液，即使是固体材料含量相对高的样品如组织样品，通常在如56°C下用时不到40分钟就完全裂解了。裂解可在45°C～70°C的范围进行，优选50°C～68°C，最优选62°C，这取决于RNA是否优选保留在分离核酸中。用于分解样品中RNA的简单方法是通过将样品加热到至少60°C的温度而不另外添加分解剂。若RNA保持在样品中，则推荐仅将样品加热至最高58°C，优选最高56°C。

在裂解步骤期间或之后增加温度至最高80°C会额外地使样品中的蛋白质(例如酶)变性而不影响所需的DNA，特别是基因组DNA。当然，该情况中不获得RNA。

由于该缓冲液基本不含任何作为PCR反应中聚合酶辅因子所需的二价离子的螯合或络合剂的试剂，且裂解缓冲液的pH落在PCR反应的最适pH范围内，用此裂解缓冲液所得的裂解物在根据本发明方法移除所述表面活性剂离子后可直接用于下游应用如qRT-PCR中。

如上所述能用作去污剂破坏细胞的阴离子表面活性剂可包含在裂解缓冲液中。所述方法最常使用的去污剂是提供十二烷基硫酸根离子的表面活性剂。溶于水后能释放十二烷基硫酸根离子(H₃C(CH₂)₁₁SO₄ ^-)入溶液中的任何化合物可用作十二烷基硫酸根离子源。十二烷基硫酸根离子源优选选自十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵和十二烷基硫酸锂，且最优选十二烷基硫酸钠。

本发明所述的裂解缓冲液优选基本不含螯合或络合剂。此类试剂的非限制性示例有EDTA、EGTA、EDDS(亚乙基二酰胺二乙酸)、NTA(氮川三乙酸)、葡糖酸、异抗坏血酸、酒石酸、柠檬酸、亚氨基二琥珀酸、三乙醇胺。就本发明而言，裂解缓冲液基本不含螯合或络合化合物，例如EDTA，若其含量低于10mg/L，优选低于1mg/L，更优选低于0.1mg/L，更为优选低于0.001mg/L，且最优选本发明所述裂解缓冲液完全不含有任何EDTA(0mg/L)。

裂解缓冲液可与蛋白酶联用。蛋白酶有时也称作蛋白水解酶，是催化水解切割多肽链(蛋白质)中连接氨基酸的肽键的酶。本领域已知适当的蛋白酶，且包括但不限于QIAGEN蛋白水解酶(Proteinase)K或QIAGEN蛋白酶(Protease)(凯杰公司，德国希尔登)。已发现较贵的蛋白水解酶K可替换为较便宜的QIAGEN蛋白酶而不影响纯化过程的结果。蛋白酶可以已存在于所提供的即用型裂解缓冲液溶液中，或可在生物样品与裂解缓冲液混合后由用户添加到混合物中。

缓冲液中阴离子表面活性剂离子源的浓度取决于待裂解的样品。缓冲液中表面活性剂离子源优选浓度优选为1～100mmol/L，更优选5～75mmol/L，更优选10～50mmol/L，且最优选25mmol/L。缓冲物质可以是能提供pH至少为7.5的任何适宜缓冲物质如TRIS、HEPES、HPPS或任意氨缓冲溶液。优选的缓冲物质是TRIS。缓冲液中缓冲物质的浓度优选范围为1～100mmol/L，更优选5～75mmol/L，更优选10～50mmol/L，且最优选25mmol/L。缓冲液中缓冲物质如TRIS对表面活性剂离子源的分子比例优选范围是3:1～1:3，更优选2:1～1:2，更优选1.2:1～1:1.2，且最优选1:1。

若要裂解含大量液体复合物的样品如血液，为避免混合物被样品液体过多稀释而优选用两倍浓度的缓冲液(2X)，其中表面活性剂离子源和缓冲物质如TRIS的浓度各自分别为2～200mmol/L，更优选10～150mmol/L，更优选20～100mmol/L，且最优选50mmol/L。裂解缓冲液还可以供用户在临用时稀释的浓缩物形式提供，该浓缩物包含如10倍浓度的表面活性剂离子源和缓冲物质(10X裂解缓冲液)。

所述裂解缓冲液可包括选自稳定剂（如叠氮化钠）、增溶剂等的其他活性组分，所述组分为本领域技术人员熟知。

由于硫酸盐如SrSO₄的溶解度相当低，所述缓冲组合物中用H₂SO₄作为酸性化合物以确保从进行沉淀的溶液中有效去除任何过量的碱或碱土金属离子。缓冲液中的氯离子浓度优选低于10mmol/L，更优选低于1mmol/L，更优选低于0.1mmol/L。

使用上述裂解缓冲液进行含细胞生物样品的裂解是通过包括下述步骤的方法：1.将样品与上述裂解缓冲液混合；2.孵育步骤1所得混合物以获得含有DNA、RNA和蛋白质的裂解物。

用于裂解一定量样品材料所需的裂解缓冲液体积取决于所处理材料的种类和尺寸。在组织样品的情况中，举例而言，在混合样品与裂解缓冲液前将较大组织样品切成约4mm³或更小的小碎片可能是有利的。对于10mg样品组织的裂解，使用的裂解缓冲液体积优选为20～150μL，更优选30～120μL，更优选50～100μL，且最优选80μL。

若待分离的核酸为脱氧核糖核酸，则裂解物中存在的RNA可任选在裂解所述样品后但在沉淀所述表面活性剂离子前分解。术语“分解RNA”包括降低裂解物中溶解的RNA含量和/或灭活RNA和/或促进RNA与DNA分离的任意方法，包括部分或完全性的热、化学和/或酶促水解、消化、转化和/或分解RNA的任意方法，和/或从溶液中去除RNA或其片段如通过沉淀、吸附过程等等。通过孵育样品与裂解缓冲液的混合物，和分解裂解物中所存在RNA的任选步骤来裂解所述生物样品可在单个步骤中进行，优选通过将混合物加热至温度等于或高于60°C，更优选60°C～70°C，更优选61°C～65°C，且最优选加热至62°C。为了确保完全裂解和RNA分解，样品加热的时间段取决于所处理样品的种类和量。优选将混合物加热10～80分钟(min)，更优选15～60分钟，更优选20～50分钟，且最优选30～45分钟。若用最高升至80°C的温度进行上述蛋白变性，过程中的RNA也分解。联用本发明选择性沉淀阴离子表面活性剂离子的方法与所述裂解程序，上述裂解物中所存在RNA的任选分解步骤和色谱步骤，可从各种生物样品中获得高质量核酸，尤其是高度纯化的DNA，且特定是高质量基因组DNA。在这种情况下，生物样品优选通过下述步骤进行：1.混合样品和裂解缓冲液，所述裂解缓冲液含有阴离子表面活性剂离子源，优选十二烷基硫酸根离子（DS^-），但基本不含螯合剂或络合剂，2.孵育步骤1所得混合物以获得至少含有DNA、RNA和蛋白质的裂解物，3.任选分解裂解物中存在的RNA,4.用本发明方法从裂解物中沉淀出表面活性剂离子,5.将核酸与裂解物中存在的沉淀物和/或其它污染物分离，优选通过尺寸排阻色谱或分离所述核酸和所述沉淀以获得纯化的含DNA洗脱物的任何已知替代方法。在此方法中，所有步骤2-5期间核酸特别是DNA基本保持在溶液中。

利用此方法可从组织样品获得纯化的核酸，尤其是高纯度DNA，仅需约45分钟(30分钟裂解，10分钟沉淀，3分钟的柱预离心，和3分钟的色谱分离本身)，而用例如QIAamp试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)裂解和纯化相同量的组织通常需要约2.5小时。

就通过UV/可见光光谱法、凝胶电泳、电导率测定、HPLC分析、PCR和其它试验所评价的纯度和得率而言，用所述方法所分离核酸的品质和纯度与用小型纯化的现有技术方法(例如非常成功的QIAamp技术(凯杰公司，德国希尔登))所得核酸的品质和纯度相当，或在很多情况下甚至更好。此外，所述方法获得的含DNA洗脱液可冷冻用于长期保存，或者可以在色谱后立即在如定量实时PCR(qRT-PCR)、PCR等下游应用中处理而无需用额外步骤从洗脱液中分离核酸。由于纯化过程中核酸尤其是DNA基本保留在溶液中，且既不通过添加有机溶剂如乙醇来沉淀，也不吸着或结合于固体基质如二氧化硅膜或阴离子交换树脂，本文所述方法比本领域已知的从细胞裂解物的步骤中分离和纯化核酸为纯DNA样品的方法快得多。此外，整个过程可完全自动化。

原则上可以从各种生物样品分离和/或纯化所有种类的核酸(RNA和DNA)，包括合成的、经遗传工程改造的或天然存在的单链或双链DNA，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡和多核苷酸，用限制性内切核酸酶部分消化DNA获得的DNA片段，线粒体DNA，质粒DNA，和宏基因组(metagenomics)DNA，代表从某群落生境(biotope)或生物群落(biocenosis)中所见的所有微生物获得的全部DNA。

本文所述方法适用于分离和纯化基因组DNA，所述基因组DNA是获自单一生物体的包含该生物体全部遗传信息的大分子量DNA，相对于质粒DNA、通过限制性内切核酸酶的作用部分消化的DNA和宏基因组DNA。若如上所述分离沉淀与所述样品，则不仅所述固体材料留在所述柱的上表面，而且小片段的DNA留在色谱材料内。由于高分子量和大尺寸，难以分离和纯化完整的高品质基因组DNA，因为基因组DNA存在相当高的降解风险，这或者是由于分离过程中的机械应力特别是剪切应力，或者是由于化学和酶促降解。另一方面，降解的DNA可能导致下游分析中的定量和定性误差。本发明所述方法提供了快速、稳健、安全、易于操作且温和的方法通过沉淀所含的表面活性剂离子，如十二烷基硫酸根离子来从各种不同生物样品中纯化DNA，特别是基因组DNA。

利用本发明所述方法，可以纯化获自各种起始材料的裂解物中存在的核酸，优选DNA，更优选基因组DNA，这些材料包括但不限于动物和人体组织如肝、脾、肺、心、脑、肾等，动物和人的血液、液体、唾液或精液，动物和人细胞的细胞培养物，动物和人的骨髓，酵母，细菌，昆虫，植物和啮齿动物的尾。样品优选为动物或人来源的含细胞生物裂解样品。在另一优选实施方式中，样品包含革兰氏阴性菌。样品可以在取自其天然环境后立即裂解(新鲜样品)，或可以在裂解前通过冷冻或化学稳定剂的作用而稳定化，例如通过福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE组织)或包括柠檬酸盐或肝素的血液稳定剂。更优选样品是选自新鲜或冷冻组织和血液的裂解样品，最优选哺乳动物组织和血液。

若本发明沉淀方法与上述裂解过程、分解所述裂解物中存在的RNA的任选步骤和色谱步骤联用，则10mg样品中获得的DNA含量通常为约5-70μg基因组DNA。本领域技术人员熟知DNA的具体含量取决于所述样品，例如其类型和年龄。

基于细胞裂解前含细胞生物样品的原始量，通常约10mg的样品量用于分子诊断中的分析。但应当理解，使用本发明所述方法能处理更大或更小的样品材料量，例如分别在g-范围或μg-至ng-范围。在此情况中，试剂、缓冲液、固体基质的用量以及色谱装置的尺寸需要通过放大或缩小来调整，这是本领域技术人员所熟知的。

本发明提供一种用于分离和纯化核酸的试剂盒，所述核酸优选含基因组DNA，所述试剂盒包含：1.碱金属单价离子和/或碱土金属二价离子的离子源，所述离子选自下组Rb⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺或其混合物，优选由其组成，所述离子源的形式是待用户溶解的水溶性碱土金属盐，或是待用户稀释的母液或是即用型溶液，和一种或多种选自下组（优选由其组成）的组分：2.含阴离子表面活性剂的裂解缓冲液，优选上述裂解缓冲液，3.用于凝胶过滤色谱的色谱设备，优选上述色谱设备，和4.任选用于扩增一种或多种靶核酸的一种或多种引物。此外所述试剂盒优选包括目前描述分离和/或纯化方法的说明。

附图说明

图1显示由猪肝组织样品的凝胶电泳获得的SYBR-Green II染色的琼脂糖凝胶，样品根据参比实施例2用含TRIS、SDS、EDTA和MgCl₂的缓冲液裂解。泳道1显示DNA大小标准。泳道2和3中所分析的样品已利用QIAsymphony平台(凯杰公司，希尔登)进行纯化，而泳道4和5以及6和7所示样品中十二烷基硫酸根离子分别通过添加K₂CO₃和KHCO₃而去除。用钾离子处理的所有样品中都存在大量核糖体RNA(rRNA)。

图2显示用不同方法移除碱土金属二价金属离子和十二烷基硫酸根离子形成的沉淀后溶液中存在的SDS残余量（参见实施例3）。虽然使用大量过量沉淀溶液没有检测到显著优势（50μL与25μL），在移除所述沉淀中过滤步骤（过滤）通常比离心（离心）明显更有效。若所述样品在冰浴（冰）中孵育10分钟然后过滤，则获得最佳的结果。

图3显示先前用沉淀溶液处理的10mg猪肝组织裂解物的纯化结果，使用不同凝胶过滤树脂与通过MiniSart滤器（德国哥廷根的萨托瑞斯公司(Sartorius)）、硅料（凯杰公司，德国海尔登）、硅颗粒床（QiaExII，凯杰公司，德国海尔登）、或QIA-粉碎柱（凯杰公司，德国海尔登）的简单过滤作比较。所述纯化方法对gDNA量(以μg计)、对洗脱液中存在的SDS量（以μmol/L计）和对水稀释后的洗脱液电导率（以μS计）的影响如实施例4所述测定。

图4显示按实施例4所述用尺寸排阻限度不同的市售Sephacryl树脂(S200,S400,S500和S1000)去除污染物的程度。

图5显示按实施例5所述的PAGE分析所得结果，所述分析为粗猪肝组织裂解物(泳道1)，"经沉淀"的粗猪肝组织裂解物(泳道2)，用QIAamp裂解试剂盒与RNA酶从猪肝组织所得裂解物(泳道3)，用QIAamp裂解试剂盒从猪肝组织所得裂解物而不添加RA酶(泳道4)、QIAGEN蛋白酶(泳道5)、RA酶A(泳道6)，以及按本发明所述纯化的洗脱液(泳道7～9)和用QIAamp试剂盒所得洗脱液(泳道10和11)的对比。泳道L中分析了蛋白质标准品。

图6显示对200μL按实施例6所述未添加RA酶所得粗猪肝裂解物的AEX-HPLC分析。还显示对HPLC运行所收集的不同组分的琼脂糖凝胶分析。

图7显示10mg新鲜猪肝的样品用a)本发明所述方法，和b)QIAamp试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)纯化的洗脱物所得HPLC概况的比较(见实施例6)。尽管两个样品中残留污染物的含量相当，按校正曲线所确定，本发明所述方法获得的gDNA得率高出近50%(9.2μg对比6.2μg)。

图8显示gDNA洗脱液的紫外/可见光谱，分别通过利用本发明所述方法(上部光谱)和利用QIAamp试剂盒(下部光谱)裂解并纯化10mg猪肝组织获得洗脱液(见实施例7)。

图9显示用本发明所述方法分离并纯化自大鼠尾部的样品的抑制研究(jun试验)(见实施例8)。由于样品中存在高浓度gDNA，在未稀释样品中观察到强产物抑制，甚至在10倍稀释的样品中也观察到弱抑制，而更高稀释度的样品中未见抑制。

图10显示按实施例8所述从qRT-PCR反应所得的CT值，所述反应在TAQman 7700分析仪上于jun试验中扩增用本发明所述方法(标为“一步式”)和用QIAamp试剂盒从10mg大鼠肝组织获得的裂解物。同样在未稀释和10倍稀释的本发明方法所纯化样品中观察到产物抑制。但对于稀释样品，本发明所述方法所得裂解物的CT值始终较低。

图11显示用本发明所述方法纯化的两个血液样品的SYBR-green II染色琼脂糖凝胶(见实施例10)。作为参比，在左侧显示DNA长度标准(GIBCO 1kb plusDNA梯度，英杰公司(Invitrogen GmbH)，德国卡尔斯鲁厄)。

图12显示从肝、肾和脾组织样品获得的RT-PCR结果，所用样品或保存在市售的RNAlater试剂(凯杰公司，德国希尔登)中，冷冻在干冰上(-78°C)待用，或在收到时即使用(新鲜样品)。用市售的DNeasy试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)(左侧)和本发明所述方法(右侧，标为“一步式”)按实施例11所述裂解并纯化样品。对两种方法而言，可见RT-PCR反应中所得CT值都相当。

图13显示按本发明所述从肝和脾组织的裂解与纯化所得洗脱液的琼脂糖凝胶(见实施例12)。

图14显示按本发明所述，如实施例13所示在凝胶过滤步骤中用水、缓冲液AE和2倍浓缩的缓冲液AE为洗脱剂，裂解并纯化大鼠肝组织所得洗脱液中gDNA(以μg计)和SDS(以μM计)的含量和电导率(稀释后以μS为单位(20°C))。

图15显示对来自FFPE大鼠肝组织的18S rRNA编码基因的RT-PCR的CT值(实施例14)。利用市售试剂盒(1)和本发明所示方法(2和3)裂解并纯化FFPE团块的切片。

图16显示利用市售试剂盒(1)和本发明所示方法(2和3)从FFPE大鼠肝组织所得gDNA的量(实施例14)。

实施例

材料与一般实验过程

凝胶过滤介质获自GE医疗保健公司(GE Healthcare，德国弗莱堡)，离子交换介质获自默克公司(Merck KgaA，德国达姆施塔特)。

除非另有说明，所分析的组织样品是大鼠的肝组织样品。

确定gDNA的含量与纯度：为评估纯化样品(洗脱液)中gDNA的量(gDNA得率)，通过紫外/可见光谱在260nm下测定样品的吸光度。从OD₂₆₀值(260nm下的光密度)中减去320nm下测定的背景吸光值，所得数值乘以DNA的特征吸光系数50，并乘以稀释因子来获得以μg/μL计的gDNA。此外，紫外/可见光谱还用于评价所得DNA的纯度。残余固体颗粒不显示明显的吸收峰，但导致整个光谱的基线提高。游离血红蛋白的吸光最大值在波长410nm处，而盐和防腐剂如叠氮化钠的吸收波长在230nm以下。用Spectramax II (分子装置公司(Molecular Devices)，美国加利福尼亚州萨尼维尔)96孔板分光计记录紫外/可见光谱。

用HPLC分析进行所得gDNA含量的更精确测定。用软件计算光谱中含gDNA峰的曲线下面积(AUC)并与HPLC标准曲线比较以确定样品中的gDNA量。还用HPLC分析确定样品的纯度，利用Vision BioCad工作站(前景生物系统公司(Perseptive Biosystems)，美国马萨诸塞州弗雷明汉)。采用装有离子交换树脂TMAE-Fractogel(S)(伊默克公司(E.Merck)，德国达姆施塔特)的0.83mLPeek柱。在缓冲于pH 7.2的递增CaCl₂梯度中以1.5mL/min流速分析样品，CaCl₂浓度在35个柱体积内从0mmol/L升到300mmol/L。持续监控260nm和410nm下的吸光度。

用50mL含2.5μL SYBR-Green II的0.8%琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳。样品在100V下运行40分钟。用来自伯乐公司(BioRad)或LTF实验室仪器公司(LTF-Labortechnik公司，德国瓦瑟堡)的市售设备分析凝胶。

SDS定量：按适用于96孔分光计的Rusconi等的改良方法(Rusconi等，Anal.Biochem.,2001,295(1),31-37)来通过紫外/可见光谱测定残留SDS浓度。该试验基于羰花青染料“全染剂(Stains All)”(4,5,4’,5’-二苯并-3,3’-二乙基-9-甲基硫杂羰花青溴)与SDS的特异性反应，该反应导致形成黄色(最大吸光值在438nm)。由于SDS在本实施例中用作十二烷基硫酸根离子源，应理解溶液中的SDS量(摩尔浓度)等于溶液中存在的十二烷基硫酸根离子量(摩尔浓度)。

将1mL染料母液(含1.0mg“全染剂”的1.0mL 50%异丙醇)用1.0mL甲酰胺和18mL水稀释得到该染料的即用型溶液。为测定样品中的SDS量，将5μL液体样品放入微孔板内，和100μL即用型溶液混合，并在室温避光孵育5分钟然后在438nm下读板。通过与校正曲线比较得到样品中的SDS量，所述校正曲线通过记录SDS浓度分别为250、167、111、74、49、32和21μmol/L的溶液在438nm下的吸光度来建立。

电导率测量：为确定样品中的离子强度，用Consort C831电导计(LTF实验室仪器公司，德国瓦瑟堡)进行电导率测量，校正至20°C。测量所需最小体积为2mL，因此在测量前用1980μL水稀释各样品的20μL各等分样品。

PCR扩增:实时PCR(qRT-PCR)试验在Rotor-Gene 2000或3000循环仪(Corbett公司，澳大利亚悉尼)以50μL规模进行，或在TaqMan 7700分析仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，美国加利福尼亚州福斯特城)上进行。

就jun RT-PCR试验而言，联用来自应用生物系统公司的2x TaqMan PCR通用预混试剂和来自应用生物系统公司(德国达姆施塔特)基于引物/探针系统(FAM)的市售试剂盒(产品号:4327113F)，其中包括20x Jun PCR引物/探针混合物。

基因组DNA标准纯化自大鼠尾部，在QIA-symphony平台(凯杰公司，德国希尔登)上使用QIAsymphony DNA试剂盒，并通过后续的阴离子交换色谱(AEX)用QIAGENtip 2500按生产商方案(凯杰公司，德国希尔登)来进一步纯化。gDNA等分存放于–20°C，并在临用前解冻。

实施例1：用不同缓冲液、不同pH裂解猪肝组织

制备以下组成的裂解缓冲液：缓冲液A：100mmol/L TRIS、5mmol/LEDTA、100mmol/L MgSO₄和100mmol/L SDS，通过添加H₂SO₄调节pH至6.0；参比缓冲液B：100mmol/L TRIS、5mmol/L EDTA、100mmol/L MgSO₄和100mmol/L SDS，通过添加H₂SO₄调节pH至8.0；待用于本发明的裂解缓冲液（缓冲液C）：TRIS 25mmol/L、SDS 25mmol/L，通过添加H₂SO₄(25%v/v)调节pH至8.5。所有缓冲液组合物制备为水溶液。参比缓冲液组合物A和B是基于常用于裂解含细胞材料的标准缓冲液组合物，额外含有Mg²⁺离子，据报道在碱性pH和37°C以上温度降解RNA (N.G.AbouHaidar和I.G.Ivanov Z.Naturforsch.1999,54c,542-548)。将猪肝组织样品(各25mg)分别与500μL参比缓冲液A、参比缓冲液B和本发明所述缓冲液在56°C下一起孵育。为帮助消耗蛋白质，向各样品溶液中添加10μLQIAGEN蛋白水解酶K(2.5AU/ml)(凯杰公司，德国希尔登)。尽管使用参比溶液B和缓冲液C时，猪肝组织的裂解通常在40分钟内已完成，但使用参比缓冲液A时，即使孵育2小时后仍有残留组织碎片。因此未能证实AbouHaidar等所述的结果。

参比实施例2：用参比缓冲液B实现裂解物的十二烷基硫酸根离子沉淀

尽管本领域已知十二烷基硫酸酯的钾盐在酸性或近中性pH下溶解度很低，最初尝试通过添加钾离子来用参比缓冲液B实现裂解物中十二烷基硫酸根离子的沉淀。为了在沉淀十二烷基硫酸根离子并随后去除所形成的沉淀物后将裂解物直接用于PCR反应中，向裂解物中添加碱性钾盐以沉淀十二烷基硫酸根离子，因为PCR反应通常需要pH为约8～9。

在第一个实验中45μL的0.25M KOH水溶液加入裂解液（500μL）。通过在HERAEUS Biofuge中20,000x g离心5分钟来移除沉淀。通过凝胶电泳在琼脂糖凝胶上分析等分上清。发现所述上清中的基因组DNA被完全降解，这很可能是由于添加氢氧化钾后样品中发现的强碱性pH。在裂解物中加入增加量的KOH水溶液的滴度实验显示KDS在pH 10.9时开始沉淀，但甚至pH 12下溶解的SDS和其镁盐仍存在于样品内。因此，KOH不能用于从含基因组DNA的裂解物中沉淀十二烷基硫酸根离子而同时不降解该基因组DNA。

为此，测试碳酸钾(K₂CO₃)和碳酸氢钾(KHCO₃)作为替代的碱性钾离子源。将20mg猪肝组织样品悬浮于500μL参比缓冲液B(pH 8.0)中并在56°C孵育30分钟。为从裂解物中沉淀十二烷基硫酸根离子，分别向两种样品中添加每个样品140μL的0.25M K₂CO₃水溶液和每个样品350μL的0.25M KHCO₃水溶液。所有样品在冰浴中孵育5分钟。尽管添加KHCO₃不显著改变裂解物的pH，观察到添加K₂CO₃后pH稍有提高。为此，对K₂CO₃处理的样品添加3μL 2%HCl(水溶液)进行中和。所有样品离心以去除沉淀，在琼脂糖凝胶上分析等分上清液(4μL)。作为阳性对照的DNA在QIAsymphony平台(凯杰公司，德国希尔登)上按QIAsymphony DNA手册05/2008纯化自用参比缓冲液B所裂解的另两种猪肝组织，采用基于磁性颗粒的结合-清洗-洗脱概念，包括RNA酶处理。

电泳凝胶见图1所示。将Gibco 1kb Plus DNA梯度(英杰公司，德国卡尔斯鲁厄)用作长度标准以鉴定存在于样品中的片段大小(泳道1)。泳道2和3中分析用QIAsymphony平台纯化的裂解物。这些样品中，主要测得良好品质的gDNA，而有大量核糖体RA(rRA)存在于经K₂CO₃(泳道4和5)与KHCO₃(泳道6和7)处理的样品中。样品中rRNA的存在出乎意料，因为根据AbouHaidar所述，pH 8.0下联用TRIS缓冲液和镁离子在30分钟裂解时间内所述rRA应当已被水解。

在另一实验中，测定所述裂解缓冲液的最佳组合物以及使用该裂解缓冲液裂解和同时分解该裂解物中存在的RA的标准最佳条件。最优缓冲液组合物应包含TRIS和SDS，两者浓度都是25mmol/L，通过添加硫酸将缓冲溶液的pH调节到pH 8.5，但该缓冲液中应不含Mg²⁺离子和EDTA。缓冲液中可添加蛋白酶如QIAGEN蛋白酶或QIAGEN蛋白水解酶K(10μL；2.5AU/ml)，优选在组织材料重悬以后添加，以帮助蛋白质分解。裂解优选在62°C进行30分钟。除非另有说明，如下使用这些裂解条件。

实施例3：用锶离子从裂解物中沉淀十二烷基硫酸根离子

不同量的0.5M SrCl₂水溶液(分别为25μL和50μL)加入获自10mg组织裂解的裂解物，所述裂解是通过在含浓度均为25mmol/L的TRIS和SDS并通过添加H₂SO₄调节pH到8.5的裂解缓冲液C中孵育所述样品。添加所述沉淀溶液后，混合物在室温或冰浴（约0°C）中孵育10分钟。然后分别通过在填充有600μL GE医疗保健公司S1000SF树脂（GE医疗保健公司，德国弗莱堡）短凝胶过滤柱上离心或过滤移除形成的沉淀。

结果如图2A（左手边）和2B（右手边）所示：图2A显示离心（离心(centrif)）和凝胶过滤色谱（过滤(filt)）后上清/洗脱液中分别存在的SDS残余量[μmol/L]。可观察到凝胶过滤色谱在从所述溶液中移除SDS方面比离心更有效。样品冰浴孵育时发现洗脱液中有最低量的残余SDS。在该情况中，将加入所述裂解液的沉淀溶液加倍时没有观察涉及纯化后洗脱液中检测残余SDS量方面的优势。图2B可以看出，氯化锶对沉淀残余蛋白也有效。为了确保通过沉淀溶液进行低样品稀释，所述沉淀溶液中的SrCl₂浓度调整为1.0M，且10μL该沉淀溶液足以影响从用80μL裂解缓冲液C孵育10mg组织所得裂解物中沉淀出十二烷基硫酸根离子和残留蛋白质。

实施例4：优化用于从裂解液纯化gDNA的离心柱

实施例3显示过滤在移除添加SrCl₂溶液后形成的沉淀方面比简单离心更有效。因此，凝胶过滤色谱所需的树脂的最小量用GE-医疗保健公司S1000SF基质测定。结果与其他过滤方法作比较，具体为通过下述的过滤：QIA粉碎柱（凯杰公司，德国海尔登）、硅料（材料编号：1016844，凯杰公司，德国海尔登）、硅颗粒床（QiaExII，凯杰公司，德国海尔登）、通过0.2μm膜MiniSart滤器的无菌过滤(德国哥廷根的萨托瑞斯公司)和市售可得的G25离心柱(GE-医疗保健公司)。

将10μL 1M SrCl₂-溶液加入80μL如实施例3所述获得的裂解物。混合物在冰浴中孵育，然后应用于不同过滤装置。用离心经过滤装置移出移动相，然后收集并分析所获洗脱液。各实验一式两份地进行。对各洗脱液，如通用方法所述测定存在的纯化gDNA含量。根据通用方法所述的方案通过紫外/可见光谱测定SDS含量。此外，通过通用方法的电导率测量法测定洗脱液中离子的存在。结果见图3。gDNA含量以μg计，SDS含量以μmol/L计且20μL洗脱液用1.980μL水稀释后的电导率以μS计。

如图3所示，传统料QIA粉碎柱和MiniSart滤器在移除SDS或其他盐上无效。市售G25离心柱能移除样品中存在的约2/3的SDS，然而，洗脱液中的残余SDS量仍太高而不能在后续PCR反应中直接使用该洗脱液。此外，用QIA粉碎柱和MiniSart滤器获得的洗脱液显示黄色。

使用S1000树脂，400μL或更少的树脂含量不足以用固定角度转子在离心期间形成均匀的凝胶床。确保柱高2.5cm、内径0.8-0.9cm的离心柱中形成均匀凝胶床所需的最小树脂量为600μL。

用离心柱的凝胶过滤色谱中常见的问题是所述裂解物可能进入所述离心柱的内壁，穿过玻璃料、滤器、毛网或膜而不进入所述凝胶床。当大样品体积应用于柱或当所述样品没有严格应用于所述凝胶床的中央时，则尤其如此。结果，污染物未从这些样品中移除。通过引入位于多孔料、滤器、毛网或膜与基质之间的无孔环，密封所述玻璃料、滤器、毛网或膜的外部区域，以阻止移动相进入所述玻璃料、滤器、毛网或膜而不穿过基质，从而克服上述问题。

下一步骤中测定基质床的最优尺寸排阻限度。如上所述向离心柱中填入600μL不同的市售凝胶过滤基质(含有球形烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺基质的Sephacryl树脂)，柱内配有致密二氧化硅玻璃料(基质编号1017499,凯杰公司，德国希尔登)、塑料环和螺帽。表1给出所用树脂的尺寸排阻限度(分别以碱基对(bp)，或kDa表示)。

表1

树脂	尺寸排阻限度
		S-200HR	30bp(5-250kDa)
S-300HR	118bp(10-1500kDa)
		S-400HR	271bp(20-8000kDa)
S-500HR	1078bp(ND)
		S-1000SF	20000bp(ND)

所有树脂于使用前在水中平衡：将10mL树脂与40mL水混合，使树脂沉降，直至获得10mL沉降物，弃去上清(水)。该过程重复三次。最终，通过加水将悬浮树脂的体积调整至10mL。通过在700x g持续3分钟的预离心步骤(预离心)建立凝胶床以使柱备用。将如上所述获自10mg组织的全部裂解物(包括沉淀物)施加到各柱的凝胶床上表面中心。然后通过700x g离心3分钟洗脱DNA。各试验进行至少两次。如上所述测定存在于洗脱液中的gDNA和SDS含量。合并同一树脂纯化的所有样品，用合并样品的经稀释溶液测定样品的电导率。结果见图4。与前文讨论的过滤方法相比，所有树脂都适于显著减少样品中的SDS和其它离子含量。根据Goldenberger等，(D.Goldenberger等，Genome Res.1995,4,368-370)所述，样品中SDS浓度超过345μmol/L会完全抑制PCR反应。对于实时PCR反应，可容许的最大SDS含量约为250μmol/L。采用S400HR树脂能从样品中完全去除SDS。还证明该树脂有助于去除残留的RNA小片段。

实施例5：洗脱液的PAGE分析

为评估纯化过程中蛋白质的去除程度，并确定凝胶过滤色谱后所得洗脱液中存在的蛋白质残留量，在含SDS的市售TRIS/HEPES 4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶(LTF-LABORTECHNIK)上通过PAGE分析按实施例4所述用S400HR树脂所纯化的样品。用NOVEX XCell系统(英杰公司，德国卡尔斯鲁厄)将凝胶在所提供的TRIS/HEPES缓冲液中以100V运行25分钟。将掺有蛋白质大小标记的15μL样品用15μL随凝胶提供的2X缓冲液稀释。混合物加热至95°C持续5分钟，然后在冰浴中冷却，此后上样至凝胶袋内。凝胶通过在Gradipure染液(Gradipore公司，澳大利亚悉尼)中浸没过夜来染色，然后用水淋洗。结果见图5。名为“L”的泳道是SeaBlue蛋白标准品，获自英杰公司(德国卡尔斯鲁厄)。泳道1中，分析用所述裂解缓冲液从10mg猪肝组织获得的15μL粗裂解物。泳道2中，分析添加本发明所述沉淀溶液后的15μL相同裂解物(未经过滤步骤)。为了比较，在泳道3中，分析用QIAamp试剂盒获得且经过15μL RNA酶A处理的15μL裂解物。在泳道4中，分析用QIAamp试剂盒获得但未添加RNA酶的15μL裂解物。为了比较，分别在泳道5和6中分析QIAGEN蛋白酶和RNA酶A。7～9各泳道中，分析了通过本发明所述凝胶过滤色谱纯化后所得洗脱液的20μL等分样(共获得100μL洗脱液)。在10和11泳道中，分析用QIAamp试剂盒所得洗脱液的20μL等分样（总计获得400μL洗脱液）。可见通过添加氯化锶已将大量蛋白质与SDS一起共沉淀。剩余量的蛋白质可通过凝胶过滤色谱来有效去除，用本发明方法所得结果与使用市售QIAamp试剂盒所得结果相当，特别是在注意到QIAamp试剂盒所得洗脱液的稀释度高达4倍的情况下。用肺样品和小鼠尾部所得的结果相当(数据未显示)。

实施例6：洗脱液的AEX-HPLC分析

为检测微量的残留污染物例如蛋白质和RNA片段，在TMAE-Fractogel SHPLC柱上用CaCl₂梯度于pH 7.2以1.5mL/min流速进行阴离子交换(AEX)HPLC分析。在含5%TRIS(pH 7.2)的水溶液中建立跨35个柱体积的0mmol/L～300mmol/L CaCl₂的梯度。所用进样体积为200μL。

在初始实验中，分析没有RNA酶时用上述缓冲液孵育10mg猪肝组织所得的200μL粗裂解物。从HPLC采集7个组分，按常规方法与全染剂染料反应，随后在琼脂糖凝胶上分析。HPLC色谱图和琼脂糖凝胶的图片见图6所示。

组分1和2不与该染料反应，表明SDS和核酸的浓度低于21μmol/L SDS的检测限。组分3和4在添加染料后显示蓝色，表明存在不能用SYBR-Green II在琼脂糖凝胶上染色的核苷酸或可溶蛋白质。组分5和6在RNA典型性电导率下洗脱，并在琼脂糖凝胶中给出小于100bp的微弱核酸条带，而组分7含有基因组DNA。

在进一步实验中，通过HPLC分析比较用本发明方法纯化的样品和用市售QIAamp试剂盒纯化的样品。为确定基因组DNA的含量，利用校正曲线来关联gDNA洗脱峰的曲线下面积和柱上所加载的gDNA量，所述校正曲线采用了递增量基因组大肠杆菌(E.coli)DNA，该DNA由阴离子交换色谱纯化。图7中显示用本发明所纯化样品(a)与用QIAamp试剂盒所纯化样品(b)的重叠色谱图，两个色谱图均在波长260nm下监测。从根据本发明所纯化50μL洗脱液得到的得率(图7中迹线a)显著高于从使用QIAamp试剂盒所得200μL gDNA中得到的gDNA量。(用于比较，图7中的迹线a和b相对某一共同进样体积标准化。)这表明用本发明所述纯化方法可获得洗脱物中的高浓度gDNA。通过对HPLC色谱图中相应峰的积分来测定，两种样品中的残留蛋白质和其它杂质的含量相当。用校正曲线来测定，按本发明所述纯化的样品中存在的gDNA量为9.2μg，而通过使用QIAamp试剂盒所得的gDNA量为6.2μg。

实施例7：用紫外/可见光谱测定洗脱液中gDNA的得率和纯度

根据本发明所述方法裂解并纯化12个10mg猪肝的样品，凝胶过滤步骤中用水为洗脱剂，并与用QIAamp柱和相同洗脱剂所纯化的6个10mg猪肝样品作比较。结果见图8，支持HPLC分析所得结果。在gDNA有最大吸光值的波长260nm处，用本发明所述方法所纯化样品中的吸光值总是高于QIAamp所纯化样品。此外，在QIAamp所纯化样品的光谱中的基线高于本发明方法所纯化样品的光谱中的基线，这可能表明QIAamp样品中的残留固体颗粒含量较高。

实施例8：所纯化大鼠尾部gDNA的RT-PCR分析

为确保按本发明所述纯化的样品中没有PCR抑制剂，按上文详述的本发明方法裂解和纯化20mg大鼠尾部。然后在Rotorgene系统(Corbett公司，澳大利亚悉尼)上采用jun-系统以实时PCR(RT-PCR)方式分析这些纯化的样品并和用AEX色谱所得gDNA获得的结果作比较。联用来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的2x TaqMan PCR通用预混试剂和市售的引物/探针系统(FAM-TAMRA,应用生物系统公司，德国达姆施塔特)，该系统中包括20xjunPCR引物/探针混合物。根据生产商的说明书进行RT-PCR。具体地，通过将混合物95°C加热20分钟进行聚合酶活化，通过双链体在95°C解链15秒并在60°C退火60秒钟来进行循环。共进行40个循环。反应混合物由22.5μL含gDNA样品，25μL预混试剂和2.5μL引物混合物组成。本发明所述裂解和纯化方法所得样品以未稀释形式和用水稀释(稀释因子10、100和1000)后在PCR中用作模板。尽管未稀释样品(图9中曲线1)由于样品中的高浓度gDNA而显示相当强的产物抑制，本发明所述方法裂解和纯化的所有样品的序列都能扩增，无论稀释因子的高低。用水稀释10倍的样品(曲线2)仅显示弱抑制。扩增前分别稀释100倍或1000倍的样品(曲线3和4)的样品中未见抑制。为了比较，还进行没有靶标的反应(无靶标反应，NTC)，并在相同条件下扩增通过AEX色谱纯化的3个样品。

与用QIAamp试剂盒裂解和纯化的样品相比，用源自10mg冷冻肝组织按本发明所述裂解和纯化的样品获得类似结果。图10显示用不同稀释度的纯化样品的jun试验中，这些样品的RT-PCR所得CT值的比较。用本发明所纯化的未稀释样品的反应中再次观察到产物抑制。按本发明所纯化样品分别稀释10倍、100倍和1000倍所得的CT值始终低于用QIAamp纯化样品所得CT值，表明按本发明所纯化样品中存在更高含量的gDNA。

还用按上述裂解然后通过沉淀去除SDS但未用凝胶过滤步骤进一步纯化所得样品进行jun试验。该试验中，未稀释、2-4-和8-倍稀释液有完全抑制。但是能从16倍稀释溶液进行扩增。

实施例9：比较用本发明所述方法和用QIAamp试剂盒从不同组织样品获得gDNA的得率

表2中所列不同组织的样品按上述裂解并随后通过添加锶离子来从裂解物中沉淀出SDS，或者按QIAamp方案裂解所述样品。裂解(以及本发明情形中的沉淀)后，合并以相同纯化方法获自同类组织的样品，然后分成各100μL的等分样。将这些等分样分别按本发明所述方法或按QIAamp方案纯化。用紫外/可见光谱和/或HPLC分析来分析样品中存在的gDNA含量。所得平均结果见表2。

表2

实施例10：裂解和纯化人血样品

由于血液样品的高液体含量，细胞裂解使用两倍浓缩的裂解缓冲液(2X)，该缓冲液含50mmol/L TRIS与50mmol/L SDS，通过添加H₂SO₄调至pH 8.5。将来自同一供体的2个40μL人血样品与等量2X裂解缓冲液混合。然后通过添加10μLQIAGEN蛋白酶(2.5AU/ml)来消耗血蛋白。样品在62°C孵育10分钟。如上所述通过沉淀从裂解物去除SDS，并用上述离心柱通过凝胶过滤色谱纯化样品。然后在琼脂糖凝胶上分析5μL和10μL的等分样(图11)。分析的所有样品中都可见gDNA条带，且没有可测的较短片段。

用18S gDNA引物定量分析样品中存在的gDNA量显示样品中平均得率为600ng gDNA(对两种样品，各进行两次RT-PCR，gDNA含量确定为所有4次实验的平均值)。

实施例11：不同动物组织样品的RT-PCR

从大鼠肝、肾和脾组织用本发明方法裂解和纯化获得或用市售DNeasy试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)按DNeasy方案获得的50ng纯化gDNA(由紫外/可见光谱估测)用作RT-PCR的靶标。使用新鲜和冷冻的组织样品，以及稳定在市售RNAlater试剂(凯杰公司，德国希尔登)中的样品。然后于TAQman系统上在基于SYBR-Green的RT-PCR反应中分析样品。如图12可见，两种方法在RT-PCR反应中所得CT值相当，无论所分析的样品类型如何(分别为新鲜、冷冻和稳定于RNAlater中)。调至pH 9.0的含有10mmol/L TRIS/HCl和0.5mmol/L EDTA的缓冲液AE用于按前文所述过程平衡离心柱并用作洗脱剂。

实施例12：从肝和脾样品纯化高分子量gDNA

按本发明所述分别裂解和纯化20mg大鼠的肝和脾组织。裂解在30分钟内完成。各实验一式两份地进行。在PCR反应和在溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶上分析所得裂解物中的gDNA质量(图13)，图中清楚显示高分子量的gDNA条带，即使凝胶过量上样。表3显示样品中存在的gDNA含量以及纯度，纯度用样品在波长260nm下的吸光度与在波长280nm下的吸光度之间的比值来评估。尽管反应条件未最终优化，仍获得大量纯度良好的gDNA。

表3

实施例13：比较不同的柱缓冲液

如上所述裂解各10mg冷冻大鼠肝组织样品。添加沉淀试剂后，所述样品使用上述柱通过凝胶过滤色谱纯化，分别在水和缓冲液AE中平衡。此外，数种样品在双倍浓缩的裂解缓冲液C中裂解并通过凝胶过滤色谱用上述离心柱纯化，在缓冲液AE中平衡。通过凝胶电泳分析所得洗脱液并测定gDNA和SDS含量以及洗脱液的电导率。仅在2个样品中测得SDS。结果见图14。

实施例14：从FFPE组织样品分离和纯化gDNA

裂解来自福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)大鼠肝块的10μm厚样品，并分离与纯化gDNA，采用a)市售QIAamp试剂盒(凯杰公司，德国希尔登)和b)用本发明所述方法。

a)在1mL二甲苯中裂解来自FFPE块的3份各10μm切片，涡旋混合10秒钟，全速离心2分钟。抽吸移除上清液。通过向各样品添加1mL EtOH，样品涡旋10秒，全速离心2分钟并去除上清液来萃取残留二甲苯。含有样品的开口管室温孵育20分钟使残留EtOH挥发。所得团块重悬于180μL ATL缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)中。向各样品添加20μL蛋白水解酶K(2.5AU/ml)(凯杰公司，德国希尔登)，涡旋混合样品。将样品在56°C孵育1小时，然后在90°C孵育1小时。样品冷至室温，然后向各样品添加1μL RNA酶A(10U/ml)(凯杰公司，德国希尔登)。向各裂解物添加200μL AL缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)，涡旋充分混合样品。然后添加200μL EtOH，再次涡旋样品。将裂解物转至QIAamp MinElute柱(凯杰公司，德国希尔登)并在6000x g离心1分钟。将QIAamp MinElute柱放入洁净的2mL收集管并弃去流出液。打开柱并用500μL AW1缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)洗涤且在6000x g离心1分钟。将QIAamp MinElute柱放入洁净的2mL收集管并弃去流出液。再次打开柱并用500μL AW2缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)洗涤且在6000x g离心1分钟。将QIAamp MinElute柱放入洁净的2mL收集管并弃去流出液。将膜全速离心3分钟以去除痕量的缓冲液。在洁净的1.5ml微量离心管中用100μl不含RNA酶的水室温孵育1分钟然后全速离心1分钟来完成gDNA的洗脱。

b)将各10μm厚的3份FFPE块切片在80μL裂解缓冲液C(25mmol/lTris/H₂SO₄,25mmol/L SDS,pH 8.5)中裂解，该缓冲液中补充有10μL QIAGEN蛋白酶(2.5AU/ml)(德国希尔敦)和1μL RA酶A(7000U/ml)。涡旋混合样品。将3个样品62°C孵育30分钟，然后90°C孵育1小时，而另3个样品56°C孵育1小时，然后90°C孵育1小时。向各样品添加10μL沉淀溶液(1mol/LSrCl₂)，然后涡旋混合样品，并在冰上孵育10分钟。然后各样品转移到本发明的预旋转离心柱上（“一步式柱”），所述柱在700x g离心3分钟，同时收集含gDNA的洗脱液。

为评估所得gDNA的量和品质，在TAQman系统上进行基于SYBR Green的RT-PCR，用18S rRNA的编码基因作为靶标。结果见图15和16。尽管两种方法的RT-PCR所得CT值相当(用本发明所纯化样品的CT值略低)，用本发明所述方法所得gDNA的量约为用市售试剂盒所得gDNA的量的约1.5-约几乎2倍。由图21可见，裂解时间延长至1小时对由FFPE样品获得gDNA的得率产生有利影响。

Claims (11)

1.从含阴离子表面活性剂离子源和核酸的液体样品中选择性沉淀阴离子表面活性剂离子的方法，所述方法包括步骤：

1.向液体样品中添加溶液(沉淀溶液)，所述溶液包含碱金属的单价离子和/或碱土金属的二价离子，所述离子选自下组：Rb⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺或其混合物，和

2.任选孵育含有所述样品和所述沉淀溶液的混合物以确保沉淀形成的完全性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀溶液中单价或二价金属离子的浓度范围是0.1～10mol/L，优选0.5～5mol/L，更优选0.75～2.5mol/L，最优选0.9～1.2mol/L。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述液体样品与沉淀溶液的体积比范围为4:1～12:1，优选5:1～11:1，更优选6:1～10:1，且最优选7:1～9:1。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合物在–10°C～10°C孵育，优选–5°C～5°C，更优选–2.5°C～2.5°C，最优选–1°C～1°C。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合物孵育3-60分钟，优选5-30分钟，最优选约10分钟。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括除去沉淀的步骤，优选通过过滤，更优选通过凝胶过滤色谱。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述液体样品是通过用裂解缓冲液处理而获自含细胞生物样品的裂解物，所述裂解缓冲液含十二烷基硫酸根离子(DS^-)来源。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含细胞的生物样品选自新鲜或冷冻的组织、血液和革兰氏阴性菌。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述组织是哺乳动物组织，优选人的组织。

10.碱金属单价离子和/或碱土金属二价离子在从含表面活性剂离子和核酸的溶液中选择性沉淀表面活性剂离子的用途，所述碱金属单价离子和/或碱土金属二价离子选自下组Rb⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺或其混合物，优选由其组成。

11.一种用于分离和纯化DNA，优选基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒包含：

1.碱土金属单价离子和/或碱土金属二价离子的离子源，所述离子选自下组Rb⁺、Cs⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺或其混合物，优选由其组成，所述离子源的形式是待用户溶解的水溶性碱土金属盐，或是待用户稀释的母液或是即用型溶液，

和一种或多种选自下组的组分：

2.含阴离子表面活性剂的裂解缓冲液，所述表面活性剂优选SDS，

3.用于凝胶过滤色谱的色谱设备，和

4.任选的引物，所述引物用于直接扩增一种或多种靶核酸。

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