JPS6133805B2

JPS6133805B2 -

Info

Publication number: JPS6133805B2
Application number: JP52044593A
Authority: JP
Inventors: Kurausu Bonhaato Dokutaa; Boizen Ue; Hansu Shuroisunaa Dokutaa
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Priority date: 1976-04-23
Filing date: 1977-04-20
Publication date: 1986-08-04
Also published as: GB1576752A; CH638401A5; JPS52154515A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は赤血球ないしヘモグロビンの溶液に比
べて酸素放出を強化した静脈内注射に適したヘモ
グロビン製剤に関する。ヘモグロビン（Hb）の酸素半飽和圧はP₅₀値と
呼ばれ、完全な赤血球においては公知のとおり27
トールである。このような酸素放出能については
赤血球内のPH値7.25のほかにとくに２・３ジホス
グリセラート（DPG）の含有量が関与してい
る。溶解ヘモグロビンないしその誘導体に基く注
入用製剤すべてにとつては血漿の約7.4のPH値が
決定的である。これらは強制的にこれらの条件の
下で酸素を運ばねばならないからである。すでに
この事実が、P₅₀値が有利な場合約24トールに低
下するのに応じて酸素固定曲線を左へ移行させ
る。しかしこの種のヘモグロビン溶液が初めて浸
入すると、ただちに解離平衡において固定されて
いない２・３ジホスグリセラートがその分子の大
きさが小さいため腎臓を通つて排泄される。
DPGはHbに塩のように結合しており、対応して
急速に解離して短時間后には血行中に溶解遊離し
ているHbがすべてDPGから分離されるようにな
る。その結果P₅₀値は15ないし17トールに低下す
る。これよりP₅₀値が高くなることは製剤の酸素
放出能が高くなつていることを示唆する。組織の
酸素供給のため容易に酸素を放出するヘモグロビ
ン製剤は従来見出だされていない。５−燐酸ピリ
ドキサール（第１図）も優先的にDPGと同じ位
置でHb−分子に結合するが、意外なことにDPG
よりは著しく強固にヘモグロビンに結合している
ことは公知である。カラカスにおける1969年汎米
ヘモグロビン・シンポジウムの報告「ヘモグロ
ビンの発生的、機能的及び物理的研究」第134な
いし142頁（バーゼル市カルカ社1971年刊）にア
ール・エー・ベンシユ、アール・ベンシユ、ア
ー・ベンク、アール・レンタール及びベー・アー
ブライが記述したヘモグロビンと燐酸ピリドキサ
ールとのモデル製剤は発熱性の反応を惹き起こす
ので注入用溶液としては使用できない。今回意外にも、赤血球に比べて酸素放出が強化
された静脈内注射に適したヘモグロビン製剤でヘ
モグロビンと燐酸ピリドキサールとの縮合生成物
からなり発熱性の反応を起こさせないものが製造
できることが見出だされた。この種の製剤はその
酸素親和力が有利なため治療用に静脈内に応用で
きる。この縮合生成物中には燐酸ピリドキサール
がヘモグロビンに統計的に分布しているヘモグロ
ビン・テトラマが存在している。この製剤はPH値
7.4においてさえP₅₀値が32トールである。この種
の製剤の血行中の滞留時間は約２時間である。発
熱性がなく、血行中において優れた酸素供与体と
して有効なこの種の注射液（Hb／PP）はアー
ル・エー・ベンシユ及びアール・ベンシユのヘモ
グロビン回収法（米国科学アカデミー紀要第59巻
第526ないし532頁（1968年））から離れて下記の
ような本願第１発明の製造方法によつて得られ
る。即ち、本願第１発明は、赤血球ないしヘモグロ
ビンの溶液に比べて酸素放出を強化した静脈内注
射に適したヘモグロビン製剤の製法において、ヒ
トの赤血球を弱アルカリ性洗液で数回処理し、次
に溶血させH⁺型カチオン交換体を用いPH値が5.0
ないし5.5に下がるまで処理をし、次に樹脂及び
沈降した基質塊を除去し、約５％ないし９％のヘ
モグロビン濃度まで水で稀釈し、PH値を７ないし
９に調整し、容器内の酸素を置換し、５ないし９
％のヘモグロビン溶液１あたり0.25ないし1.25
ｇの５−燐酸ピリドキサールを添加することを特
徴とする。本願第１発明の実施例を説明すれば、まずヒト
の赤血球を10℃ないし15℃において５分ないし15
分間β−プロピオラクトンの稀釈溶液で処理し、
その際β−プロピオラクトン（β−Pl）の比率は
赤血球沈降物１あたり４ないし12ｇとし、続い
て過剰のβ−Plとその反応生成物とを弱アルカリ
性溶液で洗い去り、赤血球沈降物１あたり１な
いし２の注射用水に撹拌混入して溶血させる。
しかしこの前処理は所望の製剤を得るために強制
的に必要ではなく、単純な洗浄処理の反復でも足
りる。得られた溶血体は次にH⁺型のカチオン交
換体でPH値が5.0ないし5.5に下るまで処理し、場
合によつては１規定水酸化ナトリウム溶液で調整
してPH値が5.5ないし5.7において冷却遠心分離に
より樹脂及び沈降した基質塊を除去する。注射用
水で稀釈してヘモグロビン濃度を５％ないし９％
としまた１規定水酸化ナトリウム溶液でPH基を７
ないし９に調整する。電解質は対応の塩を添加し
て補足して血漿に類似の濃度とし、１あたり22
ｇのグルコースモノヒドラートを添加し、場合に
よつては今一度冷却遠心分離によつて清澄にし、
続いて閉鎖容器内で20トールの真空下において10
分間撹拌し、反応混合物を純窒素ガス雰囲気下に
もたらし30ないし60秒間これですすぎ、５％ない
し９％ヘモグロビン溶液１あたり0.25ｇないし
1.25ｇの５−燐酸ピリドキサールモノヒドラート
を添加し、窒素雰囲気下で１時間室温においてさ
らに撹拌する。次に20℃のPH値が7.6に達するま
で１規定水酸化ナトリウム溶液を滴加する。最后
にこの溶液を300ml又は500mlの注射単位で滅菌
過する。添附図面の第２図はこの種の製剤（スフアデツ
クスＧ−150）のカラム・クロマトグラム（90×
1.5cm、送入量0.3ml〕を示す。 PH値7.45における本発明の製剤のP₅₀値は30な
いし40トールであり、従つて赤血球中のヘモグロ
ビンのP₅₀値を著しく超える。さらに本願第２発明の製造方法によれば、ヘモ
グロビンに燐酸ピリドキサールを結合させて組織
への酸素放出が改善され、血中滞留時間が約２時
間であるこの種の分子をさらに改質してそれらの
治療上の機能を維持しながら少なくとも２倍の時
間血行中で有効のままでいることが達成されるこ
とが見出だされた。即ち、本願第２発明は、前記
第１発明の処理に加えて、続いて該溶液を水素化
ホウ素で処理し、更にジアルデヒドで処理し、か
くして該赤血球中のヘモグロビン分子をクロスリ
ンクし、次にクロスリンクしていないヘモグロビ
ンを所望のクロスリンクしたヘモグロビンの残り
の溶液から分離することを特徴とする。本願第２発明の実施例を説明すれば、まずヒト
の赤血球を弱アルカリ性洗液で数回とくに少なく
とも４回処理し次に溶血させ、H⁺型のカチオン
交換体でPH値が5.0ないし5.5に下るまで処理し、
次に冷却遠心分離により樹脂及び沈降した基質塊
を除き、水で稀釈して所望の５％ないし９％のヘ
モグロビン濃度とし、１規定水酸化ナトリウム溶
液でPH値を７ないし９に調整し、次に20トールの
真空下において10分間撹拌した后窒素を送入しな
がら容器内の酸素が純窒素で置換されるまで撹拌
し、５％ないし９％ヘモグロビン溶液１あたり
５−燐酸ピリドキサール0.25ｇないし1.25ｇを添
加し、窒素気中で１時間室温においてさらに撹拌
し、続いて燐酸ピリドキサールに対して５ないし
10倍のモル量の水硼化ナトリウムとともにさらに
20分間室温において撹拌した后再び真空にし、ヘ
モグロビンに対して９倍のモル量のジアルデヒド
を添加し、45分間窒素気中で撹拌し、次に網状構
造となつていないヘモグロビンを塩析又は限外
過により分離し、富化した網状構造の製剤は１規
定水酸化ナトリウム溶液で20℃のPH値を7.6に調
整し、対応した塩の添加により血漿類似の濃度に
補足し、１あたり22ｇのグルコースモノヒドラ
ートを添加し滅菌過する。この場合網状構造と
なつていないヘモグロビンを除くために二つの方
法がある。 (1) 網状構造になつていないヘモグロビンの塩析
のためヘモグロビン製剤の0.8ないし1.0倍の容
積の４モル硫酸アンモニウム溶液を撹拌しなが
ら漸次混入する。遠心分離した沈澱は水に溶か
し0.5％食塩水に対して透析して硫酸アンモニ
ウム及びすべての過剰な化学助剤を除く、最后
の痕跡は混床交換体によつて除く。 (2) 中空繊維カートリツジ（製作者：米国マサチ
ユセツツ州レキシントン市ホストウエル・アベ
ニユ21、アミコンコーポレーシヨン）HIP100
にヘモグロビン製剤を通す。限外過により、
網状構造になつていないヘモグロビンは優先的
に絞り取られ、非過分の含有量は減少する。この方法では燐酸ピリドキサールをまずヘモグ
ロビンに作用させ、生成したアゾメチン−
（Schiff塩基）を続いて水硼化ナトリウムからの
発生期の水素により還元して第２アミン結合とす
る。続いて一般式Ｏ＝CH−（CH₂）ｎ−CH＝Ｏ
ｎ＝１〜６のジアルデヒドを上記の分子に作用さ
せる。これによつて改質ヘモグロビン分子が相互
結合してより大きな構造となることが達成され
る。本発明によるとこの処理にはジアルデヒドとく
に一般式OCH−（CH₂）_o−CHOただしｎは１〜６
の価を意味するものに相当するマロンジアルデヒ
ド、スクシンジアルデヒド、グルタールジアルデ
ヒド、アジピンジアルデヒド、スベルジアルデヒ
ドなど炭素原子数３〜８の直鎖のものが適してい
る。添付図面第３図のこの方法の生成物（Hb／
PP）ｍはＡ＝高度に網状構造のピリドキサール
化したヘモグロビン（ｍ＞３）、Ｂ＝オリゴマ状
に網状構造のピリドキサール化したヘモグロビン
（ｍ＝２−３）、Ｃ＝網状構造となつていないピリ
ドキサール化したヘモグロビン（ｍ＝１）からな
る。原料としてはすでに期限経過した血液銀行赤血
球が本方法の両変形に使用できる。許容できる発熱性試験のほかに、本発明による
Ｈ／PP製注射製剤はラツトとマウスとで急性毒
性について試験した。その際ラツトの静脈内注射
では体重１Kgあたり８％溶液50mlがなお異常な挙
動なしにまた目だつた徴候なしに耐えられる。マ
ウスが体重Kgあたり100mlの量の静脈内注射にな
お生残つた后、THAERの「実験医薬研究の基
礎」（1965年）によれば、LD₅₀が体重Kgあたり50
mlより大きいこと、またこの物質は“比較的無
害”との評価で格付されるべきことが測定され
た。アール・エー・及びアールベネシユの製品とは
違つて、本発明の製剤ではP₅₀値が一定であるの
で、燐酸ピリドキサールとヘモグロビンのβ−鎖
のＮ末端のバリンのアミノ基とのSchiff塩基結合
は試験管内の透析処理に対して抵抗力があること
が立証された。10℃において0.9％食塩溶液に対
して徹底的な透析が実施されたのである。その結果

【表】これについてはＲ、Ｅ、Beneschほか1971年の
引用文献を参照されたい。 HP／PP製剤は血行の生理的条件下での優れた
効果を動物実験においても示す。この製剤は40ト
ールの通常の静脈酸素分圧でもすでに酸素を組織
に与えるが、溶解遊離したヘモグロビンは病的状
況下で、すなわち静脈酸素分圧が約20トルに下つ
たとき、初めて酸素を放出する（カー・メスナー
ほか発表準備中）本発明の製造方法について以下のより具体的な
実施例によつてさらに説明する。実施例１４週間貯蔵した貯蔵血液（約270ml）の赤血球
沈降物をその容積1/3の容積の・β−プロピオラ
クトンと1.2％含んでいる1.6％食塩溶液とともに
撹拌する。赤血球は０℃で遠心分離し、上澄及び
生成した血小板皮を吸取つた后、冷却遠心分離機
上で下記の溶液を１ないし２倍の容積用いてなお
４回洗浄する。 (1) 重炭酸ナトリウムの3.8％水溶液 (2) 同上 (3) 1.6％の食塩溶液と3.8％の重炭酸ナトリウム
溶液との１：１混合物 (4) 1.6％の食塩溶液溶血のために赤血球の初の容積に相当する量の
注射用水に洗浄ずみ赤血球を撹拌混入しH⁺型の
カチオン交換体たとえばDOWE×50W×８の懸
濁液をPH値が５に下がるまで添加する。続いて１
規定水酸ナトリウム溶液でPH値を5.5ないし5.7に
中和しまた冷却遠心分離及び傾瀉により基質及び
樹脂を分離する。注射用水で上澄をヘモグロビン8.6％に稀釈し
て１規定水酸化ナトリウム溶液でPH値を7.5に調
整し溶液１あたり食塩3.8ｇ、グルコースモノ
ヒドラート22ｇ、塩化カリ0.29ｇ、塩化カルシウ
ム・ジヒドラート0.23ｇ及び硫酸マグネシウム・
七水和物0.25ｇを加える。改めて冷却遠心分離した后傾瀉し、閉鎖容器内
において10分間20トルの真空下で撹拌を行なう。
純窒素ガスを通して最后の酸素を駆出し、続いて
ヘモグロビンがほとんど脱酸型となつているよう
にする。后者は溶液１あたり1.1ｇの５−燐酸
ヒドロキサールモノヒドラート（Hb四量体１モ
ルに対し燐酸ピリドキサールて約3.5モルに相当
する）で化学変化させる。その際予め１あたり
2.12ｇの重炭酸ナトリウムを添加しておき、20℃
において１時間窒素気中で撹拌する。次に１規定水酸化ナトリウム溶液でPH値を7.6
（20℃において）に仕上調整し滅菌過する。収量：Hb8％溶液約400ml、PH7.45における値：32トール実施例２六つの貯蔵血液（約1.5）の赤血球沈降物を
合せ、実施例第１により処理し、ただし５分間
2.0％β−プロピオラクトン／1.6％食塩溶液で処
理する。溶血は赤血球容積の２倍約３の注射用
水で行なう。稀釈に適合させて溶液１あたり0.82ｇの燐酸
ピリドキサール・モノヒドラートを添加するがそ
れに先立つ１規定水酸化ナトリウム溶液によるPH
調整は実施例第11とは違つて9.0にし、窒素気中
の撹拌時間は２時間である。再び同様の処理をした結果、Hb6％のHb／PP
溶液４が得られ、P₅₀値は32トールである。実施例３ 10日経過した貯蔵血液の赤血球沈降物にβ−プ
ロピオラクトンの前処理なしに実施例第１と同様
の４回の洗浄過程を施こす。しかし洗浄ずみの赤
血球は注射用水450ml（稀釈率が高い）で溶血さ
せる。溶液１あたり1.1ｇの５−燐酸ピリドキ
サール（Hb四量体１モルに対して燐酸ピリドキ
サール５モル相当）との反応のためにはしかし
7.3のPH値に調整し、続いて室温において２時間
窒素気中で撹拌する。通常の電解質仕上調整后に、Hb5.5％Hb／PP
溶液約700mlが得られる。P₅₀値：39トール。実施例４ 25の期限経過の貯蔵血液の赤血球沈降物を合せ
（約６）実施例第１により処理する。ただし上
記β−プロピオラクトン／食塩溶液との撹拌は５
分間だけとする。そのほか実施例第１とは違つて
燐酸ピリドキサールの添加前のPH調整は7.0の値
に行なう。実施例第１と同様に行なわれる最后の処理の終
にはHb含有量８％のHb／PP製剤10.5が得ら
れ、そのP₅₀値は34トールである。実施例５６％ヘモグロビン溶液100mlを20トールに減圧
し続いて窒素ですすいで脱酸型に変えた。燐酸ピ
リドキサール47mgを撹拌を行ないながら添加しさ
らに15分間撹拌した。水に水硼化ナトリウム56mg
を添加しさらに20分間撹拌した（室温）。改めて
真空にした后10％グルタールジアルデヒド0.8ml
を添加し45分間窒素気中で撹拌した。網状構造と
なつているヘモグロビンを分離するため、硫酸ア
ンモニウムの４モル溶液90mlを７分間で添加しさ
らに10分間撹拌した。生じた沈澱は遠心分離し上
澄は棄てた。沈澱は水20mlに溶かし、続いて
Visking10／32型透析管を用いて50倍の容積の0.5
％食塩溶液に対して３時間透析を行ない、その際
外側の液は３回交換した。透析したヘモグロビン
溶液は硫酸アンモニウムを全く除くため、強酸性
のカチオン交換体たとえばNa⁺型カチオン交換体
DOWEX WX₈ないしＣ型アニオン交換体
DOWEX21K（供給者：米国ミシガン州ミドラン
ド市ダウケミカル社）からなる温床交換体に通し
た。１規定水酸化ナトリウム溶液でPHを7.5にまた
等張の電解質ないしグルコース濃度に（グルコー
ス２ｇ及び重炭酸ナトリウム0.21ｇの添加）調整
した后に製剤を滅菌過し冷蔵庫（５℃）に貯蔵
した。製剤のP₅₀値は16トールに相当し、セフアロー
ス6B（フアーマシア・フアインケミカル社の製
品）を用いたカラム溶離ダイヤフラムは第４図の
とおりであつた。実施例６実施例第５と同様にただしグルタールジアルデ
ヒド添加までは３倍の量を用いて作業した。撹拌
后に製剤を、予め0.9％NaCl溶液を充填した中空
繊維限外過カートリツジH1P100に入口圧500ト
ールで圧入循環させた。限外過で押出された容
積相当の滅菌水を連続的に補充した。循環時間は
約５時間であつた。この時間中に同時に完全な除
塩が行なわれた。製剤は実施例第５と同様に調整
したが、P₅₀値は17トールであり、第５図のゲル
クロマトグラムを示した。実施例７実施例第５と同様にただし燐酸ピリドキサール
71mgを添加して作業した。対応して調製された最
終製品はP₅₀値が17トールであり、第６図のゲル
クロマトグラムを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は５−燐酸ピリドキサールの構造式、第
２図は本願第１発明によるヘモグロビン製剤のカ
ラム・クロマトグラム、第３図は本願第２発明に
よる別のヘモグロビン製剤のカラム・クロマトグ
ラム、第４図は実施例５のヘモグロビン製剤のカ
ラム溶離ダイヤグラム、第５図は実施例６のヘモ
グロビン製剤のゲルクロマトグラム、第６図は実
施例７のヘモグロビン製剤のカラム溶離ダイヤグ
ラムを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１赤血球ないしヘモグロビンの溶液に比べて酸
素放出を強化した静脈内注射に適したヘモグロビ
ン製剤の製法において、ヒトの赤血球を弱アルカ
リ性溶液で数回処理し、次に溶血させH⁺型カチ
オン交換体を用いPH値が5.0ないし5.5に下がるま
で処理をし、次に樹脂及び沈降した基質塊を除去
し、約５％ないし９％のヘモグロビン濃度まで水
で稀釈し、PH値を７ないし９に調整し、容器内の
酸素を置換し、５ないし９％のヘモグロビン溶液
１あたり0.25ないし1.25ｇの５−燐酸ピリドキ
サールを添加することを特徴とする酸素放出を強
化したヘモグロビン製剤の製造方法。２赤血球はまず赤血球沈降物１に対して４な
いし12ｇのβ−プロピオラクトンの比率で、β−
プロピオラクトンの稀釈溶液を用いて10ないし15
℃において５ないし15分間処理し、続いて処理剤
及び反応生成物を弱アルカリ溶液で洗い去ること
を特徴とする特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の製造方法。３赤血球ないしヘモグロビンの溶液に比べて酸
素放出を強化した静脈内注射に適したヘモグロビ
ン製剤の製法において、ヒトの赤血球を弱アルカ
リ性洗液で数回処理し、次に溶血させH⁺型カチ
オン交換体を用いPH値が5.0ないし5.5に下がるま
で処理をし、次に樹脂及び沈降した基質塊を除去
し、約５％ないし９％のヘモグロビン濃度まで水
で稀釈し、PH値を７ないし９に調整し、容器内の
酸素を置換し、５ないし９％のヘモグロビン溶液
１あたり0.25ないし1.25ｇの５−燐酸ピリドキ
サールを添加し、続いて該溶液を水素化ホウ素で
処理し、更にジアルデヒドで処理し、かくして該
赤血球中のヘモグロビン分子をクロスリンクし、
次にクロスリンクしていないヘモグロビンを所望
のクロスリンクしたヘモグロビンの残りの溶液か
ら分離することを特徴とする酸素放出を強化した
ヘモグロビン製剤の製造方法。４赤血球はまず赤血球沈降物１に対して４な
いし12ｇのβ−プロピオラクトンの比率で、β−
プロピオラクトンの稀釈溶液を用いて10ないし15
℃において５ないし15分間処理し、続いて処理剤
及び反応生成物を弱アルカリ溶液で洗い去ること
を特徴とする特許請求の範囲第３項記載の製造方
法。