DE2714252C2

DE2714252C2 - Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten

Info

Publication number: DE2714252C2
Application number: DE19772714252
Authority: DE
Inventors: Klaus Dipl.-Chem. Dr. 6450 Hanau Bonhard; Uwe Boysen; Hans Dipl.-Chem. Dr. 6000 Frankfurt Schleussner
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-03-31
Publication date: 1983-08-18
Also published as: DE2714252A1

Description

Gegenstand des Hauptpatenis 26 17 822 ist ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse -,0 Injektion geeigneten Harnogiobinpräparates mit einer erhöhten Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten, das keine pyrogtne Reaktion bewirkt, aus einem Kondensationsprodukt aus Hämoglobin und Pyridoxalphosphat, bei dem man Hämoglobin mit Pyridoxalphosphat umsetzt und das Produkt anschließend deoxygeniert. das dadurch gekennzeichnet ist. daß man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösungen wenigstens 4mal behandelt, dann mit aqua pro injectione hämolysiert. das Hämolyseprodukt (,0 mit einem Kationenaustauscher in H⁴ Form behandelt. bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzcn- ' tration von 5 bis 8% mit; Wasser verdünnt, einen pH-Wert von 7 bis 9 mit 1 N-Natronlaüge einstellt, die Elektrolyte durch Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemcnohydrat/1 zugibt, dann unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten rührt, bis der Sauerstoff im Gefäß durch Zusetzen von reinem Stickstoff verdrängt ist. 1,1 g Pyridoxal-5-phosphat je Liter 6- bis8%ige Hämoglobinlösung zugibt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur weiterrührt und schließlich mit 1 N-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 bei 20⁰C einstellt und sterilfiliriert.

Es wurde nun gefunden, daß man durch weitere Modifizierung solcher durch Bindung von ^pyridoxalphosphat an Hämoglobin zur verbesserten Sauerstoffabgabe an das Gewebe befähigte Moleküle, deren Verweilzeit im Blut etwa 2 Stunden beträgt, erreicht, daß diese bei Erhaltung ihrer therapeutischen Funktion mindestens doppelt solange in der Blutbahn voll wirksam bleiben, wenn man anschließend an das Weiterrühren nach der Pyrixodal-Phosphat- und vorder pH-Wert-Einstellung mit Natronlauge, mi: Jer 5- bis lOfachen molaren Menge Natriumborhydrid gegenüber dem Pyridoxalphosphat weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur verrührt, danach wieder evakuiert, einen Dialdehyd der Formel

O = CH-(CH₃V-CH= O

worin π 1 -6 bedeutet, in 9facher molarer Menge zum Hämoglobin zugibt, 45 Minuten unter Stickstoff rührt und unvernetztes Hämoglobin dann durch Aussalzen oder Ultrafiltration abtrennt.

Au.s der DE-AS 24 49 885 sind zwar bereits Hämciglobinpräparate bekannt, die dadurch modifiziert wurden, daß man sie zuerst mit Dialdehyden behandelte und anschließend nach etwa 3wöchiger Lagerung mit Pyridoxalphosphat versetzte.

Die durch eine solche Behandlung, d. h. umgekehrte Reihenfolge der Zugabe von Dialdehyd und Pyridoxalphosphat, erzielten Produkte besitzen zwar einen etwa gleichen P 50-Wert wie die erfindungsgemäß hergestellten Produkte, jedoch erfolgt beim Produkt der DE-AS 24 49 885 eine wesentlich schnellere Ablösung des Pyridoxalphosphats in vivo, s<> daß bei längerer Verweildauer eine Senkung des !,o-Wertes erfolgt, während beim erfindungsgemäßer! Produkt der anfängliche P50-Wert bei langer Verweildauer konstant bleibt.

Für die Abreicherung an unvernetztem Hämoglobin gibt es zwei Möglichkeiten.

1. Man rührt allmählich das 0.8-l.Ofache Volumen der Hämoglobinbereitung an 4molarer Ammoniumsulfatiösung zur Aussalzung des vernetzten Hämoglobin! ein. Der abzentrifugierte Niederschlag wird in Wasser gelöst und gegen eine 0.5%ige Kochsalzlösung dialysiert zur Entfernung des Ammoniumsulfats und aller überschüssigen HilfsChemikalien. Die letzten Spuren werden durch einen Mischbettaustauscher entfernt.

2. Man durchströmt eine Hollow-Fiber-Patrone Hl P 100 (Hersteller: Firma Amicon Corporation, 21 Hostwel! Avenue. Lexington. Massachusetts. USA) mit der Hämoglobin-Bereitung. Durch Ultrafiltration wird unvernetztes Hämoglobin bevorzugt abgepreßt und dabei im Unfiltrat abgereichert.

Bei diesem Verfahren läßt man Pyridoxalphosphat zunächst auf Hämoglobin einwirken und reduziert anschließend durch naszierenden Wasserstoff aus Natriumboriiydrid die gebildeten Azomethin-(Schiff-Basen-) zu sekundären Amin-Bindungen.

(Hb)- N = CH- (Pyr)

NaBH₄

(Hb)-NH-CH₂-(Pyr)

Anschließend läßt man einen Dialdehyd der allgemeinen Formel

O = CH- (CH,),,- CH = O

/7= 1 —6, auf di<_ Moleküle einwirken. Dadurch erreicht i< > man eine Aneinanderkopplung der modifizierten Hämoglobin-Moleküle zu größeren Gebilden.

Erfindungsgemäß geeignet für die Behandlung sind Dialdehyde mit insbesondere geraden Kohlenstoffketten von 3-8 C-Atomen wie Malondialdehyd, Succin- r. dialdehyd, Glutardialdehyd, Adipindialdehyd, Suberaldehyd, die der allgemeinen Formel

OCH-(CH)_n-CHO

entsprechen, indem einen Wert von 1 — 6 bedeutet

Das Verfahrensprodukt gemäß Fig. 1 der Zeichnung besteht aus

20

A = hochvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (/7>3)

B = oligomervernetztem pyridoxaliertem Hämoglo-

bin(n = 2-3)
C = unvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (/7=1)

30

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 (nachgereicht)

100 ml einer 6%igen Hämoglobinlösung, die dadurch *> hergestellt worden war, daß man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösungen 4mal behandelte, dann mit aqua pro injectione hämolysierte, das Hämolyseprodukt mit einem Kationenaustauscher in H+ -Form behandelte bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5.5 *< > abgesunken war, dann vom Harz und ausgefällter Strommasse durch Kühlzentrifugation befreite und mit Wasser auf eine Hämoglobinkonzentrauon von 6% einstellte, wurden durch Evakuieren auf 20 Torr und anschließendes Spülen mit Stickstoff in die Desoxyform ⁴⁾ überführt. 47 mg Pyridoxalphosphat wurden unter Rühren zugegeben und 1 Stunde weitergerührt. Dann wurden 56 mg Natriumborhydrid zugegeben und weitere 20 Minuten gerührt (Raumtemperatur). Nach dem erneuten Evakuieren wurden 0,8 ml 10% Glutar- ">" dialdehyd zugegeben und 45 Minuten unter Stickstoff gerührt. Um das unvemetzte Hämoglobin abzutrennen, wurden 90 ml 4molare Ammoniumsulfatlösung in 7 Minuten zugegeben und noch 10 Minuten gerührt Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Oberstand verworfen. Der Niederschlag wurde in 20 ml Wasser aufgelöst Es folgte eine 3stündige Dialyse mit Visking Dialysierschlauch Typ 10/32 gegen das 50fache Volumen einer 0,5%igen Kochsalzlösung, wobei die Außenlösung 3mal ausgewechselt wurde. Die dialysierte Hämoglobinlösung wurde zur restlosen Entfernung des Ammoniumsulfats über einen Mischbettaustauscher geschickt, bestehend aus stark saurem Kationenaustauscher, zum Beispiel Dowex W χ 8 Kationenaustauscher in der Na+ -Form bzw. Dowex 21 K Anionenaustauscher in der Cl"-Form (Lieferant: Firme DOW Chemical Company, Midland, Michigan, USA).

Nach der Einstellung auf pH 7,5 ν -.-. n-NaOH und auf eine isotonische Elektrolyt- bzw. Glukof ekonzentration (Zusatz von 2 g Glukose und 0.21 g Natriumbicarbonat) wurde das Präparat sterilfiltriert und im Kühlschrank (5° C) aufbewahrt

Das Präparat entsprach einem P 50-Wert von 16 Torr und zeigte das Säulen-Elutions-Diagramm über Sepharose 6 B (Produkt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB) gemäß F ig. 2.

Beispiel 2 (nachgereicht)

Es wurde wie in Beispiel 1, jedoch mit der 3fachen Ansatzgröße, bis zur Zugabe des Glutardialdehyds gearbeitet. Nach dem Rühren wurde das Präparat durch eine mit 0,9% NaCI-Lösung vorgefüllte Hollow-Fiber-Ultrafiltrationspatrone H 1 P 100 mit einem Eingangsdruck von 500 Torr umgepumpt. Das durch die Ultrafiltration abgepreßte Vohimen wurde kontinuierlich durch steriles Wasser ersetzt. Die Ui.npuivpdauer betrug etwa 5 Stunden. In dieser Zeit fand gleichzeitig eine Vollentsalzung statt. Das Präparat wurde analog Bespiel 1 endeingestellt, hatte einen Pso-Werl von 19 Torr und zeigte das Gelchromatogramm von F i g. 3.

Beispiel 3 (nachgereicht)

Man verfuhr nach Beispiel 1, setzte jedoch 71 mg Pyridoxalphosphat zu. Das entsprechend hergestellte Endprodukt wies einen Pso-Weri von 18 Torr auf und zeigte das Gelchromatogramm von F i g. 4.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit , einer erhöhten Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten, das keine pyrogene Reaktion bewirkt, aus einem Kondensationsprodukt aus Hämoglobin und Pyridoxylphosphat, bei dem man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösun- ι ο gen wenigstens 4mal behandelt, dann mit aqua pro injectione hämolysiert, das Hämolyseprodukt mit einem Kationenaustauscher in H*-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch η Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzentration von 5 bis 8% mit Wasser verdünnt, einen pH-Wert von 7 bis 9 mit 1N-Natronlauge einstellt, die Elektrolyte durch Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentratio- _>υ nen ergäbt. 22 g Glucosemonohydrat/1 zugibt, dann unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten rührt, bis der Sauerstoff im Gefäß durch Zusetzen von reinem Stickstoff verdrängt ist, 03 - 1,1 g Pyridoxyi-5-phosphat je Liter 6 bis 8%ige Hämoglobinlösung 2i zugibt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur weiterrührt, und schließlich mit 1 N-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7.6 bei 20°C einstellt und sterilfiltriert, nach DE-PS 26 17 822, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend an das jo Weiterrühren nach der Pyridoxal-Phosphatzugabe und vor der pH-Wert-Einstellung mit Natronlauge, mit der 5- bis lOfachen molaren Menge Natriumborhydrid gegenüber dvm PyrJoxalphosphat weitere 20 Minuten bei Raum:emperatur verrührt, danach wieder evakuiert, einen Dialdei yd der Formel

O = CH-(CH₂J_n-CH=O

worin π 1 -6 bedeutet, in 9facher molarer Menge zum Hämoglobin zugibt. 45 Minuten unter Stickstoff rührt und unvernetztes Hämoglobin dann durch Aussalzen oder Ul'.rafiltration abtrennt.