DE2714252C2 - Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit erhöhter Sauerstoffabgabe gegenüber ErythrozytenInfo
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- DE2714252C2 DE2714252C2 DE19772714252 DE2714252A DE2714252C2 DE 2714252 C2 DE2714252 C2 DE 2714252C2 DE 19772714252 DE19772714252 DE 19772714252 DE 2714252 A DE2714252 A DE 2714252A DE 2714252 C2 DE2714252 C2 DE 2714252C2
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Description
Gegenstand des Hauptpatenis 26 17 822 ist ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse -,0
Injektion geeigneten Harnogiobinpräparates mit einer erhöhten Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten,
das keine pyrogtne Reaktion bewirkt, aus einem Kondensationsprodukt aus Hämoglobin und Pyridoxalphosphat,
bei dem man Hämoglobin mit Pyridoxalphosphat umsetzt und das Produkt anschließend deoxygeniert.
das dadurch gekennzeichnet ist. daß man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen
Waschlösungen wenigstens 4mal behandelt, dann mit aqua pro injectione hämolysiert. das Hämolyseprodukt (,0
mit einem Kationenaustauscher in H4 Form behandelt.
bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, dann vom
Harz und ausgefällter Stromamasse durch Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzcn- '
tration von 5 bis 8% mit; Wasser verdünnt, einen pH-Wert von 7 bis 9 mit 1 N-Natronlaüge einstellt, die
Elektrolyte durch Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentrationen ergänzt, 22 g Glucosemcnohydrat/1
zugibt, dann unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten rührt, bis der Sauerstoff im Gefäß durch
Zusetzen von reinem Stickstoff verdrängt ist. 1,1 g Pyridoxal-5-phosphat je Liter 6- bis8%ige Hämoglobinlösung
zugibt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur weiterrührt und schließlich mit
1 N-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,6 bei 200C
einstellt und sterilfiliriert.
Es wurde nun gefunden, daß man durch weitere Modifizierung solcher durch Bindung von pyridoxalphosphat
an Hämoglobin zur verbesserten Sauerstoffabgabe an das Gewebe befähigte Moleküle, deren
Verweilzeit im Blut etwa 2 Stunden beträgt, erreicht, daß diese bei Erhaltung ihrer therapeutischen Funktion
mindestens doppelt solange in der Blutbahn voll wirksam bleiben, wenn man anschließend an das
Weiterrühren nach der Pyrixodal-Phosphat- und vorder pH-Wert-Einstellung mit Natronlauge, mi: Jer 5- bis
lOfachen molaren Menge Natriumborhydrid gegenüber dem Pyridoxalphosphat weitere 20 Minuten bei
Raumtemperatur verrührt, danach wieder evakuiert, einen Dialdehyd der Formel
O = CH-(CH3V-CH= O
worin π 1 -6 bedeutet, in 9facher molarer Menge zum Hämoglobin zugibt, 45 Minuten unter Stickstoff rührt
und unvernetztes Hämoglobin dann durch Aussalzen oder Ultrafiltration abtrennt.
Au.s der DE-AS 24 49 885 sind zwar bereits Hämciglobinpräparate bekannt, die dadurch modifiziert
wurden, daß man sie zuerst mit Dialdehyden behandelte
und anschließend nach etwa 3wöchiger Lagerung mit Pyridoxalphosphat versetzte.
Die durch eine solche Behandlung, d. h. umgekehrte Reihenfolge der Zugabe von Dialdehyd und Pyridoxalphosphat,
erzielten Produkte besitzen zwar einen etwa gleichen P 50-Wert wie die erfindungsgemäß hergestellten
Produkte, jedoch erfolgt beim Produkt der DE-AS 24 49 885 eine wesentlich schnellere Ablösung des
Pyridoxalphosphats in vivo, s<> daß bei längerer Verweildauer eine Senkung des !,o-Wertes erfolgt,
während beim erfindungsgemäßer! Produkt der anfängliche P50-Wert bei langer Verweildauer konstant bleibt.
Für die Abreicherung an unvernetztem Hämoglobin gibt es zwei Möglichkeiten.
1. Man rührt allmählich das 0.8-l.Ofache Volumen
der Hämoglobinbereitung an 4molarer Ammoniumsulfatiösung zur Aussalzung des vernetzten
Hämoglobin! ein. Der abzentrifugierte Niederschlag wird in Wasser gelöst und gegen eine
0.5%ige Kochsalzlösung dialysiert zur Entfernung des Ammoniumsulfats und aller überschüssigen
HilfsChemikalien. Die letzten Spuren werden durch einen Mischbettaustauscher entfernt.
2. Man durchströmt eine Hollow-Fiber-Patrone Hl P 100 (Hersteller: Firma Amicon Corporation,
21 Hostwel! Avenue. Lexington. Massachusetts. USA) mit der Hämoglobin-Bereitung. Durch
Ultrafiltration wird unvernetztes Hämoglobin bevorzugt abgepreßt und dabei im Unfiltrat
abgereichert.
Bei diesem Verfahren läßt man Pyridoxalphosphat zunächst auf Hämoglobin einwirken und reduziert
anschließend durch naszierenden Wasserstoff aus Natriumboriiydrid die gebildeten Azomethin-(Schiff-Basen-)
zu sekundären Amin-Bindungen.
(Hb)- N = CH- (Pyr)
NaBH4
(Hb)-NH-CH2-(Pyr)
Anschließend läßt man einen Dialdehyd der allgemeinen
Formel
O = CH- (CH,),,- CH = O
/7= 1 —6, auf di<_ Moleküle einwirken. Dadurch erreicht i<
> man eine Aneinanderkopplung der modifizierten Hämoglobin-Moleküle zu größeren Gebilden.
Erfindungsgemäß geeignet für die Behandlung sind Dialdehyde mit insbesondere geraden Kohlenstoffketten
von 3-8 C-Atomen wie Malondialdehyd, Succin- r. dialdehyd, Glutardialdehyd, Adipindialdehyd, Suberaldehyd,
die der allgemeinen Formel
OCH-(CH)n-CHO
entsprechen, indem einen Wert von 1 — 6 bedeutet
Das Verfahrensprodukt gemäß Fig. 1 der Zeichnung
besteht aus
20
A = hochvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin
(/7>3)
B = oligomervernetztem pyridoxaliertem Hämoglo-
bin(n = 2-3)
C = unvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (/7=1)
C = unvernetztem pyridoxaliertem Hämoglobin (/7=1)
30
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 (nachgereicht)
100 ml einer 6%igen Hämoglobinlösung, die dadurch *>
hergestellt worden war, daß man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösungen 4mal
behandelte, dann mit aqua pro injectione hämolysierte, das Hämolyseprodukt mit einem Kationenaustauscher
in H+ -Form behandelte bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5.5 *<
> abgesunken war, dann vom Harz und ausgefällter Strommasse durch Kühlzentrifugation befreite und
mit Wasser auf eine Hämoglobinkonzentrauon von 6% einstellte, wurden durch Evakuieren auf 20 Torr und
anschließendes Spülen mit Stickstoff in die Desoxyform 4)
überführt. 47 mg Pyridoxalphosphat wurden unter Rühren zugegeben und 1 Stunde weitergerührt. Dann
wurden 56 mg Natriumborhydrid zugegeben und weitere 20 Minuten gerührt (Raumtemperatur). Nach
dem erneuten Evakuieren wurden 0,8 ml 10% Glutar- ">" dialdehyd zugegeben und 45 Minuten unter Stickstoff
gerührt. Um das unvemetzte Hämoglobin abzutrennen, wurden 90 ml 4molare Ammoniumsulfatlösung in 7
Minuten zugegeben und noch 10 Minuten gerührt Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert, der
Oberstand verworfen. Der Niederschlag wurde in 20 ml Wasser aufgelöst Es folgte eine 3stündige Dialyse mit
Visking Dialysierschlauch Typ 10/32 gegen das 50fache
Volumen einer 0,5%igen Kochsalzlösung, wobei die Außenlösung 3mal ausgewechselt wurde. Die dialysierte
Hämoglobinlösung wurde zur restlosen Entfernung des Ammoniumsulfats über einen Mischbettaustauscher
geschickt, bestehend aus stark saurem Kationenaustauscher, zum Beispiel Dowex W χ 8 Kationenaustauscher
in der Na+ -Form bzw. Dowex 21 K Anionenaustauscher in der Cl"-Form (Lieferant: Firme DOW
Chemical Company, Midland, Michigan, USA).
Nach der Einstellung auf pH 7,5 ν -.-. n-NaOH und auf
eine isotonische Elektrolyt- bzw. Glukof ekonzentration
(Zusatz von 2 g Glukose und 0.21 g Natriumbicarbonat) wurde das Präparat sterilfiltriert und im Kühlschrank
(5° C) aufbewahrt
Das Präparat entsprach einem P 50-Wert von 16 Torr
und zeigte das Säulen-Elutions-Diagramm über Sepharose 6 B (Produkt der Firma Pharmacia Fine Chemicals
AB) gemäß F ig. 2.
Beispiel 2 (nachgereicht)
Es wurde wie in Beispiel 1, jedoch mit der 3fachen Ansatzgröße, bis zur Zugabe des Glutardialdehyds
gearbeitet. Nach dem Rühren wurde das Präparat durch eine mit 0,9% NaCI-Lösung vorgefüllte Hollow-Fiber-Ultrafiltrationspatrone
H 1 P 100 mit einem Eingangsdruck von 500 Torr umgepumpt. Das durch die Ultrafiltration abgepreßte Vohimen wurde kontinuierlich
durch steriles Wasser ersetzt. Die Ui.npuivpdauer
betrug etwa 5 Stunden. In dieser Zeit fand gleichzeitig eine Vollentsalzung statt. Das Präparat wurde analog
Bespiel 1 endeingestellt, hatte einen Pso-Werl von 19
Torr und zeigte das Gelchromatogramm von F i g. 3.
Beispiel 3 (nachgereicht)
Man verfuhr nach Beispiel 1, setzte jedoch 71 mg
Pyridoxalphosphat zu. Das entsprechend hergestellte Endprodukt wies einen Pso-Weri von 18 Torr auf und
zeigte das Gelchromatogramm von F i g. 4.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Hämoglobinpräparates mit , einer erhöhten Sauerstoffabgabe gegenüber Erythrozyten, das keine pyrogene Reaktion bewirkt, aus einem Kondensationsprodukt aus Hämoglobin und Pyridoxylphosphat, bei dem man menschliche Erythrozyten mit schwach alkalischen Waschlösun- ι ο gen wenigstens 4mal behandelt, dann mit aqua pro injectione hämolysiert, das Hämolyseprodukt mit einem Kationenaustauscher in H*-Form behandelt, bis der pH-Wert auf 5,0 bis 5,5 abgesunken ist, dann vom Harz und ausgefällter Stromamasse durch η Kühlzentrifugation befreit, auf eine gewünschte Hämoglobinkonzentration von 5 bis 8% mit Wasser verdünnt, einen pH-Wert von 7 bis 9 mit 1N-Natronlauge einstellt, die Elektrolyte durch Salzzusätze auf Blutplasma analoge Konzentratio- _>υ nen ergäbt. 22 g Glucosemonohydrat/1 zugibt, dann unter einem Vakuum von 20 Torr 10 Minuten rührt, bis der Sauerstoff im Gefäß durch Zusetzen von reinem Stickstoff verdrängt ist, 03 - 1,1 g Pyridoxyi-5-phosphat je Liter 6 bis 8%ige Hämoglobinlösung 2i zugibt und unter Stickstoff 1 Stunde bei Raumtemperatur weiterrührt, und schließlich mit 1 N-Natronlauge auf einen pH-Wert von 7.6 bei 20°C einstellt und sterilfiltriert, nach DE-PS 26 17 822, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend an das jo Weiterrühren nach der Pyridoxal-Phosphatzugabe und vor der pH-Wert-Einstellung mit Natronlauge, mit der 5- bis lOfachen molaren Menge Natriumborhydrid gegenüber dvm PyrJoxalphosphat weitere 20 Minuten bei Raum:emperatur verrührt, danach wieder evakuiert, einen Dialdei yd der FormelO = CH-(CH2Jn-CH=Oworin π 1 -6 bedeutet, in 9facher molarer Menge zum Hämoglobin zugibt. 45 Minuten unter Stickstoff rührt und unvernetztes Hämoglobin dann durch Aussalzen oder Ul'.rafiltration abtrennt.
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CH504577A CH638401A5 (en) | 1976-04-23 | 1977-04-22 | Process for the preparation of haemoglobin preparations having an increased oxygen delivery |
GB1681677A GB1576752A (en) | 1976-04-23 | 1977-04-22 | Haemoglobin preparation |
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DE2714252A1 DE2714252A1 (de) | 1978-10-12 |
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DE3320752A1 (de) * | 1983-06-09 | 1984-12-13 | Wolfgang Prof. Dr.Dr. 6500 Mainz Barnikol | Lumineszierende schichten zur verwendung in vorrichtungen zur bestimmung der sauerstoffkonzentration in gasen und dergleichen durch messung der lumineszensverringerung |
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Family Cites Families (1)
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DE2449885C3 (de) * | 1974-10-21 | 1980-04-30 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat |
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1977
- 1977-03-31 DE DE19772714252 patent/DE2714252C2/de not_active Expired
Also Published As
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