KR20010095748A - 역전사효소를 이용한 디엔에이 칩의 제조방법 및 그로부터제조된 디엔에이 칩 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리 T 꼬리를 붙인 DNA 칩에 특정 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 붙여 다양한 종류의 프라이머가 DNA 칩위에 존재하게 만들고, 서열확인되지 않은 mRNA를 결합 온도(annealing temperature)를 조절해서, 프라이머에 상보적으로 붙게 한 후, 역전사효소를 넣어 상기 DNA 칩위에서 cDNA를 합성시키고, RNA 분해효소등을 사용해서 상기에서 결합되어 있는 mRNA를 제거함으로써 cDNA만 남아있는 cDNA 라이브러리 칩을 형성하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 DNA 칩에 관한 것이다. 본 발명에 따른 DNA 칩의 제조 방법은 6-10mer 크기의 뉴클레오타이드를 폴리 T 뒤에 붙이는 것에 의해 한종에서 발현되는 여러 mRNA중에서 하나의 mRNA를 분리해서 cDNA화할 수 있다.

Description

역전사효소를 이용한 디엔에이 칩의 제조방법 및 그로부터 제조된 디엔에이 칩{Method for preparing DNA chip by using reverse transcriptase and DNA chip prepared therefrom}

본 발명은 신규 DNA 칩 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 짧은 프라이머만 붙은 DNA 칩에 특정 크기의 서열을 갖는 mRNA를 붙이고 역전사효소를 사용하여 cDNA를 제조함으로써 신규 DNA 칩을 제조하고 이를 이용하여 신규 유전자를 확인하는 방법에 관한 것이다.

현재, 여러 유전자를 빠른 시간내에 확인하는 방법으로 DNA 칩 기술이 있다. DNA 칩은 유리 등과 같은 고체 지지재에 검사하고자 하는 타겟으로 올리고뉴클레오타이드나 cDNA등을 붙인 후, 여기에 샘플에서 추출한 DNA나 RNA를 탐침으로 만들어서 상보적으로 붙는 것을 찾음으로써, 여러 샘플간의 유전자 발현 차이를 검사하는 방법이다. 그러나, 이러한 DNA 칩의 경우 DNA 칩에 결합된 프라이머나 cDNA는 이미 우리가 알고 있는 서열이라는데 그 한계가 있었다. 따라서 DNA 칩을 가지고 새로운 유전자를 찾는 것은 현재로선 불가능한 실정이다. 그러나, 분자생물분야에서 새로운 유전자를 찾아서 그 유전자의 성질을 밝히는 것에 의해 암이나 질병에 관련된새로운 유전자를 찾는 것은 그 산업적 유용성면에서 아주 중요함을 감안할 때 상술한 DNA 칩 기술을 이용하여 신규 유전자를 찾아낼 수 있다면 산업적으로 아주 유용할 것이다.

따라서 본 발명자는 유니 칩(Uni chip)이라는 새로운 개념의 DNA 칩을 제조하고 이를 이용해서 신규 유전자를 찾는 방법을 제시하는 것을 그 기술적 과제로 하고 있다.

본 발명자는 DNA 칩을 제조하는데 있어 종래 기술이 가졌던 한계, 즉 DNA 칩에 붙이는 프라이머나 cDNA는 이미 공지된 서열을 사용해야하는 문제점을 해결하기 위해 검토한 결과, 역전사효소를 사용하여 폴리 T로부터 cDNA를 제조할 때 폴리 T프라이머의 3' 쪽을 T 대신 다른 핵산(A, G, C) 또는 일정 길이의 서열로 치환하면 합성되는 cDNA를 제한할 수 있는 사실을 기초로 하여 폴리 T 뒤에 특정 DNA 서열을 붙여 cDNA화하는 mRNA의 수를 줄여나가는 것에 의해 여러 mRNA중에서 단 하나의 mRNA만을 cDNA화할 수 있는 프라이머로 작용하도록 하는 새로운 DNA 칩 (유니 칩)작성에 성공하게 되었다.

이하에서는 DNA 칩 작성에 있어서 기초가되는 배경원리와 작성방법에 대해 자세히 설명하기로 한다.

레트로바이러스에는 역전사효소(Reverse transcriptase)가 존재하는 데, 이 효소는 RNA를 DNA로 전환하는 효소로서, 현재 cDNA를 만드는 데 널리 이용되는 효소이다. 역전사 효소를 이용해서 cDNA를 만드는 방법은 다음과 같다.

위와 같이 폴리 T를 이용해서 cDNA를 만들면, 모든 종류의 cDNA가 만들어지지만, 폴리 T 프라이머의 3' 쪽을 T 대신에 다른 핵산 (A, G, C)로 치환할 경우, 합성되는 cDNA를 제한할 수 있다. 즉, 폴리 T 프라이머의 3' 쪽의 T 대신 A로 치환하면, 폴리 A 꼬리 다음에 T가 오는 mRNA만 선택적으로 cDNA화할 수 있고; 폴리 T 프라이머의 3' 쪽의 T 대신 G로 치환하면, 폴리 A 꼬리 다음에 C가 오는 mRNA만 선택적으로 cDNA화할 수 있고; 또 폴리 T 프라이머의 3' 쪽의 T 대신 C로 치환하면, 폴리 A 꼬리 다음에 G가 오는 mRNA만 선택적으로 cDNA화할 수 있다. 위와 같이, 폴리 T 다음에 T 이외의 서열을 넣음으로써 cDNA로 만드는 mRNA를 제한할 수 있으며, 이는 DDRT (Differential Display Reverse Transcriptase)-PCR에 사용되는 기법이다.

본 발명자는 상기 방법을 좀더 개선하여 폴리 T 다음에 서열을 조금 더 넣고, RNA와 프라이머가 결합하는 온도(annealing temperature)를 조정함으로써, 프라이머에 붙는 mRNA가 제한됨으로써, 프라이머에 따라 cDNA가 되는 것을 제한할 수 있음을 주목하였다.

즉, 폴리 T 다음에 T 대신 G로 치환하면 폴리 A 꼬리 뒤에 C가 오는 mRNA만을 선택적으로 cDNA화할 수 있고; 폴리 T 다음에 T 대신 GC로 치환하면 폴리 A 꼬리 뒤에 CG가 오는 mRNA만을 선택적으로 cDNA화할 수 있고; 폴리 T 다음에 T 대신 GCA로 치환하면 폴리 A 꼬리 뒤에 CGT가 오는 mRNA만을 선택적으로 cDNA화할 수 있다.

따라서 본 발명자는 폴리 T 뒤에 특정 서열을 붙여나감으로써 cDNA화하는 mRNA의 수를 줄여나갈 수 있고, 특히 폴리 T 뒤에 7-9mer 크기의 서열을 붙일 경우, 한 종에서 발현되는 여러 mRNA중에서 단 하나의 mRNA만을 cDNA화할 수 있는 프라이머로서 작용할 수 있게됨을 발견하였다. 본 발명에서는 단 하나의 mRNA만을 cDNA화할 수 있는 프라이머를 붙인 DNA 칩을 "유니 칩"이라 칭하고 있다.

보다 상세히 설명하면, 상기 도시한 바와 같이 선택적으로 cDNA화할 수 있는 프라이머를 계속 만들어 나가면, 폴리 T 이후에 존재하는 서열에 따라서, 선택적으로 cDNA화할 수 있는 mRNA수가 달라지게된다. mRNA의 3' 말단 서열이 랜덤하게 존재할 경우, 예컨대 폴리 T 이후에 존재하는 서열이 6mer이면 4000 종류의 mRNA를 구분할 수 있으며, 7mer일때는 16,000종류, 8mer일때는 64,000종류, 9mer일때는 256,000종류를 구분할 수 있게되어, 사람의 유전자가 10만개라 할지라도 이론적으로 모두 구분할 수 있는 프라이머를 제작할 수 있게 된다.

본 발명에 따라 제조되는 유니 칩은 기존의 짧은 프라이머만 붙은 DNA 칩을 이용하고 있으므로 DNA 칩의 작성에 사용되는 고체 지지재 등에 대한 상세한 사항과 고체 지지재에 짧은 프라이머를 붙이는 방법 등에 대해서는 당해 분야에서 일반적으로 실시되는 사항을 참고한다면 용이하게 실시될 수 있을 것이라 보고 상세한 설명은 생략하기로 한다.

유니 칩은 DNA 칩위에 폴리 T 이후에 특정서열을 갖는 올리고머를 붙이고,여기에 mRNA를 붙여서 역전사효소를 이용하여 역전사반응을 일으켜서 칩위에 cDNA 라이브러리를 만들고 이를 DNA 칩으로 이용하는 것이다. 이하에 유니 칩의 제조과정을 간략히 도시한다.

위의 공정을 설명하면, 우선 DNA 칩위에 프라이머를 붙이는 데, 폴리 T 꼬리 이후에 특정 서열을 붙인 것을 순차적으로 배열함으로써, 다양한 종류의 프라이머가 칩위에 존재하게 한다. 상기 프라이머에 mRNA를 서열에 맞게 상보적으로 붙인 후(specific binding), 상보적이지 않은(non-specific binding) mRNA를 세척해서 제거한 후, 상보적으로 붙은 mRNA만을 가지고, 역전사효소를 이용해서 칩위에서 cDNA를 합성하게 된다. 이때에, 프라이머의 디자인에 따라서, 아무런 mRNA가 붙지 않은 부분도 있을 것이고, 여러종류의 mRNA가 붙은 프라이머도 존재할 것이다. 그 후에 RNA 분해효소 (RNase) 등을 사용하거나, 열을 가해서 결합된 mRNA를 제거하면cDNA만 남아있는 칩이 완성된다.

이것을 이용해서 대조용과 샘플에서 얻은 탐침을 결합시킴으로써 대조용과 샘플에서 달리 전사되는 mRNA를 찾아낼 수 있으며, 이를 결합한 프라이머를 이용해서 증폭 등을 통하여 클로닝할 경우, 다르게 전사되는 유전자를 찾아낼 수 있게 되는 것이다.

본 발명에 따른 유니 칩은 상술한 바와 같이 알지못하는 유전자도 칩에 붙여서 탐침으로 사용할 수 있고 또한 아직 서열확인되지 않은 생물체의 mRNA로 칩을 만들어서 실험에 사용할 수 있다. 또한 지금까지는 실험자들이 프라이머로부터 칩을 만들어야 했으므로, 프라이머 가격이 많이 소요되었지만, 유니 칩을 사용할 경우, 짧은 프라이머만 붙은 칩을 사다가 자신이 원하는 mRNA를 입혀서 cDNA를 만들어서 여러 목적으로 사용할 수 있다. 칩의 결합 특이성을 위해서는 긴 프라이머가 필요하지만, 유니 칩에서는 역전사효소를 이용하기 때문에, 프라이머가 짧아도 특이적으로 cDNA가 만들어지며, cDNA는 일반 프라이머보다 길기 때문에, 좀더 특징적한 칩으로 이용할 수 있다.

Claims (4)

1. (1) 폴리 T 꼬리를 붙인 DNA 칩에 특정 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 붙여 다양한 종류의 프라이머가 DNA 칩위에 존재하게 만들고,

   (2) 서열확인되지 않은 mRNA와 역전사효소를 넣어 상기 DNA 칩위에서 cDNA를 합성시키고,

   (3) RNA 분해효소를 사용하거나 열을 가해서, 상기 (2)에서 결합되어 있는 mRNA를 제거함으로써 cDNA만 남아있는 cDNA 라이브러리 칩을 형성하는 것을 특징으로 하는 DNA 칩의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 6-10mer 크기인 것을 특징으로 하는 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 따라 제조된 DNA 칩.
4. (1) 제1항에 따른 방법으로 제조한 DNA 칩을 타겟 샘플과 대조용 샘플에서 추출한 DNA나 RNA로 제조한 탐침과 상보적으로 결합시켜 타겟 샘플과 대조용 샘플에서 달리 전사되는 mRNA를 찾아내고,

   (2) 그러한 mRNA를 결합한 프라이머를 증폭 등에 의하여 클로닝하는 것에 의해 타겟 샘플과 대조용 샘플에서 다르게 전사되는 유전자를 찾아내는 것을 포함하는, 신규 유전자의 확인방법.