JP2003524412A

JP2003524412A - 遺伝子発現モニタリング方法

Info

Publication number: JP2003524412A
Application number: JP2001526844A
Authority: JP
Inventors: ヤンクシャンキャオ; ルバートストライアー; デイビッドロックハート; キャサリンジー．デュラック; イアンティートジェン; ジェイソンライエル
Original assignee: アフィメトリックスインコーポレイテッド; プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-09
Publication date: 2003-08-19
Also published as: WO2001011082A2; AU6533700A; US20060292614A1; EP1330539A2; WO2001011082A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞または小さな集団の細胞における複数の遺伝子発現のモニター方法を提供する。好ましい方法は、1000個未満の細胞における集団に由来する核酸の集団をプローブのアレイに接触させた後、細胞からの遺伝子の相対的な発現の測定として核酸の集団に対するプローブの相対的ハイブリダイゼーションを測定することを必要とする。本発明はさらに、細胞を分類する方法を提供する。これらの好ましい方法は、複数の細胞のそれぞれの発現プロフィールを決定する段階、その後発現プロフィールの類似性によって決定したクラスターに細胞を分類する段階を必要とする。本発明はさらに、細胞系列の分化をモニターする方法をさらに提供する。これらの好ましい方法は、系列内での異なる分化段階の複数の細胞のそれぞれの発現プロフィールを決定する段階を必要とする。次に、これらの細胞を発現プロフィールの類似性によって決定したクラスターに分類することができる。次に、クラスターを発現プロフィールの類似性の順に並べることができる。細胞系列における異なる分化段階で複数の遺伝子のそれぞれについて発現レベルの経時的変化を決定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、そのそれぞれが全ての目的に関してその全文が参照として本明細書
に組み入れられる、1999年8月9日に出願された米国特許仮出願第60/148,081号お
よび1999年10月22日に出願された米国特許仮出願第60/160,925号の出願日の恩典
を主張するものである。

【０００２】発明の背景発達、分化、疾患状態、および細胞環境に対する反応に関連する遺伝子を同定
することは、これらの現象をより一層理解するために重要な段階である。特に、
様々な細胞または変化した細胞環境において異なる様式で発現されている遺伝子
を同定して単離するため、および機能的遺伝子ネットワークをさらに解明するた
めに、遺伝子解析を行うための有効な方法が必要とされる。

【０００３】多くの疾患状態は、遺伝子DNAのコピー数の変化、または特定の遺伝子の転写
レベルの変化（例えば、開始の制御、RNA前駆体の提供、またはRNAプロセシング
）のいずれかのために、様々な遺伝子の発現レベルに差があることを特徴とする
。例えば、遺伝物質の喪失と獲得は、悪性の形質転換および進行において重要な
役割を果たしている。これらの獲得および喪失は、少なくとも二種類の遺伝子に
よって引き起こされると考えられる。腫瘍遺伝子は、腫瘍発生の正の調節因子で
あるが、腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍発生の負の調節因子である（マーシャル（Mars
hall、Cell 64：313〜326（1991）；ワインバーグ（Weinberg、Science 254：11
38〜1146（1991））。したがって、調節されない増殖を活性化する一つのメカニ
ズムは、腫瘍遺伝子蛋白質をコードする遺伝子の数を増加させること、またはこ
れらの腫瘍遺伝子の発現レベルを増加させること（例えば、細胞または環境の変
化に反応して）であり、別のメカニズムは、遺伝物質を失うことまたは腫瘍抑制
因子をコードする遺伝子の発現レベルを減少させることである。このモデルは、
神経膠腫進行に関連する遺伝物質の喪失と獲得によって支持される（ミカエルソ
ン（Michaelson）ら、J. Cellular Biochrome. 46：3〜8（1991））。このよう
に、特定の遺伝子（例えば、腫瘍遺伝子または腫瘍抑制因子）の発現（転写）レ
ベルの変化は、様々な癌の存在および進行の手がかりとして役立つ。

【０００４】同様に、疾患と共に細胞周期および細胞発達の制御は、特定の遺伝子の転写レ
ベルの変化を特徴とする。このように、例えば、ウイルス感染症はしばしば、特
定のウイルスの遺伝子の発現の上昇を特徴とする。例えば、単純ヘルペスウイル
ス、エプスタイン-バーウイルス感染症（例えば、感染性単球増加症）、サイト
メガロウイルス、水痘- 帯状疱疹ウイルス感染症、パルボウイルス感染症、ヒト
乳頭腫ウイルス感染症の大流行は全て、それぞれのウイルスに存在する様々な遺
伝子の発現の上昇を特徴とする。特徴的なウイルス遺伝子の発現レベルの上昇を
検出することにより、疾患状態の有効な診断が提供される。特に、単純ヘルペス
ウイルスのようなウイルスは、短期間で急速に複製を開始するために一定期間静
止状態に入る。特徴的なウイルス遺伝子の発現レベルを検出すれば、そのような
活性増殖（およびおそらく感染性の）状態を検出することができる。

【０００５】さらに、正常または異常な組織内で細胞亜集団によって特徴的な遺伝子が発現
されれば、治療的に重要である細胞の可能性を示す。例えば、特異的表面分子、
増殖因子受容体、または核蛋白質をコードする遺伝子が同定されれば、成人骨髄
、筋肉、および脳において幹細胞の可能性を有するまれな細胞集団の特徴を調べ
ることが可能である。

【０００６】 VLSIPS（商標）技術の開発によって、非常に小さい表面積を占有しうる多くの
異なるプローブのアレイを合成する方法が提供された。米国特許第5,143,854号
および国際公開公報第90/15070号を参照のこと。国際公開公報第92/10588号は、
標的核酸の配列分析のために用いることができるプローブのアレイを作製して、
特異的ヌクレオチド配列を含む核酸の有無を検出する方法を記載している。

【０００７】発明の概要本発明は、一つの細胞、一つもしくは複数の細胞、または細胞の小さい集団に
おいて、複数の遺伝子の発現をモニタリングする方法を提供する。好ましい方法
は、1000個未満の細胞における集団に由来する核酸の集団にプローブのアレイを
接触させ、その後細胞における特異的mRNAの相対量の測定値として核酸の集団に
対するプローブとの相対的ハイブリダイゼーションを決定する段階を必要とする
。

【０００８】本発明はさらに、細胞を分類する方法を提供する。これらの好ましい方法は、
複数の細胞のそれぞれの発現プロフィールを決定した後、発現プロフィールの類
似性によって決定したクラスターに細胞を分類する段階を必要とする。

【０００９】本発明はさらに、細胞系列の分化をモニターする方法を提供する。これらの好
ましい方法は、細胞系列内で異なる分化段階の複数の細胞のそれぞれの発現プロ
フィールを決定する段階を必要とする。次に、これらの細胞を、発現プロフィー
ルの類似性によって決定したクラスターに分類することができる。次に、クラス
ターを発現プロフィールの類似性の順に並べることができる。次に、細胞系列に
おいて異なる分化段階での複数の遺伝子のそれぞれについて、発現レベルの経時
的変化を決定することができる。

【００１０】本発明はさらに、細胞の特性および機能を同定する方法を提供する。これらの
好ましい方法は、細胞の特性および機能を決定するために複数の細胞のそれぞれ
の遺伝子発現プロフィールを比較する段階を必要とする。

【００１１】本発明の態様はさらに、細胞の遺伝子発現プロフィールを、正常、悪性、癌様
、または前癌様細胞の既知の遺伝子発現プロフィールと比較することによって、
正常、悪性、癌様、または前癌様細胞のような細胞試料を診断する方法に向けら
れる。本発明の態様にはさらに、複数の細胞の発現プロフィールを決定する段階
、発現プロフィールの類似性によって決定されるクラスターに細胞を分類する段
階、および複数の細胞の特性および機能を決定する段階によって、特異的細胞型
を同定する方法が含まれる。細胞は、成人脳および末梢知覚器官からの細胞を含
む如何なる組織源にも由来しうる。さらに、細胞は、幹細胞の可能性を有すると
推定されうる。細胞は、細胞のインビトロ増殖を行うことなく、生検から得ても
よい。細胞は、新生物を有することが既知であるか、または疑われる組織から得
てもよい。

【００１２】定義「核酸」または「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの
形態であるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し
、特に明記していなければ、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能しうる天
然のヌクレオチドの既知の類似体を含みうる。

【００１３】ポリヌクレオチドプローブは、一つまたは複数の種類の化学結合によって、通
常では相補的塩基対形成によって、通常では水素結合形成によって、相補的配列
の標的核酸に結合することができる一本鎖核酸である。ポリヌクレオチドプロー
ブは、天然（すなわち、A、G、C、もしくはT）、または改変された塩基（例えば
、7-デアザグアノシン、イノシン）を含みうる。したがって、ポリヌクレオチド
プローブは長さが約5〜10,000、10〜5,000、10〜500、10〜50、10〜25、10〜20
、15〜25、および15〜20塩基となりうる。プローブは典型的に、長さが約10〜50
塩基であり、しばしば15〜25塩基である。この最も単純な態様において、アレイ
には、5塩基より長く、好ましくは10塩基より長く、および時に40塩基より長い
試験プローブ（ポリヌクレオチドプローブとも呼ぶ）が含まれる。プローブはま
た、長さが50塩基未満となりうる。場合によっては、これらのポリヌクレオチド
プローブは、長さが約5〜約45、または5〜約50ヌクレオチドの範囲、または約10
〜約40ヌクレオチド、または約15〜約40ヌクレオチドの範囲となりうる。プロー
ブはまた、長さが約20または25ヌクレオチドとなりうる。

【００１４】さらに、ポリヌクレオチドプローブにおける塩基は、それがハイブリダイゼー
ションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって結合しうる
。このように、ポリヌクレオチドプローブは、構成塩基がホスホジエステル結合
よりむしろペプチド結合によって結合されるペプチド核酸となりうる。標的配列
の遠位セグメントとハイブリダイズするためのプールの構成要素として用いられ
るプローブの長さはしばしば、セグメントの空白が増加すれば増加し、それによ
ってプローブのマッチおよびミスマッチプールのあいだの識別を増加させるため
により大きいストリンジェンシーでハイブリダイゼーションを行うことができる
。

【００１５】標的配列に特異的にハイブリダイズして、これを識別するためには、比較的短
いポリヌクレオチドプローブで十分となりうる。したがって、ポリヌクレオチド
プローブは、長さが50ヌクレオチド未満、一般的に46ヌクレオチド未満、より一
般的に41ヌクレオチド未満、最も一般的に36ヌクレオチド未満、好ましくは31ヌ
クレオチド未満、より好ましくは26ヌクレオチド未満、およびさらにより好まし
くは長さが21ヌクレオチド未満である。本発明の開示における典型的なプローブ
の長さは25ヌクレオチドを有するプローブである。プローブはまた、16ヌクレオ
チド未満、長さ13ヌクレオチド未満、長さ9ヌクレオチド未満、および長さ7ヌク
レオチド未満となりうる。

【００１６】典型的に、アレイは、10ヌクレオチドまたは15ヌクレオチドである短いポリヌ
クレオチドを有しうる。さらに、核酸発現レベルを特異的に検出および定量する
ために20または25ヌクレオチドを用いることができる。ライゲーション識別方法
を用いる場合、ポリヌクレオチドアレイはより短いポリヌクレオチドを含みうる
。より長いポリヌクレオチドを含むアレイもまた適している。高密度アレイは、
約100、1000、16,000、65,000、250,000または約1,000,000個より多くの異なる
ポリヌクレオチドプローブを含みうる。

【００１７】「標的核酸」という用語は、それに対してポリヌクレオチドプローブが特異的
にハイブリダイズするように設計される核酸（しばしば、生体試料に由来する）
を意味する。検出されるのは標的核酸の有無であり、または定量されるのは標的
核酸の量である。標的核酸は、標的に向けられた対応するプローブの核酸配列と
相補的である配列を有する。標的核酸という用語は、それに対してプローブが向
けられるより大きい核酸の特異的小配列、またはその発現レベルが検出されるこ
とが望まれる全体的な配列（例えば、遺伝子またはmRNA）を意味しうる。用途の
差は本明細書から明らかとなりうる。

【００１８】「小配列」とは、核酸のより長い配列の一部を含む核酸配列を意味する。

【００１９】「遺伝子」とは、ヒト染色体のような、染色体において認められる遺伝性の遺
伝物質の単位を意味する。それぞれの遺伝子は、鎖を形成するヌクレオチドの配
列によって示されうるデオキシリボヌクレオチドの直鎖からなる。このように、
「配列」は、鎖を形成するヌクレオチドの順に並んだ一覧とヌクレオチドのその
配列を有する鎖の双方を示すために用いられる。「配列」という用語は、RNA鎖
、リボヌクレオチドで構成された直鎖を述べる場合にも同じように用いられる。
遺伝子には、調節配列、制御配列、RNA分子に転写されうる配列が含まれ、機能
不明の配列を含みうる。RNA産物のいくつか（DNAからの転写産物）は、メッセン
ジャーRNA（mRNA）であり、これには、当初ポリペプチドに翻訳されるリボヌク
レオチド配列（または配列）と翻訳されないリボヌクレオチド配列が含まれる。
翻訳されない配列には、制御配列、イントロン、および機能不明の配列が含まれ
る。同じ遺伝子に関して、ヌクレオチド配列における小さい差が、遺伝子の同一
性を変化させることなく異なる個体間で、または正常細胞と癌様細胞の間で存在
しうると認識されうる。

【００２０】「遺伝子発現パターン」とは、転写または「発現」されて、RNA分子を形成す
る特定の組織または細胞型の遺伝子セットを意味する。特定の細胞株または組織
においてどの遺伝子が発現されるかは、組織または細胞の型、細胞、組織、また
は標的生物の発達段階、および細胞が癌様細胞のような正常または形質転換した
細胞であるか否かのような要因によって左右されうる。例えば、遺伝子は、特異
的標的生物の発達において胚または胎児段階で発現されるが、標的生物が成熟す
るにつれて発現されなくなることがあり得る。または、遺伝子は、成人ヒトの肝
臓組織において発現されうるが、脳組織には存在しない。

【００２１】特異的ハイブリダイゼーションは、その配列がDNAまたはRNAの複合混合物（例
えば、総細胞）DNAまたはRNA中に存在する場合に、ストリンジェントな条件下で
特定のヌクレオチド配列に限って、ある分子が結合、二本鎖形成、またはハイブ
リダイズできることを意味する。ストリンジェントな条件は、プローブがその標
的小配列とハイブリダイズできるが、他の配列とはハイブリダイズできない条件
である。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況が異なれば異なる。
より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、スト
リンジェントな条件は、既定のイオン強度およびpHで特異的配列に対して熱融解
点（T_m）より約5℃低くなるように選択される。T_mは、標的配列と相補的なプロ
ーブの50％が平衡で標的配列とハイブリダイズする温度（既定のイオン強度、pH
、および核酸濃度の下で）である。（標的配列は一般的に過剰量で存在するため
、T_mでは、プローブの50％が平衡して占有される）。典型的に、ストリンジェン
トな条件には、pH 7.0〜8.3で塩濃度が少なくとも約0.01〜1.0 M Naイオン濃度
（または他の塩）が含まれ、短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）の場
合には温度は少なくとも約30℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミ
ドまたはテトラアルキルアンモニウム塩のような脱安定化物質を加えることによ
っても得ることができる。例えば、5×SSPE（750 mM NaCl、50 mM リン酸ナトリ
ウム、5 mM EDTA、pH 7.4）で、温度25〜30℃の条件は、対立遺伝子特異的プロ
ーブハイブリダイゼーションにとって適している（サムブルック（Sambrook）ら
、「分子のクローニング（Molecular Cloning）」、1989を参照のこと）。

【００２２】「完全なマッチプローブ」という用語は、特定の標的配列と完全に相補的であ
る配列を有するプローブを意味する。試験プローブは、典型的に標的配列の一部
（小配列）と完全に相補的である。完全なマッチ（perfect match :PM）プロー
ブは「試験プローブ」、「標準化対照」プローブ、発現レベル対照プローブ等と
なりうる。しかし、完全なマッチ対照または完全なマッチプローブは、「ミスマ
ッチ対照」または「ミスマッチプローブ」と区別される。

【００２３】「ミスマッチ対照」または「ミスマッチプローブ」という用語は、その配列が
特定の標的配列と完全には相補的でないように故意に選択されるプローブを意味
する。高密度アレイにおけるそれぞれのミスマッチ（mismatch :MM）対照に関し
て、典型的に同じ特定の標的配列に対して完全に相補的な対応する完全なマッチ
（PM）プローブが存在する。ミスマッチは一つまたは複数の塩基を含みうる。一
つまたは複数のミスマッチは、ミスマッチプローブのいずれかに存在しうるが、
末端のミスマッチは、標的配列のハイブリダイゼーションを防止する可能性が低
いためにあまり好ましくない。

【００２４】「プローブセット」という用語は、既知の標的配列と完全にマッチした少なく
とも複数の遺伝子を含む。

【００２５】「バックグラウンド」または「バックグラウンドシグナル強度」という用語は
、標識した標的核酸とポリヌクレオチドアレイの構成要素（例えば、ポリヌクレ
オチドプローブ、対照プローブ、またはアレイ基質）との間の非特異的結合、ま
たは他の相互作用が原因であるハイブリダイゼーションシグナルを意味する。バ
ックグラウンドシグナルはまた、アレイ構成要素自身の内因性の蛍光によっても
産生されうる。単一のバックグラウンドシグナルは、完全なアレイについて計算
することができ、または異なるバックグラウンドシグナルは、アレイの各領域に
ついて計算することができる。いくつかの態様において、バックグラウンドは、
アレイのプローブの最低で1％〜10％に関して平均的なハイブリダイゼーション
シグナル強度として計算される。発現モニタリングアレイにおいて（すなわち、
プローブが特異的核酸（遺伝子）とハイブリダイズするように予め選択される場
合）、異なるバックグラウンドシグナルを各標的核酸について計算することがで
きる。異なるバックグラウンドシグナルを各標的遺伝子について計算する場合、
バックグラウンドシグナルは、各遺伝子についてプローブの最低で1％〜10％に
ついて計算される。特定の遺伝子に対するプローブが十分にハイブリダイズして
、このように、標的配列に対して特異的に結合するように思われる場合、それら
は、バックグラウンドシグナル計算に用いてはならない。または、バックグラウ
ンドは試料中に認められる如何なる配列とも相補的でないプローブ（例えば、反
対向きのセンス核酸または試料が哺乳類起源である場合には、細菌遺伝子のよう
な試料中に認められない遺伝子に向けられるプローブ）とのハイブリダイゼーシ
ョンによって産生される平均的なハイブリダイゼーションシグナル強度として計
算することができる。バックグラウンドはまた、如何なるプローブも全く欠損す
るアレイの領域によって産生される平均的なシグナル強度として計算することが
できる。

【００２６】「定量する」という用語は、核酸の量または濃度（例えば、遺伝子の転写レベ
ル）を定量する意味において用いる場合、絶対的または相対的定量を意味しうる
。絶対的な定量は、一つまたは複数の標的核酸の既知濃度（例えば、BioBのよう
な対照核酸、または既知量の標的核酸自身）を含めることにより、および未知の
標的核酸のハイブリダイゼーション強度を既知の標的核酸と比較すること（例え
ば、検量線の作製による）により行うことができる。または、相対的定量は、ハ
イブリダイゼーション強度の変化および暗に転写レベルの変化を定量するために
、二つもしくはそれ以上の遺伝子、または二つもしくはそれ以上の処置のあいだ
のハイブリダイゼーションシグナルの比較によって行うことができる。

【００２７】「クラスター」または「クラスター形成」という用語は、主成分分析および多
様なクラスター形成分析のような、クラスター形成アルゴリズムを意味する。こ
れらのアルゴリズムは、細胞を群に「集合させる」役に立つ。クラスター形成の
目的は、所定のクラスターにおける単離体が類似となり、且つ異なるクラスター
における単離体が類似しない傾向があるように、定義された仮定された公理では
なくてデータによって、示唆される群またはクラスターに単離体を入れることで
ある。クラスター形成方法は、全ての目的に関してその全文が参照として本明細
書に組み入れられる、タマヨら（Tamayo、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1999）
96：2907〜2912）、およびアイセンら（Eisen、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1
998）95：14863〜14868）に記載されている。クラスター形成方法にとって有用
なソフトウェアは、ホワイトヘッド／MITゲノム研究センターによって提供され
るジーンクラスター（Gene Cluster）1.0が含まれる。

【００２８】細胞の小さい集団は、1000個もしくはそれ未満の細胞、典型的に100個もしく
はそれ未満の細胞、または10個もしくはそれ未満の細胞における集団を意味する
。本発明の発現モニタリングは単一の細胞について実施することができる。

【００２９】特定の好ましい態様の詳細な説明本発明の原理は、プローブのアレイを、単一の細胞、または約1000個もしくは
それ未満の細胞における集団に由来する核酸と接触させる段階、および細胞から
の遺伝子の相対的発現を測定するために核酸に対するプローブの相対的ハイブリ
ダイゼーションを決定する段階によって、単一の細胞、一つもしくは複数の細胞
、または細胞の小さい集団からの遺伝子の発現をモニターする方法を実施するた
めに、有利となるように適用してもよい。本発明の一つの態様に従って、プロー
ブのアレイには、GENECHIPのようなマイクロアレイが含まれる。本発明のもう一
つの態様に従って、プローブのアレイには、当技術分野で既知のフィルター、ニ
トロセルロース、ナイロン基質、および他のアレイ基質のような物質が含まれる
。

【００３０】本発明の態様はまた、プローブのアレイを、第一の単細胞と第二の単細胞にそ
れぞれ由来する第一と第二の核酸集団に接触させる段階、および第一の細胞と第
二の細胞のあいだで異なる様式で発現される遺伝子とハイブリダイズする少なく
とも一つのプローブを同定するために、第一の細胞と第二の細胞からの核酸に対
するプローブの相対的ハイブリダイゼーションを決定する段階によって、異なる
様式の発現をモニターする方法にも向けられる。方法の一つの局面に従って、第
一および第二の核酸集団は、異なる様式で標識され、プローブのアレイに同時に
適用される。または、第一および第二の核酸集団をプローブのアレイに個別に適
用する。プローブのアレイには、既知の複数の転写物のそれぞれに対して完全に
相補的である、または完全にマッチする複数のプローブが含まれる。もう一つの
態様において、プローブは遺伝子をクローニングするために異なる様式で発現さ
れた遺伝子に結合してもよい。さらなる態様に従って、異なる様式で発現された
遺伝子にハイブリダイズするプローブからの配列を含む核酸配列に関して、核酸
配列のデータベースを検索することができる。第一および第二の細胞は、共通の
細胞系列内で異なる発達段階となりうる。

【００３１】本発明の態様はさらに、プローブのアレイまたは複数のアレイを、各細胞に由
来する核酸と接触させる段階、細胞からの遺伝子の相対的発現を測定するために
核酸に対するプローブの相対的ハイブリダイゼーションを決定する段階、および
発現プロフィールの類似性に従って細胞をクラスターに分類する段階によって、
複数の細胞のそれぞれの発現プロフィールを決定することによって、遺伝子発現
の類似性に従って細胞を分類する方法に向けられる。本発明の態様はなおさらに
、プローブのアレイまたは複数のアレイを、各細胞に由来する核酸に接触させる
こと、細胞からの遺伝子の相対的発現を測定するために核酸に対するプローブの
相対的ハイブリダイゼーションを決定することによって、細胞系列内で異なる分
化段階の複数の細胞のそれぞれの発現プロフィールを決定する段階を含む、細胞
系列の分化をモニターする方法にも向けられる。次に、細胞を発現プロフィール
の類似性に従ってクラスターに分類した後、クラスターを発現プロフィールの類
似性の順に並べることができる。発現レベルの経時的変化は、細胞系列における
異なる分化段階で複数の遺伝子のそれぞれについて決定することができる。

【００３２】本発明の方法によって、所定の第一の細胞と所定の第二の細胞のあいだで異な
る様式で発現された遺伝子を都合よく決定することができる。二つの細胞は、共
通の細胞系列内の異なる発達段階であってもよい。本発明の方法によって、発現
パターンを比較し、異なる発達段階でどの遺伝子が発現されるかを決定すること
ができると考えられる。本発明の開示に従って、上記の方法には、以下の一般的
局面が含まれる：核酸の試料の調製；核酸の試料とアレイとのハイブリダイゼー
ション；ハイブリダイズした核酸の検出；および方法のさらなる局面において、
ハイブリダイゼーションパターンの分析。

【００３３】本発明の方法によって、複数の細胞からの発現プロフィールの特徴を調べて比
較すること、または本発明に従って得られた発現プロフィールを所定の細胞型に
ついて既知の発現プロフィールのデータベースと比較することによって、細胞の
特性、機能、または疾患状態を都合よく同定することができる。本発明の方法は
また、複数の細胞からの発現プロフィールの特徴を調べて比較すること、本発明
に従って得られた発現プロフィールを所定の細胞型について既知の発現プロフィ
ールのデータベースと比較することによって、所望の細胞型を都合よくアッセイ
またはスクリーニングすることができる。

【００３４】1．試料の調製遺伝子または複数の遺伝子の転写レベル（およびそれによって発現レベル）を
測定するために、遺伝子または複数の遺伝子のmRNA転写物を含む核酸試料、また
はmRNA転写物に由来する核酸を提供する。mRNA転写物に由来する核酸は、その全
合成のために、mRNA転写物またはその小配列が最終的に鋳型として役立つ核酸を
意味する。このように、mRNAから逆転写されたcDNA、cDNAから転写されたRNA、c
DNAから増幅したDNA、増幅したDNAから転写されたRNAは全てmRNA転写物に由来し
、そのような由来した産物が検出されれば、試料中に当初の転写物の有無および
／または量が示される。このように、適した試料には、遺伝子または複数の遺伝
子のmRNA転写物、mRNAから逆転写されたcDNA、cDNAから転写したcRNA、遺伝子か
ら増幅したDNA、増幅したDNAから転写したRNA等が含まれる。いくつかの方法に
おいて、核酸試料は生体試料から単離された総mRNAである。本明細書において用
いられる「生体試料」という用語は、生物、または構成要素（例えば、細胞）も
しくは生物から得られた試料を意味する。試料はいかなる生体組織または液体の
試料となりうる。しばしば、試料は患者から得る。そのような試料には、喀痰、
血液、血球（例えば、白血球）、組織または細針生検試料、尿、腹水、および胸
水、またはそれに由来する細胞が含まれる。生体試料には、組織学目的のために
採取した凍結切片のような組織切片が含まれうる。しばしば、2つの試料は、比
較目的のために提供される。試料は例えば、異なる細胞もしくは組織の型、異な
る種、同じ種の異なる個体、または異なる2つの処置を行った（例えば、薬剤治
療、および対照）同じ当初の試料に由来しうる。

【００３５】2．方法（a）cDNAの作製例えば、核酸の単離および精製方法は、国際公開公報第97/10365号、国際公開
公報第97/27317号、「生化学と分子生物学の実験技術第3章：核酸プローブとの
ハイブリダイゼーション、パートI 理論と核酸の調製（Chapter 3 of Laborato
ry Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization With
Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation）」、チ
ーセン（P. Tijssen）編、エルゼビア、ニューヨーク州（1993）、および「生化
学と分子生物学の実験技術第3章：核酸プローブとのハイブリダイゼーション、
パートI 理論と核酸の調製（Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochem
istry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes, Par
t I. Theory and Nucleic Acid Preparation）」、チーセン（P. Tijssen）編、
エルゼビア、ニューヨーク州（1993）に詳細に記載されている。

【００３６】総核酸は、例えば、酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム抽出法を用い
て所定の試料から単離することができ、およびポリA+ mRNAは、オリゴdTカラム
クロマトグラフィーまたは（dT）n磁気ビーズを用いて単離する（例えば、サム
ブルック（Sambrook）ら、「分子のクローニング：実験マニュアル（Molecular
Cloning：A Laboratry Manual）」第二版、1〜3巻、コールドスプリングハーバ
ー研究所（1989）、または「分子生物学の現行プロトコール（Current Protocol
s in Molecular Biology）」、アウスユベール（F. Ausubel）ら、グリーンパブ
リッシングウィレーインターサイエンス、ニューヨーク州（1987）を参照のこと
）。

【００３７】試料mRNAは、逆転写酵素およびオリゴdTとファージT7プロモーターをコードす
る配列とからなるプライマーによって逆転写して、一本鎖DNA鋳型を提供するこ
とができる。第二のDNA鎖は、DNAポリメラーゼを用いて重合した。インビトロ重
合化方法は周知であり（例えば、サムブルック（Sambrook）、上記を参照のこと
）、この特定の方法は、ファンゲルダーら（van Gelder、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 87：1663〜1667（1990））によって詳細に説明されており、彼らはこの
方法に従ったインビトロ増幅が様々なRNA転写物の相対的頻度を保存することを
報告した。エバーワインら（Eberwine、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1992）89
：3010〜3014）は、インビトロ転写による2サイクルの増幅を使用し、それによ
って発現のモニタリングを可能にするさらなるプロトコールを提供する。エバー
ワイン（Eberwine）らは、（Methods（1996）10(3)：283〜8）においてもう一つ
の増幅方法を記述している。もう一つの増幅方法は、ディクソンら（Dixon、Nec
leic Acids Res（1998）26(19)：4426〜31）に記載されている。なおさらなる増
幅方法は、デュラックら（Dulac、Cell（1995）83：195〜206）に記載された増
幅方法である。別の増幅方法は、参照として本明細書に組み入れられる、1999年
3月30日に出願された米国特許出願第60/126,796号；ブラディら（Brady, G.、Me
dhods in Molecular and Cellular Biology 2：17〜25（1990）；ブラディら（B
rady, G.）、Current Biology（1995）5：909〜922）に記載されている。いくつ
かの方法において、個々の細胞または単細胞集団を組織生検または顕微解剖から
得る。他の方法において、単細胞は細胞ソーティングによって得る。別の方法に
おいて、単細胞は連続希釈によって得る。cDNAの好ましい合成および増幅方法は
、デュラック（Dulac, C.、Curr. Top. Dev. Biol.（1998）36：245〜58（1998
））に記載されている；この参考文献およびその中に引用されている全ての参考
文献は参照として本明細書に組み入れられる）。核酸は典型的に標識される。標
識は、増幅の際にプライマーの一つとの結合によって、または組み入れられるヌ
クレオチドの一つによって導入することができる。または、標識は、末端標識に
よる増幅および切断後に行うことができる。本発明において用いるのに適した検
出可能な標識には、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学、電気的、光学的、
または化学的手段によって検出可能な如何なる組成物も含まれる：国際公開公報
第97/10365号を参照のこと。

【００３８】好ましい方法は、分析すべき単一の細胞内でポリA⁺ RNAの完全な集団の増幅を
行う。好ましい方法はまた、増幅されるmRNAの種を保存する直線的増幅も提供す
る。

【００３９】 PCR増幅法は、「PCR技術：原理とDNA増幅への応用（PCR Technology：Princip
les and Applications for DNA Amplification）」（エールリッヒ（H.A. Ehrli
ch）編、フリーマンプレス、ニューヨーク、ニューヨーク州、1992；「PCRプロ
トコール：方法と応用の手引き（PCR Protocols：A Guide to Methods and Appl
ications ）」（イニス（Innis）ら編、アカデミックプレス、サンジエゴ、カリ
フォルニア州、1990）；マティラら（Mattila）、Nucleic Acids Res. 19、4967
（1991）；エッカートら（Eckert）、PCR Methods and Applications 1、17（19
91）；「PCR」（マクファーソン（McPherson）ら編、IRLプレス、オックスフォ
ード）；および米国特許第4,683,202号（そのそれぞれが全ての目的に関して参
照として本明細書に組み入れられる）。標的試料における核酸は、増幅混合物に
おいて一つまたは複数の標識ヌクレオチドを含めることによって増幅の過程で通
常標識される。標識はまた、増幅後、例えば末端標識によって増幅産物に結合さ
せることができる。増幅産物は、増幅反応において用いられる酵素と基質に応じ
てRNAまたはDNAとなりうる。

【００４０】他の適した増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（LCR）（ウ＆ワラス（Wu and Wa
llace）、Genomics 4、560（1989）；ランデグレンら（Landegren）、Science 2
41、1077（1988））、転写増幅（オウ（Kwoh）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86、1173（1989））、および自動継続配列複製（グアテリ（Guatelli）ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 87、1874（1990））、および核酸に基づく配列増幅（
NASBA）が含まれる。後者の2つの増幅方法は、等温転写に基づく等温反応を含み
、これは増幅産物として一本鎖RNA（ssRNA）と二本鎖DNA（dsDNA）の双方をそれ
ぞれ、約30：1または100：1の比で産生する。

【００４１】多様な標識が増幅の過程において、または増幅後標的核酸に組み入れることが
できる。適した標識には、フルオレセインまたはビオチンが含まれ、後者はハイ
ブリダイゼーション後フィコエリスリン-ストレプトアビジンによる染色によっ
て検出される。いくつかの方法において、標的核酸のハイブリダイゼーションを
対照核酸と比較する。選択的に、そのようなハイブリダイゼーションは、標的試
料と対照試料について異なる標識を用いることによって同時に行うことができる
。対照試料と標的試料は、望ましければ、蛍光強度を等しくするためにハイブリ
ダイゼーションの前に希釈することができる。

【００４２】3．支持体支持体は、ガラス、シリカ、プラスチック、ナイロン、またはニトロセルロー
スのような多様な物質で構成されうる。支持体は、非多孔性または多孔性であっ
てもよく、当技術分野で既知の被膜、桿状、ビーズ、糸、針金、および他の支持
体形状であってもよい。支持体は好ましくは堅固で平坦な表面を有する。支持体
は典型的に、1個〜10,000,000個の個々の空間的に位置特定可能な領域または合
成セルを有する。10〜1,000,000個または100〜100,000個、または1000〜100,000
個の合成セルを有する支持体が一般的である。合成セルの密度は典型的に、1平
方センチメートルあたり少なくとも1000、10,000、100,000、または1,000,000個
の合成セルである。典型的に合成セル1個あたり単一の型のプローブが存在する
。いくつかの支持体において、全ての合成セルはプローブのプールした混合物に
よって占有される。他の支持体において、いくつかの合成セルはプローブのプー
ルした混合物によって占有され、他の合成セルは、少なくとも合成方法によって
得ることができる純度の程度まで、単一の型のポリヌクレオチドによって占有さ
れる。本出願において記述されるプローブの設計の戦略を、同じアレイにおいて
、国際公開公報第95/11995号、欧州特許第717,113号、および国際公開公報第97/
29212号によって記載されるような他の戦略と組み合わせることができる。

【００４３】アレイにおけるそれぞれの異なるポリヌクレオチドプローブの位置および配列
は一般的に既知である。その上、多数の異なるプローブが、比較的小さい面積を
占有して、それによって一般的にプローブ密度が1cm²あたり約60個より多く、よ
り一般的に約100個より多く、および最も一般的に約600個より多く、しばしば約
1000個より多く、よりしばしば約5,000個より多く、最もしばしば約10,000個よ
り多く、好ましくは約40,000個より多く、より好ましくは約100,000個より多く
、および最も好ましくは約400,000個より多くの異なるポリヌクレオチドプロー
ブを有する高密度アレイを提供することができる。アレイの表面積が小さければ
（しばしば、約10 cm²未満、好ましくは約5cm²未満、より好ましくは約2cm²未満
、および最も好ましくは約1.6 cm²未満）、少量の試料容積と極めて均一なハイ
ブリダイゼーション条件を用いることができる。

【００４４】4．プローブアレイの合成プローブのアレイは、支持体上で段階的に合成することができる、または予め
合成した形で結合させることができる。本発明のプローブのアレイには、小型の
アレイまたはマイクロアレイが含まれる。好ましい合成方法は、VLSIPS（商標）
（フォドー（Fodor）ら、1991、フォドー（Fodor）ら、1993、Nature 364、555
〜556；マクゴール（McGall）ら、米国特許出願第08/445,332号；米国特許第5,1
43,854号；欧州特許第476,014号を参照のこと）であり、これは高密度の小型ア
レイにおいてポリヌクレオチドプローブの合成を指示するために光を用いること
を必要とする。合成サイクル数を減少させるためにマスクを設計するためのアル
ゴリズムは、ハッベル（Hubbel）ら、米国特許第5,571,639号および米国特許第5
,593,839号に記載されている。アレイはまた、機械的に拘束された流路によって
支持体のセルに単量体を輸送することによって組み合わせて合成することができ
る。ウィンクラー（Winkler）らの欧州特許第624,059号を参照のこと。アレイは
また、インクジェットプリンターを用いて支持体上に単量体試薬を吹き付けるこ
とによって合成することができる。例えばピーズ（Pease）らの欧州特許第728,5
20号を参照のこと。

【００４５】対照および標的試料を、一つまたは複数のプローブセットを含むアレイにハイ
ブリダイゼーションさせて、最適な洗浄を行って未結合プローブと非特異的結合
プローブとを除去した後、それぞれの試料のハイブリダイゼーション強度をアレ
イにおけるそれぞれのプローブについて決定する。蛍光標識に関して、ハイブリ
ダイゼーション強度は、例えば、光子計数モードで走査型共焦点顕微鏡によって
決定することができる。適当な走査装置は、例えば、トルルソン（Trulson）ら
の米国特許第5,578,832号；スターン（Stern）らの米国特許第5,631,734号に記
載されており、アフィメトリクスインク社からGENECHIP標識として利用可能であ
る。いくつかの型の標識は、酵素的な方法によって増幅することができるシグナ
ルを提供する（ブロード（Broude）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91、3072
〜3076（1994））。

【００４６】5．アレイの設計（a）カスタムアレイ（custmized array）と一般的アレイ発現モニタリングのためのアレイの設計は、例えば、国際公開公報第97/27317
号および国際公開公報第97/10365号に記載されている。主に2つのアレイの分類
が存在する。一つの型のアレイは、予め既知である特定のmRNA配列の存在および
／またはレベルを検出する。これらのアレイにおいて、ポリヌクレオチドプロー
ブはmRNA遺伝子配列の特定の予め選択した小配列とハイブリダイズするように選
択することができる。そのような発現モニタリングアレイは、検出されるそれぞ
れのmRNAに対して複数のプローブを含みうる。mRNAの分析に関して、プローブは
、標的核酸に含まれるmRNAの領域と相補的であるように設計される（すなわち、
3'末端または3'末端から一定距離離れた場所）。アレイはまた、一つまたは複数
の制御プローブを含みうる。

【００４７】他の型のアレイは、mRNAまたはmRNAタグの配列が予め既知であるか否かによら
ず、mRNAを分析するためにアレイを用いることができるという意味において、一
般的アレイと呼ばれる。そのようなアレイは、無作為、偶然に選択した、または
任意のプローブセットを含みうる。または、一般的アレイは、特定の予め選択し
た長さの全ての可能性があるポリヌクレオチドを含みうる。無作為ポリヌクレオ
チドアレイは、特定の長さのヌクレオチド配列のプールが、その長さについて可
能性がある全ての配列の集合体から無作為に選択した（すなわち、盲検的、不偏
な選択的）ヌクレオチド配列のプールから有意に逸脱しないアレイである。ポリ
ヌクレオチドプローブの任意または偶然のヌクレオチドアレイは、標的核酸を同
定および／または予め選択することなく、ポリヌクレオチドプローブが選択され
るアレイである。任意または偶然のヌクレオチドアレイは、近似となり得て、無
作為にさえなりうるが、それらが無作為性の統計学的定義を満たす保証はない。
アレイは、本明細書に記載のようにプローブの組成、および／またはプローブの
非重複性、および／またはコード配列の偏りに基づいて何らかのヌクレオチド選
択を反映することができる。しかし、そのようなプローブセットはなおも如何な
る特定の遺伝子に対しても特異的となるように選択されない。

【００４８】または、一般的アレイは、所定の長さについて起こりうる全てのヌクレオチド
を含みうる；すなわち、配列のあらゆる順列に対応する配列を有するポリヌクレ
オチド。このように、本発明のポリヌクレオチドプローブは、好ましくは4塩基
（A、G、C、T）もしくは（A、G、C、U）またはこれらの塩基の誘導体までを含む
ため、長さがXの起こりうる全てのヌクレオチドを有するアレイは、実質的に4^X
個の異なる核酸を含む（例えば、2量体に関しては16個の異なる核酸、3量体に関
しては64個の異なる核酸、8量体に関しては65536個の異なる核酸）。いくつかの
少数の配列は、合成問題のために特定の長さの全ての起こりうるヌクレオチドの
プールから存在しないことがありうる。長さがXである全ての可能性があるヌク
レオチドを含むアレイは、長さがXの実質的に起こりうる全てのヌクレオチドを
有するアレイを意味する。長さがXの可能性がある全てのヌクレオチドは、90％
より多く、典型的に95％より多く、好ましくは98％より多く、より好ましくは99
％より多く、および最も好ましくは99.9％より多くの可能性がある数の異なるヌ
クレオチドを含む。一般的アレイは、2つのmRNA集団またはそれに由来する核酸
のあいだの比較ハイブリダイゼーション分析にとって特に有用である。

【００４９】（b）変法（1）定常領域カスタムアレイおよび一般的アレイの双方において、プローブは、標的核酸と
のハイブリダイゼーションを介する可変領域と融合したさらなる定常領域を含み
うる。いくつかのアレイにおいて、定常領域は二本鎖であり、それによってハイ
ブリダイズした標的が固定プローブにライゲーションすることができる部位を提
供する。定常ドメインは、実質的に全てのポリヌクレオチドプローブに共通する
ヌクレオチド小配列である。定常ドメインは典型的に、基質に最も近いポリヌク
レオチドプローブの末端に存在する（すなわち、リンカー／もう一つの分子に結
合した）。定常領域は、実質的に如何なる配列も含みうる。いくつかの定常領域
は、制限酵素切断部位（制限酵素によって認識される核酸配列）のセンス鎖また
はアンチセンス鎖と相補的な配列または小配列を含む。

【００５０】定常領域は、アレイ上で新規に合成することができ、または別の技法で調製し
て、その後無傷でアレイにカップリングさせることができる。定常ドメインは、
個々に合成してから、無傷の定常小配列を高密度アレイにカップリングさせるこ
とができるため、定常ドメインは実質的に如何なる長さともなりうる。いくつか
の定常ドメインは、長さが3ヌクレオチドから約500ヌクレオチド、より典型的に
長さが約3ヌクレオチドから約100ヌクレオチド、最も典型的に長さが3ヌクレオ
チドから約50ヌクレオチドの範囲である。定常ドメインはまた、長さが3ヌクレ
オチドから約45ヌクレオチド、または長さが3ヌクレオチドから約25ヌクレオチ
ド、または長さが3〜約15、またはさらに10ヌクレオチドさえの範囲となりうる
。定常ドメインはまた、長さが約5ヌクレオチド〜約15ヌクレオチドの範囲とな
りうる。

【００５１】（2）制御プローブカスタムアレイまたは一般的プローブアレイのいずれかは、上記のプローブの
他に対照プローブを含みうる。

【００５２】（a）標準化対照標準化対照は典型的に、核酸試料に加えられる一つまたは複数の参照ポリヌク
レオチドと完全に相補的である。ハイブリダイゼーション後の標準化対照から得
たシグナルは、ハイブリダイゼーション条件の変更、標識の強度、読みとりおよ
び分析効率、ならびに完全なハイブリダイゼーションシグナルをアレイのあいだ
で変化させうる他の要因に対する対照を提供する。アレイにおける他の全てのプ
ローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）の読みを対照プローブからのシグナ
ル（例えば、蛍光強度）によって除して、それによって測定を標準化することが
できる。

【００５３】実質的に如何なるプローブも標準化対照として役立ちうる。しかし、ハイブリ
ダイゼーション効率は、塩基の組成とプローブの長さによって変化しうる。標準
化プローブは、アレイに存在する他のプローブの平均的な長さを反映するように
選択することができるが、それらは一定範囲の長さを含むように選択することが
できる。一つまたは複数の標準化対照は、アレイにおける他のプローブの（平均
的な）塩基組成を反映するように選択することができる。しかし、一つまたは少
数の標準化プローブを用いることができ、それらは、それらがウェルとハイブリ
ダイズするが（すなわち、二次構造なし）如何なる標的特異的プローブもマッチ
しないように選択することができる。

【００５４】標準化プローブは、ハイブリダイゼーションにおいて空間的変動を効率よく制
御するために、アレイにおける如何なる位置で、またはアレイ全体を通じて多数
の位置で存在しうる。標準化対照は、アレイの角または端部と共にアレイの中央
に存在しうる。

【００５５】（b）発現レベル対照発現レベル対照は、生体試料において構成的に発現された遺伝子と特異的にハ
イブリダイズするプローブとなりうる。発現レベル対照は、細胞の全体的な健康
および代謝活性を制御するように設計することができる。発現レベル対照と標的
核酸の発現レベルとの共分散を調べると、遺伝子の発現レベルにおいて測定され
た変化または変動が、その遺伝子の転写速度の変化または細胞の健康における一
般的変動によることを示すことができる。このように、例えば、細胞の健康が不
良であるか、または重要な代謝物を欠損する場合、能動的な標的遺伝子と構成的
に発現された遺伝子の双方の発現レベルは減少すると予想される。この逆もまた
当てはまりうる。このように、発現レベル対照と標的遺伝子の双方の発現レベル
がいずれも減少するか、またはいずれも増加するように思われる場合、変化は、
対象となる標的遺伝子が異なる様式で発現しているのではなく、全体として細胞
の代謝活性の変化に帰因しうる。逆に、標的遺伝子の発現レベルと発現レベル対
照が同時に変化しなければ、標的遺伝子の発現レベルの変動は、細胞の代謝活性
の全体的な変化ではなくてその遺伝子の調節の差に帰因しうる。

【００５６】構成的に発現された実質的に如何なる遺伝子も発現レベル対照のための適した
標的を提供しうる。典型的に発現レベル対照プローブは、β-アクチン遺伝子、
トランスフェリン受容体遺伝子、GAPDH遺伝子等を含むがこれらに限定されるこ
とはない構成的に発現された遺伝子の小配列と相補的である配列を有しうる。

【００５７】（c）ミスマッチ対照ミスマッチ対照はまた、標的遺伝子に対するプローブ、発現レベル対照、また
は標準化対照のために提供されうる。ミスマッチ対照は典型的に、既知のmRNA種
にマッチしたプローブを含むカスタムアレイにおいて用いられる。例えば、いく
つかのそのようなアレイは、それぞれのマッチプローブに対応するミスマッチプ
ローブを含む。ミスマッチプローブは、ミスマッチの少なくとも一つの位置を除
いて、その対応するマッチプローブと同じである。ミスマッチ塩基は、プローブ
がそうでなければ特異的にハイブリダイズする標的配列における対応する塩基と
相補的でないように選択された塩基である。適当なハイブリダイゼーション条件
（例えば、ストリンジェントな条件）において、試験または対照プローブがその
標的配列とハイブリダイズするが、ミスマッチプローブはハイブリダイズするこ
とができない（または有意に低い程度にハイブリダイズすることができる）と予
想されうるように、一つまたは複数のミスマッチを選択する。ミスマッチプロー
ブは中央部ミスマッチを含みうる。このように、例えば、プローブが20量体であ
る場合、対応するミスマッチプローブは、6位〜14位（中心部ミスマッチ）のい
ずれかの位置で単一の塩基ミスマッチ（例えば、Aの代わりにG、C、またはTを用
いる）を有することを除いて同一の配列を有しうる。

【００５８】一般的（例えば、無作為、任意、または偶然）アレイにおいて、標的核酸は不
明であるために、完全なマッチおよびミスマッチプローブは、決定、設計、また
は選択される仮定された公理となりえない。この場合、プローブは、プローブの
各対が一つまたは複数の予め選択されたヌクレオチドにおいて異なる対として提
供されうる。このように、対におけるどのプローブが完全なマッチであるかは仮
定された公理として知られていないが、対の他のプローブは、標的配列のミスマ
ッチ対照として作用しうることは知られている。完全なマッチおよびミスマッチ
プローブを対として提供する必要はないが、特定の予め選択されたヌクレオチド
において互いに異なるプローブのより大きい集合体（例えば、3、4、5個または
それ以上）として提供されうる。

【００５９】カスタムアレイおよび一般的アレイの双方において、ミスマッチプローブは、
プローブが相補的である標的以外の試料中の核酸と非特異的結合または交差ハイ
ブリダイゼーションに対する対照を提供しうる。このように、ミスマッチプロー
ブはハイブリダイゼーションが特異的であるか否かを示すことができる。例えば
、相補的標的が存在する場合、完全なマッチプローブを含む合成セルは、ミスマ
ッチプローブを含むセルより一貫して明るくなりうる。さらに、全ての中心部ミ
スマッチが存在する場合、ミスマッチプローブは変異を検出するために用いるこ
とができる。最後に、完全なマッチとミスマッチプローブ（I(PM)-I(MM)）のあ
いだの強度の差は、ハイブリダイズした物質の濃度のよい測定値を提供しうる。

【００６０】（d）試料の調製、増幅、および定量対照アレイはまた、試料調製／増幅対照プローブを含みうる。これらは、それらが
アッセイされる特定の生体試料の核酸において通常起こらないことから、選択さ
れた対照遺伝子の小配列と相補的であるプローブとなりうる。適した試料調製／
増幅対照プローブには、例えば、調べる試料が真核細胞からの生体試料である場
合に細菌遺伝子に対するプローブ（例えば、Bio B）が含まれる。

【００６１】次に、RNA試料に、試料調製／増幅対照プローブがプロセシング前に向けられ
る核酸の既知量を加えることができる。試料調製物／増幅対照プローブのハイブ
リダイゼーションの定量は、プロセシング段階によって引き起こされる核酸の量
の変化の手段を提供しうる（例えば、PCR、逆転写、またはインビトロ転写）。

【００６２】定量対照は類似となりうる。典型的に、それらはハイブリダイゼーションの前
に既知量の試料核酸と組み合わせることができる。それらは、定量参照を提供し
、ハイブリダイゼーション量（濃度）を定量するための検量線の決定を行うため
に有用である。

【００６３】6．検出方法一つの検出方法において、mRNA、またはそれに由来する核酸は、典型的に変性
型でアレイに適用される。核酸の構成要素の鎖は、相補的プローブとハイブリダ
イズし、これは標識を検出することによって同定される。選択的に、マッチプロ
ーブのハイブリダイゼーションシグナルを、対応するミスマッチまたは他の対照
プローブのシグナルと比較することができる。ミスマッチプローブの結合はバッ
クグラウンドの測定として役立ち、マッチプローブの結合から差し引くことがで
きる。完全なマッチプローブとミスマッチプローブのあいだに結合の有意な差が
あれば、マッチプローブが相補的である核酸が存在することを示している。完全
にマッチプローブとの結合は、ミスマッチプローブに対する結合より典型的に少
なくとも1.2、1.5、2、5、10、または20倍高い。

【００６４】上記の方法の変法において、核酸を標識しないが、核酸鎖を鋳型として用いて
核酸鎖にハイブリダイズしたプローブの鋳型方向伸長によって検出する。プロー
ブは、標識したヌクレオチドによって伸長し、標識の位置は、アレイにおいてプ
ローブが伸長されていることを示している。異なる標識を有する異なる塩基を用
いて多数回の伸長を行うことによって、それに対してタグがハイブリダイズする
プローブとの相補性によって決定するより、タグにおけるさらなる塩基の同一性
を決定することが可能である。プローブの標的依存的伸長を用いることは、米国
特許第5,547,839号に記載されている。

【００６５】さらなる変法において、タグ鎖とハイブリダイズしたプローブをイノシンによ
って伸長する。イノシンまたはタグ鎖のいずれかを標識することができる（図6
を参照のこと）。イノシン（これは他の全ての塩基と対を形成することができる
）のような縮重塩基を加えると、ポリヌクレオチドプローブと変性一本鎖DNAと
のあいだの二本鎖安定性を増加させることができる。1−6イノシンをプローブの
末端に加えれば、一般的なライゲーションアレイ上でのハイブリダイゼーション
とライゲーション反応の双方のシグナル強度を増加させうる。これによって、よ
り高い温度でのライゲーションが可能となる。縮重塩基を用いることは、国際公
開公報第97/27317号に記載されている。

【００６６】ライゲーション反応は、特にミスマッチがポリヌクレオチドプローブの5'末端
近傍である場合に、完全に相補的なハイブリッドと一つまたは複数の塩基対が異
なるハイブリッドとのあいだの区別の改善を提供することができる。シグナル検
出においてライゲーション反応を用いることは、ハイブリッド二本鎖の安定性を
増加させ、ハイブリダイゼーション特異性を改善し（特に、より短いポリヌクレ
オチドプローブの場合（例えば、5〜12量体）、および選択的にさらなる配列情
報を提供する。シグナル検出において用いられるライゲーション反応は、国際公
開公報第97/27317号に記載されている。選択的に、ライゲーション反応は、イノ
シンまたは他の塩基のいずれかによってプローブの鋳型方向伸長と組み合わせて
用いることができる。

【００６７】7．ハイブリダイゼーションパターンの分析標識の位置は、アレイにおける各プローブに関して検出し、したがって、アレ
イ上のプローブと相補的である各配列の濃度は、米国特許第5,143,854号、国際
公開公報第90/15070号、およびトルルソンら（Trulson、上記）によって記述さ
れるように、読みとり装置を用いて蛍光強度を測定することによって決定される
。カスタムアレイの場合、ハイブリダイゼーションパターンを分析して、例えば
国際公開公報第97/10365号に記載のように分析される試料中の既知のmRNA種の存
在および／または相対量または絶対量を決定することができる。2つの試料の発
現パターンの比較は、mRNAおよび2つの試料のあいだで異なる様式で発現される
その対応する遺伝子を同定するために有用である。

【００６８】多数の遺伝子の発現レベルの定量的モニタリングは、遺伝子機能の解明、疾患
の原因とメカニズムの探索、および可能性がある治療的および診断的標的の発見
において貴重であることを証明しうる。発現モニタリングは、その発現が疾患状
態において変化している核酸の発現（転写）レベルをモニターするために用いる
ことができる。例えば、癌は乳癌の場合にHER2（c-erbB-2/neu）癌原遺伝子のよ
うな特定のマーカーの過剰発現を特徴としうる。

【００６９】発現モニタリングは、薬剤のような既定の刺激に反応した様々な遺伝子の発現
をモニターすることができる。これは、終点の記述が複雑なものであれば、一つ
の特定の遺伝子が過剰発現、または過小発現されるか否かを単に問うことなく医
薬品研究において特に有用である。したがって、疾患状態または薬剤の作用様式
が十分に特徴付けされていない場合、発現モニタリングによって、特に関連する
遺伝子の迅速な定量が可能となる。

【００７０】一般的アレイにおいて、ハイブリダイゼーションパターンはまた、どのプロー
ブが試料中のどのmRNAに対応するかは直ちにはわからないが、試料中の相対的mR
NAの存在および量の測定である。

【００７１】しかし、特定の遺伝子に関する知識がなくても、有用な遺伝子を同定する妨害
とはならない。例えば、健康な細胞に関して特定の一般的アレイ上でのハイブリ
ダイゼーションパターンが既知で、疾患細胞のパターンとは有意に異なる場合、
疾患を有する細胞が健康な細胞のパターンに似たパターンとなるようにする化合
物に関して化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。これは、
薬剤に対する細胞の反応の詳しい測定を提供する。

【００７２】一般的アレイは、遺伝子の発見のためと、様々な刺激に対する複雑な細胞反応
の基礎となるメカニズムを解明するために強力なツールである。例えば、一般的
アレイは、発現フィンガープリンティングのために用いることができる。特定の
細胞型からのmRNAが、異なる条件（例えば、疾患状態において特定の遺伝子にお
ける変異を有する場合）で異なる明確な全体的なハイブリダイゼーションパター
ンを示すことが判明すると仮定する。この発現パターン（発現フィンガープリン
ト）は、異なる場合において再現可能で明らかに識別可能であれば、非常に詳し
い診断剤として用いることができる。パターンが十分に解釈可能である必要はな
く、特定の細胞状態に対して単に特異的であればよい（および好ましくは診断お
よび／または予後関連性）

【００７３】カスタムアレイおよび一般的アレイの双方を薬剤安全性研究に用いることがで
きる。例えば、新しい抗生物質を作製する場合、哺乳類細胞に対する発現プロフ
ィールに有意に影響を及ぼしてはならない。ハイブリダイゼーションパターンは
、例えば、毒性スクリーニングとして、細胞に及ぼす薬剤の影響の詳細な測定と
して用いることができる。

【００７４】一般的アレイのハイブリダイゼーションパターンによって提供される配列情報
を用いて、アレイとハイブリダイズしたmRNAをコードする遺伝子を同定すること
ができる。そのような方法は、国際公開公報第97/27317号に記載される標的核酸
として本発明のDNA核酸を用いて行うことができる。DNA核酸を変性させて、国際
公開公報第97/27317号に記載する標準的な条件を用いて、プローブの相補的領域
とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションパターンは、どの
プローブが試料中の核酸鎖と相補的であるかを示す。2つの試料のハイブリダイ
ゼーションパターンを比較すれば、どのプローブが2つの試料のあいだで異なる
様式で発現されたmRNAに由来する核酸鎖とハイブリダイズするかが示される。こ
れらのプローブは、それらが異なる発現を受けるmRNA種に対して相補的な配列を
含むことから特に重要である。そのようなプローブの配列は既知であり、そのよ
うなmRNAが既にシークエンシングされていれば、異なる発現を受ける完全長のmR
NAの同一性を決定するために、データベースにおける配列と比較することができ
る。または、プローブの配列を用いて、異なる様式で発現されたmRNAをクローニ
ングするためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーを設計するこ
とができる。異なる様式で発現されたmRNAは、典型的に、関係するmRNAが最高レ
ベルで発現される試料からクローニングされる。いくつかの方法において、デー
タベース比較またはクローニングは、上記のように鋳型依存的伸長によってプロ
ーブ配列から推定することができる以上にさらなる配列情報を提供することによ
って容易となる。

【００７５】8．キット本発明はさらに、上記のプローブアレイを含むキットを提供する。キットの選
択的なさらなる構成要素には、例えば他の制限酵素、逆転写酵素、またはポリメ
ラーゼ、基質ヌクレオシド三リン酸、標識するために用いられる手段（例えば、
アビジン酵素結合体および酵素基質と標識がビオチンである場合には色原体）、
および逆転写酵素、PCR、またはハイブリダイゼーション反応にとっての適当な
緩衝液が含まれる。通常、キットはまた、方法を行うための説明書を含む。

【００７６】実施例I 単一のニューロンからのcDNA合成以下の当技術分野で公知の一般的なプロトコールを用いて、ラット鋤鼻器から
単離した単一の嗅覚ニューロンから調製したcDNAライブラリーのディファレンシ
ャルスクリーニングを行った。デュラック＆アクセル（Dulac, C. and Axel, R.
、Cell 83、195〜206、1995）を参照のこと。

【００７７】標的神経上皮組織を顕微解剖して、非常に活性の弱いトリプシン溶液を用いて
穏やかに単離させ、ニューロンがなおその軸索と樹状細胞を有し、したがってそ
の形態に基づいて個々に選択することができる状態の単細胞懸濁液を得た。

【００７８】次に個々の細胞を選択して溶解緩衝液に加え、細胞の溶解を行った。次に、細
胞RNAとオリゴdTプライマーとをアニール化させた。

【００７９】不完全な伸長を促進し、約500 bp〜約1000 bpのあいだ、より特に約600 bpの
短いcDNAを調製するための、時間および試薬の限定的条件において逆転写酵素に
よる逆転写を行った。完全な伸長を行うには不十分な短い伸長時間を用い、不完
全な伸長を行った。例えば、mRNAの典型的な集団について10秒の伸長時間を用い
ることができる。または、不完全な伸長はポリメラーゼによる伸長を行うために
最適以下の温度を用いて行うことができる。さらなる変法において、ジデオキシ
ヌクレオチドのような停止ヌクレオチドを用いることによって不完全な伸長を行
うことができる。不完全な伸長条件によって典型的に、約100〜約1000塩基の長
さを有する伸長した核酸が得られる。いくつかの方法において、不完全な伸長に
よって典型的に、約400〜約800塩基の長さを有する伸長した核酸が得られる。い
くつかの方法において、不完全な伸長により、約600塩基の長さを有する伸長し
た核酸が得られる。次にcDNAの5'末端にポリA（dATP）およびターミナルトラン
スフェラーゼを用いて複数のdATPテールをつけた。

【００８０】次にcDNAを、3'末端に24（dT）を有する60量体プライマーを用いてPCR試薬に
よって増幅した。PCRサイクリングは、94℃で1分、42℃で2分、次に72℃で6分で
行い、各サイクルで10秒の伸長時間とした。25サイクルを実施した。さらなるTa
qポリメラーゼを添加して、さらに25サイクルを実施した。

【００８１】デュラック（Dulac、Current Topics in Developmental Biology, Cloning of
Genes from Single Neurons 36：245〜258（1998））に開示された方法は、本
発明のcDNAの調製において開示されている。本発明に従って、神経上皮を顕微鏡
下で解剖し、35 mmのペトリ皿に入れて、Ca²⁺およびMg²⁺を含まないリン酸緩衝
生理食塩液（PBS）で数回すすいだ。次に組織を細いピンセット、微小なメス、
または微小な鋏で多数の小さな断片にした。次に、PBSを「ピペットマン」また
はパスツールピペットによって除去して、予め37℃に加温した0.025％トリプシ
ン、0.75 mMエチレンジアミン四酢酸を含むCa²⁺およびMg²⁺を含まないPBS（スペ
シャルディメディア社の低トリプシン-高EDTA溶液）2mlに置換した。組織とトリ
プシンは、2mlプラスチックピペットによるピペッティングによって2、3回上下
させて非常に穏やかに混合した。

【００８２】解離した組織を含むペトリ皿を37℃のインキュベータ内で10〜15分保温した。
15分後、組織とトリプシンを再度、前述のように2、3回非常に穏やかに混合して
、倒立顕微鏡下で観察して大きな細胞塊を調べた。大きな塊の辺縁部の細胞が解
離し始めることが認められ、十分に解離したいくつかの細胞がペトリ皿の底に認
められた時点で解離を停止した。この段階で、細胞塊が20〜30分後なおも付着性
であれば、トリプシンをピペットによって再度除去して、予め加温したトリプシ
ン2mlを加えて、37℃でさらに10分保温する。

【００８３】トリプシン処理を停止させるため、トリプシン2mlと組織を、予め加温したダ
ルベッコ改変イーグル培地＋10％ウシ胎児血清10 ml溶液にピペットで移した。
この段階では、粉砕を行わなかった。その代わりに、トリプシンと組織を2000 r
pmで10分間遠心して、上清を全て除去して、Ca²⁺およびMg²⁺を含まない冷却した
PBS5mlを加えた。細胞懸濁液をピペットおよび徐々に小さい直径のピペットマン
チップ：2mlプラスチックピペット、1mlプラスチックピペット、次に200 μlチ
ップのピペットマンを用いたピペッティングによって4、5回上下させて非常に穏
やかに粉砕した。細胞懸濁液を氷上で保持した。

【００８４】細胞をライツ倒立顕微鏡で観察して、塊および単離されたニューロンが無傷の
軸索と樹状突起を保持していることを確認した。細胞懸濁液を10分間デカントし
て細胞塊を除去した。

【００８５】細胞懸濁液の適当な希釈液をライツ倒立顕微鏡で観察して、丸い細胞体と長い
軸索および樹状突起によってニューロンを特定した。単離されたニューロンを、
細長い斜角の微小毛細管を備えたライツ顕微操作装置によって採取するか、また
は細長い25μl微小毛細管に接続したマウスピペットによって直接採取した。細
胞は十分にまばらでなければならない；そうでなければ、余分な細胞が同時に採
取されるか、またはピペットの外側に付着する可能性がある。個々の細胞を首尾
よく採取するには、数時間の訓練のみが必要である。

【００８６】細胞を採取する場合、PBS各500 μlを加えた4ウェルマルチディッシュ（ヌン
ク社）を用いれば、顕微鏡の焦点を一つのウェルから次のウェルへと変更する必
要がない。候補となるニューロンを、細胞懸濁液を含むウェルから細胞を含まな
い隣接するウェルに移した。微小毛細管をPBSを含む皿の中で数回すすぎ、細胞
を再度採取して、PCRチューブに播種した。

【００８７】単細胞または10〜20個の細胞の群を、下記のように調製した氷冷溶解緩衝液4
μlを含む薄い壁のPCR反応チューブに容量0.2〜0.5 μlで播種した。PCRチュー
ブは、微小毛細管の先端が溶液に達するのが見えるように十分に透明である。チ
ューブを直ちに30秒間遠心して、細胞が溶解緩衝液に接していること、好ましく
はチューブの底に存在し、チューブの壁に付着していないことを確認する。集め
た細胞を含むPCRチューブを氷上で保持した。細胞を含まないゼロ対照チューブ
も同様に調製した。陽性対照として10〜20個の細胞の塊を含むチューブ数本を調
製すると有用である。PCRチューブへの細胞の播種は数時間を超えてはならない
。

【００８８】細胞の解離の際に、cDNA溶解緩衝液を以下のように調製した。cDNA溶解緩衝液
100 μlに関して、以下を氷上で混合した：モロニーマウス白血病ウイルス（MML
V）逆転写酵素＋緩衝液5×（ギブコ-BRL）20μl、H₂O（RNアーゼ、DNアーゼ不含
、スペシャルティメディア社）76μl、ノニデットP40（USB）0.5 μl、プライム
RNアーゼ阻害剤（3'5'インコーポレイテッド社）1μl、RNAガード（ファルマシ
ア社）1μl、および新しく調製したプライマー混合保存液の24倍希釈液2μl。プ
ライマー混合保存液は、−20℃で分注保存して、この中には100 mM dATP、dCTP
、dGTP、dTTP溶液（最終濃度12.5 mM）（ベーリンガー社）各10 μl；50 OD/ml
pd(T)19〜24（ファルマシア社）10 μl；およびH₂O 30 μlが含まれた。

【００８９】cDNA合成と増幅一般的に、個々のニューロンを微小毛細管によって採取して、細胞溶解緩衝液
を含むPCR反応チューブに直接播種する。溶解はその後65℃で行い、オリゴdTプ
ライマーから合成した一本鎖cDNA合成を逆転写酵素混合液を37℃で加えた後、試
薬によって一本鎖cDNAの5'にポリ（A）テールを合成させた。5'ポリ（A）および
3'ポリ（T）テールによって、ポリ（T）配列を含むプライマーを用いてPCR増幅
を行うことが可能になる。ブラディら（Brady、1990）から改変したこのプロト
コールによって、一本のチューブにおいて個々のニューロンからPCR増幅cDNA 50
μg以上を合成することが可能になる（デュラック＆アクセル（Dulac and Axel
）、1995）。逆転写は、約500 bpと約1kbのあいだのcDNAを作製するための限定
的条件で行い、これは等しく増幅される可能性が高い。このようにして、PCR段
階にもかかわらず、増幅されたcDNAは異なる細胞RNAの正確な再現を維持する。
このcDNA合成は、単細胞または細胞群のみならず、数百個の細胞から精製した非
常に少量のRNAについて行うことができる。

【００９０】特に、PCRチューブに採取した単細胞を65℃で1分間溶解した後、チューブを室
温で1〜2分保持してオリゴdTプライマーをRNAにアニーリングさせる。次に、PCR
チューブを氷上に戻して4℃で2分間急速に遠心して濃縮体を除去した。トリ骨髄
芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素（ギブコ-BRL社）とMMLV逆転写酵素の1：1（
容量：容量）混合物0.5 μlを加えて、37℃で最長で15分間インキュベートした
。次に酵素を65℃で10分間不活化して、氷上に戻し、4℃で2分間遠心した。

【００９１】氷上で、5×BRLターミナルトランスフェラーゼ緩衝液（ギブコ社）800 μl、1
00 mM ATP 30 μl、および1.17 ml H₂Oを含む2×テール付加緩衝液4.5 μlを加
えた。チューブを37℃で15分間インキュベートした。次に、酵素を65℃で10分間
不活化した後、4℃で2分間遠心した。

【００９２】それぞれのチューブに、氷冷PCR緩衝混合液90 μlを加えた。プライマーの2量
体形成を防止するために、全ての試薬およびPCR緩衝混合液を氷上に保持するこ
とが重要である。PCR緩衝混合液90 μlには、10×PCR緩衝液II（パーキンエルマ
ー社）10 μl、25 mM MgCl₂（パーキンエルマー社）10 μl、20 mg/ml BSA（ベ
ーリンガー社）0.5 μl、100 mMデオキシヌクレオチド三リン酸（ベーリンガー
社）各1μl、5％トライトンX100（シグマ社）1μl、AL1プライマー（ATT GGA TC
C AGG CCG CTC TGG ACA AAA TAT GAA TTC(T)24（0.1 μMスケール）（オリゴ等
）5μg、H₂O qsp 90 μl、アンプリタック（AmpliTaq）（パーキンエルマー社）
2μl、および分子生物学等級の鉱油（シグマ社）1、2滴が含まれた。

【００９３】パーキンエルマーDNAサーマルサイクラー480において、25サイクルを以下のよ
うに実施した：94℃で1分、42℃で2分、72℃で6分、各サイクルで10秒間の伸長
期間。これらの最初の25サイクルの終了後、アンプリタック1μlを各チューブに
直接加えて、各サイクルで伸長時間をとらないことを除いて先の記述と同じプロ
グラムで25サイクル以上を同じプログラムで実施した。2回目の組のサイクルを
最初の組のサイクルが終了した直後に開始すれば、一般的により高い収量が得ら
れる。

【００９４】 cDNAをフェノール-クロロホルムによって抽出して、エタノールによって沈殿
させ、分析中におけるcDNA全量の凍結融解を避けるために、試料の半量を保存試
料として−80℃で凍結した。

【００９５】単細胞ライブラリーのディファレンシャルスクリーニング得られたcDNAの品質を調べるために、各ウェルに細胞cDNA5μlを添加して2つ
の1.5％アガロースゲルを泳動させた。DNAの非常に強いスメア（約500 ng）が0.
4〜1.2 kbに観察された。ゼロ対照についても酵素溶液に存在するいくつかの微
量の細菌混入物に起因しうる同様の結果が見られることは稀ではないが、特異的
プローブは、さらなる対照においてそのレーンとハイブリダイズしないはずであ
る。次に、cDNAを2つの二重サンドイッチサザンブロットにおいて4枚のハイボン
ド（Hybond）N+メンブレン（アマシャム社）に転写して、大量に発現された遍在
する遺伝子（例えば、チューブリンおよびリボプロテイン）、中程度から低い程
度に発現された遍在遺伝子（すなわち、Go）、および関係する細胞型に特異的な
2つの遺伝子とハイブリダイズさせた。産生されたcDNAは、ほとんどが1kbより短
いため、プローブまたはPCRプライマーは、調べた遺伝子の3'末端に対応するは
ずである。さらに、3'非翻訳領域での異なる動物種のあいだの交差ハイブリダイ
ゼーションは、ラットとマウスのあいだでさえ、チューブリンのような非常に保
存された遺伝子さえも起こる可能性は低い。

【００９６】チューブリンとリボプロテインのシグナルは極めて強く、曝露1時間未満でも
出現した。分裂細胞はこれらのマーカーの強度を減少させることができる。さら
なるマーカーを用いることができ、これらは当業者に明らかであろう。

【００９７】単細胞cDNA試料の再増幅各細胞cDNAを以下のプロトコールに従って再増幅した。各単細胞cDNA試料に10
0 μlPCR反応を3回行った。一つの反応に関して、以下のPCR混合物を組み合わせ
た：超純水H₂O 80 μl、10×PCR緩衝液10 μl、10×MgCl₂ 10 μl、dNTP各0.2
μl、Taqポリメラーゼ1μl、およびAL-1プライマー5μg。

【００９８】混合物100 μlを、DNAを含まない陰性対照に加えた。混合物300μlを各単細胞
cDNA試料についてPCRチューブに加えた。単細胞cDNA試料保存液2.25 μlを混合
物各300 μl試料に加えて、100 μlアリコット3本に分配した。各100 μlアリコ
ットに鉱油2滴を加えて、これを94℃で1.5分、42℃で2分、72℃で3分、72℃で20
分の、25サイクルで増幅した。得られた産物を4℃に保温した。各PCR反応産物を
、キアゲン社のキアクイック（Quiaquick）PCR精製キットを用いて精製した。

【００９９】実施例II GENECHIP発現アレイを用いた遺伝子発現のプロファイリング断片化、末端標識、ハイブリダイゼーション、および発現のプロファイリング
段階を含む以下の一般的プロトコールを用いて、GENECHIP発現アレイ上の発現プ
ロフィールを得た。

【０１００】 PCR産物5μg（18 μl）（MOE-10（0.275 μg/μl）を、EF溶液（キアゲンキッ
トPCR精製におけるトリス）15.5 μl、プロメガ社の10×ワンフォーオール（One
-Phor-All）緩衝液4μl、およびDNアーゼI 0.5単位と組み合わせた。総容量は40
μlであり、この中にはDNA 5μgとDNアーゼI 0.50 μgが含まれた。

【０１０１】総量を37℃で14分保温した後、99℃で15分保温し、次にPCR産物を長さ約50 bp
〜100 bpの断片に細分化するために氷上に5分間置いた。次に、総量をビオチン-
N6-ddATP（「NEN」）1μlおよびTdT（ターミナルトランスフェラーゼ）（15単位
/μl）1.5 μlと組み合わせることによって、断片を末端標識した。総容量（42.
5 μl）を37℃で1時間保温した後、99℃で15分保温し、氷上で5分間保持した。

【０１０２】標識および断片化したcDNAを、1×MES緩衝液（0.1 M MES、1.0 M NaCl、0.01
％トライトンX-100、pH 6.7）溶液中の5〜10 μg標識標的と、0.1 mg/mlサケ精
子DNAとを含むハイブリダイゼーション溶液200 μl中で、さらなるチップとハイ
ブリダイズさせた。用いたアレイは、アフィメトリクスマウス発現アレイであっ
た：約11,000個の遺伝子とESTを含む11Kセット（11KsubAおよび11KsubB）。アレ
イを回転装置に置いて、45℃で16時間60 rpmで回転させた。ハイブリダイゼーシ
ョンの後、アレイを6×SSPE-T（0.9 M NaCl、60 mM NaH₂PO₄、6mM EDTA、0.005
％トライトンX-100、pH 7.6）によって22℃でフルイディクスステーション（ア
フィメトリクス社）上で10×2サイクル洗浄した後、0.1 MESで45℃で30分洗浄し
た。アレイをストレプトアビジン-フィコエリスリン結合体（モレキュラープロ
ーブ社）によって染色した後、フルイディクスステーション上で6×SSPE-T洗浄
液によって再度10×2サイクル洗浄した。シグナルを増強するために、アレイを
さらに抗ストレプトアビジン抗体で30分染色した後、ストレプトアビジン-フィ
コエリスリン結合体によって15分染色した。6×SSPE-Tによってフルイディクス
ステーション上で10×2サイクル洗浄した後、改変共焦点スキャナ（アフィメト
リクス社）を用いて3μmの解像度でアレイを走査した。

【０１０３】さらなるPCR産物もまた、上記のように断片化、末端標識、ハイブリダイゼー
ションおよび発現プロフィール形成を行った。下記の表に、各単細胞PCR産物に
ついて得られた結果を要約する。

【０１０４】

【表１】アレイ型：Mu11KB アレイ型：Mu11KA

【０１０５】上記の方法を用いて単一のニューロンおよび嗅覚上皮に関して発現された遺伝
子数を決定するためにさらなる実験を行い、データを下記の表2に示す。嗅覚上
皮組織については、上記の増幅段階を行わなかった。

【０１０６】

【表２】

【０１０７】図1は、主嗅覚上皮と単一の嗅覚知覚ニューロンの遺伝子発現画像の比較を示
す。同一のマウス11KサブAアレイを用いて、主嗅覚上皮（MOE）と単一の嗅覚知
覚ニューロンの双方において約6,500個の遺伝子の遺伝子発現を評価した。MOEか
ら調製した標識されたRNA標的10 μgを左のパネルのハイブリダイゼーションの
ために用い、アレイ上の遺伝子の35％を検出した。単一のニューロンから調製し
た標識したDNA標的10 μgを右のパネル上でアレイにハイブリダイズさせ、遺伝
子の18％を検出した。図2は、図1のアレイと同一の領域を示す。単一のニューロ
ンに関するハイブリダイゼーション結果は、主嗅覚上皮と比較して有意に複雑で
はなく、これに対応して単一のニューロンに関してより特異的である。

【０１０８】マウスのアレイにおいて、網膜と単一の光受容体細胞において発現されたいく
つかの識別特徴分子の画像は、上記の方法を用いて得た。画像を図3および4に示
し、これらは光受容体細胞について得られた画像は複雑性が低いことを示してい
る。

【０１０９】実施例III 単細胞cDNAの直線的増幅の確認本明細書に記載した方法によるmRNAの増幅が直線的であるか否かを決定するた
めに、当技術分野で公知の方法に従って多くの実験を行った。嗅覚上皮および単
一の嗅覚ニューロンにおける遺伝子発現プロフィールを比較した。データを図5
に示し、発現された遺伝子の百分率対発現レベル（百分位数範囲）の点から、嗅
覚上皮（OE2）といくつかの単一の嗅覚ニューロン（NB12、NB1、NB13、NB14、お
よびNB2）の発現プロフィールのあいだに良好な相関を認めた。

【０１１０】サザンブロットおよびマイクロアレイハイブリダイゼーションによる遺伝子発現プロフィールの相関サザンブロット法によって決定した特定の遺伝子の発現プロフィールの結果を
、本発明の方法に従ってマイクロアレイハイブリダイゼーションによって決定し
た同じ遺伝子の発現プロフィールの結果と比較する試験を行った。この結果を図
6に示す。この結果、サザンブロットとマイクロアレイハイブリダイゼーション
によって得られた遺伝子発現プロフィールのあいだに良好な相関を示し、関係す
る遺伝子の遺伝子発現プロフィールを決定するマイクロアレイハイブリダイゼー
ション法の有用性を確証する。

【０１１１】実施例VI 相関係数分析単細胞を嗅覚上皮または鋤鼻器上皮から採取して、単細胞cDNAを各細胞から調
製して、上記の様にマイクロアレイにハイブリダイズさせた。組織に関しては、
全RNAを逆転写して上記の様にマイクロアレイにハイブリダイズさせた。全ての
細胞におけるあらゆる遺伝子の発現プロフィールの変化を測定し、相関係数を得
た。この結果を図7に示す。M＝成人嗅覚上皮から採取した嗅覚知覚神経（OSNs）
。N＝新生児嗅覚上皮から採取したOSNs。S＝嗅覚上皮由来の支持グリア細胞。E
＝OSN前駆体細胞。V＝成人鋤鼻器上皮から採取した鋤鼻知覚神経。T＝全組織。
相関係数がより高ければ、単細胞cDNA試料がより類似の発現プロフィールを有す
ることを示す。より高度に関連すると予想される細胞は、より高い相関係数を有
する傾向がある。例えば、成人嗅覚上皮から採取したOSNsは互いに高度に相関す
る傾向があるが、OSN前駆体細胞には相関しない。または、OSN前駆体細胞は他の
知覚神経ニューロンおよび支持細胞に対して低い相関を有する傾向があるが、互
いに非常に高度に相関する。

【０１１２】発現プロフィールの類似性による細胞の階層的クラスター形成得られた相関係数を用いて、個々の細胞の関係、すなわち主嗅覚上皮（MOE細
胞）からの嗅覚ニューロン、鋤鼻器（VNO細胞）および一つの光受容体細胞から
の2つの嗅覚ニューロンの関係を階層的クラスター形成分析によって可視化した
。クラスター形成を図10に示し、これは胚MOE（I）から得た細胞が、共にクラス
ターを形成するのみならず、新生児MOE（II）、成人MOE（IV）、および光受容体
細胞から得た細胞とは異なることを示している。さらに、VNO細胞（III）は共に
クラスターを形成する。NB10は支持細胞であり、したがって他のMOE細胞とクラ
スターを形成しない。遺伝子クラスターおよびスタンフォード大学からオンライ
ンで入手できるツリービュー（Tree View）ソフトウェアを、クラスター形成分
析において用いた。同様に、ホワイトヘッド／MITゲノム研究センターによって
提供されるジーンクラスター1.0ソフトウェアをクラスター形成分析に用いるこ
とができる。

【０１１３】実施例VII 転写プロフィールのモニタリングによる細胞の特性および機能の同定個々のニューロン、ニューロン前駆体、および胚細胞からの転写プロフィール
のモニタリングは、上記の方法に従って実施した。細胞の特性および機能は、発
現プロフィールを比較することによって決定した。図9は、アイセン（Eisen）ら
からの階層的クラスター形成ソフトウェアを用いた単一の嗅覚ニューロンによっ
てではなく、NB10による遺伝子の組の発現を示す。NB10を支持細胞として同定す
ることは既に参照として組み入れられている。嗅覚上皮の支持体細胞によるIdの
発現パターンは、右のパネルに記載する。同様の遺伝子クラスター形成法を用い
て、特定のニューロン集団の発現プロフィールを図12に同定し、これは機能的ま
たは発達的に個別のニューロン亜集団を表す。これらの転写識別における特徴は
全嗅覚上皮MOE1およびMOE2のような、大きな細胞集団から同定することができな
い。

【０１１４】前述の本発明は理解を明確にする目的で詳細に説明してきたが、添付の特許請
求の範囲内で特定の改変を行うことができることは明白である。上記で引用した
刊行物および特許文書は全て、それぞれが個々に示されているのと同程度に全て
の目的に関してその全文が参照として本明細書に組み入れられる。

【図面の簡単な説明】

特定の好ましい態様についての詳しい説明を行う上で、以下の添付の図面を参
照すること。

【図１】主嗅覚上皮における遺伝子発現のプロファイリングの結果および
単一の嗅覚知覚ニューロンにおける遺伝子発現を示す、GENECHIP発現アレイの比
較である。

【図２】図1のGENECHIP発現アレイの一部拡大図である。

【図３】網膜において発現された識別特徴分子のGENECHIP発現アレイパタ
ーンを示す。

【図４】網膜の単一の光受容体細胞において発現された識別特徴分子また
は代表的な分子のGENECHIP発現アレイパターンを示す。

【図５】異なる発達段階の新生ニューロン細胞のあいだの発現プロフィー
ルの相関係数を示すチャートである。

【図６】発現プロフィールの類似性による細胞のクラスター形成の略図を
表す。

【図７】嗅覚上皮と単一の嗅覚ニューロンにおいて発現された遺伝子の百
分率および発現レベルのグラフである。

【図８】サザンブロットおよびマイクロアレイハイブリダイゼーションに
よる遺伝子発現プロフィールの相関のチャートである。

【図９】胚細胞を支持細胞として同定する遺伝子クラスターおよび組織に
おける対応する遺伝子発現を示す。

【図１０】組織全体における遺伝子発現をモニターすることによって検出
することができない個々のニューロンの特異的遺伝子発現プロフィールを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年７月１７日（２００２．７．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者キャオヤンクシャンアメリカ合衆国カリフォルニア州パロアルトウィルトンアベニュー 445 (72)発明者ストライアールバートアメリカ合衆国コロンビア州アスペンサウススターウッドドライブ 617 (72)発明者ロックハートデイビッドアメリカ合衆国カリフォルニア州デルマートーリーポイントロード 510 (72)発明者デュラックキャサリンジー．アメリカ合衆国マサチューセッツ州ケンブリッジドゥウォルフストリート＃48 10 (72)発明者ティートジェンイアンアメリカ合衆国マサチューセッツ州ソマービルディミックストリート 17 (72)発明者ライエルジェイソンアメリカ合衆国マサチューセッツ州ソマービルバッキンガムストリート＃２ 19 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA09 CA12 HA12 4B063 QA01 QA05 QA18 QA19 QQ08 QQ42 QR32 QR56 QR62 QR82 QS03 QS25 QS34 【要約の続き】的変化を決定することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の段階を含む、一つまたは複数の細胞において一つまた
は複数の遺伝子の発現をモニターする方法： 1000個未満の細胞に由来する核酸の集団にプローブのアレイを接触させる段階
、核酸の集団に対するプローブの相対的ハイブリダイゼーションを決定する段階
。
【請求項２】核酸の集団が単一の細胞に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】核酸の集団が、cDNAの集団を生成するためのmRNAの集団の逆
転写およびcDNAの増幅によって調製される、請求項１記載の方法。
【請求項４】逆転写が不完全な伸長条件下で行われる、請求項３記載の方
法。
【請求項５】核酸が100個未満の細胞に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項６】不完全な伸長条件が、限定された試薬を用いることによって
、完全な伸長に必要な時間より短い時間を用いることによって、最適以下の温度
を用いることによって、または鎖停止ヌクレオチドを組み入れることによって行
われる、請求項４記載の方法。
【請求項７】不完全な伸長条件が、中央値の長さが約100〜1000塩基であ
るポリヌクレオチドを合成する、請求項４記載の方法。
【請求項８】不完全な伸長条件が、中央値の長さが約500〜700塩基である
ポリヌクレオチドを合成する、請求項４記載の方法。
【請求項９】モニターすべき遺伝子が少なくとも部分的に既知の配列の遺
伝子であり、プローブのアレイが、モニターすべき各遺伝子に対するプローブセ
ットを含み、該プローブセットが転写物と完全に相補的であるか、または完全に
マッチする複数のプローブを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】各プローブセットにおける少なくともいくつかのプローブ
が、転写物の配列の3'末端から1000塩基以内のセグメントに対して完全に相補的
であるか、または完全にマッチする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】各プローブセットにおける少なくとも一つのプローブが、
転写物のコード配列の3'末端から1000塩基以内のセグメントに対して完全に相補
的であるか、または完全にマッチする、請求項９記載の方法。
【請求項１２】プローブセットにおけるプローブが、モニターすべき複数
の転写物における一つの遺伝子、一つの遺伝子ファミリー、または一つの遺伝子
クラスターと完全に相補的であるか、または完全にマッチする、請求項９記載の
方法。
【請求項１３】各プローブセットにおける少なくとも10個のプローブが、
転写物のコード配列の3'末端から500塩基以内のセグメントに対して完全に相補
的であるか、または完全にマッチする、請求項９記載の方法。
【請求項１４】プローブのアレイが、少なくとも1000個の遺伝子に対する
プローブセットを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１５】プローブのアレイが、少なくとも10,000個の遺伝子に対す
るプローブセットを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１６】各プローブセットが、それぞれの完全なマッチプローブに
対するミスマッチプローブを含み、ミスマッチプローブが単一の位置で完全なマ
ッチプローブとは異なる、請求項９記載の方法。
【請求項１７】遺伝子の相対的発現レベルを決定するために、マッチおよ
びミスマッチプローブのハイブリダイゼーションを比較する段階をさらに含む、
請求項９記載の方法。
【請求項１８】 1000個の遺伝子それぞれの相対的発現レベルが決定される
、請求項９記載の方法。
【請求項１９】 10,000個の遺伝子それぞれの相対的発現レベルが決定され
る、請求項９記載の方法。
【請求項２０】検出された遺伝子の相対的発現レベルが少なくとも約２倍
〜約10倍変化する、請求項９記載の方法。
【請求項２１】検出された遺伝子の相対的発現レベルが少なくとも100倍
変化する、請求項９記載の方法。
【請求項２２】検出された遺伝子の相対的発現レベルが少なくとも1000倍
変化する、請求項９記載の方法。
【請求項２３】プローブアレイが、所定の長さの全てのプローブを含む完
全なアレイである、請求項１記載の方法。
【請求項２４】複数の遺伝子の少なくともいくつかが未知配列の遺伝子で
ある、請求項１記載の方法。
【請求項２５】増幅された核酸を断片に切断する段階をさらに含む、請求
項２記載の方法。
【請求項２６】断片を末端標識する段階をさらに含む、請求項25記載の方
法。
【請求項２７】アレイが１cm²あたり少なくとも1000個のプローブを含む
、請求項１記載の方法。
【請求項２８】プローブが15〜25塩基の核酸である、請求項１記載の方法
。
【請求項２９】プローブが非多孔性の支持体に結合している、請求項１記
載の方法。
【請求項３０】一つまたは複数の細胞が、細胞のインビトロ増殖を行うこ
となく生検から得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３１】一つまたは複数の細胞が、新生物であることが既知である
か、または新生物であることが疑われる組織から得られる、請求項20記載の方法
。
【請求項３２】以下の段階を含む発現モニタリング方法：第一および第二の細胞に由来する第一および第二の核酸集団にプローブのアレ
イを接触させる段階；第一および第二の細胞のあいだで異なる様式で発現される遺伝子に結合する少
なくとも一つのプローブを同定するために、第一および第二の細胞からの核酸に
対するプローブの相対的結合を決定する段階。
【請求項３３】第一および第二の核酸集団が異なる様式で標識され、且つ
プローブのアレイに同時に適用される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】第一および第二の核酸集団がプローブのアレイに個々に適
用される、請求項32記載の方法。
【請求項３５】プローブのアレイが、複数の既知の転写物のそれぞれに対
して完全に相補的であるか、または完全にマッチした複数のプローブを含む、請
求項32記載の方法。
【請求項３６】遺伝子をクローニングするために、異なる様式で発現され
た遺伝子に結合するプローブを用いる段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
【請求項３７】異なる様式で発現された遺伝子にハイブリダイズするプロ
ーブからの配列を含む核酸配列に関してデータベースを検索する段階をさらに含
む、請求項32記載の方法。
【請求項３８】第一および第二の細胞が、一般的な細胞系列において異な
る発達段階の細胞である、請求項32記載の方法。
【請求項３９】以下の段階を含む、細胞を分類する方法：複数の細胞のそれぞれの発現プロフィールを決定する段階；発現プロフィールの類似性によって決定されたクラスターに細胞を分類する段
階。
【請求項４０】以下の段階を含む、細胞系列の分化をモニターする方法；細胞系列において異なる分化段階の複数の細胞のそれぞれの発現プロフィール
を決定する段階；発現プロフィールの類似性によって決定されたクラスターに細胞を分類する段
階；発現プロフィールの類似性の順にクラスターを並べる段階；細胞系列における異なる分化段階の複数の遺伝子のそれぞれについて、発現レ
ベルの経時的変化を決定する段階。
【請求項４１】不完全な伸長条件が、中央値の長さが約20〜100塩基であ
るポリヌクレオチドを合成する、請求項４記載の方法。
【請求項４２】以下の段階を含む、異なる様式で発現された転写物を同定
する方法：細胞系列内で異なる分化段階の複数の細胞のそれぞれの発現プロフィールを決
定する段階；発現プロフィールの類似性によって決定されたクラスターに細胞を分類する段
階；発現プロフィールの類似性の順にクラスターを並べる段階；細胞系列における異なる分化段階の複数の遺伝子のそれぞれについて、発現レ
ベルの経時的変化を決定する段階；及び異なる様式で発現された転写物を同定する段階。
【請求項４３】以下の段階を含む、特異的細胞型を同定する方法：複数の細胞の発現プロフィールを決定する段階；発現プロフィールの類似性によって決定されたクラスターに細胞を分類する段
階；複数の細胞の特性および機能を決定する段階。
【請求項４４】細胞が成人の脳に由来する、請求項43記載の方法。
【請求項４５】細胞が末梢知覚器官に由来する、請求項43記載の方法。
【請求項４６】複数の細胞の一つが幹細胞である可能性を有すると推定さ
れうる、請求項43記載の方法。