DE102010036111B4

DE102010036111B4 - Vorbehandlungsverfahren zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren aus einer Umweltprobe

Info

Publication number: DE102010036111B4
Application number: DE201010036111
Authority: DE
Inventors: Dr. Köhne Stefan; Gudrun Zoll
Original assignee: Bundesamt fuer Ausruestung Informationstechnik und Nutzung der Bundeswehr
Current assignee: Bundesrepublik Deutschland (bundesamt fur Aus De
Priority date: 2010-09-01
Filing date: 2010-09-01
Publication date: 2013-08-29
Anticipated expiration: 2030-09-02
Also published as: DE102010036111A1

Abstract

Vorbehandlungsverfahren zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren aus einer Umweltprobe mit einer silikathaltigen Hintergrundmatrix, derart, dass das Vorbehandlungsverfahren folgende Schritte umfasst: • Zugabe einer Vorbehandlungslösung zu der Umweltprobe unter Erhalt einer Mischung, derart, dass die Vorbehandlungslösung einen Wirkstoff aufweist, der ein wasserlösliches Celluloseether-Derivat mit anionisch reaktiven Gruppen ist, • Durchführung einer Thermolyse mit der zuvor erhaltenen Mischung, • physikalische Trennung der zuvor behandelten Mischung mittels Sedimentation unter Erhalt eines Überstandes, • Klärung des Überstandes durch Zentrifugation, • Weiterbearbeitung des geklärten Überstandes, derart, dass der Wirkstoff der Vorbehandlungslösung Natrium-Carboxymethylcellulose ist und die Weiterbearbeitung des geklärten Überstandes mit einem handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit erfolgt, unter Erhalt einer Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vorbehandlungsverfahren zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren aus einer Umweltprobe mit einer silikathaltigen Hintergrundmatrix.
Für die Streitkräfte, den Katastrophenschutz, die Feuerwehr und auch die Polizei stellen biologische Agenzien, die von kriminellen Gruppen oder Individuen als Waffe eingesetzt werden können, eine immer größere Herausforderung dar. Solche biologischen Agenzien werden unter anderem mit molekulargenetischen Verfahren nachgewiesen und identifiziert. Die Heterogenität des Probenmaterials von Luft, Wasser und Boden ist hierbei eine besondere Herausforderung. Speziell Bodenproben stellen auf Grund der unterschiedlichen Zusammensetzung mit den Silikatverbindungen Ton, Lehm und Sand und dem Vorhandensein verschiedener inhibitorischer Begleitsubstanzen, wie z. B. Huminsäuren, das Laborpersonal immer wieder vor große Probleme. Speziell bei dem Einsatz molekulargenetischer Nachweisverfahren, wie der Polymerase Kettenreaktion (PCR), treten folgende Probleme auf:

• Durch die Bindung von Nukleinsäuren an bestimmte Bodenpartikel, wie z. B. Quarz, Glimmer oder Feldspat, ist die Ausbeute an isolierter DNA/RNA häufig stark eingeschränkt.
• Des Weiteren können Begleitsubstanzen, wie z. B. Huminsäuren, zusammen mit den Nukleinsäuren aus der Probe extrahiert werden, die beim anschließenden molekulargenetischen Nachweis das Schlüsselenzym der PCR, die Taq Polymerase, inhibieren.

Einer Probenaufbereitung kommt daher eine hohe Bedeutung zu. Der Markt bietet eine Vielzahl von handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kits an. Diese Kits sind auf die jeweilige Zusammensetzung einer zu untersuchenden Probe zum Teil sehr speziell zugeschnitten. Beschrieben sind diese Kits zum Beispiel in der US 7 459 548 B2 , der US 6 368 800 B1 , der EP 1 882 739 A1 , der EP 1 527 172 B1 und der EP 1 442 045 B1 .
In einem Aufsatz (Applied and Environmental Microbiology, July 2010, Vol. 76, No. 13, Seite 4571–4573, Kelly A. Fitzpatrick et al., „Practical Method for Extraction of PCR-Quality DNA from Environmental Soil Samples”) wird die Problematik beschrieben, mit handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kits eine brauchbare DNA aus Bodenproben zu isolieren.
In einem weiteren Aufsatz (BIOspektrum/05.10/16. Jahrgang, Seiten 558–559) wird eine automatisierte DNA-Extraktion aus Bodenproben beschrieben. Die DNA-Extraktion erfolgt mit handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kits.
In einem weiteren Aufsatz (Current Microbiology Vol. 22 (1991), Seiten 345–348) ist dargelegt, dass Huminsäuren aus Bodenproben an Polyvinylpolypyrrolidon adsorbiert werden.
Die DNA-Isolierung kommerzieller Kits baut häufig auf einer chemischen Lyse zur Freisetzung der Nukleinsäuren auf. Die dazu verwendeten Lysepuffer sind so ausgewählt, dass eine hohe Effizienz des Aufschlusses der Zellen erreicht wird. Hierbei wird sehr häufig die chemische Interaktion zwischen Lysepuffer, Nukleinsäuren und Hintergrundmatrix außer Acht gelassen. Bedingt durch die Ladungsunterschiede zwischen den negativ geladenen Nukleinsäuren und den positiv geladenen Bodenpartikeln kommt es zu irreversiblen Bindungen und somit zu hohen Verlusten in der Gesamtausbeute an Nukleinsäuren. Des Weiteren führen die Bestandteile vieler Lysepuffer, wie SDS, EDTA und Triton X-100, dazu, dass Inhibitoren, wie z. B. Huminsäuren, zusammen mit den Nukleinsäuren aus der Umweltprobe extrahiert werden. Die mitisolierten Inhibitoren lassen sich nur schwer aus den isolierten Nukleinsäuren entfernen und sind somit ein Problem für die anschließende molekulargenetische Analytik.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren aus einer Umweltprobe mit einer silikathaltigen Hintergrundmatrix so auszubilden, dass eine hohe Ausbeute an Nukleinsäuren erzielt wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruches 1 gelöst.
Die Vorteile der Erfindung bestehen darin, dass mit einem einfachen und schnellen Vorbehandlungsverfahren in Verbindung mit beispielsweise einem handelsüblichen DNA-Isolierungs-Kit Nukleinsäuren mit einem hohen Wirkungsgrad isoliert und aufkonzentriert werden. Dies ist die Voraussetzung dafür, bei einem nachfolgenden molekulargenetischen Nachweisverfahren eine hohe Sensitivität zu erzielen.
Überlegungen führten dazu, ein Vorbehandlungsverfahren mit einer Vorbehandlungslösung einzusetzen.
• Zur Vorbehandlungslösung:
Bei der Suche nach einem geeigneten Wirkstoff für die Vorbehandlungslösung wurde nach einer Substanz gesucht, die die Bindung zwischen den negativ geladenen Nukleinsäuren und den positiv geladen Bodenpartikeln verhindert. In einem ersten Schritt wurde der Komplexbildner EDTA in einem Vorbehandlungsverfahren getestet. Dies führte schon zu einer deutlichen Erweiterung des Probenspektrums im Bereich tonhaltiger Umweltproben, jedoch war die Ausbeute an Nukleinsäuren noch nicht zufriedenstellend. Schließlich fiel die Wahl auf eine Cellulose. Als Wirkstoff für die Vorbehandlungslösung kommt ein wasserlösliches Celluloseether-Derivat mit anionisch reaktiven Gruppen in Frage. Celluloseether sind Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose oder die Carboxymethylcellulose. Mit dem aufgefundenen Wirkstoff wurden überraschend gute Ergebnisse erzielt. Die anionisch reaktiven Gruppen eines wasserlöslichen Celluloseether-Derivates binden besonders gut die positiv geladenen Bodenbestandteile, wie die Schichtsilikate. Damit wird verhindert, dass sich während der späteren Lyse die freigesetzten, negativ geladenen Nukleinsäuren an die Bodenpartikel binden.
• Thermolyse:
Die zeitliche Einwirkung von Temperatur um 95°C führt bei Zellen zur Lyse, in deren Folge die Nukleinsäuren freigesetzt werden.
• Physikalische Trennung:
Die Mischung aus Umweltprobe und Vorbehandlungslösung wurde anschließend einer schonenden, physikalischen Trennung unterworfen, mit dem Ziel die Nukleinsäuren von den Festbestandteilen der Proben zu trennen.
• Klärung des Überstandes:
Die weitere Klärung des Überstandes erfolgte durch Zentrifugation.
Der Wirkstoff der Vorbehandlungslösung ist Natrium- Carboxymethylcellulose. Überraschend zeigte sich, dass mit einer Lösung, die als Wirkstoff Natrium-Carboxymethylcellulose enthält, eine sehr hohe Ausbeute an Nukleinsäuren erzielt werden konnte. Die anionisch reaktiven Gruppen der Carboxymethylcellulose binden besonders gut positiv geladene Bodenbestandteile, wie die Schichtsilikate. Damit wird verhindert, dass sich während der nachfolgenden Lyse die freigesetzten, negativ geladenen Nukleinsäuren an die Bodenpartikel binden. Ein weiterer Vorteil von Natrium-Carboxymethylcellulose ist, dass sie gut erhältlich ist.
Ferner erfolgt die Weiterbearbeitung des Überstandes mit einem handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit, unter Erhalt einer Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung. Handelsübliche Nukleinsäuren-Isolierungs-Kits arbeiten zuverlässig.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung kann fakultativ, wenn die Umweltprobe inhibitorische Substanzen aufweist, die erhaltene Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung nachbehandelt werden. Im Nachbehandlungsverfahren wird die Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung durch ein Trennmaterial, das ein quervernetztes Polymer aufweist, geführt, um inhibitorische Substanzen, wie Huminsäuren, abzutrennen. Die Nachbehandlung ist unkompliziert und effektiv.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist das quervernetzte Polymer gequollenes Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP). PVPP ist ein Derivat des Polyvinylpyrrolidon (PVP) und wird in der Lebensmittelindustrie eingesetzt, um Gerbstoffe und Polyphenole, zu denen auch die Huminsäuren gehören, zu binden und abzutrennen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird die Abtrennung mit einer zentrifugierbaren Trennsäule durchgeführt. Mit Hilfe der Zentrifugalkraft ist es leicht möglich, die Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung durch das Trennmaterial zu pressen. Ebenso gehören Zentrifugen zur Standardausstattung eines Labors.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele beschrieben.
Erstes Ausführungsbeispiel
Eine Isolation und Aufkonzentration von Nukleinsäuren wurde an einem Standardboden (Lehmboden mit Tonanteilen, Charge F6S4108) durchgeführt. Dieser Standardboden ist bei der Landwirtschaftlichen Untersuchungs- und Forschungsanstalt Speyer (LUFA) erhältlich.
Die Isolation und Aufkonzentration von Nukleinsäuren umfasste:

• ein Vorbehandlungsverfahren,
• eine Weiterbearbeitung mit einem handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit und
• ein Nachbehandlungsverfahren.

Vergleichs-Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen wurden gewonnen, indem ein handelsübliches Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit ohne ein Vorbehandlungs- und Nachbehandlungsverfahren eingesetzt wurde. Anschließend erfolgte wieder eine PCR-Analyse. In einem ersten Schritt wurden 6 Aliquots vom Standardboden mit unterschiedlichen Mengen an Bakterien (Bacillus anthracis, vegetativ) versetzt: 10⁷; 10⁶; 10⁵; 10⁴ und 10³ Zellen. Als Negativ-Kontrolle wurde H₂O verwendet:

• 0,5 g Standardboden +400 μL der obigen Bakteriensuspensionen bzw. für die Negativ-Kontroll 400 μL H₂O.
• Den Boden mit den Bakterien, auf einem Reagenzglasschüttler bei mittlerer Umdrehungszahl mischen.

a) Vorbehandlungsverfahren:

• Zugabe von 400 μL einer wässrigen Vorbehandlungslösung. Die Vorbehandlungslösung enthielt als Wirkstoff Natrium-Carboxymethylcellulose.
• Einzelheiten: Die Vorbehandlungslösung enthielt 3 Gew.-% Natrium-Carboxymethylcellulose mit einem durchschnittlichen Substitutionsgrad von 0,7 in einer wässrigen Wirkstoff-Aufnahmelösung. Diese enthielt: 0,02 M Phosphatpuffer 0,0054 M KCl 0,274 M NaCl 0,32 Vol.-% Tween 20
• Weitere Einzelheiten der Vorbehandlungslösung: Der eingesetzte Konzentrationsbereich der Natrium-Carboxymethylcellulose kann zwischen 1 und 4 Gew.-% liegen. Konzentrationen ab 3 Gew.-% führen bei der Herstellung der Carboxymethylcellulose-Lösung zu Problemen bezogen auf Löslichkeit und Viskosität. Die Menge der reaktiven Gruppen eines Celluloseethers wird durch den durchschnittlichen Substitutionsgrad bestimmt. Geeignet ist ein durchschnittlicher Substitutionsgrad zwischen 0,6 und 0,95. Die Anwesenheit von Phosphaten unterstützt die Stabilisierung von Celluloseethern bei Erwärmung, daher wird ein Phosphatpuffer (PBS-Puffer) mit pH 7,4 eingesetzt. Ein pH-Wert zwischen 7,0 und 8,0 ist geeignet. Um eine gleichmäßige Verteilung in der Mischung aus Standardboden und Vorbehandlungslösung zu erreichen, enthält die Vorbehandlungslösung eine nichtionische, grenzflächenaktive Substanz, Tween 20.
• Die Mischungen wurden auf einem Reagenzglasschüttler bei mittlerer Umdrehungszahl gründlich gemischt.
• Die Mischungen wurden zur thermischen Lyse für 10 Minuten in einen Thermoblock bei 95°C inkubiert.
• Die Mischungen wurden aus dem Thermoblock entnommen und auf einem Reagenzglasschüttler bei mittlerer Umdrehungszahl gründlich gemischt.
• Die Mischungen ließ man anschließend in einem Kühlbock bei ca. 8°C für 1 bis 3 Minuten abkühlen und sedimentieren. Hierbei fand eine physikalische Trennung unter Erhalt eines Überstandes statt.
• Danach wurden die flüssigen und ungeklärten Überstände der Mischungen abgenommen und in neue Reaktionsgefäße überführt.
• Diese Überstände wurden zur Klärung in einer Zentrifuge bei einem Beschleunigungswert mit 6700 g für 1 Minute zentrifugiert.
• Nach der Zentrifugation wurden die Überstände in neue Reaktionsgefäße überführt.
• Um die Verluste an DNA so genug wie möglich zu halten, wurden in einem weiteren Schritt die Sedimente der Mischungen ebenfalls in einer Zentrifuge bei einem Beschleunigungswert mit 6700 g für 1 Minute zentrifugiert.
• Diese Überstände wurden mit den bereits überführten und geklärten Anteilen der entsprechenden Probe vereinigt.

b) Weiterbearbeitung mit einem handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit
Hierfür standen zahlreiche handelsübliche Kits zur Verfügung, zum Beispiel:
PrestoSpin D Plant Kit^®, Fa. Molzym; QIAamp DNA Stool Mini Kit^®, Fa. Qiagen; EZ1 DNA Blood (350 μl/200 μl) Kit^®, Fa. Qiagen; DNA IQ Casework Sample Kit for Maxwell 16^®, Fa. Promega; PowerSoil DNA Isolation Kit^®, Fa. MoBio; Tissue Genomic Purification Kit^®, Fa. Dr. Lerche; SoilMaster DNA Extraction Kit^® Fa. Epicentre; FastDNA Spin Kit for Soil^®, Fa. Q BIOgene.
Die DNA-Isolierung aus den geklärten Überständen erfolgte mit einem Roboter zur Nukleinsäuren-Isolierung der Firma Promega. Dabei wurde ein handelsübliches Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit, das DNA IQ Casework Sample Kit for Maxwell 16^® der Firma Promega verwendet. Der Roboter arbeitete nach dem ”Forensic Mode”-Protokoll.
c) Nachbehandlungsverfahren
Da die oben erhaltenen Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen noch sichtbare Inhibitoren enthielten, sichtbar aufgrund einer Braunfärbung, erfolgte anschließend eine Aufreinigung der Nukleinsäuren in einem Nachbehandlungsverfahren.
Bei dem Nachbehandlungsverfahren wurde die Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung durch ein Trennmaterial, das ein quervernetztes Polymer aufweist, geführt, um inhibitorische Substanzen, wie Huminsäuren, abzutrennen.
Das quervernetzte Polymer war gequollenes Polyvinylpolvpyrrolidon (PVPP).
Die Abtrennung wurde mit zentrifugierbaren Trennsäulen durchgeführt.
Die zentrifugierbaren Trennsäulen (PVPP-Säulen) wurden nach folgenden Schritten hergestellt:

• Entsprechend der Probenanzahl wurden in 6 Pierce Spin Columns der Firma Thermo Scientific (Produkt No.: 69725) je 0.05 g Polyvinypolypyrrolidon (PVPP) eingewogen.
• Jede Säule wurde mit 800 μL H₂O versetzt und zum Quellen einige Minuten stehen gelassen.
• In einer Zentrifuge mit einem Beschleunigungswert von 4000 g wurden die Säulen für 1 Minute zentrifugiert.
• Anschließend wurde jede Säule einmal gewaschen, indem sie mit 400 μL H₂O befüllt und nochmals mit einem Beschleunigungswert von 4000 g für 1 Minute zentrifugiert wurde.
• Anschließend wurden die Säulen mit 400 μL H₂O befüllt und stehen gelassen.
• Unmittelbar vor der Verwendung der Säulen wurden diese erneut bei einem Beschleunigungswert von 4000 g, 1 Minute zentrifugiert.

Die Schritte des Nachbehandlungsverfahrens waren:

• Zur Aufreinigung der DNA-Konzentrate wurden jeweils 70 μL der gewonnenen Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen auf jeweils eine der zentrifugierten PVPP-Säulen aufgetragen.
• Anschließend wurden die Säulen bei einem Beschleunigungswert von 4000 g 1 Minute zentrifugiert, um aufgereinigte Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen zu gewinnen. Inhibitorische Substanzen, wie Huminsäuren, wurden vom PVPP zurückgehalten.

d) Parallelversuch ohne Vor- und Nachbehandlung
Um Vergleichswerte zu generieren, wurden im Parallelversuch 6 Aliquots vom Standardboden mit den gleichen Bakterienkonzentrationen versetzt und ohne weitere Vorbehandlung mit dem gleichen handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit aufgearbeitet. Eine Nachbehandlung fand nicht statt. Die gewonnene Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen wurden dann ebenfalls der weiteren PCR-Analyse zugeführt.
e) Analyse mittels PCR
Die gewonnenen Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen wurden in einer für die verwendeten Bakterien spezifischen Realtime PCR analysiert. Mit der PCR wurden die Nachweisgrenzen ermittelt und somit die Nachweissensitivitäten bestimmt.
f) Ergebnis
Ein handelsüblicher DNA-Isolierungs-Kit mit Vor- und Nachbehandlungsverfahren erbrachte gegenüber einem handelsüblichen Kit ohne Vor- und Nachbehandlungsverfahren folgende Vorteile:

• Die Nachweisgrenze bei einem handelsüblichen Kit ohne Vor- und Nachbehandlung lag bei 10⁶ Zellen in 0,5 g Bodenprobe.
• Durch eine Vor- und Nachbehandlung konnte die Nachweisgrenze auf 10³ Zellen in 0,5 g Bodenprobe erhöht werden.
• Die Nachweissensitivität konnte um den Faktor 1000 gesteigert werden.

Zweites Ausführungsbeispiel
Ein weiteres Ausführungsbeispiel zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren wurde mit Kaolin-Proben durchgeführt. Kaoline sind verschiedene Aluminiumhydratsilikate, die als Endprodukt bei der Verwitterung von Granit und Feldspat entstehen. Kaoline gehören im Bereich des Nachweises von biologischen Agenzien zu den ”Critical Reagents”, da sie die nachgeschaltete Analytik oftmals stark behindern.
Zur Ermittlung der Nachweisgrenzen wurden 6 Kaolin-Aliquots (je 0,05 g Aluminiumsilikat der Firma Aldrich) mit unterschiedlichen Mengen an Bakterien versetzt: 10⁶; 10⁵; 10⁴ und 10³ Zellen. Als Negativ-Kontrolle wunde H₂O verwendet.
Analog zum ersten Ausführungsbeispiel erfolgten das Vorbehandlungsverfahren und die Weiterbearbeitung mit dem genannten handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit.
Parallel zum ersten Ausführungsbeispiel wurden wieder die Vergleichwerte ermittelt, indem das handelsübliche Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit ohne ein Vorbehandlungsverfahren eingesetzt wurde. Durch interne Inhibitionskontrollen konnte nachgewiesen werden, dass keine Inhibitoren mehr in den gewonnenen Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen enthalten waren. Daher wurde in diesem Ausführungsbeispiel auf ein Nachbehandlungsverfahren verzichtet.
Die gewonnenen Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen wurden anschließend wie in Ausführungsbeispiel 1 einer spezifischen Realtime PCR unterzogen.
Ergebnis
Ein handelsüblicher DNA-Isolierungs-Kit mit dem Vorbehandlungsverfahren erbrachte gegenüber einem handelsüblichen Kit ohne Vorbehandlungsverfahren folgende Vorteile:

• Die Nachweisgrenze bei einem handelsüblichen Kit ohne Vorbehandlung lag bei 10⁵ Zellen in 0,05 g Kaolin-Probe.
• Durch eine Vorbehandlung konnte die Nachweisgrenze auf 10³ Zellen in 0,05 g Kaolin-Probe erhöht werden.
• Die Nachweissensitivität konnte um den Faktor 100 gesteigert werden.

Drittes Ausführungsbeispiel:
Ein weiteres Ausführungsbeispiel zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren wurde mit Wüstenboden aus den Vereinigten Arabischen Emiraten (Abu Dhabi) durchgeführt. Dieser Wüstenboden enthält auf Grund seiner sandigen Zusammensetzung einen hohen Anteil an Silikaten.
Zur Ermittlung der Nachweisgrenzen wurden 6 Aliquots von je 0,5 g Wüstenboden mit unterschiedlichen Mengen an Bakterien versetzt: 10⁶; 10⁵; 10⁴ und 10² Zellen. Als Negativ-Kontrolle wurde H₂O verwendet.
Analog zum ersten und zweiten Ausführungsbeispiel erfolgten das Vorbehandlungsverfahren und die Weiterbearbeitung mit dem genannten handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit.
Wie im zweiten Ausführungsbeispiel wurden parallel die Vergleichwerte ermittelt, indem das handelsübliche Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit ohne ein Vorbehandlungsverfahren eingesetzt wurde. Durch interne Inhibitionskontrollen konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass keine Inhibitoren mehr in den gewonnenen Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen enthalten waren. Daher wurde auch hier auf ein Nachbehandlungsverfahren verzichtet.
Die gewonnenen Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösungen wurden anschließend wie in Ausführungsbeispiel 1 und 2 einer spezifischen Realtime PCR unterzogen.
Ergebnis
Ein handelsüblicher DNA-Isolierungs-Kit mit dem Vorbehandlungsverfahren erbrachte gegenüber einem handelsüblichen Kit ohne Vorbehandlungsverfahren folgende Vorteile:

• Die Nachweisgrenze bei einem handelsüblichen Kit ohne Vorbehandlung lag bei 10⁵ Zellen in 0,5 g Wüstenboden.
• Durch eine Vorbehandlung konnte die Nachweisgrenze auf 10² Zellen in 0,5 g Wüstenboden erhöht werden.
• Die Nachweissensitivität konnte um den Faktor 1000 gesteigert werden.

Claims

Vorbehandlungsverfahren zur Isolierung und Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren aus einer Umweltprobe mit einer silikathaltigen Hintergrundmatrix, derart, dass das Vorbehandlungsverfahren folgende Schritte umfasst: • Zugabe einer Vorbehandlungslösung zu der Umweltprobe unter Erhalt einer Mischung, derart, dass die Vorbehandlungslösung einen Wirkstoff aufweist, der ein wasserlösliches Celluloseether-Derivat mit anionisch reaktiven Gruppen ist, • Durchführung einer Thermolyse mit der zuvor erhaltenen Mischung, • physikalische Trennung der zuvor behandelten Mischung mittels Sedimentation unter Erhalt eines Überstandes, • Klärung des Überstandes durch Zentrifugation, • Weiterbearbeitung des geklärten Überstandes, derart, dass der Wirkstoff der Vorbehandlungslösung Natrium-Carboxymethylcellulose ist und die Weiterbearbeitung des geklärten Überstandes mit einem handelsüblichen Nukleinsäuren-Isolierungs-Kit erfolgt, unter Erhalt einer Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die aus Anspruch 1 erhaltene Nukleinsäuren-Konzentrat-Lösung durch ein Trennmaterial, das ein quervernetztes Polymer aufweist, geleitet wird, um inhibitorische Substanzen, wie Huminsäuren, abzutrennen.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das quervernetzte Polymer gequollenes Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem die Trennung mit einer zentrifugierbaren Trennsäule durchgeführt wird.