DE102014214173A1

DE102014214173A1 - Verfahren zur selektiven größenfraktionierten Isolierung von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102014214173A1
Application number: DE102014214173.7A
Authority: DE
Inventors: Timo Hillebrand
Original assignee: AJ Innuscreen GmbH
Current assignee: AJ Innuscreen GmbH
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2014-07-21
Publication date: 2016-01-21
Anticipated expiration: 2034-07-22
Also published as: DE102014214173B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur größenfraktionierten Isolierung von Nukleinsäuren, gekennzeichnet durch folgende Schritte: – Zu einem Volumen des Gemischs von Nukleinsäuren wird – in Anwesenheit von chaotropen Salzen – ein erster Bindungspuffer hinzugefügt, der mindestens eine Substanz enthält, die multivalente Kationen komplexiert – Abtrennen der durch Schritt a) gebundenen Nukleinsäuren – Das Filtrat aus Schritt a) wird mit einem zweiten Bindungspuffer versetzt, der mindestens ein nichtionisches Tensid oder einen Alkohol oder ein Gemisch aus nichtionischem Tensid und Alkohol enthält – Abtrennen der durch Schritt c) gebundenen Nukleinsäuren – Waschen und Eluieren der nach Schritt a) und b) isolierten Nukleinsäuren nach bekannten Verfahren, mit dem Ergebnis, dass die Nukleinsäuren, die nach Schritt a) isoliert wurden, nicht nur eine größere Anzahl von Basenpaaren aufweisen als die unter Schritt c) isolierten Nukleinsäuren, sondern dass sowohl nach Schritt a) als auch nach Schritt c) einzelne, bestimmte Nukleinsäure-Fraktionen mit einer bestimmten Anzahl von Basenpaaren isoliert werden, die im jeweils anderen Schritt nicht isoliert werden. Die Größenverhältnisse der Nukleinsäure-Fraktionen sind durch die Konzentration der Substanzen, die multivalente Kationen komplexieren sowie durch die Konzentrastion der Tenside steuerbar.

Description

Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur größenfraktionierten Isolierung von Nukleinsäuren.
Die Erfindung zielt insbesondere auf solche Anwendungen, bei denen es gewünscht ist, dass nur Nukleinsäuren eines ausgewählten Größenspektrums isoliert werden sollen, damit spezifische downstream-Applikationen effizienter durchgeführt werden können.
Stand der Technik
Für die Aufreinigung und Rückgewinnung von Nukleinsäuren, insbesondere von DNA bzw. von DNA-Fragmenten, existiert heute eine Vielzahl von kommerziell verfügbaren Kits.
Alle diese Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltende Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und abschließend von den Trägerpartikeln abgelöst.
Das physiko-chemische Prinzip dieser Form der spezifischen Anbindung von Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien soll dabei in der Störung übergeordneter Strukturen des wässrigen Milieus bestehen, durch welche die Nukleinsäuren an der Oberfläche von mineralischen Materialien, insbesondere von Glas- bzw. Silicapartikeln, adsorbieren. Die Störung der übergeordneten Strukturen des wässrigen Milieus erfolgt dabei immer unter Anwesenheit chaotroper Ionen und ist bei hohen Konzentrationen dieser fast quantitativ. Seit 1998 ist zusätzlich bekannt, dass eine Anbindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger auch gänzlich ohne chaotrope Salze enthaltene Puffer möglich ist. So wird in der Druckschrift WO2007/036564 offenbart, dass auch sogenannte antichaotrope Salze enthaltene Puffer eine spezifische Adsorption von Nukleinsäuren an mineralische Träger erlauben, wobei der Prozess der Isolierung der Nukleinsäuren in Analogie zum bekannten Verfahren auf der Basis einer chaotropen Chemie umgesetzt wird. Auch diese Bindungschemie wurde nachfolgend optimiert und verfeinert ( EP1960520 B1 ).
In der Offenlegungsschrift WO 01/62976 A1 wird ein Verfahren offenbart, welches die Aufreinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Reaktionsansätzen unter Zugabe von unterschiedlichen Alkoholen, deren nachfolgender Präzipitation an speziellen festen Phasen (Membranen mit spezifischen physikalischen Charakteristika), Waschschritten mit alkoholischen Puffern und der finalen Elution der Nukleinsäuren mittels Wasser beschreibt. Ebenso beschreiben die Patenschriften US 5405951 A und EP 0512767 B1 die Isolierung von Nukleinsäuren durch Inkubation der Nukleinsäure enthaltenden Probe mit einem Alkohol und der nachfolgenden Inkubation der Probe mit einem mineralischen Material. Die Elution der Nukleinsäuren erfolgt über die Zugabe von auf 60°C erwärmtem Wasser.
In der Patentschrift DE 10253351 B4 wird offenbart, dass die Aufreinigung und Rückgewinnung von Nukleinsäuren dadurch erfolgt, dass man die Nukleinsäure enthaltende Lösung mit Zusätzen so einstellt, dass sie monovalente und multivalente Kationen sowie einen Alkohol enthält, sie danach mit der festen Phase in Kontakt bringt, den Träger anschließend ggf. wäscht und die Nukleinsäure von der festen Phase löst. Als monovalente Salzkomponenten werden Ammoniumchlorid, Natriumchlorid und/ oder Kaliumchlorid verwendet und als multivalente Salzkomponente Magnesiumchlorid, Calciumchlorid, Zinkchlorid und/ oder Manganchlorid.
Es wird offenbart, dass gerade die Kombination eines monovalenten und eines multivalenten Salzes dazu führt, dass Nukleinsäuren an feste Phasen adsorbieren, wobei die dazu notwendigen Ionenstärken nur sehr gering sein müssen. Dies hat den Vorteil, dass ggf. bisher immer notwendige Waschschritte nicht mehr benötigt werden und sich somit die Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren deutlich verkürzen und vereinfachen lassen.
In der Druckschrift WO 2007/065934 A1 wird ein Verfahren offenbart, welches ebenfalls eine Aufreinigung von lang- und kurzkettigen DNA-Fragmenten erlaubt, wobei durch die Verwendung von Salzen der Zitronensäure Puffer eingesetzt werden, die nur geringe Ionenstärken enthalten, so dass ebenfalls Waschschritte nicht mehr notwendig sind.
Alle diese verschiedenen Verfahren zeigen eine Gemeinsamkeit. Sie erlauben immer die Isolierung einer in einer Probe enthaltenen Gesamtnukleinsäure. Dies bedeutet, befindet sich in einer Probe ein Gemisch aus lang- und kurzkettigen Nukleinsäuren, so wird immer dieses Gemisch an Nukleinsäuren aufgereinigt. Es erfolgt keine Trennung oder differenzielle Extraktion von lang- und kurzkettigen Nukleinsäure-Fragmenten bzw. eine gezielte Aufreinigung von Nukleinsäuren, welche sich in einem gewünschten Größenspektrum befinden.
Moderne diagnostische Fragestellungen definieren heute die Notwendigkeit, aus einer Nukleinsäuren enthaltenen Probe selektiv bestimmte Nukleinsäurefraktionen an- bzw. abzureichern bzw. diese Fraktionen differenziert vorliegen zu haben. Als Nukleinsäurefraktion im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Größenfraktion der Nukleinsäure gemeint, d.h. kurzkettige, längerkettige oder langkettige Nukleinsäuren.
Die Anreicherung von kurzkettigen Nukleinsäuren und damit verbunden eine Abreicherung von längerkettigen und langkettigen Nukleinsäuren aus einer Probe spielt in der modernen Prenataldiagnostik eine wesentliche Rolle. Hierbei geht es um eine gewünschte größenfraktionierte Trennung frei zirkulierender maternaler DNA von frei zirkulierender fötaler DNA im Blut von Schwangeren. Die Nutzung frei zirkulierender fötaler DNA für eine Prenataldiagnostik (z.B. Nachweis von Trisomien) hat den Vorteil, dass eine invasive Untersuchung (Amniozentese oder Chorionzottenbiopsie) nicht notwendig wäre, welche für den wachsenden Föten immer ein Risiko bedeutet. Dem Fachmann ist aber auch bekannt, dass der Anteil an frei zirkulierender DNA fötalen Ursprungs im Blut der Mutter generell sehr viel geringer ist, als der Anteil der frei zirkulierenden DNA der Mutter. Durch den großen Überschuss maternaler DNA wird die Untersuchung von Targetsequenzen des Föten deutlich erschwert, dies insbesondere bei der DNA-Sequenzierung.
Darüber hinaus ist der Anteil der frei zirkulierenden DNA generell immer sehr gering, was zusätzlich eine Diagnostik erschwert, da nicht immer eine ausreichende Menge an DNA bereitgestellt werden kann. Hier wäre es wünschenswert, mehr Probenvolumen für eine Extraktion einsetzen zu können. Neben der Prenataldiagnostik spielt die Isolierung von frei zirkulierender Nukleinsäure aus Körperflüssigkeiten eine immer größere Rolle. Dies betrifft die molekulare Tumordiagnostik, die Untersuchung von Transplantatabstoßungsreaktionen u.v.m. Auch bei diesen Forschungsfeldern ist es immer mehr von Interesse, eine selektive größenfraktionierte Extraktion von Nukleinsäuren aus einer Probe durchführen zu können. Wichtig ist wiederum auch, dass man ausreichende Mengen an Nukleinsäuren isoliert und aus diesem Grunde größere Probenvolumina einfach und schnell bearbeiten kann. Wichtig ist auch, generell zu untersuchen, wie sich die Größenverteilung von Nukleinsäuren in einer Probe darstellt, da daraus Rückschlüsse über den Ursprung von frei zirkulierender DNA gezogen werden können.
In EP 2128169 A1 ist ein Verfahren offenbart, welches die Isolierung/ Aufreinigung von kurzkettigen Nukleinsäuren aus einem nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterial beschreibt. Dabei kommen zwei Varianten zum Einsatz. Die Aufreinigung von insbesondere kurzkettigen Nukleinsäuren erfolgt dadurch, dass das Ausgangsmaterial mit einer chaotropen Verbindung, mit Isopropanol sowie einem nukleinsäurebindenden Trägermaterial in Kontakt gebracht wird. Dabei soll der Alkohol in einer Konzentration von ≥ 5% (v/v) und kleiner gleich ≤ 40% (v/v) vorliegen. Dadurch sollen kurzkettigere Nukleinsäuren effizienter an das Trägermaterial binden. Die gebundenen Nukleinsäuren können am Trägermaterial verbleiben, können aber auch eluiert werden. Nach Daten der Patentschrift sollen kurzkettige Nukleinsäuren unter diesen Bindungsbedingungen besonders effizient aufgereinigt werden (Kombination von chaotroper Verbindung mit Isopropanol) und sogar eine Anreicherung von kurzkettigen Nukleinsäuren gegenüber längerkettigen Nukleinsäuren möglich sein. Das Verfahren beschreibt aber keine wirkliche Trennung von kurzkettigen und längerkettigen Nukleinsäuren, sondern nur eine Anreicherung der kurzkettigen Nukleinsäuren. Alle Fraktionen werden aufgereinigt. Um eine Trennung von kurzkettigen und langkettigen Nukleinsäuren durchzuführen, wird in dieser Schrift ein zweites Verfahren beschrieben. Bei diesem Verfahren wird das Ausgangsmaterial mit einer chaotropen Verbindung, mit einem verzweigten und/ oder unverzweigten Alkohol sowie einem nukleinsäurebindenden Trägermaterial in Kontakt gebracht, wobei der Alkohol in einer Konzentration von ≤ 30% (v/v) vorliegt. Danach wird der Durchbruch oder Überstand aus dem ersten Schritt mit einer chaotropen Verbindung, mit einem verzweigten und/ oder unverzweigten Alkohol sowie einem nukleinsäurebindenden Trägermaterial in Kontakt gebracht, wobei der Alkohol in einer Konzentration von ≥ 5% (v/v) vorliegt. Es wird ausgeführt, dass unter den Bedingungen der Kombination eines nukleinsäurebindenden Trägermaterial mit einer chaotropen Verbindung und einem Alkohol mit einer Konzentration von ca. 25 % dazu führt, dass bevorzugt lang- und längerkettige Nukleinsäuren binden, die kurzkettigen Nukleinsäuren dagegen nur sehr schlecht binden und sich demnach im Durchbruch/ Überstand befinden, aus welchem sie dann gemäß dem beschriebenen Verfahren isoliert werden können. Auch dieser zweite Verfahrensweg beschreibt lediglich eine Anreicherung von längerkettigen Nukleinsäuren. Es gibt keinen Hinweis darauf, dass man eine fraktionierte Isolierung von kurzkettigen und länger-/ langkettigen Nukleinsäuren durchführen kann. Auch erlaubt das Verfahren keine Isolierung von Gesamtnukleinsäure und eine nachfolgende Trennung von kurzkettigen und länger-/ langkettigen Nukleinsäuren. Entscheidend für die Anreicherung von kurzkettigen Nukleinsäuren ist die Kombination einer chaotropen Verbindung mit vorzugsweise Isopropanol.
In der Patentschrift DE102006045391 B4 wird ebenfalls ein Verfahren beschrieben, welches sich für die Trennung von lang- und kurzkettigen Nukleinsäuren aus einem diese Nukleinsäuren enthaltenem Gemisch eignet. Die Trennung erfolgt dabei nicht durch eine Änderung der Bindungsbedingungen, sondern über ein sukzessives Passagieren der mit einer chaotropen Verbindung in Kontakt gebrachten Probe über zwei Siliziumdioxidphasen, welche zwei unterschiedliche Porengrößen aufweisen. Nach zweimaligem Durchlaufen der Probe durch die Siliziumdioxydphase 1 und nach zweimaligem Durchlaufen der Probe über die Siliziumdioxydphase 2, sind die Nukleinsäurefragmente in der Form getrennt, als das an der ersten Phase Nukleinsäurefragmente, die mindestens 20.000 Basenpaare groß sind, binden und an der zweiten Phase Nukleinsäurefragmente von höchstens 10.000 Basenpaaren binden. Dieses Verfahren eignet sich damit nicht für die Trennung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren, wie es gerade die Zielstellung der vorliegenden Erfindung ist.
Aufgabe der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, die im Stand der Technik beschriebenen Nachteile zu beseitigen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Im Ergebnis werden in einem ersten Trennungsschritt einzelne, bestimmte längerkettige Nukleinsäure-Fraktionen mit einer bestimmten Anzahl von Basenpaaren, von bestimmten kürzerkettigen Nukleinsäure-Fraktionen abgetrennt, wobei die kürzerkettigen in einem zweiten isoliert werden. Nach dem ersten Schritt sind also die kürzerkettigen Nukleinsäuren nicht an eine feste Phase mittels des ersten Bindungspuffers anbindbar, sondern befinden sich im Filtrat und werden erst nach Zugabe des zweiten Bindungspuffers an eine weitere feste Phase anbindbar. Überraschenderweise wurde dabei festgestellt, dass nicht etwa nur eine prozentuale Abreicherung der jeweils Größenordnung stattfindet, sondern, dass bestimmte Fraktionen nur dem ersten bzw. nur nach dem zweiten Trennungsschritt nachweisbar sind.
Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren bereitgestellt, dass es erlaubt, aus einer Probe, die ein Gemisch aus kurz- und längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren (insbesondere DNA) enthält, selektiv unterschiedliche Größenfraktionen der DNA aufzureinigen bzw. zu isolieren und damit diese Fraktionen für weitere Anwendungen verfügbar zu haben.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, aus einer Probe, die ein Gemisch aus kurz- und länger-/langkettigen Nukleinsäuren (DNA) enthält, selektiv kurzkettige Nukleinsäuren von langkettigen Nukleinsäuren zu trennen, wobei das Größenspektrum der jeweiligen Fraktion einstellbar ist (z.B. Trennung von DNA die kleiner 500 Basenpaare ist von DNA die größer 500 Basenpaare ist). Die jeweils nicht gewünschte Fraktion kann dann verworfen werden, wogegen mit der gewünschten Fraktion weitergearbeitet wird.
Ein weiterer Vorteil ist, dass aus einer großvolumigen Proben (z.B. Plasma, Serum, Urin oder andere zellfreie Körperflüssigkeiten) kurzkettige und länger-/langkettige Nukleinsäuren aufkonzentriert wird und nachfolgend, wie unter Punkt 1 bzw. Punkt 2 beschrieben, eine selektive größenfraktionierte Trennung von Nukleinsäuren durchgeführt werden kann.
Der vorliegenden Erfindung lag eine Beobachtung zu Grunde, dass die Isolierung von kurzkettigen DNA-Fragmenten (DNA-Fragmente kleiner als 500 bp) aus einem TBE Agarosegelstückchen (TBE = TRIS-Borat-EDTA-Puffer, wobei TRIS für Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan steht) immer problematischer ist, als aus einem TAE Gelstückchen (TAE = TRIS-Acetat-EDTA-Puffer). Dem Fachmann ist bekannt, dass man sich bei der Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen der klassischen Technik, welche von Vogelstein und Gillespie bereits 1979 beschrieben wurde, bedient. Dabei wird das Agarosegelstück durch die Zugabe einer chaotropen Verbindung aufgelöst und nachfolgend mit einem mineralischen Trägermaterial in Kontakt gebracht. Dabei adsorbieren die in der Agarose enthaltenen DNA-Fragmente an das Trägermaterial, werden gewaschen und final vom Trägermaterial eluiert. Diese Methode ist Stand der Technik. Gerade aber die Aufreinigung von kurzkettigen DNA-Fragmenten aus TBE Agarose ist schwierig und viel weniger effizient als aus einem TAE Agarosegel.
Die Ursache scheint in einer höheren Konzentration an EDTA im TBE Agarosegel zu liegen. So enthält ein TBE Puffer die doppelte Menge an EDTA als ein TAE Puffer. Sollte dies die Ursache sein, dann würde die Möglichkeit bestehen, über die Änderung der Konzentration an EDTA in einem Bindungspuffer solche Bindungsbedingungen einzustellen, die seine Trennung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren erlauben könnte.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann genau dies sehr effizient erreicht werden. Darüber hinaus können die Bindungsbedingungen so flexibel eingestellt werden, das de facto jede beliebige Größenfraktionierung von Nukleinsäuren vorgenommen werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit, aus einer Probe, welche ein Gemisch aus kurz- und längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren (DNA) enthält, selektiv unterschiedliche Größenfraktionen der DNA aufzureinigen bzw. zu isolieren oder auch bestimmte Größenfraktionen selektiv zu entfernen. Der Ablauf des Verfahrens basiert darauf, dass ein Gemisch aus kurz- und längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren mit einer chaotropen Verbindung in Kontakt gebracht wird. Diese chaotrope Verbindung enthält darüber hinaus eine Erdalkali Ionen komplexierende Substanz, vorzugsweise EDTA. Nachfolgend wird dieser Ansatz mit einem nukleinsäurebindenden Trägermaterial (z.B. eine Zentrifugationssäule mit einem Glasfasermaterial) in Kontakt gebracht. Dann wird das Trägermaterial mit Waschpuffern gewaschen und final nach Zugabe von Wasser oder eines anderen Niedrigsalzpuffers die gebundene Nukleinsäurefraktion vom Träger eluiert. Überraschenderweise zeigt sich, dass sich in Abhängigkeit von der Konzentration an EDTA in der chaotropen Verbindung das Größenspektrum der Nukleinsäuren, welche am Träger binden, verändert. Eine sukzessive Erhöhung der EDTA-Konzentration bewirkt, dass zuerst kurzkettige Nukleinsäuren nicht mehr binden und nachfolgend auch längerkettige Nukleinsäuren nicht binden und lediglich langkettige Nukleinsäuren am Träger verbleiben. Diese Fraktionierung kann dabei flexibel eingestellt werden. Letztlich binden dann am ersten Trägermaterial längerkettige/ langkettige oder auch nur langkettige Nukleinsäuren und kurzkettige bzw. kurzkettige/ längerkettige Nukleinsäuren nicht. Die nichtgebundene Fraktion an Nukleinsäuren befindet sich dann jeweils im Filtrat.
Die Isolierung der im Filtrat befindlichen kurzkettigen Nukleinsäuren erfolgt mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wie folgt. Das Filtrat wird jetzt mit einem nichtionischen Tensid, z.B. aus der Klasse der Alkylglucoside oder Oktylphenolethoxylate, versetzt bzw. zur besseren Handhabung mit einem Gemisch aus einer chaotropen Verbindung und einem nichtionischen Tensid. Nachfolgend wird das Gemisch mit einem nukleinsäurebindenden Träger in Kontakt gebracht (z.B. eine Zentrifugationssäule mit Glasfasermaterial), dann gewaschen und final die Nukleinsäure durch Zugabe von Wasser oder eines Niedrigsalzpuffers vom Träger eluiert.
Es zeigt sich, dass durch das nichtionische Tensid die Bindungsbedingungen so geändert werden, dass jetzt die im Filtrat enthaltenen kurzkettigen Nukleinsäuren oder ggf. die kurzkettigen/ längerkettigen Nukleinsäuren effizient an das Trägermaterial binden. Damit scheint das eingesetzte nichtionische Tensid die Wirkung von EDTA in Bezug auf die Bindungsinhibition von kurzkettigen Nukleinsäuren bzw. kurzkettigen/ längerkettigen Nukleinsäuren aufzuheben und als Gegenspieler zum EDTA zu fungieren. Gerade dieses Wechselspiel wird erfindungsgemäß genutzt, um die gewünschte Größenfraktionierung zu realisieren. Man kann anstelle des nichtionischen Tensids die Bindungsinhibierung von EDTA auch durch die Zugabe eines Alkohols bzw. durch die Zugabe eines Gemisches aus einem Alkohol und eines nichtionischen Tensid für den Schritt der zweiten Bindung einsetzen. Zusätzlich kann auch eine Mischung von einem Alkohol und einer chaotropen Verbindung oder eine Mischung aus einem Alkohol, einem nichtionischen Tensid und chaotropen Salz für die Aufhebung der Bindungsinhibition von EDTA eingesetzt werden und für den Schritt der Anbindung von kurzkettigen bzw. kurzkettigen/ längerkettigen Nukleinsäuren an das zweite Trägermaterial verwendet werden.
Überraschenderweise zeigt sich auch, dass es sich bei der Größenfraktionierung nicht um eine prozentuale Anreicherung/Abreicherung bestimmter Fragmentgrößen um 20%, 50% oder 60 % handelt, wie dies in der zitierten Patentanmeldung EP2128169 A1 beschrieben ist, sondern das diese Trennung auch fast quantitativ erreicht werden kann.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können somit selektiv und flexibel zwei Nukleinsäurefraktionen getrennt isoliert werden und liegen parallel vor. Möchte man nicht beide Fraktionen haben, sondern nur eine Fraktionen, dann kann das jeweilige Trägermaterial verworfen werden und man arbeitet nur mit dem Trägermaterial, an welchem sich die gewünschte Nukleinsäurefraktion befindet. Somit kann man die gewünschte Anreicherung/Abreicherung einer ausgewählten Nukleinsäuregrößenfraktion einfach und effizient einstellen und realisieren.
Basierend aus den Beobachtungen, dass die Kombination einer chaotropen Verbindung, EDTA und nichtionisches Tensid dafür verantwortlich ist, welche Nukleinsäurefraktion (kurzkettig oder längerkettig/ langkettig) an einen mineralischen Träger binden, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren es auch, eine biologische Probe, welche unterschiedliche Nukleinsäurefraktionen enthält, direkt zu bearbeiten. Insbesondere zellfreie Körperflüssigkeiten (Serum, Plasma, Urin, etc.) sind wichtige Ausgangsproben, da man aus ihnen effizient sog. zirkulierende zellfreie DNA isolieren möchte.
Wie schon aufgeführt, ist es hier wichtig z.B. langkettige Nukleinsäuren aus der Probe abzureichern und kurzkettige Nukleinsäuren effizient aufzureinigen (z.B. für eine Prenataldiagnostik eine Trennung von maternaler und fötaler DNA zu erreichen). Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht auch die direkte Bearbeitung solcher Proben. Hierzu wird die Probe mit einem Lyse-/ Bindungspuffer versetzt, welcher aus der erfindungsgemäßen Kombination einer chaotropen Verbindung, EDTA sowie einem nichtionisches Tensid besteht. Auch hierbei können durch die Veränderungen der Konzentrationen an EDTA in Kombination mit dem Tensid und der chaotropen Verbindung die Bindungsbedingungen so flexibel eingestellt werden, dass eine gewünschte Größenfraktionierung definiert werden kann. Nach kurzer Lyse der Ausgangsprobe wird die Probe mit einem nukleinsäurebindenden Träger (z.B. Zentrifugationssäule mit Glasfasermaterial) in Kontakt gebracht. Dabei binden die längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren an diesen Träger, die kurzkettigen befinden sich im Filtrat. Die Zentrifugationsäule kann jetzt verworfen werden oder wird gemäß dem schon beschriebenen Verfahrensablauf gewaschen und die gebundenen längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren werden vom Träger eluiert und liegen dann für weitere Anwendungen vor. Das Filtrat wird weiterbehandelt und mit einem nichtionischen Tensid oder einem Gemisch aus einem nichtionischen Tensid und einer chaotropen Verbindungen oder einem Gemisch aus einem nichtionischen Tensid und einem Alkohol oder nur einem Alkohol versetzt. Dadurch wird die inhibierende Wirkung von EDTA in Bezug auf die Bindung von kurzkettigen Nukleinsäuren aufgehoben und die kurzkettigen Nukleinsäuren binden effizient an ein zweites Trägermaterial (z.B. Zentrifugationssäule mit Glasfasermaterial). Nach Waschschritten werden die kurzkettigen Nukleinsäuren eluiert und können analysiert werden.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es somit möglich, die längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren aus der Probe effizient abzureichern und die kurzkettigen Nukleinsäuren effizient zu isolieren. Besonders bedeutsam erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch, dass es auch möglich ist, großvolumige biologische Proben so zu bearbeiten, dass eine Größenfraktionierung von Nukleinsäuren möglich ist. Hierbei ist wiederum die Untersuchung von zellfreien Körperflüssigkeiten von steigendem Interesse.
Wie bereits beschrieben, sind zirkulierende Nukleinsäuren sehr interessant für eine Vielzahl von diagnostischen Fragestellungen. Allerdings ist die Menge dieser zellfreien zirkulierenden DNA sehr gering, so dass die Möglichkeit der Bearbeitung großer Probenvolumen sehr wünschenswert ist, da damit eine deutliche Erhöhung der Ausbeuten an DNA erreicht werden kann. Die Druckschrift ( WO 2009/135936 A1 ) beschreibt ein effizientes und sehr einfaches Verfahren zur Anreicherung von zellfreier DNA aus großvolumigen Proben. Für diese Anreicherung und nachfolgende Aufreinigung zellfreier DNA gibt es auch einen kommerziell verfügbaren Kit (PME free-circulating DNA Extraction Kit; Analytik Jena AG). Allerdings gestattet dieses Verfahren nur die Aufreinigung der zellfreien zirkulierenden Gesamt-DNA. Es erlaubt keine Trennung von kurzkettigen und langkettigen Nukleinsäuren. Hier bietet die vorliegende Erfindung eine Lösung an. So ist es möglich, den Anreicherungsschritt für zellfreie DNA mit einer nachfolgenden Größenfraktionierung von kurzkettigen und längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren zu kombinieren. Damit besteht erstmalig die Möglichkeit, große Probenvolumina zu bearbeiten und auch eine Größenfraktionierung zu ermöglichen. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt dabei in einem ersten Schritt die Anreicherung der zellfreien Gesamt-DNA einer Probe. Dazu gibt man zur Probe eine wässrige Alginatlösung und eine wässrige Lösung, enthaltend Salze von di- bzw. polyvalenten Kationen (z.B. Kalziumchlorid oder Aluminiumchlorid). Nach kurzer Zentrifugation wird der großvolumige Überstand entfernt und mit dem resultierenden Pellet wird weitergearbeitet. In diesem Pellet befindet sich die zellfreie Gesamt-DNA.
Das Pellet wird jetzt mit einem Puffer aufgelöst und nachfolgend die Bedingungen eingestellt, die eine effiziente Adsorption der angereicherten zellfreien Gesamt-DNA an ein erstes Trägermaterial erlauben (z.B. Zentrifugationssäule mit Glasfasermaterial). Nach Waschschritten wird über dieses erste Trägermaterial die zellfreie Gesamt-DNA eluiert. Im resultierenden Eluat befinden sich damit kurzkettige und längerkettige/ langkettige Nukleinsäuren. Von diesem Eluat wird ein kleines Volumen aufgehoben. Das restliche Volumen wird jetzt gemäß dem bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren weiter bearbeitet. Zum Eluat wird eine chaotrope Verbindung und eine definierte Menge an EDTA gegeben. Nachfolgend wird dieser Ansatz mit einem nukleinsäurebindenden Träger (z.B. eine Zentrifugationssäule mit einem Glasfasermaterial) in Kontakt gebracht. Danach wird das Trägermaterial mit Waschpuffern gewaschen und final nach Zugabe von Wasser oder eines anderen Niedrigsalzpuffers die gebundene Nukleinsäurefraktion vom Träger eluiert. Dieses zweite Eluat enthält erfindungsgemäß jetzt die Fraktion der längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäure.
Die Isolierung der im Filtrat befindlichen kurzkettigen Nukleinsäuren erfolgt dann wiederum dadurch, dass das Filtrat jetzt mit einem nichtionischen Tensid, mit einem Gemisch aus einer chaotropen Verbindung und einem nichtionischen Tensid oder einem Gemisch aus einem nichtionischen Tensid und einem Alkohol oder einem Alkohol gemischt wird. Nachfolgend wird das Gemisch mit einem nukleinsäurebindenden Träger in Kontakt gebracht (z.B. eine Zentrifugationssäule mit Glasfasermaterial), dann gewaschen und final die Nukleinsäure durch Zugabe von Wasser oder eines Niedrigsalzpuffers vom Träger eluiert.
Damit hat man dann in diesem Eluat die dritte Fraktion. Die Kombination von Anreicherung zellfreier DNA und Isolierung der Gesamt-DNA mit einer nachfolgenden Größenfraktionierung der DNA kann aber auch dadurch erfolgen, dass man das nach Anreicherung erhaltenen Pellet mit einer chaotropen Verbindung und EDTA auflöst und danach diesen Ansatz in Kontakt mit einem ersten Träger bringt und damit die längerkettige/ langkettige Nukleinsäurefraktion bindet und eluiert und das Filtrat durch Änderung der Bindungsbedingungen durch die Zugabe eines nichtionischen Tensids, eines Gemisches aus einer chaotropen Verbindung und einem nichtionischen Tensid oder einem Gemisch aus einem nichtionischen Tensid und einem Alkohol oder einem Alkohol oder einem Alkohol und einer chaotropen Verbindung ändert, so dass nachfolgend die kurzkettigen Nukleinsäuren an einen zweiten Träger binden und eluiert werden können. Auch in diesem Falle kann man eine Trennung von kurz- und längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren erreichen. Damit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren auch in exzellenter Weise für die Bearbeitung von großvolumigen Proben. Darüber hinaus kann in jedem Falle eine Selektivität in Bezug auf die Größe der jeweils an den ersten oder zweiten Träger bindenden Nukleinsäuren eingestellt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erklärt. Diese Ausführungsbeispiele stellen dabei aber keine Limitierung der Erfindung dar.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
Selektive größenfraktionierte Isolierung von DNA aus einer Probe, die ein Gemisch von unterschiedlichen DNA-Fragmenten enthält. Darstellung des Einflusses der Wechselwirkung von EDTA und einem nichtionischen Tensid aus der Klasse der Alkylglucoside.
Jeweils 50 µl einer Probe, enthaltend DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe (110 bp, 250 bp, 550 bp und 1030/ 1200 bp) wurden mit 400 µl einer chaotropen Verbindung (4M Guanidinisothyocyanat) gemischt. Die chaotrope Verbindung enthielt darüber hinaus zwei unterschiedliche Konzentrationen an EDTA (5 mM und 10 mM). Danach wurde der Ansatz über eine erste Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) zentrifugiert. Das Filtrat wurde mit 400 µl eines Gemisches aus einer chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids aus der Klasse der Alkylglucoside (4M Guanidinisothyocyanat/30 % nichtionisches Tensid) versetzt und dieser Ansatz auf eine zweite Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) überführt und zentrifugiert. Nachfolgend wurden beide Zentrifugationssäulen mit einem alkoholischen Waschpuffer gewaschen, durch einen Zentrifugationsschritt getrocknet und die gebundene Nukleinsäure durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) eluiert.
Der Nachweis der isolierten DNA-Fragmente erfolgte mittels eines Agilent-Bioanalyzers unter Nutzung des DNA Kits 7500. Dies erlaubt den sensitiven und quantitativen Nachweis der isolierten DNA-Fragmente. Hierbei zeigt sich deutlich, dass bei einer EDTA-Konzentration von 5mM in der chaotropen Verbindung sowohl das 250 bp, das 550 bp und das 1030/ 1200 bp Fragment an die erste Zentrifugationssäule binden. Das 110 bp Fragment bindet dagegen nicht (nicht quantifizierbar). Damit können durch die Einstellung dieser Bindungsbedingungen an ein erstes Trägermaterial Nukleinsäuren gebunden und isoliert werden, die größer als 110 bp sind oder dieses Größenspektrum kann auch selektiv entfernt werden. Das Eluat der zweiten Zentrifugationssäule enthält dagegen das DNA-Fragment von 110 bp, aber keine der 3 anderen Fragmente (nicht quantifizierbar). Dies beweist, dass durch die Zugabe einer Mischung einer chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids zum Filtrat die Inhibition der Bindung des kleinen Fragmentes aufgehoben wurde und dieses dann aus dem Filtrat isoliert werden kann. Wiederholt man denselben Versuch und erhöht die Konzentration von EDTA auf 10 mM, dann zeigt sich eindrucksvoll, dass man die größenfraktionierte Bindung der DNA-Fragmente steuern kann. Unter diesen Bedingungen binden nur noch das 550 bp und das 1030/ 1200 bp Fragment an die erste Zentrifugationssäule, nicht aber das 110 bp bzw. das 250 bp Fragment. Diese Fragmente können dann nach Änderung der Bindungsbedingungen durch die Zugabe der chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids an die zweite Zentrifugationssäule binden und dann eluiert werden. Dies beweist, dass man durch die Änderung der Konzentration an EDTA Bindungsbedingungen so einstellen kann, dass an einen ersten Träger selektiv DNA-Fragmente binden, die eine gewünschte Größe haben, die jeweils kleineren Nukleinsäuren binden dagegen nicht an das erste Trägermaterial. Im korrespondierenden Filtrat befindliche Nukleinsäuren adsorbieren dann an einen zweiten Träger, wenn man die Bindungsinhibition von EDTA zum Beispiel durch die Zugabe eines Gemisches aus einer chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids aufhebt.
1 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse (5 mM EDTA im ersten Bindungspuffer) mit dem Eluat der ersten Zentrifugationssäule mit den Fragmenten von 250 bp, 550 bp und 1030/ 1200 bp.
2 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse (5 mM EDTA im ersten Bindungspuffer) mit dem Eluat der zweiten Zentrifugationssäule mit dem 110 bp Fragment.
3 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse (10 mM EDTA im ersten Bindungspuffer) mit dem Eluat der ersten Zentrifugationssäule mit den Fragmenten von 550 bp und 1030/ 1200 bp.
4 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse (10 mM EDTA im ersten Bindungspuffer) mit dem Eluat der zweiten Zentrifugationssäule mit den Fragmenten von 110 bp und 250 bp.
Beispiel 2
Selektive größenfraktionierte Isolierung von DNA direkt aus einer Plasmaprobe
Ziel des Beispiels war es, zu zeigen, dass auch aus einer biologischen Probe direkt eine größenfraktionierte Isolierung von DNA möglich ist, bzw. zu zeigen, dass bestimmte Nukleinsäurefraktionen aus einer Probe effizient entfernt werden können, damit diese keinen störenden Einfluss auf spezifische Applikationen haben. Ziel war es, Fragmente größer ca. 200 bp aus einer Probe zu entfernen und DNA, welche kurzkettiger ist, effizient aufzureinigen. Das Beispiel illustriert auch, wie ein nichtionisches Tensid zur Steuerung der selektiven Bindung in Kombination mit einer chaotropen Verbindung und in Kombination von EDTA eingesetzt werden kann. Ausgangsprobe waren jeweils 200 µl einer Plasmaprobe, enthaltend vier DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe (110 bp, 250 bp, 550 bp und 1030/ 1200 bp).
Die Probe wurden mit 300 µl einer chaotropen Verbindung (4M Guanidinisothyocyanat) gemischt. Die chaotrope Verbindung enthielt darüber hinaus 5% eines nichtionischen Tensids aus der Klasse der Alkylglucoside sowie 5 mM EDTA. Weiterhin wurde der Probe 20 µl Proteinase K (20 mg/ ml) zugegeben. Die Probe wurde für 15 min bei 70°C lysiert. Danach wurde der Ansatz über eine erste Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) zentrifugiert. Das Filtrat wurde mit 400 µl eines Gemisches aus einer chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids aus der Klasse der Alkylglucoside (4M Guanidinisothyocyanat/30 % nichtionisches Tensid) versetzt und dieser Ansatz auf eine zweite Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) überführt und zentrifugiert. Darüber hinaus wurden bei einer Probe die Bedingungen so eingestellt, dass alle Fragmente an einer Zentrifugationssäule binden und eluiert werden können und damit eine Gesamtnukleinsäure-Extraktion in Abgrenzung von einer selektiven größenfraktionierten Extraktion durchgeführt wird. Nach Lyse wurde diese Probe sofort mit 400 µl eines Gemisches aus einer chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids aus der Klasse der Alkylglucoside (4M Guanidinisothyocyanat/30 % nichtionisches Tensid) versetzt und dieser Ansatz auf eine Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) überführt und zentrifugiert. Nachfolgend wurden alle drei Zentrifugationssäulen mit einem alkoholischen Waschpuffer gewaschen, durch einen Zentrifugationsschritt getrocknet und die gebundene Nukleinsäure durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) eluiert.
Der Nachweis der isolierten DNA-Fragmente erfolgte wiederum mittels eines Agilent Bioanalyzers unter Nutzung des DNA Kits 7500. Die Auswertung zeigt, dass eine größenfraktionierte Trennung von DNA direkt aus einer biologischen Probe möglich ist. In diesem Beispiel wurden die Bindungsbedingungen für die erste Zentrifugationssäule und für die zweite Zentrifugationssäule so eingestellt, dass an der ersten Säule Fragmente von ca. 200 bp nicht binden und diese kurzkettigeren Fragmente dann im Filtrat sind und über die zweite Zentrifugationssäule isoliert werden können. Somit konnte gezeigt werden, dass man längerkettige Nukleinsäuren effizient aus einer Probe entfernen kann bzw. je nach Zielstellung beide Fraktionen parallel aufgearbeitet und verfügbar sind.
5 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse mit dem Eluat der ersten Zentrifugationssäule mit den Fragmenten von 250 bp, 550 bp und 1030/ 1200 bp.
6 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse mit dem Eluat der zweiten Zentrifugationssäule mit 110 bp Fragment.
7 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse mit dem Eluat der Zentrifugationssäule, welche für die Isolierung der Gesamtnukleinsäure eingesetzt wurde mit allen 4 DNA-Fragmenten.
Beispiel 3
Anreicherung von DNA aus einer großvolumigen Probe und nachfolgende größenfraktionierte Isolierung der angereicherten DNA
Ziel des Beispiels war es, zu zeigen, dass auch aus einer großvolumigen biologischen Probe in einem ersten Schritt die Gesamtnukleinsäure angereichert werden kann und nachfolgend eine größenfraktionierte Isolierung verschiedener DNA-Fraktionen möglich ist.
Ausgangsmaterial war 1 ml Plasmaprobe, enthaltend vier DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe (110 bp, 250 bp, 550 bp und 1030/ 1200 bp). Die Anreicherung der DNA-Fragmente erfolgte mittels eines kommerziell verfügbaren Kits (PME free-circulating DNA Extraction Kit; Analytik Jena AG). Dazu wurde die Probe mit den Reagenzien VCR1 und VCR2 gemischt und nachfolgend kurz geschüttelt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Probe bei 11.000 × g für 3 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Nach diesem Anreicherungsschritt befindet sich die DNA in einem Pellet. Das Pellet wurde mit einem Lysepuffer versetzt und lysiert und nachfolgend wurde ein Bindungspuffer zugegeben. Der Ansatz wurde dann über eine Zentrifugationssäule zentrifugiert, gewaschen und die DNA abschließend durch Zugabe von 50 µl H₂O eluiert. Diese erste Fraktion enthielt die Gesamtnukleinsäure (exemplarisch vertreten durch die 4 DNA-Fragmente, welche der initialen Probe zugegeben wurden). Vom Eluat wurden 10 µl aufgehoben. Die verbliebenen 40 µl wurden für die weitere fraktionierte Isolierung der DNA verwendet. Für die Gewinnung der längerkettigen/ langkettigen Fragmente wurden die Bindungsbedingungen jetzt so eingestellt, dass an eine zweite Zentrifugationssäule nur Fragmente binden, die größer ca. 100 bp sind. Dazu wurde das Eluat mit 400 µl einer chaotropen Verbindung (4M Guanidinisothyocyanat) gemischt. Die chaotrope Verbindung enthielt darüber hinaus 5 mM EDTA. Danach wurde der Ansatz über eine Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) zentrifugiert. Die Zentrifugationssäule wurde aufbewahrt. Zur Isolierung der kurzkettigen DNA wurde das Filtrat mit 400 µl eines Gemisches aus einer chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids aus der Klasse der Alkylglucoside (4M Guanidinisothyocyanat/30 % nichtionisches Tensid) versetzt und dieser Ansatz auf eine dritte Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) überführt und zentrifugiert. Nachfolgend wurden die beiden Zentrifugationssäulen mit einem alkoholischen Waschpuffer gewaschen, durch einen Zentrifugationsschritt getrocknet und die gebundene Nukleinsäure durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) eluiert.
Der Nachweis der isolierten DNA-Fragmente erfolgte wiederum mittels eines Agilent Bioanalyzers unter Nutzung des DNA Kits 7500. Die Auswertung zeigt, dass eine Kombination von Anreicherung von Nukleinsäuren aus einer großvolumigen Probe mit einer größenfraktionierte Trennung von DNA möglich ist. In diesem Falle wurden nach Anreicherung von Gesamtnukleinsäure drei Nukleinsäurefraktionen erhalten. In der ersten Fraktion befindet sich die Gesamtnukleinsäure, in der zweiten Fraktion die längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren und in der dritten Fraktion die kurzkettigen Nukleinsäuren (hier im exemplarisch dargestellt durch die jeweiligen DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe).
Es kann dabei jeweils mit den drei Fraktionen gearbeitet werden, bzw. nur mit der oder den jeweils gewünschten Fraktionen.
8 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse mit dem Eluat der ersten Zentrifugationssäule, welche für die Isolierung der Gesamtnukleinsäure nach vorangegangenem Anreicherungsschritt eingesetzt wurde (mit allen 4 DNA-Fragmenten).
9 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse mit dem Eluat der zweiten Zentrifugationssäule, welche die 250 bp, 550 bp sowie 1030/ 1200 bp Fragmente enthält.
10 zeigt das Ergebnis der Agilent Bioanalyzer Analyse mit dem Eluat der dritten Zentrifugationssäule, welche das 110 bp Fragment enthält.
Beispiel 4
Anreicherung von zellfreier DNA aus einer Serumprobe und einer Plasmaprobe und nachfolgende selektive Trennung der kurzkettigen und längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren, differenzierte Isolierung der beiden Fraktionen und Messung der Abreicherung der kurzkettigen Nukleinsäuren von den längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäuren mittels realTime PCR.
Ausgangsmaterial war eine 1 ml Plasmaprobe sowie eine 1 ml Serumprobe. Die Anreicherung der DNA-Fragmente erfolgte mittels eines kommerziell verfügbaren Kits (PME free-circulating DNA Extraction Kit; Analytik Jena AG) nach Herstellerangaben. Nach Anreicherungsschritt wurde die zellfreie Gesamtnukleinsäure gemäß Herstellerangaben isoliert.
Das Eluat mit der isolierten Gesamtnukleinsäure wurde dann für die selektive Trennung der kurzkettigen von der längerkettigen/ langkettigen Nukleinsäurefraktion eingesetzt. Die Bindungsbedingungen wurden so gewählt, dass an die erste Zentrifugationsäule Fragmente von größer ca. 300 bp binden und an die zweite Zentrifugationssäule Fragmente kleiner 300 bp. In der Fraktion der kurzkettigen Nukleinsäuren sollte der Anteil der längerkettigen Nukleinsäure drastisch reduziert werden.
Das nach Anreicherung und Extraktion erhaltene Eluat (50 µl) mit der Gesamtnukleinsäure an zellfreien DNA wurde mit 400 µl einer chaotropen Verbindung (4M Guanidinisothyocyanat) gemischt. Die chaotrope Verbindung enthielt darüber hinaus 5 mM EDTA. Danach wurde der Ansatz über eine erste Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) zentrifugiert. Die Zentrifugationssäule wurde aufbewahrt. Zur Isolierung der kurzkettigen DNA wurde das Filtrat mit 400 µl eines Gemisches aus einer chaotropen Verbindung und eines nichtionischen Tensids aus der Klasse der Alkylglucoside (4M Guanidinisothyocyanat/30 % nichtionisches Tensid) versetzt und dieser Ansatz auf eine zweite Zentrifugationssäule (mit Glasfasermaterial) überführt und zentrifugiert. Nachfolgend wurden die beiden Zentrifugationssäulen mit einem alkoholischen Waschpuffer gewaschen, durch einen Zentrifugationsschritt getrocknet und die gebundene Nukleinsäure durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (10 mM Tris HCl) eluiert.
Die eluierten Nukleinsäurefraktionen wurde dann in einer realTime PCR getestet.
Dazu wurde eine SybrGreen-basierte realTime PCR zur Amplifizierung eines ca. 1 kb großen Cytochrom b Fragmenten durchgeführt. Jeweils beide Eluatfraktionen aus den beiden Proben wurden für die PCR eingesetzt. Verwendete PCR Primer:
Reaktionsansatz (Amplifikation/Hybridisierung)

Pro Probe:

sense Primer (50 pmol/ µl) 0,1 µl

antisense Primer (50 pmol/ µl) 0,1 µl

SyGreen MasterMix (AJ) 7,5 µl

PCR-Grade H₂O add. 15 µl
Die PCR wurde in einem handelsüblichen realTime-PCR-Cycler durchgeführt:
Amplifikationskonditionen
Schritt 1:

Denaturierung 95°C 120“

Schritt 2

Amplifizierung 45 Zyklen

95°C 4“

55°C 40‘‘
Anschließend wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Amplifikationsspezifität nachzuweisen. Die PCR-Ergebnisse sind in der 11 grafisch dargestellt. Je kleiner die Ct-Werte, desto höher ist der Anteil der jeweiligen Nukleinsäurefraktion in der Probe. Da ein Unterschied von 3,3Ct-Werten ungefähr einer 1:10 Verdünnung entspricht, kann man, basierend auf den Ergebnissen berechnen, dass im Falle der Serumprobe eine 1000-fache Konzentrationsverminderung der langkettigen Nukleinsäure in der kurzkettigen Fraktion erreicht wurde. Im Falle der Plasmaprobe erreicht dieser Wert sogar eine 100.000-fache Abreicherung der langkettigen Nukleinsäure in der Fraktion der kurzkettigen Nukleinsäuren. Dies zeigt, wie effizient die Trennung von lang- und kurzkettigen Nukleinsäuren mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist.
Die Darstellung der Ct-Werte ist in Figur abgebildet.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2007/036564 [0005]
EP 1960520 B1 [0005]
WO 01/62976 A1 [0006]
US 5405951 A [0006]
EP 0512767 B1 [0006]
DE 10253351 B4 [0007]
WO 2007/065934 A1 [0009]
EP 2128169 A1 [0014, 0026]
DE 102006045391 B4 [0015]
WO 2009/135936 A1 [0031]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619) [0004]

Claims

Verfahren zur fraktionierten größenabhängigen Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch von Nukleinsäuren mit einer unterschiedlichen Anzahl an Basenpaaren (bp), gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) zu einem Volumen des Gemischs von Nukleinsäuren wird – in Anwesenheit von chaotropen Salzen – ein erster Bindungspuffer hinzugefügt, der mindestens eine Substanz enthält, die multivalente Kationen komplexiert b) Abtrennen der durch Schritt a) gebundenen Nukleinsäuren c) das Filtrat aus Schritt a) wird mit einem zweiten Bindungspuffer versetzt, der mindestens ein nichtionisches Tensid oder einen Alkohol oder ein Gemisch aus nichtionischem Tensid und Alkohol enthält d) Abtrennen der durch Schritt c) gebundenen Nukleinsäuren e) Waschen und Eluieren der nach Schritt a) und b) isolierten Nukleinsäuren nach bekannten Verfahren, resultierend, dass die Nukleinsäuren, die nach Schritt a) isoliert wurden, nicht nur eine größere Anzahl von Basenpaaren aufweisen als die unter Schritt c) isolierten Nukleinsäuren, sondern dass sowohl nach Schritt a) als auch nach Schritt c) einzelne, bestimmte Nukleinsäure-Fraktionen mit einer bestimmten Anzahl von Basenpaaren isoliert werden, die im jeweils anderen Schritt nicht isoliert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Bindungspuffer mindestens eine chaotrope Substanz enthält.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als multivalente Kationen komplexierende Substanz EDTA oder EGTA eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als nichtionisches Tensid eine Substanz aus der Klasse der Alkylglucoside oder Oktylphenolethoxylate verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Nukleinsäuren (Anzahl der Basenpaare), die nach Schritt 1a) isoliert werden, durch die Änderung der Konzentration der multivalente Kationen komplexierenden Substanz gesteuert wird, wobei mit steigender Konzentration weniger kurzkettige Nukleinsäuren (geringere Anzahl an Basenpaaren) abgetrennt werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Größe der Nukleinsäuren (Anzahl der Basenpaare), die nach Schritt 1a) isoliert werden, durch die Zugabe eines nichtionischen Tensids oder eines Alkohols oder eines Gemischs aus nichtionischem Tensid und Alkohol zum ersten Bindungspuffer gemäß 1a) gesteuert wird, wobei mit steigender Konzentration der zugesetzten Substanzen mehr kurzkettige Nukleinsäuren (geringere Anzahl an Basenpaaren) abgetrennt werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Fraktionierung bei einer beliebig großvolumigen Probe zunächst die Gesamt-Nukleinsäure nach einem bekannten Verfahren aufkonzentriert wird und anschließend die Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 fraktioniert werden.
Verwendung des Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Isolierung von Nukleinsäure-Fraktionen aus einem Gemisch von Nukleinsäuren mit einer unterschiedlichen Anzahl an Basenpaaren (bp), mit folgender Größe: a) ca. kleiner gleich 110 bp oder b) ca. kleiner gleich 250 bp oder c) ca. größer gleich 550 bp oder
Verwendung von Substanzen, die multivalente Kationen komplexieren in Kombination mit nichtionischen Tensiden zur fraktionierten größenabhängigen Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Gemisch von Nukleinsäuren mit einer unterschiedlichen Anzahl an Basenpaaren.