KR20060129340A - 효소 소화에 의한 핵산의 신속한 제조 - Google Patents

효소 소화에 의한 핵산의 신속한 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 제거하지 않으면서, 생물학적 샘플로부터 직접적으로 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다.
생물학적 샘플로부터 직접적인 핵산의 단리 및 정제, 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터, 비이온성 세제, 추출 효소 용액, 결합 용액

Description

효소 소화에 의한 핵산의 신속한 제조{RAPID PREPARATION OF NUCLEIC ACIDS BY ENZYMATIC DIGESTION}
핵산 이용에서의 진보, 예컨대 자동화된 서열분석 및 의약 스크리닝으로 모든 형태 (플라스미드 또는 벡터가 포함되는 선형 및 원형)의 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 신속하고, 효율적이며 비용-효과가 높은 단리 및 정제 방법에 대한 요구가 증가되었다. 당해 DNA의 충분한 카피(copy)를 수득하기 위해, 예를 들어, 연구원은 당해 DNA를 벡터 또는 플라스미드 내로 넣는다. 이어서 구축된 플라스미드를 세포, 예컨대 박테리아 세포 (예를 들어, 대장균) 내로 형질전환시킨다. 이어서 박테리아 세포가 고체 선택 배지, 예컨대 한천 상에서 성장되고, 세포 분열을 통해, 구축된 플라스미드를 함유하는 동일한 박테레아 세포의 콜로니가 발육된다. 연구원은 이러한 콜로니를 액체 배지, 예컨대 LB 브로쓰(broth) 내로 접종하고, 하룻밤 동안 콜로니가 증식되도록 한다.
일반적으로 행해지는 플라스미드 제조 방법은 (1) 일반적으로 플라스미드를 함유하는 세포를 펠렛화시키는 원심분리에 의해, 배양물로부터 세포를 수확하는 것, 및, 원심 분리 후, (2) 배양 배지를 제거하는 것을 필요로 한다. 수확 후, 와류(vortexing), 교반(shaking), 또는 피펫팅(pipetting)에 의해 재현탁 완충액 내 에 세포가 재구성되는 추가적인 단계가 취해진다. 이러한 통상적인 단계들은 추가적인 비용, 시간 및 조작이 수행되어야할 필요가 있기 때문에 자동화가 잘 되어 있지 않다. 이러한 단계들을 자동화하려고 하는 시스템들은 매우 비용이 많이 든다. 세포를 수확하고, 배양 배지를 제거하고 세포를 재현탁시킨 후에만, 세포가 최종적으로 용해된다(lysed).
종래 기술에는 배양 배지가 단리된 플라스미드의 후속 조작을 방해한다는 것이 개시되어 있다. 예를 들어, [Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, p. 1.31]에는 "연구가들이 최초로 미니프렙(miniprep)할 때, 플라스미드 DNA는 제한 효소에 의한 절단에 대해 저항성이다. 거의 항상, 이러한 문제는 박테리아의 펠렛으로부터 모든 상층액을 제거할 때 충분히 주의하지 않기 때문에 발생한다"라고 언급되어 있다.
용해는 염기, 세제, 효소 및/또는 열의 사용에 의해 일반적으로 이루어진다. 세포를 용해시키는데 알칼리성 용해 방법이 사용된 경우, 중성화 및 후속되는 용해물 세정 단계가 필요하다. 이러한 방법은 힘들고 오래 걸리는 단계를 필요로 하고, 이는 신속한 핵산 제조 방법의 개발을 막는다.
DNA 공급원, 예를 들어, 혈액, 타액, 박테리아 배양물 등으로부터 DNA를 단리하는 대안적인 방법에는 DNA 공급원을 단백질분해성(proteolytic) 효소 및 세제의 배합물로 용해시킨 후, 혼합물을 유기 용매, 예를 들어, 페놀 및 클로로포름으로 추출하여, DNA는 수성 상에 들어가고 가수분해된 생성물들은 유기 상에 들어가 도록 하는 것이 수반된다. 이어서 수성 상 내의 DNA를 알콜의 첨가에 의해 침전시킨다. 그러나, 이러한 유기 추출 방법은 힘들고 시간 소비적이며, 페놀 또는 기타 독성 유기 용매의 사용을 필요로 하여, 안정성 면에서 위험하다.
또다른 접근법에서, DNA 결합 고체 상의 존재 하에 DNA 공급원을 카오트로픽(chaotropic) 물질, 예를 들어 구아니디늄 염, 요소 및 요오드화나트륨으로 용해시킴으로써 DNA가 단리된다. 방출된 DNA는 1 단계 반응에서 고체 상에 결합되고,고체 상을 세척하여 모든 잔류 오염물을 제거한다. 이러한 방법은 덜 시간 소비적이고 독성인 것으로 증명되었지만, 이들은 세포를 펠렛화 및 재현탁시켜 배양 배지를 제거하는 것을 여전히 필요로 한다. 또한, 카오트로픽 물질로 핵산 공급원을 용해시키는 것은 핵산의 가장 통상적인 단리 및 정제 방법 중 일부, 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피 및 고체 상 가역 고정화와 양립할 수 없다.
일단 DNA가 세포로부터 방출되면, 이를 정제하기 위한 다수의 방법이 있다. 민감한 하류 조작, 예컨대 자동화된 서열분석에 순도가 매우 중요하다.
정제를 위한 한 접근법은 CsCl 구배 원심분리를 이용한다. CsCl 구배 원심분리는, 핵산의 분리를 위해, 인터칼레이팅제(intercalating agent), 예컨대 브롬화에티듐의 존재 하에 CsCl 농도 구배 내에서의 사이즈가 상이한 핵산 분자 (RNA, 플라스미드 DNA, 게놈 DNA)의 상이한 침강 거동을 이용한다. 이러한 유형의 분리는 다량의 핵산에서만 이용될 수 있고, 초원심분리를 필요로 한다. 초원심분리의 높은 재정 지출에 더하여, 이중 CsCl 구배 정제, 브롬화에티듐의 제거를 위한 유기 추출 및 CsCl의 제거를 위한 투석을 위해 상당한 시간 지출 (48 시간 이상)이 필요 하다.
정제, 또는 조합된 용해/정제를 위한 일부 방법은 플라스미드 제조를 위한 박테리아 배양물을 용해시키는데 독성 유기 용매 (예를 들어, 페놀 및 클로로포름)를 사용한다. 그러나, 페놀-클로로포름 방법은 지루하고 시간 소비적인 상 분리 단계를 필요로 한다. 또한, 독성 유기 용매를 사용하는 작업은 바람직하지 않다.
DNA 및 RNA는 중성 pH에서 음이온이고, 따라서 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다. 박테리아 세포는 알칼리성 용해에 의해 전형적으로 용해된다. 세포 단백질 및 게놈 DNA는 세제 및 후속되는 원심분리에 의해 분리된다. 플라스미드 DNA를 함유하는 상층액은 "세정된 용해물"로 칭해진다. 세정된 용해물을 음이온 교환 컬럼 상에 적용하면, 원하는 RNA 또는 DNA는 컬럼에 결합하는 반면, 불순물은 컬럼을 통과한다.
양호한 결과를 수득하기 위해, 단리된 핵산의 특정 조작은 핵산이 충분히 순수할 것을 필요로 한다. 이같은 조작 중 하나에는 자동화된 서열분석이 포함된다. 전형적으로, 자동화된 서열분석 기계에서는 방사성 뉴클레오티드보다는 플루오로크롬 태그가 부착된 뉴클레오티드가 사용된다. 4 종의 상이한 염료가 사용되고, 레이져에 의해 자극되면, 이들은 상이한 파장의 빛을 방출한다. 염료를 사용하여 프라이머 또는 각각의 4 종의 디데옥시 사슬 종결인자를 표지할 수 있다. 각각의 디데옥시 반응 혼합물이 상이한 표지에 의해 동정되기 때문에, 방사성 표지를 사용할 때 필요한 4 개의 분리된 레인(lane) 상에 러닝(running)시키는 것과는 달리, 혼합물을 풀링하여(pooled) 단일 레인 상에 러닝시킬 수 있다. 형광 태그 가 부착된 디데옥시 단편들이 겔 아래로 이동하고, 레이져 광선을 통과하여, 플루오로크롬이 레이져에 의해 자극되고, 빛을 방출하고, 이는 광증폭기 또는 CCD 카메라에 의해 검출된다. 서열분석은 핵산 제제 내의 불순물에 민감성이기 때문에, 플라스미드는 자동식 서열분석을 위해 충분히 순수하여야 한다. 또한, 다수의 상이한 플라스미드가 일반적으로 제조되어 서열분석에 사용되고, 이는 신속하고 단순한 제조가 요구되도록 한다.
따라서, 효율적이고, 신속하며, 현행 방법보다 더 적은 조작을 필요로 하는 핵산의 단리 및 정제 방법이 여전히 요구된다. 이같은 방법은 용해 전에 핵산을 함유하는 세포를 수확하는 것을 필요로 하지 않아야 하고, 자동화될 수 있어야 한다. 또한, 추가적인 분자성 조작, 특히 핵산 제제 내의 불순물에 민감성인 조작, 예컨대 자동화된 서열분석, PCR, 제한 소화 및 서브클로닝(subcloning)에서 사용될 수 있는 충분히 정제된 핵산을 생산하는 것이 바람직하다.
도 1에서는 50 mM 트리스(Tris)-HCl (pH 8.0), 200 mM EDTA, 5 ％ 트리톤(Triton) X-100 및 10 ㎎/㎖ RNA분해효소(RNase) A를 포함하는 효소 용액 1 (트랙(track) 3 및 5), 및 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 200 mM EDTA, 5 ％ 트리톤 X-100, 10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A 및 20 ㎎/㎖ 라이소자임을 포함하는 효소 용액 2 (트랙 4 및 6)를 사용하여 다양한 인큐베이션 시간에서 회수된 플라스미드 DNA의 양이 비교된다. 보이는 바와 같이, 트랙 4 및 6에서 가장 많은 양의 단리 및 정제된 플라스미드 DNA가 나타나고, 이는 본 발명의 추출 효소 용액을 사용하는 것이 플라 스미드 DNA가 신속하게 단리 및 정제되도록 한다는 것을 나타낸다.
도 2에서는 다양한 추출 효소 용액 제제를 사용하여 회수된 플라스미드 DNA의 양이 비교된다. 비이온성 세제, 라이소자임, 리보핵산분해효소 및 금속 킬레이터(chelator)의 다양한 배합물의 비교는 4 종의 성분 모두를 함께 사용하는 것 뿐만 아니라, 더 적은 정도이긴 하지만, 라이소자임, 비이온성 세제 및 금속 킬레이터를 사용하는 것이 단리 및 정제된 플라스미드 DNA의 양에 대해서 상승 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 추출 효소 용액이 1단계 플라스미드 단리 및 정제를 위해 결합 용액과 배합될 수 있다는 것을 나타내는 전기영동 겔이다. 도 3은 회수된 플라스미드 DNA의 양이 PEG 농도에 의존적이라는 것을 추가적으로 설명한다.
도 4는 본 발명의 실시양태에 따라 제조되고 EcoR I 및 Xho I으로 소화된 플라스미드 pCMV-SPORT-βgal 또는 플라스미드 pCR II-TOPO의 제한 소화를 나타낸다. 도 4는 본 발명의 추출 효소 용액으로 단리 및 정제된 플라스미드 DNA가 제한 효소에 의해 쉽게 소화될 수 있었고, 고처리량 클론(clone) 스크리닝 및 서브클로닝에 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 추출 효소 용액으로의 처리 후의 pCMV-SPORT-βgal에 대한 전형적인 크로마토그램이다 (부분적) (서열 1). 도 5는 본 발명의 추출 효소 용액으로 단리 및 정제된 플라스미드 DNA가 자동화된 형광 서열분석에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 6은 pCR II-TOPO 에 대한 전형적인 크로마토그램이다 (부분적) (서열 2). 도 6은 본 발명의 추출 효소 용액으로 단리 및 정제된 플라스미드 DNA가 자동화된 형광 서열분석에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
발명의 개요
생물학적 샘플의 배양 배지 또는 세포액 (즉, 세포 또는 세포성 물질을 함유하는 유체)를 먼저 제거하지 않으면서, 생물학적 샘플로부터 직접적으로 1 종 이상의 핵산을 신속하게 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 방법, 조성물 및 키트가 본원에서 청구된다. 더욱 구체적으로, 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터 및 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액 (이하에서 이 4 종의 성분의 배합물을 "추출 효소 용액"으로 지칭함)을 키트 및 조성물이 포함하는, 생물학적 샘플로부터 직접적으로 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 방법, 키트 및 조성물이 본원에서 청구된다. 또한, 본원에서 청구된 일부 방법들이 추출 효소 용액을 사용한다. 다른 방법들은 배양물로부터 직접적으로 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하기 위해, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위해 라이소자임을 사용한다.
본원에서 청구된 조성물 및 키트는 결합 용액을 추가로 포함할 수 있다. 본원 방법 또한 결합 용액이 있는 조성물 및 키트를 사용할 수 있다. 추가적으로, 추출 효소 용액은 핵산의 단리 및 정제 방법이 자동화되도록 한다.
생물학적 샘플을 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터 및 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액으로 처리하는 것은 신속하고, 효율적이며, 비용-효과가 높은 핵산의 단리 및 정제 방법을 허용한다. 추출 효소 용액으로, 원심분리에 의해 생물학적 샘플로부터 세포를 수확할 필요가 없고, 세포 배양 배지 또는 세포액이 제거될 필요가 없다. 이는 세포가 펠렛으로부터 재현탁되어야 할 필요 또한 제거한다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명가들은 추출 효소 용액이 세포 배양물 또는 세포액 내에서의 신속한 효소 소화를 허용하여, 배양 배지 성분으로부터의 어떠한 방해도 없이 또는 최소한도의 방해로, 용해 후 DNA/RNA가 조작되도록 허용하는 것으로 생각한다. 추가적으로, 추출 효소 용액을 사용함으로써, 리보핵산분해효소에 의한 RNA 분해가 카오트로픽 염의 존재하에서와 같이 세포 용해 동안 제한되지 않는 것으로 생각된다.
추출 효소 용액 내에서 4 종의 성분 모두가 함께 배합되는 것은 효과적인 세포 용해, RNA 분해 및 양호한 핵산 회수를 나타낸다. 추가적으로, 추출 효소 용액은 귀찮은 세포 수확 및 재구성 단계를 제거함으로써, 핵산 단리 및 정제 방법을 단순화 및 능률화시킨다. 단독으로 사용된 또는 1 종 또는 2 종의 다른 성분과만 배합된 임의의 성분이 4 종의 성분 모두를 함께 사용하는 것만큼 효과적이지는 않지만, 본원에 기술된 발명은 4종의 성분의 배합에 제한되지 않는다. 또한, 라이소자임을 비이온성 세제 및/또는 금속 킬레이터와 함께 사용하는 것 (리보핵산분해효소는 사용하지 않음)도 4 종의 성분 모두를 함께 사용하는 것보다는 낮은 정도이지만 또한 효과적이라는 것이 발견되었다. 리보핵산분해효소가 사용되지 않은 경우, 효소 용액는 RNA 및 DNA 추출에 사용될 수 있다.
본원에서 청구된 방법, 키트 및 조성물의 추출 효소 용액은 혈액, 타액, 조직, 세포 배양물, 세포액, 세포성 물질 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는 생물학적 샘플에 대해 사용되도록 의도된다. 본원에서 청구된 방법, 키트 및 조성물을 혈액 및 타액에 사용하기 위해, 단백질분해효소(protease)가 포함되지만 이에 제한되지 않는 추가적인 효소 성분이 첨가될 필요가 있을 수 있다. 세포 배양물의 비제한적인 예로는 박테리아, 식물, 효모 및 포유류 세포 배양물이 포함된다. 본원에서 청구된 방법, 키트 및 조성물을 식물, 효모 및 포유류 세포 배양물에 사용하기 위해, 식물에 대해서는 셀룰로스분해효소(cellulase) 및 펙틴분해효소(pectinase), 효모 세포에 대해서는 라이티카제(lyticase), 그리고 포유류 세포에 대해서는 단백질분해효소가 포함되지만 이에 제한되지 않는 추가적인 효소 성분이 첨가될 필요가 있을 수 있다.
본원에서 청구된 효소 용액은 신속하게 세포 배양물을 용해시키고 DNA를 방출시킨다; 충분한 핵산이 세포 배양물을 효소 용액으로 처리한 후 약 10 초 내에 회수될 수 있다. 그러나, 일반적으로 적어도 약 1 분, 2 분 또는 5 분 동안 효소 용액을 사용하려 할 것이다. 유리한 결과는 약 15 분 미만, 또는 적어도 약 30 분 미만 내에 달성되어야 한다.
이러한 추출 효소 용액을 포함하는 방법, 조성물 및 키트에 의해 단리 및 정제된 핵산을 PCR, DNA 서열분석, 제한 소화 및 서브클로닝이 포함되지만 이에 제한되지 않는 하류의 용도에 사용할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 1) 생물학적 샘플의 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않고, 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터 및 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액을 생물학적 샘플과 배합하여 용해물 혼합물을 형성시키고; 2) 용해물 혼합물을 인큐베이션하고; 3) 혼합물을 결합 용액과 배합하는 것을 포함하는, 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플의 제조 방법을 포함한다. 4) 핵산을 고체 지지체에 결합시키고; 5) 고체 지지체로부터 핵산을 용출시키는 것을 포함하는, 후속되는 단리 및 정제 단계가 이어서 수행될 수 있다.
추출 효소 용액은 세포 용해 및 RNA 분해를 야기함으로써, 생물학적 샘플의 배양 배지 또는 세포액로부터의 어떠한 방해도 없이 또는 최소한도의 방해로 배양물로부터 직접적으로 핵산이 단리 및 정제되도록 한다.
추출 효소 용액은 혈액, 타액, 조직, 세포 배양물, 세포액, 세포성 물질 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는 생물학적 샘플에 대해 사용될 수 있다. 세포 배양물의 비제한적인 예로는 박테리아, 식물, 효모 및 포유류 세포 배양물이 포함된다. 식물, 효모 또는 포유류 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 제조할 때, 식물 세포에 대해서는 셀룰로스분해효소 및 펙틴분해효소, 효모 세포에 대해서는 라이티카제, 그리고 포유류 세포에 대해서는 단백질분해효소가 포함되지만 이에 제한되지 않는 추가적인 효소 성분이 첨가될 필요가 있을 수 있다. 본원에서 청구된 방법은 원형 또는 선형 여부와 상관없이 DNA가 포함되는 핵산의 단리 및 정제에 사용될 수 있다.
본원에서 청구된 방법에서, 사용자는 생물학적 샘플을 간략하게 추출 효소 용액으로 처리한다. 일반적으로 약 1 분 미만 내지 약 2 분 미만 동안 처리되어야 하지만, 생물학적 샘플은 약 10 초 정도 간략하게 처리될 수 있고, 당업자는 그 이상 또는 이하의 시간 또한 효과적으로 사용될 수 있음을 인지할 것이다 (예컨대 5 분, 15 분, 또는 30 분 미만).
추출 효소 용액이 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터 및 비이온성 세제를 포함하지만, 트리스와 같은 완충액 및 글리세롤과 같은 안정화제가 포함되는 추가적인 성분이 장기간의 보관을 위해 효소 용액을 안정화시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 효소 용액은 다중 유형의 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터 또는 비이온성 세제를 또한 포함할 수 있다.
본 발명가들은 모든 라이소자임이 추출 효소 용액에서 유용한 것으로 여긴다. 라이소자임의 농도는 10 및 30 ㎎/㎖의 농도가 효과적인 것으로 발견되었지만, 0.5 ㎎/㎖만큼 낮거나 40 ㎎/㎖만큼 높을 수 있다. 유사하게, 모든 리보핵산분해효소가 RNA의 신속한 분해를 위해 효소 용액에서 유용한 것으로 여겨진다. 리보핵산분해효소의 농도는 5 ㎎/㎖ 및 10 ㎎/㎖의 농도가 효과적이었지만, 0.1 ㎎/㎖만큼 낮거나 20 ㎎/㎖만큼 높을 수 있다.
본 발명의 실행에 유용한 금속 킬레이터에는 EDTA, EGTA, CDTA 및 이의 배합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 금속 킬레이터의 농도는 100 및 200 mM의 농도가 효과적이었지만, 10 mM만큼 낮거나 300 mM만큼 높을 수 있다.
본 발명의 실행에 유용한 비이온성 세제에는 폴리옥시에틸렌, 알킬글루코시드, 알킬티오글루코시드, 및 이들의 배합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 폴리옥시에틸렌에는 트리톤 X-100 (Sigma-Aldrich로부터 입수가능하고, 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르로 또한 공지됨), 트윈(Tween) (Sigma-Aldrich로부터 입수가능하고, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트로 또한 공지됨) 및 아이게팔(Igepal) CA-630 (Sigma-Aldrich로부터 입수가능하고, (옥틸페녹시)폴리에틸렌글리콜로 또한 공지됨)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 알킬티오글루코시드에는 옥틸티오글루코시드, 예컨대 옥틸-β-D-티오글루코피라노시드 (Sigma- Aldrich로부터 입수가능)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 비이온성 세제의 농도는 1 ％ 및 5 ％의 농도가 또한 효과적이지만, 0.5 ％만큼 낮거나 10 ％만큼 높을 수 있다.
상기 방법은 결합 용액과 함께 또한 사용될 수 있다. 결합 용액은 후속하여 DNA를 매트릭스에 포획시키기 위해 추출 효소 용액 후에 또는 추출 효소 용액과 동시에 사용될 수 있다.
다양한 시약이 추출 효소 용액과 함께 결합 용액으로서 사용될 수 있다. 결합 용액에는 (1) 염이 없는 또는 염이 있는, 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, (2) 알콜, 카오트로프(chaotrope) 및 염의 배합물, 및 (3) 폴리에틸렌 글리콜, 알콜 및 염의 배합물이 비제한적으로 포함될 수 있다.
결합 용액에서 유용한 알콜의 비제한적인 예로는 이소프로판올, 에탄올, 이들의 배합물 등이 포함된다. 결합 용액에서 유용한 염의 비제한적인 예로는 염화나트륨, 염화리튬, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산리튬, 이들의 배합물 등이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
결합 용액에서 유용한 카오트로프의 비제한적인 예로는 구아니딘 티오시아네이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 과염소산나트륨, 요오드화나트륨, 이들의 배합물 등이 포함된다.
간략한 원심분리 또는 진공 여과를 사용하여 DNA 포획을 보조할 수 있다. DNA 포획은 카오트로프에 의해 구동되는 결합 모드에 의해 또는 침전에 의해 구동되는 결합 모드에 의해 성취될 수 있다. 실리카를 기재로 하는 매트릭스가 카오트로프에 의해 구동되는 결합에 필수적이지만, 침전에 의해 구동되는 결합에는 필수적이지 않다.
당업자에게 공지된 수단에 의한 포획 (예컨대 고체 지지체 상(上)에 포획) 후, 핵산 (예를 들어, DNA)을 세척 용액으로 세척하여 잔류 염 및 기타 불순물을 제거할 수 있다. 이어서 결합된 플라스미드 DNA를 저염 완충액 또는 멸균 증류수의 첨가가 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 공지된 수단에 의해 선택적으로 용출시킬 수 있다. 결합된 핵산으로부터 염 및 기타 불순물을 제거하는데 유용한 세척 용액의 비제한적인 예로는 60-80 ％ 에탄올 및 50-70 ％ 이소프로판올이 포함된다. 핵산을 용출시키는데 유용한 용액의 비제한적인 예로는 10 mM 트리스 (pH 8.5) 및 멸균 증류수가 포함된다.
추출 효소 용액을 첨가한 후, 음이온 교환기 또는 기타 표면에 의해 DNA를 포획할 수 있다. 다수의 표면이 특정 조건에서 핵산과 결합하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 표면에는 이산화실리카, 산화알루미나, 규조토, 마이크로입자 (예컨대 카르복실화 마그네틱 폴리스티렌 비즈(beads) 및 마그네틱 실리카 비즈), 및 중합체 (예컨대 폴리에틸렌이민)가 비제한적으로 포함된다. 추출 효소 용액을 DNA 결합 마이크로입자 또는 중합체와 배합하여 세포 용해와 DNA 포획을 동시에 실행시킬 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시양태에는 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않고, 1) 라이소자임, 2) 리보핵산분해효소, 3) 금속 킬레이터 및 4) 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액, 및 1) 폴리에틸렌 글리콜 및 2) 염을 포함하는 결합 용액과 생물학적 샘플을 배합하여 용해물 혼합물을 형성시키고; 용해물 혼합물을 약 10 초 내지 약 30 분 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하는 방법이 포함된다. 핵산을 고체 지지체 (예컨대 비즈, 다공성 매트릭스 또는 적절한 작용기를 갖는 기타 고체 표면)에 결합시키고 고체 지지체로부터 핵산을 용출시키는 것을 포함하는 후속되는 핵산 단리 및 정제 단계가 이어서 수행될 수 있다. 결합 용액은 효소 용액 후에 또는 용액과 동시에 사용될 수 있다. 이러한 실시양태 또는 본원에서 청구된 모든 실시양태에 유용한 추출 효소 용액 및 결합 용액은 상기 기술된 것과 동일하다.
본 발명의 추가적인 실시양태에는 생물학적 샘플의 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않고 추출 효소 용액을 생물학적 샘플에 첨가하는 것을 포함하는, 1 종 이상의 핵산의 단리 및 정제를 위한 박테리아 세포의 제조 방법이 포함된다.
본 발명의 또다른 실시양태에는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플의 제조를 위한 추출 효소 용액이 포함된다. 추출 효소 용액은, 상기 기술된 바와 같이, 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터 및 비이온성 세제를 포함한다.
추출 효소 용액은 약 0.5 내지 약 40 ㎎/㎖ 라이소자임, 약 0.1 내지 약 20 ㎎/㎖의 리보핵산분해효소, 약 10 내지 약 300 mM 금속 킬레이터 및 약 0.5 ％ 내지 약 10 ％ 비이온성 세제를 포함할 수 있다. 추출 효소 용액은 글리세롤 및 완충액을 추가적으로 포함할 수 있다. 추가적인 실시양태의 추출 효소 용액은 약 10 내지 약 30 ㎎/㎖ 라이소자임, 약 5 내지 약 10 ㎎/㎖ 리보핵산분해효소 A, 약 100 내지 약 200 mM EDTA, 약 1 내지 약 5 ％ 트리톤 X-100을 포함한다. 또다른 실시양태의 추출 효소 용액은 약 20 ㎎/㎖ 라이소자임, 약 10 ㎎/㎖ 리보핵산분해효소 A, 약 200 mM EDTA 및 약 5 ％ 트리톤 X-100을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시양태에는 당해 핵산의 자동화된 단리 및 정제 방법이 포함된다. 이러한 자동화된 방법은 1) 당해 핵산을 함유하는 세포를 배양하기 위한 수단; 2) 세포 배양 배지를 먼저 제거하지 않고, a) 라이소자임, b) 리보핵산분해효소, c) 금속 킬레이터 및 d) 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액을 배양된 세포에 첨가하여 용해물 혼합물을 형성시키기 위한 수단; 3) 용해물 혼합물을 인큐베이션하기 위한 수단; 4) 용해물 혼합물을 결합 용액과 배합하기 위한 수단; 5) 핵산을 매트릭스에 결합시키기 위한 수단; 및 6) 결합된 핵산을 매트릭스로부터 용출시키기 위한 수단을 포함한다.
세포를 배양하기 위한 수단에는 세포 (예컨대 박테리아 세포)를 고체 선택 배지, 예컨대 한천 상에서 성장시킨 후, 세포를 액체 배지, 예컨대 LB 브로쓰 내로 접종하고, 하룻밤 동안 세포가 증식되도록 하는 것이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 세포 배양물은 고처리량 용기, 예컨대 멀티-웰(multi-well) 플레이트 및 스트립 튜브(strip tube)에서 또한 성장될 수 있다. 별법으로, 박테리아 세포 콜로니를 고체 선택 배지에서 스크랩하여 플라스미드 제조에 직접적으로 사용할 수 있다.
배양된 세포에 추출 효소 용액을 첨가하기 위한 수단에는 피펫, 멀티-채널(multi-channel) 피펫, 또는 동결건조된 형태의 추출 효소 용액의 분말을 첨가하는 것이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
용해물 혼합물을 결합 용액과 배합하기 위한 수단에는 피펫 및 혼합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
핵산을 매트릭스에 결합시키기 위한 수단에는 이산화실리카, 산화알루미나, 규조토, 마이크로입자 (예컨대 카르복실화 마그네틱 폴리스티렌 비즈 및 마그네틱 실리카 비즈), 및 중합체 (예컨대 폴리에틸렌이민)로 구성되는 군으로부터 선택된 매트릭스의 사용이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 매트릭스에는 상기 물질들의 배합물이 포함될 수 있다. 결합된 핵산을 매트릭스로부터 용출시키기 위한 수단에는 저염 완충액 또는 멸균 증류수의 첨가가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
자동화된 방법은 세포를 펠렛화시키기 위해 원심분리를 필요로 하지 않고 배양 배지의 제거를 필요로 하지 않기 때문에 추가적으로 유용하다.
본 발명의 추가적인 실시양태에는 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않으면서, 생물학적 샘플로부터 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 키트가 포함된다. 이러한 키트는 1) 라이소자임, 2) 리보핵산분해효소, 3) 금속 킬레이터, 및 4) 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액을 포함한다. 이러한 키트는 추출 효소 용액과 함께 사용될 수 있거나 추출 효소 용액이 사용된 후에 사용될 수 있는 결합 용액을 또한 포함할 수 있다. 유용한 결합 용액의 비제한적인 예로는 1) 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 2) 알콜 및 염의 배합물, 또는 3) 알콜, 염 및/또는 카오트로프의 배합물이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태의 키트는 약 0.5 내지 약 40 ㎎/㎖ 라이소자임, 약 0.1 내지 약 20 ㎎/㎖의 리보핵산분해효소, 약 10 내지 약 300 mM 금속 킬레이터 및 약 0.5 ％ 내지 약 10 ％ 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액을 포함한다. 키트의 추출 효소 용액은 글리세롤 및 완충액을 추가적으로 포함할 수 있다. 또다른 실시양태의 키트의 추출 효소 용액은 약 20 ㎎/㎖ 라이소자임, 약 10 ㎎/㎖ 리보핵산분해효소 A, 약 200 mM EDTA, 및 약 5 ％ 트리톤 X-100을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시양태에는 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않으면서, 생물학적 샘플로부터 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 효소 용액에 관한 것이고, 라이소자임을 포함하는 효소 용액이 또한 포함된다. 이때, 상기 핵산이 RNA 또는 DNA이다. 효소 용액의 추가적인 성분은 비이온성 세제, 금속 킬레이터, 이들의 배합물 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 실시양태 또한 키트로서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시양태에는 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않고, 라이소자임을 포함하는 효소 용액을 생물학적 샘플에 첨가하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 DNA를 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 방법이 포함된다. 효소 용액은 비이온성 세제, 금속 킬레이터, 이들의 배합물 등을 추가로 포함할 수 있다. 리보핵산분해효소를 첨가하지 않으면, 이러한 실시양태는 DNA의 단리 및 정제뿐만 아니라, RNA에 대해서도 사용될 수 있다. 결합 용액이, 상기 기술된 바와 같이, 이러한 방법에서 효소 용액의 첨가와 함께 또는 첨가 후에 추가적으로 사용될 수 있다.
상기 기술된 본 발명의 유리한 성질은 하기의 실시예를 참조로 관찰될 수 있고, 하기의 실시예는 실시양태들을 예증하지만 본 발명을 제한하지 않는다.
달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 모든 유리 필터 재료는 Ahlstrom으로부터 입수가능하고, 모든 다른 성분 및 재료들은 Sigma-Aldrich로부터 입수가능하다.
실시예 1
이 실시예에서는 박테리아 배양물로부터 직접적으로 플라스미드 DNA를 일반적으로 제조하는 것이 제공된다.
단계 1: 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 200 mM EDTA, 5 ％ 트리톤 X-100, 10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A 및 20 ㎎/㎖ 라이소자임을 포함하는 추출 효소 용액 (배양물의 약 0.1 부피)을 튜브, 웰 또는 DNA 정제 컬럼 내의 박테리아 배양물에 첨가하고, 아래위로의 피펫팅, 뒤집음 또는 와류에 의해 10 초 미만 동안 간략하게 혼합한다. 실온에서 1-2 분 동안 인큐베이션한다.
단계 2: 결합 용액 (40 ％ 이소프로판올, 1.8 M 구아니딘 티오시아네이트 및 1.0 염화나트륨)을 배양물의 약 1 배 부피로 첨가하고, 아래위로의 피펫팅 또는 뒤집음에 의해 간략하게 혼합한다. 혼합물을 DNA 정제 컬럼으로 옮기고, 최대 속도에서 30 초 동안의 원심분리 또는 진공 여과에 의해 DNA를 매트릭스에 결합시킨다. 이러한 실험에 사용된 DNA 결합 컬럼은 다양한 크기의 유리 필터 디스크의 층들이 채워진 플라스틱 컬럼 (길이 1.209 인치, 최상부에서의 직경 0.508 인치 및 기저부에서의 직경 0.165 인치)으로 구성되었다.
단계 3: 컬럼을 최대 속도에서 1 분 동안의 원심분리 또는 진공 여과에 의해 세척 용액 (10 mM 트리스 (pH 8.5), 80 ％ 에탄올)으로 세척한다.
단계 4: 플라스미드 DNA를 최대 속도에서 30 초 동안의 원심분리에 의해 저염 완충액 (10 mM 트리스, pH 8.5) 또는 멸균 증류수로 용출시킨다.
실시예 2
이 실시예에서는 다양한 효소 용액을 사용하여 야간 배양물로부터 직접적으로 플라스미드 DNA를 단리 및 정제하고, 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터, 및 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액을 플라스미드 DNA 회수에 사용 하는 것의 공동작용성 효과가 제시된다.
플라스미드 pCMV-SPORT-βgal (7.8 kb)을 함유하는 대장균 균주 DH5α를 플라스미드 제조에 사용하였다. 각각의 경우에, LB 브로쓰 내의 야간 배양물 200 ㎕ 분취량 (OD600 = 3.0)을 Ahlstrom 유리 필터 페이퍼 등급 121의 층 2 개 및 Ahlstrom 유리 필터 페이퍼 등급 151의 층 1 개 (기저부)가 충전된 미니 스핀 컬럼 내로 로딩하였다. 야간 배양물에 효소 용액 20 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2 분 이하로 인큐베이션하였다. 하기의 효소 용액이 사용되었다:
효소 용액 1 효소 용액 2
50 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0)
200 mM EDTA 200 mM EDTA
5 ％ 트리톤 X-100 5 ％ 트리톤 X-100
10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A 10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A
20 ㎎/㎖ 라이소자임
인큐베이션 후, 용해물을 250 ㎕의 결합 용액 (40 ％ 이소프로판올, 6 M LiCl, 0.6 M 구아니딘 티오시아네이트)과 혼합하고, 혼합물을 14,000 rpm에서 15 초 동안의 원심분리에 의해 컬럼에 강제로 넣었다. 이어서, 컬럼을 400 ㎕의 세척 용액 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl, 80 ％ 에탄올)으로 14,000 rpm에서 1 분 동안의 원심분리에 의해 세척하였다. 플라스미드 DNA를 컬럼으로부터 50 ㎕의 용출 용액 (10 mM 트리스, pH 8.5) 내에 14,000 rpm에서 30 초 동안의 원 심분리에 의해 용출시켰다.
각각의 제제 내의 단리 및 정제된 플라스미드 DNA의 양을 아가로스 겔 전기영동에 의해 5 ㎕의 용출물로 결정하였다. 1 kb DNA 래더(ladder)를 트랙 1에 로딩하고, GenElute Endo-Free Maxi Kit에 의해 정제된 대조군 플라스미드 DNA 100 ng을 트랙 2에 로딩하였다 (겔 내 DNA 양의 상대적인 측정을 제공하기 위해). 1 분 미만의 인큐베이션 시간으로 효소 용액 1로 처리된 샘플을 트랙 3에 로딩하고; 1 분 미만의 인큐베이션 시간으로 효소 용액 2로 처리된 샘플을 트랙 4에 로딩하고; 2 분의 인큐베이션 시간으로 효소 용액 1로 처리된 샘플을 트랙 5에 로딩하고; 2 분의 인큐베이션 시간으로 효소 용액 2로 처리된 샘플을 트랙 6에 로딩하였다. 실시예 2의 겔의 결과가 도 1에 제시된다.
실시예 3
이 실시예에서는 라이소자임, 리보핵산분해효소, 금속 킬레이터, 및 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액의 플라스미드 DNA 회수에 사용하는 것의 공동작용성 효과가 제시된다.
플라스미드 pCMV-SPORT-βgal을 함유하는 대장균 DH5α의 LB 브로쓰 내의 야간 배양물 350 ㎕ 분취량 (OD600 = 3.3)을 실시예 2에서와 동일한 유형의 미니 스핀 컬럼 내로 로딩하였다. 이어서 배양물을 35 ㎕의 효소 용액으로 2 분 동안 실온에서 용해시켰다. 하기의 효소 용액이 사용되었다:
효소 용액 1 효소 용액 2
25 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5) 25 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5)
10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A 5 ％ 트리톤 X-100,
30 ㎎/㎖ 라이소자임 10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A
30 ㎎/㎖ 라이소자임
효소 용액 3 효소 용액 4
25 mM 아세트산나트륨 (pH 4.5) 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0)
5 ％ 트리톤 X-100 5 ％ 트리톤 X-100
200 mM EDTA 200 mM EDTA
10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A 10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A
30 ㎎/㎖ 라이소자임 30 ㎎/㎖ 라이소자임
효소 용액 5 효소 용액 6
50 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0)
200 mM EDTA 5 ％ 트리톤 X-100,
10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A 10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A,
30 ㎎/㎖ 라이소자임 30 ㎎/㎖ 라이소자임
보이는 바와 같이, 효소 용액 1, 2, 5 및 6에서는 추출 효소 용액의 4 종의 성분 모두가 사용되지는 않은 반면, 효소 용액 3 및 4에서는 4 종의 성분이 모두 사용되었다.
이어서 용해물을 각각의 경우에 350 ㎕의 결합 용액 (40 ％ 이소프로판올, 1.8 M 구아니딘 티오시아네이트, 1 M NaCl)과 혼합하고, 혼합물을 원심분리에 의해 컬럼에 강제로 넣었다. 700 ㎕의 에탄올 용액 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl)으로 세척한 후, 플라스미드 DNA를 50 ㎕의 용출 용액 (10 mM 트리스, pH 8.5) 내에 용출시켰다.
플라스미드 DNA 회수를 각 경우에 1 ㎕의 용출물로 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정하였다. 1 kb DNA 래더를 트랙 1에 로딩하고, GenElute Endo-Free Maxi Kit에 의해 정제된 대조군 플라스미드 DNA 100 ng을 트랙 2에 로딩하였다. 효소 용액 1로 처리된 샘플을 트랙 3에 로딩하고; 효소 용액 2로 처리된 샘플을 트랙 4에 로딩하고; 효소 용액 3으로 처리된 샘플을 트랙 5에 로딩하고; 효소 용액 4로 처리된 샘플을 트랙 6에 로딩하고; 효소 용액 5로 처리된 샘플을 트랙 7에 로딩하고; 효소 용액 6으로 처리된 샘플을 트랙 8에 로딩하였다.
실시예 3의 결과가 도 2에 제시된다.
실시예 2 및 실시예 3의 결과의 비교는, 라이소자임이 사용되기만 하면, 4 종의 성분 모두가 사용되지 않은 배합물이 4 종의 성분 모두를 사용하는 것보다 적은 정도이긴 하지만 유리한 결과를 또한 나타낸다는 것을 추가적으로 제시한다. 따라서, 라이소자임과 금속 킬레이터 및/또는 비이온성 세제의 배합물 또한 신속한 추출에 사용될 수 있다. 이러한 실시양태는 리보핵산분해효소가 사용되지 않는다면 RNA 단리 및 정제에 추가적으로 사용될 수 있다.
실시예 4
이 실시예에서는 본 발명의 추출 효소 용액이 플라스미드 DNA 단리를 위해 결합 용액과 함께 사용될 수 있다는 것이 제시된다.
플라스미드 pCMV-SPORT-βgal을 함유하는 대장균 DH5α의 LB 브로쓰 내의 야간 배양물의 350 ㎕ 분취량 (OD600 = 3.1)을 Ahlstrom 유리 필터 페이퍼 등급 121의 층 3개가 충전된 미니 스핀 컬럼 내로 로딩하였다. 야간 배양물에 용해/결합 용액 350 ㎕를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3 분 동안 인큐베이션하였다. 하기의 용해/결합 용액을 사용하였다:
용해/결합 용액 1 용해/결합 용액 2
10 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 10 mM 트리스-HCl (pH 8.0)
40 mM EDTA 40 mM EDTA
1 ％ 트리톤 X-100 1 ㎎/㎖ RNA분해효소 A
2 ㎎/㎖ RNA분해효소 A 3 ㎎/㎖ 라이소자임
6 ㎎/㎖ 라이소자임 20 ％ PEG 8000
8％ PEG 8000 0.6 M NaCl
0.6M NaCl
보이는 바와 같이, 용해/결합 용액 2는 더 높은 농도의 DNA 결합제 PEG 8000을 포함한다는 점에서 용해/결합 용액 1과 상이하다.
인큐베이션 후, 혼합물을 14,000 rpm에서 30 초 동안의 원심분리에 의해 컬럼에 강제로 넣었다. 이어서 컬럼을 500 ㎕의 세척 용액 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 10 mM NaCl)으로 14,000 rpm에서 1 분 동안의 원심분리에 의해 세척하였다. 플라스미드 DNA를 50 ㎕의 용출 용액 (10 mM 트리스, pH 8.5) 내에 14,000 rpm에서 30 초 동안의 원심분리에 의해 용출시켰다.
플라스미드 DNA의 회수를 각 경우에 3 ㎕의 용출물로 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정하였다. 1 kb DNA 래더를 트랙 1에 로딩하고, GenElute Endo-Free Maxi Kit에 의해 정제된 대조군 플라스미드 DNA 100 ng을 트랙 2에 로딩하였다. 용해/결합 용액 1로 처리된 샘플을 트랙 3에 로딩하고, 용해/결합 용액 2로 처리된 샘플을 트랙 4에 로딩하였다.
실시예 4의 결과가 도 3에 제시되고, 이는 회수된 플라스미드 DNA의 양이 DNA 결합제 PEG 8000의 농도에 의존적이었음을 나타낸다.
실시예 5
이 실시예에서는 추출 효소 용액으로 단리 및 정제된 플라스미드 DNA가 제한 효소에 의해 쉽게 소화될 수 있고 자동화된 형광 서열분석에 사용될 수 있음이 제시된다.
대장균 균주 DH5α 내의 플라스미드 pCMV-SPORT-βgal 또는 대장균 균주 TOPO 10 내의 1.8 kb 삽입물이 있는 플라스미드 pCR II-TOPO를 함유한 샘플을 제한 소화 및 자동화된 형광 서열분석을 위한 플라스미드 제제에 사용하였다. 각 경우에, LB 브로쓰 내의 야간 배양물 400 ㎕를 2 분 동안 실온에서 40 ㎕의 효소 용액 (50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 200 mM EDTA, 5 ％ 트리톤 X-100, 10 ㎎/㎖ RNA분해효소 A, 20 ㎎/㎖ 라이소자임)으로 처리하였다. 이어서 용해물을 400 ㎕의 결합 용액 (40 ％ 이소프로판올, 1.8 M 구아니딘 티오시아네이트, 1 M NaCl)과 혼합하였다. 원심분리 또는 진공 여과에 의해, 혼합물을 Ahlstrom 유리 필터 페이퍼 등급 181의 층 1 개 (최상부) 및 Ahlstrom 유리 필터 페이퍼 등급 121의 층 2 개가 충전된 미니 스핀 컬럼에 강제로 넣었다. 컬럼을 에탄올 용액 (10 mM 트리스-HCl (pH 8.5), 80 ％ 에탄올)으로 세척한 후, 플라스미드 DNA를 40 ㎕의 용출 용액 (10 mM 트리스, pH 8.5) 내에 용출시켰다.
각각의 제한 소화를 위하여, 플라스미드 pCMV-SPORT-βgal을 함유하는 용출물 2 ㎕ 또는 1.8 kb 삽입물이 있는 플라스미드 pCR II-TOPO를 함유하는 용출물 3 ㎕를 1 시간 동안 37 ℃에서 15 ㎕ 반응 부피로 각각의 EcoR I 및 Xho I 3 유닛으로 소화시켰다. 결과가 도 4에 제시된다.
1 kb DNA 마커를 트랙 1에 로딩하였다. 절단되지 않은 pCMV-SPORT-βgal을 트랙 2에 로딩하였다. 원심분리에 의해 단리된 pCMV-SPORT-βgal 샘플의 소화물을 트랙 3-6에 로딩하였다. 진공 여과에 의해 단리된 pCMV-SPORT-βgal 샘플의 소화물을 트랙 7-10에 로딩하였다. GenElute Plasmid Miniprep Kit에 의해 단리된 pCMV-SPORT-βgal 샘플의 소화물을 트랙 11에 로딩하였다. 원심분리에 의해 단리된 pCR II-TOPO 샘플의 소화물을 트랙 12-15에 로딩하였다. 진공 여과에 의해 단리된 pCR II-TOPO 샘플의 소화물을 트랙 16-19에 로딩하였다. 절단되지 않은 pCR II-TOPO를 트랙 20에 로딩하였다.
자동화된 형광 서열분석을 위해, 상기 방법에 의한 각각의 단리로부터의 용출물 6 ㎕를 Big Dye 3.1로의 모세관 서열분석을 위해 SeqWright (Houston, Texas)에 의뢰하였다. pCMV-SPORT-βgal의 8 개의 독립적인 제제의 평균 프레드(Phred) 20 점수는 802 ± 20이었다. pCMV-SPORT-βgal에 대한 전형적인 크로마토그램이 도 5에 부분적으로 제시된다. pCR II-TOPO의 8 개의 독립적인 제제의 평균 프레드 20 점수는 768 ± 50이었다. pCR II-TOPO에 대한 전형적인 크로마토그램이 도 6에 부분적으로 제시된다.
따라서, 본 발명에 따라, 상기 제시된 목표 및 장점을 충분히 충족시키는 방법, 조성물 및 키트가 제공되었음이 명백하다. 본 발명이 다양한 구체적인 예 및 이의 실시양태에 대하여 기술되었지만, 본 발명이 이에 제한되지 않고 상기 기술(記述)의 견지에서 당업자에게 많은 별법, 변형 및 변화가 명백할 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 취지 및 넓은 범주 내에 속하는 모든 이같은 별법, 변형 및 변화를 포함하는 것이 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Chen, Fuqiang <120> Rapid Preparation of Nucleic Acids by Enzymatic Digestion <130> SGM8522.4 <140> PCT/US2004/043980 <141> 2004-12-30 <150> US 60/533,624 <151> 2003-12-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 197 <212> DNA <213> Plasmid pCMV-SPORT-betagal <400> 1 tccatcagtt gctgttgact gtaccggctg atgttgaact ggaagtcgcc gcgccactgg 60 tgtgggccat aattcaattc gcgcgtcccg cagcgcagac cgttttcgct cgggaagacg 120 tacggggtat acatgtctga caatggcaga tcccagcggt caaaacaggc ggcagtaagg 180 cggtcgggat agttttc 197 <210> 2 <211> 197 <212> DNA <213> Plasmid pCRII-TOPO <400> 2 atgaatgatt aggaaaatca atcaacatct cacaaaataa tccatatcct aggaggcagt 60 ttggcatgga gaaaaggaca caagctctgg agtcaacaga agttaagtct gaatcctagc 120 tctgttgctt ttcaaactgt gtgatcttgg ataagttact tgatctgagt ctcggtttct 180 tgatgtgtaa aatggat 197

Claims (58)

  1. a. 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않고, 1) 라이소자임, 2) 리보핵산분해효소, 3) 금속 킬레이터 및 4) 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액을 생물학적 샘플과 배합하여 용해물 혼합물을 형성시키고;
    b. 용해물 혼합물을 인큐베이션하고;
    c. 1) 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 2) 알콜 및 염 혼합물, 또는 3) 알콜, 염, 및/또는 카오트로프(chaotrope) 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 결합 용액을 용해물 혼합물에 첨가하는 것을 포함하는,
    1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플이 세포 배양물인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 세포 배양물 내의 세포가 박테리아, 식물, 효모 및 포유류로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 결합 용액을 첨가하기 전에 10 초 이상 동안 용해물 혼합물을 인큐베이션하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 결합 용액을 첨가하기 전에 30 분 미만 동안 용해물 혼합물 을 인큐베이션하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 결합 용액을 첨가하기 전에 5 분 미만 동안 용해물 혼합물을 인큐베이션하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 결합 용액을 첨가하기 전에 2 분 미만 동안 용해물 혼합물을 인큐베이션하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 결합된 핵산을 세척 용액으로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 핵산을 용출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 금속 킬레이터가 EDTA, EGTA, CDTA 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 비이온성 세제가 폴리옥시에틸렌, 알킬글루코시드, 알킬티오글루코시드 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 알킬티오글루코시드가 옥틸-β-D-티오글루코피라노시 드이거나, 또는 상기 폴리옥시에틸렌이 트리톤(Triton) X-100, 트윈(Tween), 또는 아이게팔(Igepal) CA-630인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 알콜이 이소프로판올, 에탄올 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 염이 염화나트륨, 염화리튬, 염화칼륨, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨 및 아세트산리튬으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 카오트로프가 구아니딘 티오시아네이트, 구아니딘 히드로클로라이드, 과염소산나트륨, 요오드화나트륨 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제3항에 있어서, 세포 배양물 내의 세포가 효모 세포이고, 추출 효소 용액이 라이티카제(lyticase)를 추가적으로 포함하는 방법.
  17. 제3항에 있어서, 세포 배양물 내의 세포가 포유류이고, 추출 효소 용액이 단백질분해효소를 추가적으로 포함하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 핵산이 DNA인 방법.
  19. 제1항에 있어서, d) 핵산을 고체 지지체에 결합시키고, e) 결합된 핵산을 고체 지지체로부터 용출시킴으로써 핵산을 단리 및 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 추출 효소 용액 및 결합 용액이 동시에 첨가되는 방법.
  21. a) 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않고, 1) 라이소자임, 2) 리보핵산분해효소, 3) 금속 킬레이터 및 4) 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액, 및 1) 폴리에틸렌 글리콜 및 2) 염을 포함하는 결합 용액과 생물학적 샘플을 배합하여 용해물/결합 용액을 형성시키고;
    b) 용해물/결합 용액 혼합물을 약 10 초 내지 약 30 분 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는,
    생물학적 샘플로부터 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 생물학적 샘플이 세포 배양물인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 세포 배양물 내의 세포가 박테리아, 식물, 효모 및 포유류 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  24. 제21항에 있어서, c) 핵산을 고체 지지체에 결합시키고, d) 핵산을 세척 용액으로 용출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 핵산을 용출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 금속 킬레이터가 EDTA, EGTA, CDTA 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제21항에 있어서, 비이온성 세제가 폴리옥시에틸렌, 알킬글루코시드, 알킬티오글루코시드 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 알킬티오글루코시드가 옥틸-β-D-티오글루코피라노시드이거나, 또는 상기 폴리옥시에틸렌이 트리톤 X-100, 트윈, 또는 아이게팔 CA-630인 방법.
  29. 제21항에 있어서, 용해물/결합 용액을 약 5 분 미만 동안 인큐베이션하는 방법.
  30. 제21항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 방법.
  31. 제21항에 있어서, 임의의 또는 모든 단계가 자동화된 방법.
  32. 제22항에 있어서, 세포 배양물 내의 세포가 효모 세포이고, 추출 효소 용액이 라이티카제를 추가적으로 포함하는 방법.
  33. 제22항에 있어서, 세포 배양물 내의 세포가 포유류 세포이고, 추출 효소 용액이 단백질분해효소를 추가적으로 포함하는 방법.
  34. a) 라이소자임;
    b) 리보핵산분해효소;
    c) 금속 킬레이터; 및
    d) 비이온성 세제
    를 포함하는 추출 효소 용액을 생물학적 샘플에 첨가하여 용해물 혼합물을 형성시키고, 용해물 혼합물을 약 10 초 이상 내지 약 30 분 동안 인큐베이션하고, 이때 추출 효소 용액이 세포를 용해시킴으로써, 핵산이 단리 및 정제를 위해 유리되는 것을 포함하는, 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않으면서, 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하는 방법.
  35. 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않으면서, 생 물학적 샘플로부터 핵산을 신속하게 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 추출 효소 용액으로, 하기를 포함하는 용액:
    a) 라이소자임;
    b) 리보핵산분해효소;
    c) 금속 킬레이터; 및
    d) 비이온성 세제.
  36. 제35항에 있어서, 생물학적 샘플이 세포 배양물인 추출 효소 용액.
  37. 제36항에 있어서, 세포 배양물 내의 세포가 박테리아, 식물, 효모 및 포유류 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 추출 효소 용액.
  38. 제35항에 있어서, 금속 킬레이터가 EDTA, EGTA, CDTA 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 추출 효소 용액.
  39. 제35항에 있어서, 비이온성 세제가 폴리옥시에틸렌, 알킬글루코시드, 알킬티오글루코시드 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 추출 효소 용액.
  40. 제35항에 있어서, 알킬티오글루코시드가 옥틸-β-D-티오글루코피라노시드이 거나, 또는 상기 폴리옥시에틸렌이 트리톤 X-100, 트윈, 또는 아이게팔 CA-630인 추출 효소 용액.
  41. 제35항에 있어서, 상기 라이소자임의 농도가 약 0.5 내지 40 ㎎/㎖이고, 상기 리보핵산분해효소의 농도가 약 0.1 내지 약 20 ㎎/㎖이고, 상기 금속 킬레이터의 농도가 약 10 내지 약 300 mM이고, 상기 비이온성 세제의 농도가 약 0.5 ％ 내지 약 10 ％인 추출 효소 용액.
  42. 제35항에 있어서, 안정화제 및 완충액을 추가적으로 포함하는 추출 효소 용액.
  43. 제42항에 있어서, 약 20 ㎎/㎖ 라이소자임, 약 10 ㎎/㎖ 리보핵산분해효소 A, 약 200 mM EDTA, 약 5 ％ 트리톤 X-100, 약 20 ％ 글리세롤 및 약 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0)을 포함하는 추출 효소 용액.
  44. a) 당해 핵산을 함유하는 박테리아 세포를 배양하고;
    b) 배양 배지를 먼저 제거하지 않고,
    1. 라이소자임;
    2. 리보핵산분해효소;
    3. 금속 킬레이터; 및
    4. 비이온성 세제
    를 포함하는 추출 효소 용액을 배양된 박테리아 세포에 첨가하여 용해물 혼합물을 형성시키고;
    c) 용해물 혼합물을 인큐베이션하고;
    d) 용해물 혼합물을 결합 용액과 배합하고;
    e) 핵산을 매트릭스에 결합시키고;
    f) 결합된 핵산을 매트릭스로부터 용출시키는 것을 포함하는,
    당해 핵산의 자동화된 단리 및 정제 방법.
  45. 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않으면서, 생물학적 샘플로부터 1 종 이상의 핵산을 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 키트로, 1) 라이소자임, 2) 리보핵산분해효소, 3) 금속 킬레이터, 및 4) 비이온성 세제를 포함하는 추출 효소 용액을 포함하는 키트.
  46. 제45항에 있어서, 결합 용액을 추가로 포함하는 키트.
  47. 제46항에 있어서, 상기 결합 용액이 1) 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 2) 알콜 및 염의 배합물, 또는 3) 알콜, 염, 및/또는 카오트로프의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 키트.
  48. 제46항에 있어서, 상기 결합 용액이 추출 효소 용액과 동시에 또는 추출 효소 용액 후에 사용될 수 있는 키트.
  49. (1) 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 먼저 제거하지 않고, 라이소자임을 포함하는 효소 용액을 생물학적 샘플에 첨가하여 용해물 혼합물을 형성시키고, (2) 상기 용해물 혼합물을 약 10 초 내지 약 30 분 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플로부터 1 종 이상의 RNA 또는 DNA인 핵산을 단리 및 정제하기 위한, 또는 1 종 이상의 RNA 또는 DNA인 핵산을 후속하여 단리 및 정제하기 위한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 효소 용액이 비이온성 세제, 금속 킬레이터 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 성분을 추가로 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 1) 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 2) 알콜 및 염의 배합물, 또는 3) 알콜, 염, 및/또는 카오트로프의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택된 결합 용액과 용해물 혼합물을 배합하고; 핵산을 고체 지지체에 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  52. 라이소자임을 포함하는, 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 제거하지 않으면서 생물학적 샘플로부터 핵산을 신속하게 추출하기 위한 효소 용액.
  53. 제52항에 있어서, 비이온성 세제, 금속 킬레이터 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 성분을 추가로 포함하는 효소 용액.
  54. 제53항에 있어서, 리보핵산분해효소를 추가로 포함하는 효소 용액.
  55. 라이소자임을 포함하는, 생물학적 샘플의 세포 배양 배지 또는 세포액을 제거하지 않으면서 생물학적 샘플로부터 RNA 또는 DNA를 신속하게 추출하기 위한 키트.
  56. 제55항에 있어서, 비이온성 세제, 금속 킬레이터 및 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 성분을 추가로 포함하는 키트.
  57. 제56항에 있어서, 결합 용액을 추가로 포함하는 키트.
  58. 제57항에 있어서, 상기 결합 용액이 1) 알콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 2) 알콜 및 염의 배합물, 또는 3) 알콜, 염, 및/또는 카오트로프의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 키트.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005057334A1 (de) 2005-11-28 2007-06-06 Aj Innuscreen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus beliebigen Ausgangsmaterialien
EP2281826B1 (en) * 2008-04-02 2016-02-17 Rbc Bioscience Corp. Reagents, chaotropic agents, kits and methods for isolating nucleic acids based on magnetic cellulose materials
DK2473596T3 (en) * 2009-09-03 2018-01-22 Becton Dickinson Co METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIRECT CHEMICAL LYSIS
US8816064B2 (en) 2010-09-30 2014-08-26 Phynexus, Inc. Purification of nucleic acids
WO2014018195A1 (en) 2012-06-21 2014-01-30 Monsanto Technology Llc Lysis buffer and methods for extraction of dna from plant material
TWI555850B (zh) * 2012-08-09 2016-11-01 財團法人工業技術研究院 用於分離核酸的組合物及方法
CN103571824B (zh) * 2012-08-09 2016-04-13 财团法人工业技术研究院 用于分离核酸的组合物及方法
US9976136B2 (en) 2015-05-14 2018-05-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
CN109072231A (zh) * 2016-01-08 2018-12-21 帕特霍奎斯特公司 非细胞生物流体中宿主核酸对核酸消化酶的可及性的调节
CA3036702A1 (en) * 2016-09-15 2018-03-22 Sun Genomics Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US11959125B2 (en) 2016-09-15 2024-04-16 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
US10428370B2 (en) 2016-09-15 2019-10-01 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4843012A (en) * 1986-09-17 1989-06-27 Genetics Institute, Inc. Novel composition for nucleic acid purification
US4900677A (en) * 1986-09-26 1990-02-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for rapid isolation of high molecular weight DNA
GB8725606D0 (en) * 1987-11-02 1987-12-09 Soc D Etudes Prod Chimique Preparation polynucleotides
US5234809A (en) * 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
ATE104338T1 (de) * 1989-05-22 1994-04-15 Genetics Inst Verbesserte zusammensetzung zur isolierung und anreicherung von nukleinsaeure und dadurch verbessertes verfahren.
US4997932A (en) * 1989-11-13 1991-03-05 Boehringer Mannheim Corporation Method and kit for purifying nucleic acids
WO1992008133A1 (en) * 1990-10-29 1992-05-14 Dekalb Plant Genetics Isolation of biological materials using magnetic particles
SE9103215D0 (sv) * 1991-11-04 1991-11-04 Kabi Pharmacia Ab A method and device for dosing a liquid preparation
DE4321904B4 (de) * 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
US5438129A (en) * 1993-09-27 1995-08-01 Becton Dickinson And Company DNA purification by solid phase extraction using partially fluorinated aluminum hydroxide adsorbant
US5990301A (en) * 1994-02-07 1999-11-23 Qiagen Gmbh Process for the separation and purification of nucleic acids from biological sources
US6037465A (en) * 1994-06-14 2000-03-14 Invitek Gmbh Universal process for isolating and purifying nucleic acids from extremely small amounts of highly contaminated various starting materials
US5660984A (en) * 1994-12-09 1997-08-26 Davis; Thomas E. DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof
DE19530132C2 (de) * 1995-08-16 1998-07-16 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien
DE29601618U1 (de) * 1996-01-31 1996-07-04 Invitek Gmbh Vorrichtung zur gleichzeitigen multiplen Isolierung
US5981735A (en) * 1996-02-12 1999-11-09 Cobra Therapeutics Limited Method of plasmid DNA production and purification
US7026468B2 (en) * 1996-07-19 2006-04-11 Valentis, Inc. Process and equipment for plasmid purification
AU4174397A (en) * 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cdna and genomic dna
US6027945A (en) * 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
GB9709728D0 (en) * 1997-05-13 1997-07-02 Dynal As Single step method
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
DE19743518A1 (de) * 1997-10-01 1999-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Automatisierbare universell anwendbare Probenvorbereitungsmethode
ZA99493B (en) * 1998-01-30 1999-07-22 Akzo Nobel Nv Method for the isolation of nucleic acid.
US6194562B1 (en) * 1998-04-22 2001-02-27 Promega Corporation Endotoxin reduction in nucleic acid purification
US6534262B1 (en) * 1998-05-14 2003-03-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
JP2000166556A (ja) * 1998-12-10 2000-06-20 Hitachi Ltd 核酸の回収方法及び装置
US6174704B1 (en) * 1998-12-23 2001-01-16 Pierce Chemical Company Method for recovery of proteins prepared by recombinant DNA procedures
US6866855B2 (en) * 2000-06-12 2005-03-15 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection
US6548256B2 (en) * 2000-07-14 2003-04-15 Eppendorf 5 Prime, Inc. DNA isolation method and kit
US6818398B2 (en) * 2000-12-29 2004-11-16 The University Of Chicago Column device for isolation and labeling of nucleic acids
WO2003040687A2 (en) * 2001-11-06 2003-05-15 Cortex Biochem, Inc. Isolation and purification of nucleic acids

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