ES2938752T3 - Método, solución de lisis y kit para la reducción selectiva de ácidos nucleicos animales en una muestra - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para eliminar selectivamente ácidos nucleicos animales de ácidos nucleicos no animales en una muestra, que comprende células animales y al menos otro tipo de células, seleccionadas entre células microbianas y células vegetales o una combinación de las mismas, a un solución de lisis A para ser utilizada en y para un kit para llevar a cabo dicho método, así como al uso de una membrana de sílice particular como matriz de filtración para separar células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas de células animales lisadas y como matriz de adsorción matriz para ácidos nucleicos, en particular en un método según la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método, solución de lisis y kit para la reducción selectiva de ácidos nucleicos animales en una muestra

La presente invención se refiere a una solución de lisis y a un kit que permite la reducción selectiva de ácidos nucleicos animales a partir de ácidos nucleicos no animales en una muestra, que comprende células animales y al menos otro tipo de células, seleccionadas de células microbianas y células vegetales o una combinación de estas.

Las células microbianas, es decir, células de microorganismos tales como bacterias, arqueas y hongos, incluyendo levaduras, o una combinación de estas, normalmente se encuentran junto con células animales en muestras biológicas, tales como, por ejemplo, fluidos corporales animales. La detección precisa y rápida de microorganismos patógenos en tales muestras es de suma importancia para un diagnóstico rápido y preciso y, por lo tanto, una terapia. Esto es particularmente cierto dado que muchas infecciones causadas por microorganismos todavía están asociadas con una alta morbilidad y mortalidad, a pesar de los avances en los métodos de tratamiento actuales. Así, una reducción selectiva de células animales y, con respecto a los métodos biomoleculares basados en el análisis de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos animales, de células no animales y ácidos nucleicos, respectivamente, es deseable tanto para análisis convencionales como para técnicas de cultivo para células microbianas y/o vegetales, así como análisis de sus ácidos nucleicos.

Sin embargo, mientras que las técnicas de cultivo convencionales suelen tolerar una cantidad bastante grande de «fondo» animal, es decir, células, desechos celulares y/o antiguos compuestos intracelulares liberados de las células animales, el fondo animal debe estar en la concentración más baja posible en los métodos de análisis de los ácidos nucleicos no animales. Esto es particularmente cierto, por ejemplo, para la multiplicación del genoma entero (WGA, por sus siglas en inglés) o la llamada secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés).

Usando técnicas de cultivo convencionales, a menudo se requieren varios días para identificar un microorganismo. Además, solo se pueden detectar organismos conocidos u organismos capaces de crecer en los medios específicos. Esto significa que es imposible analizar o caracterizar un microbioma completo. Por este motivo, en la actualidad se usan métodos basados en la multiplicación de ácido nucleico microbiano para la detección de microorganismos. En la presente memoria, normalmente se aísla primero un microorganismo patógeno de una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre humana se lisa y luego se multiplican sus ácidos nucleicos usando cebadores específicos para el microorganismo patógeno para detectar. Por supuesto, esto solo es posible si ya se sabe qué tipo de microorganismo patógeno se detectará.

En los últimos años se han desarrollado métodos para multiplicar y secuenciar ácidos nucleicos sin necesidad de cebadores específicos, conocidos, por ejemplo, como multiplicación de genoma entero (WGA), multiplicación de transcriptoma entero (WTA, por sus siglas en inglés) o multiplicación de ácido nucleico entero (WNA, por sus siglas en inglés) seguida de secuenciación de nueva generación. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la materia y están descritos en la literatura. Sin embargo, como en estos métodos no se emplea un cebador específico, prácticamente todos los ácidos nucleicos presentes en una muestra se multiplican y/o secuencian.

Mientras que una célula humana normalmente comprende de aproximadamente 6 a 9 picogramos de ADN genómico y 1 mL de sangre comprende de aproximadamente 4 a 10 millones de glóbulos blancos, una célula de E. coli normalmente contiene solo aproximadamente 5 femtogramos de ADN. Es más, el número de células microbianas en muestras de pacientes infectados suele ser mucho menor que el contenido de sus propias células. Por ejemplo, la proporción de ADN microbiano a humano en muestras de sangre de pacientes con sepsis suele estar en el intervalo de aproximadamente 1 a 2 x 109. Por esta razón, se han desarrollado varios métodos en el estado de la técnica para (más o menos) reducir selectivamente el número de células animales y/o ácidos nucleicos animales en tales muestras.

Los métodos y kits dedicados al problema de la reducción selectiva del número de células animales / ácidos nucleicos animales de células microbianas / ácidos nucleicos microbianos se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2006/092278 A1, WO 2009/015484 A1, WO 2011/070507 A1, WO 2011/061274 A1 y/o están disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales kit VYOO (SIRS-Lab, Jena, Alemania), kit MolYsis (Molzym GmbH & Co. KG, Bremen, Alemania) o kit QlAamp® UCP PurePathogen Blood (QI^a G^e N, Hilden, Alemania). Un método para lisar selectivamente glóbulos rojos mediante una solución que comprende saponina se describe en el documento WO85/05684 A.

Usando el kit VYOO, tanto las células animales como las microbianas presentes en la muestra se lisan en un primer paso y luego se aísla el ADN total presente en la muestra. En un paso adicional, el ADN microbiano se enriquece usando una fase sólida funcionalizada con anticuerpos que se une selectivamente al ADN microbiano no metilado, mientras que el ADN humano metilado no se une a dicha fase sólida y, así, puede separarse del ADN microbiano. En pasos posteriores, el ADN microbiano tiene que ser eluído de la fase sólida y tiene que precipitar del eluato, lo que hace que este método consuma bastante tiempo. Es más, normalmente ni la unión de las células microbianas a la fase sólida funcionalizada con anticuerpos ni la posterior precipitación del eluato son cuantitativas, por lo que podrían perderse cantidades significativas de ADN microbiano.

En los métodos descritos en los documentos WO 2006/092278 A1, WO 2009/015484 A1, WO 2011/070507 A1 y WO 2011/061274 A1, por otro lado, se emplean tampones de lisis específicos para lisar selectivamente células eucariotas superiores en presencia de células microbianas, permaneciendo estas últimas esencialmente intactas durante dicho paso de lisis. Después, las células animales lisadas se separan de las células microbianas esencialmente intactas mediante varios pasos de lavado y centrifugación. Esto, sin embargo, también puede llevar mucho tiempo en muchos casos. Es más, el tampón de lisis altamente alcalino empleado en el documento WO 2011/070507 A1 (phE9,5) y los tampones caotrópicos empleados en los documentos WO 2011/061274 A1, WO 2006/092278 A1 y el kit MolYsis podría no ser adecuado para muestras sensibles o emplear sustancias tóxicas, respectivamente.

Además de los inconvenientes mencionados anteriormente de los métodos y kits conocidos en el estado de la técnica, la proporción de ADN microbiano a ADN animal en muestras aisladas y purificadas usando estos métodos y kits a menudo es solo de aproximadamente 1:1000 o incluso inferior y, así, todavía es demasiado bajo para la secuenciación de nueva generación, ya que en este caso el 99,99 % de los recursos y costes se gastarían en fragmentos de ADN animal (conocidos).

Por consiguiente, un objeto de la presente invención era proporcionar una solución de lisis y un kit que permitiera reducir selectivamente el número de ácidos nucleicos animales de ácidos nucleicos no animales en una muestra que comprende células animales y al menos otro tipo de células, seleccionadas de células microbianas y células vegetales o una combinación de estas, lo que permite una disminución significativa del número de ácidos nucleicos animales en la muestra en comparación con los métodos y kits conocidos en el estado de la técnica.

Este objeto se cumple con la solución de lisis y el kit de la presente invención como se define en las reivindicaciones. Usando la solución de lisis y/o el kit de la presente invención es posible disminuir significativamente la cantidad de células animales y, en particular, los ácidos nucleicos animales en una muestra (inicial) que comprende tanto células animales como microbianas y/o vegetales. Por ejemplo, es posible obtener una cantidad relativa de ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales, respectivamente, por ejemplo, ADN, hasta al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 98,2 % o incluso más, basándose en la cantidad total de ácidos nucleicos según PCR en una muestra procesada, que inicialmente, es decir, antes de comenzar la lisis de la solución de la presente invención, puede haber comprendido una proporción de ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales a ácidos nucleicos animales de aproximadamente 1:105 o incluso menos. Esto hace que la solución de lisis y el kit sean particularmente adecuados para aislar ácidos nucleicos destinados a usarse en métodos posteriores como WGA, WNA, WTA y/o NGS.

Además, usando la solución de lisis de la presente invención, el número de pasos del método laboriosos y que consumen mucho tiempo puede disminuirse significativamente, pasos que además siempre conllevan el riesgo de pérdida de muestra.

Así, la presente invención se refiere a una solución de lisis como se define en las reivindicaciones adjuntas y a un kit que comprende dicha solución de lisis y otros ingredientes como se define en las reivindicaciones. Cualquier contenido de la siguiente descripción que no se encuentre dentro de la definición y el alcance de las reivindicaciones adjuntas debe considerarse como ilustrativo, no como parte de la invención.

En la presente descripción, el término «reducción selectiva» debe entenderse como la disminución de la cantidad de ácidos nucleicos animales presentes en la muestra, de modo que la proporción de ácidos nucleicos animales a ácidos nucleicos no animales en la muestra se desplace a favor de los ácidos nucleicos no animales. Preferiblemente, la cantidad de ácidos nucleicos animales en la muestra se disminuye en un factor de al menos 103, más preferiblemente al menos 104, incluso más preferiblemente 105 y lo más preferiblemente al menos 5 x 105 o incluso mayor, calculado como la cantidad de ácido nucleico animal (tanto intracelular como extracelular) inicialmente presente en la muestra, es decir, antes de comenzar el método de la presente descripción, dividido por la cantidad de ácidos nucleicos animales presente en la muestra después de reducir selectivamente el número de ácidos nucleicos animales según el método de la presente descripción. Preferiblemente, la cantidad de ácidos nucleicos no animales en la muestra obtenida después de completar el método de la presente descripción que se origina al menos en un tipo adicional de células que inicialmente están presentes en la muestra, es al menos el 50 %, 60 %, 70 %. %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 98,2 % o incluso más, basado en la cantidad total de ácidos nucleicos en la muestra procesada.

Salvo que se defina de otro modo en particular, el término «esencialmente» se entenderá de manera que en cualquier caso se obtenga más del 50 % del rasgo considerado, preferiblemente al menos el 60 %, más preferiblemente al menos el 70 %, aún más preferiblemente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % y lo más preferiblemente al menos el 98 %. «Esencialmente» también puede representar el 100 %. El término «sustancialmente» se entenderá de manera similar.

En los términos de la presente descripción, los ácidos nucleicos animales incluyen tanto ácidos nucleicos de cadena simple como de doble cadena de células animales, incluidos ácidos ribonucleicos (ARN) y ácidos desoxirribonucleicos (ADN), tales como, entre otros, ARNm, ARNmi, ARNt , ARNr, ARNsn, ADNg, A d N plasmídico y ADNmt (ADN mitocondrial).

Las células animales son células eucariotas que, a diferencia de, por ejemplo, las células vegetales, carecen de cloroplastos y paredes celulares. En la presente memoria, el término «células animales» incluye ambos tipos de células que están presentes en estructuras «organizadas», como, por ejemplo, tejidos o cultivos celulares, así como células aisladas y/o individuales, por ejemplo, que están presentes en fluidos corporales o excrementos de un mamífero y, en particular, un ser humano, incluyendo, por ejemplo, sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, heces y similares.

El término «células animales» comprenderá, en particular, células de mamíferos, pero también células de insectos, células de aves, células de aves de corral, células de peces, células de anfibios, células de reptiles, células de moluscos, en donde se prefieren las células de mamíferos y se prefieren particularmente las células humanas.

En los términos de la presente descripción, los ácidos nucleicos no animales incluyen tanto el ARN como el ADN de cadena simple y doble de origen microbiano y/o vegetal, tales como, entre otros, ARNm, ARNmi, ARNt, ARNr, ARNsn, plásmidos, ADNg, ADN plasmídico y ADNmt (ADN mitocondrial).

Las «células microbianas» son células de un microorganismo, es decir, un organismo que consiste en una sola célula (organismo unicelular) o agrupaciones de células incluidas biopelículas. En los términos de la presente descripción, los microorganismos incluyen tanto procariotas como eucariotas, tales como bacterias, hongos, levaduras, algas microscópicas, arqueas y protozoos. Las células microbianas y/o vegetales pueden provenir de un organismo natural o modificado por ingeniería genética.

Las células vegetales son células eucariotas que, a diferencia de las células animales, comprenden una pared celular. A diferencia de las paredes celulares de las bacterias y los hongos, la pared celular de una planta normalmente comprende celulosa, hemicelulosa, pectina y, a menudo, lignina.

En la presente descripción, las células microbianas pueden seleccionarse preferiblemente del grupo que comprende bacterias, arqueas y hongos, incluida la levadura, o una combinación de los tipos de células antes mencionados. Incluso más preferiblemente, las células microbianas incluyen células bacterianas y lo más preferiblemente pueden representar esencialmente células bacterianas. Esto significa que lo más preferiblemente la cantidad de células bacterianas con respecto al número total de células no animales presentes en la muestra después de usar el método inventivo puede ser al menos el 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o incluso mayor.

En términos de la presente descripción, «bacterias» puede incluir bacterias tanto grampositivas como gramnegativas, en particular, bacterias que se sabe que están implicadas en el desarrollo de sepsis en animales, en particular, en seres humanos. Ejemplos de especies de bacterias de particular interés son Micobacteria spp., Enterococcus, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Serratia, Escherichia, Acinetobacter, Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella, Legionella, Chlamydia, Shigella, Pseudomonas, Listeria, Yersinia, Corynebacterium, Bordetella, Bacillus, Clostridium, Haemophilus, Helicobactery Vibrio, en donde las bacterias a menudo involucradas en la sepsis son, en particular, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus faecalis y/o especies de Klebsiella, Enterobacter, Serratia y Pseudomonas.

Las células fúngicas preferidas pueden representar células, o proceder de células, de la especie Aspergillus, Basidiobolus, Cephalosporium, Skopulariopsis, Rhizomucor, Entomophthora, Mucor, Syncephalastrum, Absidia, Altenaria, Rhizopus, Stemphylium, Nigrospora, Chrysosporium, Botrytis, Helmithosporium, Curvularia, Hemispora, Phoma, Paecilomyces y Thielavia, en particular, A. fumigatus, A. tereus, A. niger, A. nidulans, A. homegadus, A. flavus B. microsporus, B. rhanarum, C. crysogenum, C. corebiobides, C. regatum y C. diospyri.

Las células microbianas también pueden representar células de levadura, en particular, de levaduras patógenas de la especie Candida, por ejemplo, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. albicans, C. guilliermondii, así como células de algas, por ejemplo, de Euglena spp., Coscinodiscus spp., Trachelomonas spp., Gymnodinium sanguineum, Dinophysis nitra, Ceratium massiliense, Chlorella, Chlorococcum o Eremosphaera, o de protozoos, por ejemplo, Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Toxoplasma y Cryptosporidium, preferiblemente Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzei, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium serpentis y Cryptosporidium hominis.

La muestra procesada en el método de la presente descripción preferiblemente puede comprender lo siguiente o derivarse de lo siguiente: tejido, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares, aspirados de médula ósea, homogeneizados de huesos, hisopos, enjuagues de hisopos o fluidos corporales, preferiblemente fluidos corporales, seleccionándose más preferiblemente fluidos corporales del grupo que comprende líquido amniótico, humor acuoso, bilis, lavado de vejiga, sangre, incluida la sangre entera, muestras de sangre estabilizadas con citrato, EDTA, heparina o similares o concentrados de sangre como concentrados de trombocitos o eritrocitos, plasma sanguíneo, exudados de mama, lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, quilo, quimo, citosol, heces, contenido gástrico, líquido intersticial, líquido articular, linfa, menstruación, moco, plasma, líquido pleural, pus, saliva, sebo, semen, suero, esputo, sudor, líquido sinovial, lágrimas, orina, secreciones vaginales y humor vítreo.

La muestra preferiblemente puede derivar de su entorno natural, en particular, un animal, preferiblemente un organismo animal. Puede ser particularmente preferido que la muestra represente un fluido corporal de un mamífero, en particular, un ser humano, o un concentrado de este o un fluido corporal diluido. Es más, las suspensiones o lodos de muestras en una solución acuosa, por ejemplo, un tampón, pueden ser adecuados como muestra para procesar en el método de la presente descripción.

El volumen de la muestra no está particularmente limitado. Por ejemplo, los volúmenes de muestra de 1 pL a 1 L, preferiblemente de 100 pL a 500 mL, más preferiblemente de 200 pL a 100 mL y particularmente preferido de 1 mL a 10 mL pueden procesarse usando el método de la presente descripción.

En los términos de la presente descripción, el término «lisis esencialmente selectiva» se usa para indicar que preferiblemente el 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,2 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,95 % o incluso más de las células animales inicialmente presentes en la muestra antes de llevar a cabo el paso i) del método de la presente descripción se lisan en dicho paso i), mientras que las células microbianas y/o las células vegetales permanecen esencialmente intactas. En la presente memoria, el término «esencialmente intacto» se usa para indicar que al menos el 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,2 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,95 % o incluso más de dichas células, basándose en el número total de dichas células que están presentes en la muestra antes de llevar a cabo el paso i) no se lisan en dicho paso.

En la presente descripción, el término «separación esencial» se usa para indicar que al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,2 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,95 % (v/v ) o incluso más de cualquier líquido que esté presente en la muestra antes del paso v), incluido cualquier ácido nucleico animal residual digerido que se adhiera a las células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas se separa de dichas células microbianas y/o vegetales en el paso v).

El método de la presente descripción combina un paso de lisis selectiva de células animales en presencia de células microbianas y/o vegetales, un paso posterior de digestión tanto del ADN animal como del ARN animal y un paso de separación rápida y fiable de las células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas de cualquier parte líquida extracelular de la muestra, incluidos los antiguos compuestos intracelulares de células animales, como, por ejemplo, los ácidos nucleicos animales digeridos.

Usando el método de la presente descripción, se pueden obtener muestras que comprendan al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 98,2 % o incluso más de ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales incluidos originalmente en la muestra a partir de muestras que tenían previamente una proporción de ADN animal a ADN microbiano y/o vegetal en el intervalo de aproximadamente 105:1, sin la necesidad de tampones altamente alcalinos y/o caotrópicos, como lo demuestran los ejemplos incluidos en la presente memoria.

El método comprende varias realizaciones particularmente preferidas. En una realización, la separación de las células microbianas y/o vegetales en el paso (v) se separan de la parte líquida restante de la muestra mediante centrifugación. Esto es particularmente adecuado cuando se tratan muestras que no comprenden demasiadas células animales, sino varias células microbianas/vegetales, por ejemplo, una proporción de células animales:células microbianas / vegetales de 103:1, o 102:1. Tales muestras son, por ejemplo, frotis bucales, licor, plasma, líquido amniótico, humor acuoso, bilis, lavado vesical, plasma sanguíneo, exudados mamarios, lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, quilo, citosol, heces, contenido gástrico, en particular, ácido gástrico, líquido intersticial, líquido articular, linfa, moco, plasma, líquido pleural, saliva, sebo, suero, esputo, sudor, líquido sinovial, lágrimas, orina, secreciones vaginales y humor vítreo, sin limitarse a dichas muestras. Independientemente de lo anterior, esto también podría ser particularmente adecuado si las células microbianas / células vegetales son difíciles de abrir mediante un tratamiento químico/enzimático y, por consiguiente, la lisis celular de las células microbianas/vegetales tiene que ser soportada mecánicamente, por ejemplo, mediante el uso de perlas de vidrio o una herramienta similar.

En otra realización preferida, si las muestras se tratan con una gran cantidad de células animales en comparación con el número de células microbianas / células vegetales, por ejemplo, una proporción de 106:1 o superior, como sangre entera, tejidos, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares, aspirados de médula ósea, homogeneizados de huesos, hemoderivados, muestras de sangre estabilizadas con citrato, EDTA, heparina o similares o concentrados de sangre como concentrados de trombocitos o eritrocitos, muestras de semen o similares, sin perjuicio de lo anterior, podría ser ventajoso separar las células microbianas / células vegetales del resto de las células animales lisadas y de la parte líquida de la muestra por filtración. Independientemente de la proporción de células animales a microbianas / células vegetales en la muestra, la filtración también puede usarse en lugar de la centrifugación, si las células microbianas de interés pueden lisarse adecuadamente mediante lisis química o enzimática sin necesidad de ningún soporte mecánico.

Como esta realización del método de la presente descripción se basa principalmente en un paso de filtrado de la muestra para separar las células microbianas y/o vegetales de cualquier parte líquida restante de la muestra, incluidas las células animales lisadas, los restos de células animales y/o los ácidos nucleicos animales digeridos, se pueden evitar los laboriosos y engorrosos pasos de lavado y separación de células microbianas y/o vegetales por medio de centrifugación.

Si la separación de las células microbianas/vegetales se realiza por centrifugación, dicha centrifugación se realiza preferiblemente aplicando una fuerza menor que 40000 xg, preferiblemente menor o igual que 30000 xg, más preferiblemente menor o igual que 20000 xg e incluso más preferiblemente menor o igual que 15000 xg y preferiblemente mayor o igual que 1000 xg, más preferiblemente mayor o igual que 2000 xg, incluso más preferiblemente mayor o igual que 3500 xg y lo más preferiblemente mayor o igual que 5000 xg. Se prefiere particularmente la centrifugación de la muestra en el intervalo de 6000 xg a 12000 xg, en particular de 7000 xg a 10 000 xg. Después de la separación mediante un primer paso centrífugo, el sedimento puede lavarse al menos una vez con un tampón de lavado adecuado, seguido de una sedimentación adicional de las células por centrifugación, antes de lisar las células microbianas/vegetales para un análisis adicional de su contenido.

En la realización de separación por filtración, preferiblemente el paso v) comprende filtrar la muestra a través de un filtro sólido para retener esencialmente las células microbianas y/o vegetales como retenido en el filtro mientras que la parte líquida de la muestra, incluidos los ácidos nucleicos animales digeridos, esencialmente pasa el filtro como filtrado.

En los términos de la presente descripción, un «filtro sólido» incluye cualquier filtro hecho de material sólido, incluidos los filtros de superficie y de profundidad. Un filtro de superficie actúa más o menos como un tamiz sólido y mantiene las partículas para retener, en este caso células microbianas y/o vegetales, en su superficie. Un filtro de profundidad, por otro lado, es un lecho de material poroso que retiene las partículas en todo el medio a medida que pasan por dicho medio y puede estar hecho de una membrana, material monolítico o granular o una combinación de estos. El filtro usado en el método de la presente descripción también puede comprender tanto un filtro de superficie como un filtro de profundidad.

El filtro usado en el método de la presente descripción comprende al menos una parte que tiene un tamaño de poro que está en el intervalo de (0,1 -1,5) gm; preferiblemente (0,2-1,0) gm; más preferiblemente (0,3-0,8) gm [particularmente preferido (0,25 /- 0,05 - 0,8) gm] y más preferiblemente (0,5 - 0,7) gm.

El filtro usado en el paso v) para separar las células microbianas y/o vegetales de la parte líquida de la muestra puede comprender preferiblemente poliéster, polietersulfona (PES), celulosa, acetato de celulosa (CA), ésteres mixtos de celulosa (MCE), politetrafluoroetileno (PTFE), poliamida (PA), nailon, polipropileno (PP), cerámica, fibras de vidrio, sílice o combinaciones o mezclas de estos como material filtrante.

Preferiblemente, el flujo a través del filtro se puede soportar aplicando presión en el lado de alimentación del filtro o vacío en el lado del filtrado o incluso más preferiblemente centrifugando el filtro colocado en un recipiente de centrifugado adecuado, preferiblemente con una fuerza en el intervalo de aproximadamente 5000 xg a 15000 xg, más preferiblemente de aproximadamente 8000 xg a aproximadamente 12000 xg y lo más preferiblemente de aproximadamente 10000 xg durante un periodo de tiempo en el intervalo de aproximadamente 30 s a 30 min, preferiblemente de aproximadamente 1 min a aproximadamente 20 min, incluso más preferiblemente de aproximadamente 5 min a aproximadamente 15 min y lo más preferiblemente de aproximadamente 10 min. La filtración se puede llevar a cabo preferiblemente a temperatura ambiente [(2015) 2C],

Como ya se mencionó anteriormente, el filtro usado en el método de la presente descripción puede combinar tanto un filtro de superficie como uno de profundidad. Por ejemplo, se pueden usar unidades de filtración tales como columnas giratorias, que comprenden un filtro de superficie superior, por ejemplo, un filtro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 0,25 gm hecho, por ejemplo, de acetato de celulosa, seguido de un filtro de profundidad que comprende un filtro de fibra de vidrio que comprende poros del tamaño de poro mencionado anteriormente.

En el paso iii) preferiblemente tanto el ADN como el ARN de los ácidos nucleicos animales pueden digerirse en un paso, preferiblemente enzimáticamente, más preferiblemente mediante una endonucleasa que degrade tanto el ADN como el ARN.

En los términos de la presente descripción, tanto el ADN como el ARN de los ácidos nucleicos animales se digieren en un solo paso, si tanto el ADN como el ARN se degradan al mismo tiempo. Esto se puede hacer química, enzimáticamente o mediante cualquier otro método adecuado para degradar el ADN y el ARN de origen animal dejando esencialmente intactas las células microbianas y/o vegetales. Preferiblemente, los ácidos nucleicos animales se digieren enzimáticamente por la acción de una o más nucleasas. Por ejemplo, es posible agregar tanto una DNasa como una RNasa a la muestra en el paso iii) (o viceversa, es decir, la muestra a una solución que comprenda estas enzimas). Más preferiblemente, se emplea una nucleasa que degrada tanto el ADN como el ARN, en particular, una endonucleasa que degrada tanto el ADN como el ARN. Se pueden preferir enzimas que sean eficaces a pH por debajo de 9,5 y, en particular, a un pH casi neutro [pH (6,0 - 8,0)]. En particular, para muestras sensibles, también puede ser deseable usar una enzima que no solo sea eficaz a 37 °C, sino también a temperatura ambiente [(20 D 5) °C] o incluso por debajo. Cuando se emplean nucleasas de alta actividad específica frente a ácidos nucleicos, por ejemplo, preferiblemente de al menos 104 U/mg, más preferiblemente de al menos 105 U/mg, se debe agregar a la muestra una cantidad menor de estas nucleasas. Esto minimiza cualquier esfuerzo que deba emprenderse para eliminar la(s) nucleasa(s) después de completar el paso iii).

El paso de digerir los ácidos nucleicos animales preferiblemente se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 50 °C, preferiblemente de aproximadamente temperatura ambiente [(20 J 5) °C] a aproximadamente 37 °C, durante un periodo de tiempo en el intervalo de aproximadamente 5 min a 3 h, preferiblemente de aproximadamente 10 min a aproximadamente 2 h, más preferiblemente de aproximadamente 15 min a aproximadamente 1 h y lo más preferiblemente durante aproximadamente 30 min.

Además, se prefiere usar nucleasas que ataquen todo tipo de ácidos nucleicos, incluyendo ADN y ARN lineales, así como circulares de cadena simple y doble. Preferiblemente, la(s) nucleasa(s) digiere(n) los ácidos nucleicos a oligonucleótidos terminados en monofosfato de menos de 50 bases de longitud, preferiblemente de menos de 20 bases de longitud, más preferiblemente de menos de 15 bases de longitud, incluso más preferiblemente de menos de 10 bases de longitud, aún más preferiblemente menos de 8 bases de longitud y lo más preferiblemente menos de 6 bases de longitud. Los fragmentos de este tamaño pueden separarse fácilmente de las células restantes mediante filtración usando uno o más de los filtros descritos anteriormente, sin riesgo de obstruir el filtro y/o aumentar la viscosidad de la muestra para filtrar.

Una endonucleasa adecuada es, por ejemplo, la endonucleasa manipulada genéticamente producida en cepa W3110 de E. coli, que contiene el plásmido patentado pNUC 1, como se describe en el documento US 5,173,418 y en el documento EP 0229 866 B1, Benzonase®, disponible de Merck, Alemania, Cyanase™, disponible de RiboSolutions, EE. UU. o nucleasa universal Pierce™, disponible de Thermo Scientific, Alemania, sin limitarse a las mencionadas.

En principio, ambas endonucleasas, es decir, enzimas que rompen el enlace fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos y exonucleasas, rompiendo el enlace fosfodiéster al final de una cadena de polinucleótidos, se pueden usar. Puede preferirse el uso de una o más endonucleasas.

En principio, puede usarse una amplia variedad de tampones de lisis o soluciones de lisis diferentes para lisar células animales en presencia de células microbianas y/o vegetales (referido como «solución de lisis» en lo que sigue) en el paso i) del método de la presente descripción. Por motivos medioambientales y de seguridad, puede preferirse el uso de una solución de lisis esencialmente exenta de caotropos.

Las sustancias caotrópicas desnaturalizan las proteínas, aumentan la solubilidad de las sustancias no polares en agua y destruyen las interacciones hidrofóbicas. Es más, también median en la unión de ácidos nucleicos a fases sólidas como membranas de sílice o partículas de vidrio. Los iones caotrópicos comprenden comúnmente iones yoduro, perclorato, (iso)tiocianato y/o guanidinio. En consecuencia, la solución de lisis usada en el método de la presente descripción, así como la solución de lisis de la presente invención, preferiblemente están esencialmente exentas de iones yoduro, perclorato, (iso)tiocianato y/o guanidinio.

En los términos de la presente invención, la solución de lisis está esencialmente exenta de caotropos, si contiene menos de 2 M, preferiblemente menos de 1 M, más preferiblemente menos de 0,1 M, incluso más preferiblemente menos de 0,01 M, aún más preferiblemente menos de 0,001 M y lo más preferiblemente ninguna de las sustancias caotrópicas mencionadas anteriormente.

Preferiblemente, la solución de lisis usada en el paso i) comprende al menos un tensioactivo, una sal soluble en agua y/o un modificador de la viscosidad y, opcionalmente, un sulfonato polianiónico, como se describe en detalle a continuación. Preferiblemente, la solución de lisis puede comprender al menos un tensioactivo, más preferiblemente al menos un tensioactivo no iónico. Puede preferirse que todos los tensioactivos que estén presentes en la solución de lisis sean tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos no iónicos se pueden seleccionar preferiblemente del grupo que comprende ésteres de sorbitán de ácidos grasos, ésteres de polioxietilensorbitán de ácidos grasos, éteres de polioxialquileno de alcoholes grasos, éteres de polioxialquileno de alquilfenoles, poloxámeros, saponinas o mezclas de estos.

Los poloxámeros son copolímeros tribloque no iónicos compuestos por una cadena hidrofóbica esencial de polioxipropileno flanqueada por dos cadenas hidrofílicas de polioxietileno y están disponibles comercialmente, por ejemplo, de BASF (Ludwigshafen, Alemania).

La solución de lisis según la invención comprende al menos una saponina en una cantidad total entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 15 % (p/v). Las saponinas son glucósidos anfipáticos de esteroides, alcaloides de esteroides o triterpenos. Al ser metabolitos secundarios, pueden aislarse de fuentes naturales, en particular, frutos, raíces, tubérculos, hojas y similares de plantas, por ejemplo, los frutos de Sapindus (nueces de jabón). Los extractos de plantas purificados que comprenden saponinas están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, Ee . UU.) o en AppliChem (Darmstadt, Alemania). Puede preferirse además que cualquier tensioactivo no iónico que esté presente en la solución de lisis represente una saponina.

Los tensioactivos mencionados anteriormente, en particular, las saponinas según la invención, están presentes en la solución de lisis en una cantidad total de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 15 % (p/v), basado en la solución de lisis total, preferiblemente en una cantidad del 5 % al 14 %, más preferiblemente en una cantidad del 5 % al 13 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 12 %, incluso más preferiblemente de aproximadamente el 5 % al 10 % y lo más preferiblemente de aproximadamente el 5 % al 8 %. Las cantidades mencionadas se refieren a la cantidad total de los tensioactivos incluidos.

Asimismo, la solución de lisis puede comprender opcionalmente un sulfonato polianiónico, preferiblemente polianetol sulfonato de sodio. El sulfonato polianiónico puede estar presente en una concentración de 0,001 mM a 50 mM, preferiblemente de 0,01 mM a 10 mM, más preferiblemente de 0,1 mM a 5 mM, incluso más preferiblemente de 0,5 mM a 3 mM y lo más preferiblemente de 1,0 mM a 2,0 mM, basado en la solución de lisis A completa.

Asimismo, la solución de lisis según la invención comprende una sal soluble en agua que se selecciona de acetatos, sulfatos, glutamatos solubles en agua o mezclas de estos, por ejemplo, sus sales de sodio o una mezcla de estos. Se prefieren particularmente los acetatos y glutamatos o una mezcla de estos. La(s) sal(es) soluble(s) en agua están presentes en una cantidad total de 50 mM a 850 mM, más preferiblemente de 100 mM a 500 mM y lo más preferiblemente de 160 mM a 250 mM, basado en la solución de lisis A completa.

Asimismo, la solución de lisis comprende un modificador de la viscosidad para aumentar o disminuir la viscosidad de la solución de lisis y, opcionalmente, cualquier solución a la que se agregue la solución de lisis. El modificador de la viscosidad se selecciona de glucosa y/o sacarosa. El agente modificador de la viscosidad está presente en una cantidad de 300 mM a 1000 mM, preferiblemente de 300 mM a 900 mM, más preferiblemente de 300 mM a 700 mM y lo más preferiblemente de 400 mM a 500 mM, basado en la solución de lisis A completa.

El pH de la solución de lisis preferiblemente puede estar en el intervalo de 4 a 9, más preferiblemente de 4,5 a 8,5 y lo más preferiblemente de 5 a 8.

La solución de lisis comprende una combinación de las sustancias antes mencionadas, y preferiblemente representa una solución de lisis esencialmente exenta de caotropos como se define en las reivindicaciones.

La solución de lisis comprende al menos una saponina, una sal de acetato y/o glutamato soluble en agua y sacarosa y/o glucosa como modificador de la viscosidad en las concentraciones definidas en las reivindicaciones. En una realización preferida particular, la solución de lisis comprende al menos una saponina, una sal de glutamato y sacarosa, o puede consistir en estos ingredientes y agua.

Dependiendo de la muestra tratada y de los pasos de análisis deseados llevados a cabo con las células microbianas/vegetales o con cualquier biomolécula aislada de las células microbianas/vegetales, podría ser preferible incluir o no un sulfonato polianiónico como se mencionó anteriormente en la solución de lisis. P. ej. para muestras de sangre, en particular, para muestras de sangre de hemocultivos, podría ser preferible incluir dicho sulfonato polianiónico, ya que dicho compuesto tiene un efecto positivo sobre la estabilidad de las células microbianas en tales muestras. Así, dichas células se mantienen durante el tratamiento para aislarlas. Las células aisladas mediante dicho método pueden analizarse y determinarse bien, por ejemplo, por un mayor cultivo. Por otra parte, se sabe que los sulfonatos polianiónicos tienen un efecto negativo, por ejemplo, análisis PCR debido a la inhibición de la multiplicación PCR. Dado que el compuesto es muy difícil de eliminar, podría ser ventajoso mantener cualquier sulfonato polianiónico fuera de la solución de lisis A, si el análisis posterior se basa en PCR, en particular, si en el paso (v) se separan las células microbianas/vegetales del resto líquido por centrifugación.

Así, se prefiere usar una solución de lisis sin sulfonato polianiónico si se cumple al menos una de las siguientes condiciones:

(a) se usan muestras que tienen una cantidad baja de células animales (es decir, muestras que tienen menos de 1 x 106 células/mL, preferiblemente menos de 105 células/mL, más preferiblemente menos de 104 células/mL, incluso más preferiblemente menos de 103 células/mL), por ejemplo, frotis bucales, licor, plasma, líquido amniótico, humor acuoso, bilis, lavado vesical, plasma sanguíneo, exudados mamarios, lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, quilo, citosol, heces, contenido gástrico, en particular, ácido gástrico, líquido intersticial, líquido articular, linfa, moco, plasma, líquido pleural, saliva, sebo, suero, esputo, sudor, líquido sinovial, lágrimas, orina, secreciones vaginales y humor vítreo, sin limitarse a dichas muestras;

(b) las células microbianas/vegetales se separan del resto de las células animales lisadas y/o de la parte líquida de la muestra en el paso (v) por centrifugación;

c) el contenido de las células microbianas / células vegetales, en particular, los ácidos nucleicos aislados de dichas células, se analizará mediante PCR o una reacción similar.

Por otro lado, se prefiere usar una solución de lisis que comprenda un sulfonato polianiónico cuando se cumpla al menos una de las siguientes condiciones:

(d) se usan muestras que tienen una gran cantidad de células animales (es decir, muestras que tienen al menos 1 x 106 células/mL, preferiblemente al menos 107 células/mL, más preferiblemente al menos 107 células/mL, incluso más preferiblemente al menos 109 células/mL), por ejemplo, sangre total, tejidos, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares, aspirados de médula ósea, homogeneizados de huesos, hemoderivados, muestras de sangre estabilizadas con citrato, EDTA, heparina o similares o concentrados de sangre tales como concentrados de trombocitos o eritrocitos, semen o muestras similares, sin quedar restringido lo mencionado;

(e) las células microbianas/vegetales se separan del resto de las células animales lisadas y/o de la parte líquida de la muestra en el paso (v) por filtración;

f) las células microbianas o las células vegetales se analizarán mediante cultivo adicional.

Se señala particularmente que no es limitativo ni absolutamente necesario para la presente invención que la solución de lisis que comprende un sulfonato polianiónico se use cuando se presente al menos una de las condiciones (d), (e) o (f), o usando la solución de lisis sin sulfonato polianiónico cuando está presente al menos una de las condiciones (a), (b) o (c). Sin embargo, podría preferirse debido a la mayor idoneidad para los métodos de análisis. Podría preferirse además que se use la solución respectiva, si se cumplen al menos dos de las condiciones mencionadas o incluso las tres condiciones.

La solución de lisis se puede agregar a la muestra en una cantidad tal que la proporción de la muestra a la solución de lisis sea de 10:1 a 1:10, preferiblemente de 5:1 a 1:5, más preferiblemente de 2:1 a 1:2, en donde se prefiere particularmente una proporción de aproximadamente 1:1 o exactamente 1:1. La cantidad de solución de lisis para agregar se calcula preferiblemente en función de la concentración final deseada de los ingredientes en la muestra para lisis. Así, si la solución de lisis comprende los ingredientes descritos anteriormente en una concentración en el extremo superior como se indicó anteriormente, la proporción de solución de lisis:muestra puede estar por debajo de 1, mientras que dicha proporción aumenta por encima de 1, cuando la concentración de la solución de lisis está más en el extremo inferior de los intervalos citados anteriormente para cada uno de los ingredientes. La concentración final preferida de los ingredientes en la muestra después de la adición de la solución de lisis está representada preferiblemente por la mitad de las concentraciones, respectivamente, como se cita arriba o abajo para la solución de lisis.

Además de los pasos esenciales i), iii) y v) ya descritos, el método de la presente descripción puede comprender además los pasos adicionales: ii) esencialmente eliminar la parte líquida de la muestra de las celdas restantes, y/o iv) eliminar y/o inactivar toda nucleasa presente junto con las células restantes, preferiblemente digiriéndola con una proteinasa.

Se puede preferir que ambos pasos ii) y iv) se lleven a cabo en el método de la presente descripción, en donde la numeración indica el orden preferido de los pasos.

Con respecto al paso ii), puede preferirse eliminar esencialmente la parte líquida de la muestra de las células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas después de la lisis selectiva de las células animales según el paso i) del método de la presente descripción, antes de digerir cualquier ácido nucleico animal que todavía esté presente junto con las células microbianas y/o vegetales, por ejemplo, adhiriéndose a ellas. En los términos de la presente descripción, la parte líquida de la muestra se elimina esencialmente, si al menos el 90 %, preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 97 %, aún más preferiblemente al menos el 98 %, aún más preferiblemente al menos el 99 % y lo más preferiblemente al menos el 99,5 % (v/v) de la parte líquida de la muestra que está presente después del paso i) se elimina durante el paso ii) antes de llevar a cabo el paso iii). Esto se puede hacer, por ejemplo, filtrando y/o centrifugando la muestra para obtener un sedimento celular / un retenido celular en el filtro que comprenda las células microbianas y/o vegetales y aspirando, decantando y/o pipeteando los filtrados líquidos sobrenadantes, sin limitarse a esto.

En principio, es adecuado cualquier método adecuado para eliminar un líquido de células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas sin comprometer la integridad de dichas células. Puede ser preferible usar una columna giratoria equipada con un filtro adecuado, como se describe con más detalle a continuación para eliminar esencialmente la parte líquida de la muestra de las células restantes mediante filtración con la ayuda de una fuerza centrífuga. La centrifugación puede llevarse a cabo preferiblemente a una fuerza en el intervalo de aproximadamente 5000 xg a 15000 xg, más preferiblemente de 8000 xg a 12000 xg y lo más preferiblemente de aproximadamente 10 000 xg, preferiblemente durante aproximadamente 2 min a 20 min, más preferiblemente durante aproximadamente 5 min a 15 min y lo más preferiblemente durante aproximadamente 10 min. Sorprendentemente, se ha descubierto que incluso cuando se procesan cantidades más bien pequeñas de células microbianas y/o vegetales, por ejemplo, de aproximadamente 105 a 106 células E. co lien una muestra de sangre de 1 mL, la centrifugación durante el paso ii) se puede llevar a cabo preferiblemente en un recipiente de fondo redondo para obtener un sedimento celular, que se puede separar fácilmente del sobrenadante restante y tiene una estructura que asegura una digestión eficaz de cualquier ácido nucleico animal restante que se adhiera a las células microbianas y/o vegetales. En este sentido, se logran resultados notablemente mejores usando un recipiente de centrifugación de fondo redondo que usando un recipiente de fondo cónico.

Con respecto al paso iv), después de digerir los ácidos nucleicos animales en la muestra, la nucleasa puede eliminarse y/o inactivarse. Esto se puede hacer después o antes de separar esencialmente las células microbianas y/o vegetales de la parte líquida de la muestra filtrando la muestra según el paso v) y preferiblemente se puede llevar a cabo antes de dicho paso v). La(s) nucleasa(s) puede(n) eliminarse, por ejemplo, lavando las células microbianas y/o vegetales con agua o un tampón de lavado acuoso adecuado y/o inactivando dicha(s) nucleasa(s), por ejemplo, digiriéndolo con una proteinasa, agregando inhibidores de nucleasas adecuados y/o un paso de calentamiento. Puede preferirse la digestión con proteinasa, opcionalmente junto con uno o más pasos de lavado, para eliminar y/o inactivar la(s) nucleasa(s). Las proteinasas adecuadas son, por ejemplo, proteinasa K y/o proteasa QIAGEN, ambas disponibles comercialmente de QIAGEN (Hilden, Alemania).

La digestión enzimática de la(s) nucleasa(s) preferiblemente se puede llevar a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 10 °C a 50 °C, preferiblemente a una temperatura en el intervalo de aproximadamente temperatura ambiente (20 5) °C a aproximadamente 37 °C y lo más preferiblemente a temperatura ambiente, incubando la muestra con la proteinasa durante aproximadamente 10 min a 3 h, preferiblemente durante aproximadamente 15 min a 2 h, más preferiblemente durante aproximadamente 20 min a aproximadamente 1 h y lo más preferiblemente durante aproximadamente 30 minutos. Es más, el sedimento celular puede aflojarse en este paso de digestión enzimática, en particular, si se usa proteinasa K, para asegurar una velocidad de filtración rápida sin obstruir el filtro en el siguiente paso v) de filtración.

El método de la presente descripción puede comprender pasos adicionales, por ejemplo, pasos de lavado intermedios llevados a cabo antes o después de cualquiera de los pasos i), ii), iii), iv) y/o v). Puede ser preferible, por ejemplo, lavar las células microbianas y/o vegetales aisladas en la superficie del filtro obtenido después del paso v) con agua o un tampón de lavado adecuado, por ejemplo, agregando agua al filtro y centrifugándolo a una fuerza en el intervalo de aproximadamente 5000 xg a aproximadamente 15000 xg, preferiblemente de aproximadamente 8000 xg a 12 000 xg y lo más preferiblemente de aproximadamente 10000 xg durante aproximadamente 15 s a 15 min, preferiblemente durante aproximadamente 30 s a 10 min, y más preferiblemente durante aproximadamente 1 min a aproximadamente 5 min. Después de separar esencialmente las células microbianas y/o vegetales según el paso v) y opcionalmente lavarlas, el método de la presente descripción puede comprender preferiblemente uno o más pasos adicionales de análisis adicional de las células microbianas y/o vegetales o cualquier parte de las mismas. Estos pasos adicionales pueden comprender tanto métodos llevados a cabo en las células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas, como, por ejemplo, cultivo, citometría, microscopía, inmunodetección, espectroscopia y similares, y/o lisis de las células microbianas o vegetales, así como como métodos llevados a cabo en o más tipos de compuestos intracelulares, incluidos ARN, ADN, proteínas, metabolitos, lípidos, glucósidos, partes de la pared celular y similares, por ejemplo, mediante técnicas de transferencia o análisis de micromatrices, métodos que son bien conocidos para un persona experta en la materia. Preferiblemente, el método de la presente descripción puede comprender uno o más pasos adicionales de multiplicación y/o análisis de los ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales, preferiblemente mediante un método seleccionado del grupo que comprende la multiplicación del genoma completo (WGA), la multiplicación del transcriptoma completo (WTA), y PCR de multiplicación de ácido nucleico completo (WNA), incluida PCR en tiempo real (qPCR) o PCR con transcripción inversa (RT-qPCR) y/o secuenciación, en particular, secuenciación de nueva generación, estos métodos de concentración, aislamiento, purificación, multiplicación y/o análisis de los ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales llevándose a cabo previa lisis de las respectivas células microbianas y/o vegetales.

Para analizar compuestos intracelulares, por ejemplo, ácidos nucleicos de las células microbianas o vegetales, dichas células se lisan por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen la lisis química y/o enzimática, así como la lisis mecánica o cualquier combinación de estas, sin limitar la descripción.

Los tampones, métodos y kits para lisar células microbianas y vegetales y posteriormente aislar y purificar los ácidos nucleicos liberados de estas células son bien conocidos por los expertos y están disponibles comercialmente, por ejemplo, de QIAGEN (Hilden, Alemania). En dichos pasos se puede aislar, purificar y/o analizar ADN o ARN o ambos tipos de ácidos nucleicos. Preferiblemente, al menos el ADN de las células microbianas y/o vegetales se aísla, purifica, multiplica y/o analiza.

Además, es posible llevar a cabo un análisis adicional tanto de las células microbianas y/o vegetales como de sus compuestos intracelulares, por ejemplo, dividiendo la cantidad de células microbianas y/o vegetales obtenidas después de separarlas esencialmente mediante filtración según el paso v) del método de la presente descripción y pasos de lavado opcionales. Por ejemplo, una fracción de estas células puede cultivarse mientras que la otra fracción puede lisarse. Como alternativa, se puede cultivar primero la cantidad completa de células obtenidas y luego se puede lisar al menos una parte de las células obtenidas después del cultivo.

El análisis del contenido celular, en particular, de las biomoléculas (ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, etc.) puede llevarse a cabo por cualquier procedimiento adecuado de aislamiento y análisis de dichas biomoléculas conocido por un experto en la materia.

Para el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos a partir de un lisado, las fases sólidas que unen dichas moléculas que comprenden, por ejemplo, vidrio y/o sílice y a los que los ácidos nucleicos solo se unen en presencia de un agente mediador de unión / tampón de unión adecuados son bien conocidos por un experto en la materia. Los soportes sólidos incluyen membranas, partículas, perlas y similares y están disponibles comercialmente de varias compañías. En la presente memoria, la unión se basa principalmente en la adsorción de los ácidos nucleicos a la fase sólida. Las fases sólidas que solo se unen a los ácidos nucleicos en presencia de un mediador de unión / tampón de unión adecuado o en condiciones particulares son especialmente útiles en el método de la presente descripción, ya que su comportamiento de unión se puede «activar» agregando tampones de unión y/o lavado apropiados. Es más, mediante el uso de una fase sólida a base de vidrio o sílice, es posible unir selectivamente ADN o ARN o ambos tipos de ácidos nucleicos para aislar y purificar uno o ambos, lo que se describe, por ejemplo, en el documento EP 0743950 A1. Así, puede preferirse usar vidrio o sílice que comprenda fases sólidas, por ejemplo, membranas, partículas o perlas, para aislar y purificar los ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales en el método de la presente descripción.

Si se usa un paso de filtración para separar esencialmente las células microbianas y/o vegetales según el paso v) del método de la presente descripción, también es posible combinar un filtro superficial o profundo como se describió anteriormente con una fase sólida para unir ácidos nucleicos en presencia de un tampón de unión / mediador de unión apropiado en un dispositivo, como, por ejemplo, una columna de centrifugación equipada con una membrana de sílice, cubierta en su parte superior por un filtro de acetato de celulosa. En dicho dispositivo, el filtro y la membrana de sílice preferiblemente pueden estar dispuestos de tal manera que los ingredientes de una muestra añadida a dicho dispositivo primero entren en contacto con el filtro y tengan que pasar por dicho filtro antes de entrar en contacto con la membrana de sílice. Al aplicar la muestra después del paso iii) o preferiblemente después del paso iv), si está presente, al dispositivo, las células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas se retienen en el filtro durante el paso de filtración v), mientras que cualquier parte líquida de la muestra, incluidos los ácidos nucleicos animales digeridos y otros compuestos disueltos, pasa tanto por el filtro como por la membrana de sílice subyacente si no hay un mediador de unión apropiado. Para garantizar la eliminación completa de cualquier sustancia adherida a las células y/o al dispositivo, el dispositivo puede lavarse con agua o un tampón de lavado apropiado. Las células microbianas y/o vegetales que están presentes en el filtro pueden luego lisarse usando un tampón de lisis apropiado.

Opcionalmente, la digestión con proteinasa o cualquier otra inhibición de nucleasa adecuada puede tener lugar luego para inactivar la nucleasa que esté presente en la muestra. Si se añade al dispositivo un mediador de unión / tampón de unión apropiado para mediar en la unión de los ácidos nucleicos deseados, como, por ejemplo, etanol o isopropanol (96 % a 100 %), antes de centrifugar dicho dispositivo, estando presentes los ácidos nucleicos en la muestra después de la lisis de las células de interés se adsorbe en la membrana de sílice mientras que el resto del lisado microbiano y/o vegetal pasa por el dispositivo. Por supuesto, también se puede usar un tampón de lisis / unión adecuado como saben los expertos en la materia. Los ácidos nucleicos unidos a la fase sólida pueden luego purificarse además mediante pasos de lavado apropiados, que son bien conocidas por un experto en la materia, antes de eluirlos con un tampón de elución apropiado, por ejemplo, agua.

Si se usa una membrana de sílice con un tamaño de poro en el intervalo de 0,1 gm a 1,5 gm; preferiblemente de 0,2 gm a 1,0 gm; más preferiblemente de 0,3 gm a 0,8 gm; dicha membrana de sílice puede incluso actuar como un filtro para separar células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas de células animales lisadas y como matriz de adsorción para los ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales. En este caso, se puede omitir el uso de un filtro separado.

Por consiguiente, la presente descripción se relaciona además con el uso de una membrana de sílice que tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0,1 gm a 1,5 gm; preferiblemente de 0,2 gm a 1,0 gm; más preferiblemente de 0,3 gm a 0,8 gm; más preferiblemente de 0,5 gm a 0,7 gm que puede incluso actuar como filtro para separar células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas de células animales lisadas y como matriz de adsorción para ácidos nucleicos, en un método para aislar, purificar, enriquecer, multiplicar y/o analizar ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales de una muestra que comprende células animales y al menos otro tipo de células, seleccionadas de células microbianas y células vegetales o una combinación de estas. El método para aislar, purificar, enriquecer, multiplicar y/o analizar ácidos nucleicos microbianos y/o vegetales comprende preferiblemente el método de la presente descripción.

Además, la presente descripción se refiere al uso de una combinación de un filtro que tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0,1 gm a 1,5 gm; preferiblemente de 0,2 gm a 1,0 gm; más preferiblemente de 0,3 gm a 0,8 gm; lo más preferiblemente de 0,5 gm a 0,7 gm de cualquier otro material distinto de sílice, preferiblemente un material como se definió anteriormente para el filtro (excepto sílice) con una membrana de sílice adecuada para unir ácidos nucleicos. Dicha combinación de filtro y membrana de sílice preferiblemente se montan uno al lado del otro, preferiblemente dentro de un dispositivo tubular, por ejemplo, una columna de centrifugación.

El filtro de sílice o la combinación del filtro y una membrana de sílice se usan preferiblemente en un método como el descrito anteriormente para a) retener las células microbianas o vegetales en el paso v) y b) unir los ácidos nucleicos liberados de las células microbianas o vegetales después de su lisis.

El uso de un filtro de sílice que tenga un tamaño de poro adecuado o el uso de una combinación de un filtro que tenga un tamaño de poro adecuado con una membrana de sílice adyacente dentro del mismo dispositivo da como resultado la ventaja de que, en el método descrito anteriormente, las células microbianas o vegetales separadas del contenido celular de los animales no tienen que transferirse a otro contenedor o recipiente para su tratamiento posterior, por ejemplo, para la lisis de las células y el aislamiento de ácidos nucleicos. La muestra se puede procesar más en el mismo dispositivo (por ejemplo, ej., columna de centrifugación), evitando cualquier pérdida de material debido a los pasos de transferencia.

Así, según la descripción, se proporciona una columna de centrifugación que comprende un filtro de sílice o una combinación de un filtro y una membrana de sílice como se describió anteriormente. Dicho dispositivo puede usarse adecuadamente en el método de la presente descripción.

Como ya se explicó anteriormente, el método de la presente descripción no se limita al uso de ningún tampón de lisis de células animales específico. Sin embargo, la solución de lisis descrita anteriormente es particularmente adecuada para usarse en el método de la presente descripción para lisar las células animales. Por consiguiente, la presente invención se refiere además a una solución de lisis, preferiblemente una solución de lisis para usar en el paso (i) del método de la presente descripción, que comprende al menos una saponina en una cantidad total del 5 % al 15 % (p/v), una sal soluble en agua seleccionada del grupo que comprende acetatos, sulfatos, glutamatos y mezclas de estos y un agente modificador de la viscosidad que se selecciona del grupo que comprende sacarosa y glucosa o una mezcla de estos. Opcionalmente, la solución de lisis comprende un sulfonato polianiónico, preferiblemente si se tiene que considerar al menos una de las condiciones (d), (e) o (f) (ver arriba).

Preferiblemente, al menos una saponina puede estar presente en una cantidad total del 5 % al 12 %, más preferiblemente del 5 % al 10 % y lo más preferiblemente del 5 % al 8 %, basado en la solución de lisis entera.

El sulfonato polianiónico puede estar presente en una concentración de 0,001 mM a 50 mM; preferiblemente de 0,01 mM a 10 mM; más preferiblemente de 0,1 mM a 5 mM; incluso más preferiblemente de 0,5 mM a 3 mM y lo más preferiblemente de 1,0 mM a 2,0 mM; basado en la solución de lisis A entera. Preferiblemente, el sulfonato polianiónico puede representar sulfonato de polianetol.

La sal soluble en agua preferiblemente puede estar presente en una cantidad de 10 mM a 1000 mM, preferiblemente de 50 mM a 850 mM, más preferiblemente de 100 mM a 500 mM y lo más preferiblemente de 160 mM a 250 mM, basado en la solución de lisis A entera.

El agente modificador de la viscosidad preferiblemente puede estar presente en una cantidad de 10 mM a 1000 mM, preferiblemente de 100 mM a 900 mM, más preferiblemente de 300 mM a 700 mM y lo más preferiblemente de 400 mM a 500 mM, basado en la solución de lisis entera.

El pH de la solución de lisis preferiblemente puede ser de 4 a 9, más preferiblemente de 4,5 a 8,5 y lo más preferiblemente de 5 a 8.

La solución de lisis de la presente invención se puede proporcionar como un concentrado o una solución lista para usar. Puede ser particularmente preferido almacenar la solución de lisis de la presente invención en forma congelada. La presente descripción se refiere además al uso de la solución de lisis en un método para lisar selectivamente células animales en presencia de células no animales, en donde dicha solución de lisis está exenta de cualquier sulfonato polianiónico, si se cumple al menos una de las siguientes condiciones:

(a) se usan muestras que tienen una cantidad baja de células animales (es decir, muestras que tienen menos de 1 x 106 células/mL, preferiblemente menos de 105 células/mL, más preferiblemente menos de 104 células/mL, incluso más preferiblemente menos de 103 células/mL), por ejemplo, frotis bucales, licor, plasma, líquido amniótico, humor acuoso, bilis, lavado vesical, plasma sanguíneo, exudados mamarios, lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquídeo, quilo, citosol, heces, contenido gástrico, en particular, ácido gástrico, líquido intersticial, líquido articular, linfa, moco, plasma, líquido pleural, saliva, sebo, suero, esputo, sudor, líquido sinovial, lágrimas, orina, secreciones vaginales y humor vítreo, sin limitarse a dichas muestras;

(b) las células no animales, preferiblemente microbianas/vegetales se separan del resto de las células animales lisadas y/o la parte líquida de la muestra en el paso (v) por centrifugación;

c) el contenido de las células microbianas/células vegetales, en particular, los ácidos nucleicos aislados de dichas células, se analizará mediante PCR o una reacción similar; o

la solución de lisis que comprende un sulfonato polianiónico cuando se cumple al menos una de las siguientes condiciones:

(d) se usan muestras que tienen una gran cantidad de células animales (es decir, muestras que tienen al menos 1 x 106 células/mL, preferiblemente al menos 107 células/mL, más preferiblemente al menos 107 células/mL, incluso más preferiblemente al menos 109 células/mL), por ejemplo, sangre total, tejidos, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares, aspirados de médula ósea, homogeneizados de huesos, hemoderivados, muestras de sangre estabilizadas con citrato, EDTA, heparina o similares o concentrados de sangre tales como concentrados de trombocitos o eritrocitos, semen o muestras similares, sin restringirse lo mencionado;

(e) las células microbianas/vegetales se separan del resto de las células animales lisadas y/o de la parte líquida de la muestra en el paso (v) por filtración;

f) las células microbianas o las células vegetales se analizarán mediante cultivo adicional.

La invención asimismo se refiere a un kit para la depleción selectiva de ácidos nucleicos animales de una muestra que comprende células animales y células microbianas y/o vegetales, preferiblemente por el método de la presente descripción, que comprende al menos dos de los siguientes componentes:

(i) una solución de lisis como se define en las reivindicaciones para lisar selectivamente las células animales en presencia de células microbianas y/o vegetales, teniendo dicho tampón un pH en el intervalo de 4,0 a 9,0; (ii) una endonucleasa capaz de degradar tanto el ARN como el ADN, o una mezcla de al menos una ADNasa y al menos una ARNasa; y/o

(iii) un filtro como se define en las reivindicaciones para separar esencialmente células microbianas y/o vegetales esencialmente intactas de la parte líquida de la muestra, incluidos los ácidos nucleicos animales digeridos, reteniendo esencialmente las células microbianas y/o vegetales mientras la parte líquida de la muestra pasa el filtro como un filtrado.

Se prefiere particularmente que el kit comprenda al menos los componentes (i) y (iii).

Las soluciones de lisis, endonucleasas y filtros preferidos ya se han descrito anteriormente.

El kit puede comprender además al menos uno de los siguientes componentes: instrucciones para usar el kit (también se pueden proporcionar en un sitio web o en cualquier otra plataforma de publicación adecuada), medios cromatográficos para purificar, concentrar y/o aislar células microbianas y/o vegetales o ácidos nucleicos, agentes o tampones para lisar las células microbianas y/o vegetales, mediadores de unión o tampones de unión, tampones de lavado, tampones de elución, otros medios para filtrar y/o centrifugar la muestra o una combinación de estos.

La solución de lisis y el kit de la presente invención son particularmente adecuados para eliminar selectivamente los ácidos nucleicos animales de los ácidos nucleicos no animales tanto de bacterias grampositivas como gramnegativas y superan a los kits actualmente conocidos para este propósito, como lo demuestran los siguientes ejemplos. Así, la solución de lisis y el kit de la presente invención son útiles en numerosos campos, incluidos, por ejemplo, el diagnóstico y seguimiento de enfermedades infecciosas, la detección de guerra microbiológica y la inspección de alimentos, sin limitarse a esto.

Lista de figuras

La figura 1 muestra los valores de umbral de ciclo (CT) obtenidos en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rt-PCR) de ácidos nucleicos aislados de muestras de sangre que primero se enriquecieron con 1 x 106 células de Bacillus subtilis y luego se procesaron según el método de la presente descripción (rutas 1 a 4) o el kit QlAamp disponible en el mercado (ruta 5). En la ruta 6 se muestra el resultado obtenido usando agua como control no objetivo (NTC) (siglas en inglés) (ejemplo 1).

La figura 2 muestra los valores de CT obtenidos en rt-PCR (izquierda y ejemplo comparativo), después de WNA y WGA, respectivamente, de una muestra de sangre enriquecida con 1 x 106 células de Bacillus subtilis procesada según el método de la presente descripción (ejemplo 2).

La figura 3 muestra los valores de CT obtenidos en rt-PCR de ácidos nucleicos de muestras de sangre estabilizadas con diferentes agentes estabilizantes (rutas I: heparina; rutas II: EDTA; rutas III: citrato; ruta IV: agua como NTC) y enriquecidas con 1 x 106 células de Streptococcus haemolyticus antes de ser procesadas según el método de la presente descripción. Las muestras que se muestran en las respectivos rutas a) se procesaron según el método de la presente descripción inmediatamente después de ser recolectadas y enriquecidas con las células. Las muestras que se muestran en las respectivas rutas b) se almacenaron a temperatura ambiente durante dos días antes de ser procesadas. Las muestras que se muestran en las respectivas rutas c) se almacenaron a temperatura ambiente durante seis días antes de ser procesadas. Las muestras que se muestran en las respectivas rutas d) se almacenaron a 4 °C durante dos días antes de ser procesadas. Las muestras que se muestran en las respectivas rutas e) se almacenaron a 4 °C durante seis días antes de ser procesadas (ejemplo 3).

La figura 4 muestra los valores de CT obtenidos en rt-PCR de ácidos nucleicos de muestras de hisopos bucales enriquecidos con 106 células de Bacillus subtilis, cada una de 4 muestras se trataron con una solución de lisis que comprendía sal sódica del ácido polianetolsulfónico (SPS) o con una solución de lisis exenta de SPS y las células microbianas se separaron mediante un paso de filtración (ejemplo 4).

La figura 5 muestra los valores de CT obtenidos en rt-PCR de ácidos nucleicos de cuatro muestras de hisopos bucales enriquecidas con 106 células de Bacillus subtilis, las muestras se trataron con solución de lisis que comprendía sal sódica del ácido polianetolsulfónico (SPS), o con solución de lisis exenta de SPS, respectivamente, y las células microbianas se separaron por centrifugación (ejemplo 4). La ruta en el extremo derecho representa el control no objetivo (última ruta).

La figura 6 muestra el porcentaje de ADN bacteriano (mostrado en negro) y ADN humano (mostrado en gris) obtenido en la secuenciación de nueva generación a partir de muestras que contenían prácticamente puro ADN de Bacillus subtilis (ruta 1), una muestra de sangre enriquecida con 1 x 106 células de Bacillus subtilis procesada usando el kit QlAamp disponible comercialmente (ruta 2) y el método de la presente descripción (ruta 3) (ejemplo 5).

Ejemplos

Protocolo A general para el procesamiento, por ejemplo, de una muestra de sangre según el método de la presente descripción

Se pipeteó 1 mL de la respectiva muestra de sangre en un tubo Eppendorf de fondo redondo de 2 mL que ya contenía 500 gL de una solución de lisis según la presente invención y se mezcló mediante vórtex pulsado. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador de extremo a extremo. Como tampón de lisis animal puede usarse cualquier tampón de lisis adecuado. La solución de lisis usada en los ejemplos comprendía el 7,73 % en peso de saponina; 0,19 M de sal monosódica de ácido L-glutámico monohidratado; 0,48 M de sacarosa y 1,92 mM de sal sódica de ácido polianetolsulfónico.

A continuación, la mezcla se centrifugó durante 10 min a 10000 xg en una centrífuga a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante.

Se agregaron 600 gL de un tampón que comprendía Tris 50 mM pH 7,5; MgCl21,5 mM y NaCl 20 mM; y 8 gL de una mezcla de enzimas (DNAsa/RNAsa y/o enzimas de restricción) o una cantidad adecuada de una endonucleasa (por ejemplo, ej., Benzoase®, disponible de Merck, Alemania, Cyanase®, disponible de RiboSolutions, EE. UU., o nucleasa universal Pierce™, disponible de Thermo Scientific, Alemania) al sedimento. La mezcla resultante se mezcló mediante vórtex pulsado. El tubo se hizo girar brevemente en una centrífuga para eliminar las gotas del interior de la tapa y luego se incubó a 37 °C durante 30 min con agitación [63 rad/s (600 rpm)] en un bloque calefactor o a temperatura ambiente en un agitador de extremo a extremo.

Luego se agregaron 40 gL de Proteinasa K (QIAGEN, Hilden, Alemania) y la muestra se mezcló mediante vórtex pulsado. Después de hacer girar brevemente el tubo en una centrífuga para eliminar las gotas del interior de la tapa, la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de extremo a extremo. Para eliminar las gotas del interior de la tapa, se hizo girar el tubo durante unos 5 min.

Luego, las muestras se aplicaron con cuidado en una columna de centrifugación equipada con un filtro que tenía un tamaño de poro de 0,25 gm /- 0,05 gm; la columna de centrifugación se colocó en un recipiente apropiado y se hizo girar en una centrífuga a 10000 xg durante 3 min a temperatura ambiente y se descartó el filtrado; o las muestras se centrifugaron en una centrífuga a 10000 xg durante 15 min para sedimentar las células bacterianas presentes en la muestra. El sedimento se puede lavar de una a tres veces con PBS.

En este momento es posible recoger del filtro las células no animales esencialmente intactas. Si se desea la lisis de las células no animales y el posterior análisis de los ácidos nucleicos no animales, se llevan a cabo los siguientes pasos adicionales:

Cuando se usó un filtro, para lavar las células se aplicaron 600 gL de agua sobre el filtro y la columna de centrifugación que comprendía dicho filtro se centrifugó a 10000 xg durante 3 min a temperatura ambiente. El filtrado se descartó.

Se agregaron al filtro 180 gL de la solución A de lisis mencionada anteriormente, ahora complementada con 20 g/L de lisozima, y el filtro se incubó a 37 °C durante 30 min con agitación a [63 rad/s (600 rpm)] en un bloque de calentamiento.

Se agregaron 200 gL de tampón AL (QIAGEN, Hilden, Alemania), suplementado con 20 gL de Proteinasa K (QIAGEN, Hilden, Alemania), a la columna de centrifugación que luego se incubó a 56 °C durante 30 min con agitación a [63 rad/s (600 rpm)] en un bloque de calefacción.

Para aislar los ácidos nucleicos no animales mediante adsorción en una membrana de sílice, se agregaron a la muestra 200 gL de etanol (96 % a 100 %) y se mezclaron mediante agitación vorticial pulsada durante 15 s. Luego, la muestra se aplicó a una membrana de sílice adecuada para la unión de ácidos nucleicos, por ejemplo, una membrana de sílice contenida en las columnas de centrifugación comercialmente disponibles con el nombre comercial QlAamp o MinElute de QIAGEN, Hilden, Alemania, y se procesó según el protocolo del fabricante.

Protocolo B general para el procesamiento, por ejemplo, una muestra de hisopo bucal según el método de la presente descripción

Se usaron hisopos Coplan FLOQ para tomar muestras de células de la mucosa oral (bucal) y luego cada hisopo se agitó en 1 mL de PBS. Las bacterias se agregaron directamente a la muestra para sortear las irregularidades debidas a las diferencias en la eficiencia del lavado. Aproximadamente se usaron 1x104 o 1x106 células por muestra dependiendo del experimento correspondiente. Para tener un material de muestra homogéneo, se combinaron varias muestras de hisopos y luego se dividió la suspensión celular entre varias muestras.

Se pipeteó 1 mL de la muestra respectiva en un tubo Eppendorf de fondo redondo de 2 mL que ya contenía 500 gl de una solución de lisis según la presente invención y se mezcló mediante vórtice pulsado. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min en un agitador de extremo a extremo. Como tampón de lisis animal puede usarse cualquier tampón de lisis adecuado. La solución de lisis usada en los ejemplos comprendía el 7,73 % en peso de saponina; 0,19 M de sal monosódica de ácido L-glutámico monohidratado; sacarosa 0,48 M y; opcionalmente, sal sódica de ácido polianetolsulfónico 1,92 mM si estaba presente.

Luego, la mezcla se centrifugó durante 10 min a 10000 xg en una centrífuga a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante.

Se agregaron 600 gL de un tampón que comprendía Tris 50 mM pH 7,5; MgCl21,5 mM y NaCl 20 mM; y 8 gL de una mezcla de enzimas (DNAsa/RNAsa y/o enzimas de restricción) o una cantidad adecuada de una endonucleasa (por ejemplo, ej., Benzoase®, disponible por Merck, Alemania, Cyanase®, disponible de RiboSolutions, EE. UU., o nucleasa universal Pierce™, disponible de Thermo Scientific, Alemania) al sedimento. La mezcla resultante se mezcló mediante vórtex pulsado. El tubo se hizo girar brevemente en una centrífuga para eliminar las gotas del interior de la tapa y luego se incubó a 37 °C durante 30 min con agitación [63 rad/s (600 rpm)] en un bloque calefactor o a temperatura ambiente en un agitador de extremo a extremo.

Luego se agregaron 40 gL de Proteinasa K (QIAGEN, Hilden, Alemania) y la muestra se mezcló mediante vórtex pulsado. Después de hacer girar brevemente el tubo en una centrífuga para eliminar las gotas del interior de la tapa, la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de extremo a extremo. Para eliminar las gotas del interior de la tapa, se hizo girar el tubo durante unos 5 min.

Luego, las muestras se aplicaron con cuidado en una columna de centrifugación equipada con un filtro que tenía un tamaño de poro de 0,25 gm /- 0,05 gm; la columna de centrifugación se colocó en un recipiente apropiado y se hizo girar en una centrífuga a 10000 xg durante 3 min a temperatura ambiente y se descartó el filtrado; o las muestras se centrifugaron en una centrífuga a 10000 xg durante 15 min para sedimentar las células bacterianas presentes en la muestra. El sedimento se pudo lavar de una a tres veces con PBS.

En este momento es posible recoger las células no animales esencialmente intactas del filtro o del sedimento. Si se desea la lisis de las células no animales y el posterior análisis de los ácidos nucleicos no animales, se llevan a cabo los siguientes pasos adicionales:

Cuando las células microbianas se separaron por filtración, las células del filtro se podían lisar como se describió anteriormente en el protocolo A, o se podían resuspender en 200 pL de tampón de lisis ATL y tratar como se describió a continuación para el sedimento después de la centrifugación.

Los sedimentos de las muestras después de la centrifugación se resuspendieron en 200 pL de tampón de lisis ATL (QIAGEN, Hilden, Alemania), se transfirieron a tubos Pathogen Lysis L (QIAGEN) y se lisaron mecánicamente mediante perlas de vidrio tratando las muestras según el protocolo FastPrep (QIAGEN). Después de la adición de 40 pL de Proteasa K, la incubación a 56 °C durante 30 min, se agregaron 200 pL de tampón APL y las muestras se incubaron a 70 °C durante 10 min.

Para aislar los ácidos nucleicos no animales mediante adsorción en una membrana de sílice, se agregaron a la muestra 200 pL de etanol (96 % a 100 %) y se mezclaron mediante agitación vorticial pulsada durante 15 s. Luego, la muestra se aplicó a una membrana de sílice adecuada para la unión de ácidos nucleicos, por ejemplo, una membrana de sílice contenida en las columnas de centrifugación comercialmente disponibles con el nombre comercial QlAamp o MinElute de QIAGEN, Hilden, Alemania, y se procesó según el protocolo del fabricante.

Ejemplo 1: Agotamiento de ADN humano de muestras de sangre enriquecidas con Bacillus subtilis

Se enriqueció 1 mL de sangre entera humana con 1 x 106 células de Bacillus subtilis y se procesó según el método de la descripción como se describe en el Protocolo general A anterior usando un filtro para separar las células microbianas.

A modo de comparación, se enriquecieron 200 pL de sangre entera humana con el mismo número (1 x 106 células) de células Bacillus subtilis y se procesaron usando el kit QlAamp disponible en el mercado según el protocolo del fabricante (QIAGEN, Hilden, Alemania).

Los ácidos nucleicos presentes en el eluato obtenido al final de cada uno de los protocolos fueron luego multiplicados en rt-PCR. Los valores de CT obtenidos se muestran en la Figura 1, las rutas 1 a 4 representan muestras procesadas según la presente descripción, mientras que la ruta 5 representa la muestra comparativa procesada usando el kit QIAampor. En la ruta 6, se usó agua como control no objetivo (NTC). En cada ruta a la izquierda se muestran los valores de ct que se refieren al ácido nucleico microbiano («Bac Sub»), a la derecha se muestra el resultado que se refiere al ácido nucleico humano («Humano 2»).

Aunque la cantidad inicial de ADN humano en la muestra comparativa era solo 1/5 de la cantidad de ADN humano en la muestra procesada según el método de la presente descripción debido al menor volumen de muestra usado en la muestra comparativa, la muestra comparativa purificada comprendía mucho más ADN humano que las muestras procesadas según el método de la presente descripción. En las muestras procesadas según el método de la presente descripción, por otro lado, la cantidad de ADN humano estaba cerca del límite de detección de la rt-PCR. La cantidad de ADN bacteriano es comparable para ambos métodos.

El valor del umbral de ciclo (CT) se define como el número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente que detecta una reacción positiva en la PCR en tiempo real cruce el umbral (nivel de fondo). Los valores de CT son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico objetivo en la muestra, de modo que un valor de CT bajo indica una cantidad alta de ácido nucleico objetivo en la muestra y viceversa.

Ejemplo 2: WNA y WGA de ADN aislado por el método de la presente descripción para aplicación de NGS

Las muestras y las muestras comparativas se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Los ácidos nucleicos obtenidos luego se multiplicaron mediante tres métodos de PCR: rtPCR como en el Ejemplo 1, multiplicación del genoma entero (WGA) o multiplicación del ácido nucleico entero (WNA). La WGA se llevó a cabo usando el kit REPLIg-Mini de QIAGEN, Hilden, Alemania, según las instrucciones.

La multiplicación de ácidos nucleicos enteros se lleva a cabo aislando los ácidos nucleicos de las bacterias según el Ejemplo 1, llevando a cabo una transcripción inversa de los ácidos nucleicos completos y después realizando una WGA usando el Kit REPLIg-Mini de QIAGEN, Hilden, Alemania según las instrucciones.

Los resultados se muestran en la Figura 2, mostrando los valores CT obtenidos. En cada ruta, a la izquierda se muestran los valores de CT que se refieren al ácido nucleico microbiano («Bac Sub»), a la derecha se muestra el resultado que se refiere al ácido nucleico humano («Humano 2»).

Este ejemplo demuestra que los ácidos nucleicos no animales aislados por el método de la presente descripción son adecuados para la multiplicación en WNA y WGA, respectivamente, y, así, para aplicaciones de secuencias de nueva generación (NGS).

Ejemplo 3: Aislamiento de ADN bacteriano a partir de muestras de sangre estabilizadas

Se enriquecieron muestras de sangre humana, cada una con un volumen de 1 mL, con 1 x 106 células de Streptococcus haemolyticus y se suplementaron con heparina, EDTA o citrato, respectivamente, como estabilizador (en las cantidades habituales para la conservación de la sangre, es decir, heparina 17 UI/mL, EDTA 1,8 mg/mL, citrato 0,38 %).

Las muestras estabilizadas con heparina, EDTA y citrato, respectivamente, se procesaron según el método de la presente descripción, como se describe en el Protocolo general anterior, inmediatamente después de añadir las células bacterianas, mientras que otras muestras se almacenaron durante 2 o 6 días, respectivamente, a temperatura ambiente o 4 °C, respectivamente, antes de ser procesado según el Protocolo general A anterior usando un filtro para separar las células microbianas.

Los ácidos nucleicos que estaban presentes en el eluato obtenido después de llevar a cabo el Protocolo general A anterior se multiplicaron en rt-PCR.

Los resultados se presentan en la Figura 3: La Figura 3 muestra los valores de CT obtenidos en la rt-PCR (rutas I: muestras estabilizadas con heparina; rutas II: muestras estabilizadas con EDTA; rutas III: muestras estabilizadas con citrato; ruta IV: muestras con agua como NTC). Las muestras que se muestran en las respectivas rutas a) se procesaron según el método de la presente descripción inmediatamente después de ser recolectadas y enriquecidas con las células bacterianas. Las muestras que se muestran en las respectivas rutas b) se almacenaron a temperatura ambiente durante dos días antes de ser procesadas. Las muestras que se muestran en las respectivas rutas c) se almacenaron a temperatura ambiente durante seis días antes de ser procesadas. Las muestras que se muestran en las respectivas rutas d) se almacenaron a 4 °C durante dos días antes de ser procesadas. Las muestras que se muestran en las rutas e) respectivas se almacenaron a 4 °C durante seis días antes de ser procesadas. En cada ruta, a la izquierda, se muestran los valores de ct que se refieren a las células microbianas («Haemol»), a la derecha se muestra el resultado que se refiere a los ácidos nucleicos humanos («Alu 2»).

Estos resultados demuestran que el método de la presente descripción también es útil para aislar ácidos nucleicos no animales de muestras de sangre estabilizadas.

Ejemplo 4: Aislamiento de ADN bacteriano a partir de hisopos

Las muestras se trataron según el protocolo general B. Se añadió una cantidad de aproximadamente 106 células B. subtilis a muestras de hisopos bucales en 1 mL de PBS como se describió anteriormente y se usaron para preparar las muestras.

En un primer enfoque, las células microbianas se separan del resto de las muestras después de la lisis de las células humanas mediante un paso de filtración, en un segundo enfoque mediante centrifugación. La lisis de las células humanas se llevó a cabo mediante la solución A de lisis, que comprendía ácido polianetolsulfónico (+SPS) o estaba exenta de ácido polianetolsulfónico (-SPS), en cualquier caso, con ayuda de perlas de vidrio.

Como control positivo se aislaron los ácidos nucleicos de 1x106 células de B. subtilis usando el kit QIAamp (QIAGEN, Hilden, Alemania) según las instrucciones. Para comparar una de las muestras (intercambio bucal, enriquecido con B. subtilis) se trató también con el kit QlAamp (sin lisis previa de las células humanas). Como control negativo (sin objetivo) sirvió H2O.

Los ácidos nucleicos que estaban presentes en el eluato obtenido después de llevar a cabo el Protocolo general B anterior o después del tratamiento con el kit QlAamp se multiplicaron en rt-PCR, los valores de CT resultantes se muestran en las Figuras 4 y 5.

Todas las muestras que se muestran en la Figura 4 se trataron separando las células microbianas del resto de células humanas lisadas mediante un paso de filtración. Se puede observar que la adición de SPS aumenta significativamente el rendimiento de ácidos nucleicos B. subtilis de las muestras.

Las muestras mostradas en la Figura 5 se trataron separando las células microbianas del resto de células humanas lisadas por centrifugación. Para cada muestra, se llevó a cabo la rt-PCR (como una doble verificación) dos veces con referencia a B. subtilis. Como se puede observar, los valores de CT de las muestras tratadas con la solución de lisis que comprende SPS tienen una alta variación, debido al efecto de inhibición de SPS en la PCR. La ruta de la derecha es el control no objetivo (última ruta).

Ejemplo 5: Secuenciación de nueva generación de ADN obtenido mediante el método de la presente descripción

El eluato obtenido de las muestras, que se prepararon según el protocolo general A y el método comparativo del ejemplo 1, se sometieron a la multiplicación del genoma completo usando el Minikit REPLI-g de QIAGEN según las instrucciones del kit.

El porcentaje de ADN compatible con origen humano y bacteriano, respectivamente, para cada muestra se muestra en la Figura 6. Como control, el ADN bacteriano puro de Bacillus subtilis también se multiplicó y secuenció como se describió anteriormente (ruta 1 en la Figura 5). Incluso en este control, se detectan pequeñas cantidades de ADN humano, muy probablemente debido a la contaminación ambiental. Comparando la ruta 2 (muestra procesada usando el kit QlAamp disponible comercialmente) y la ruta 3 (muestra procesada según el método de la presente descripción) se puede ver que usando el método de la presente descripción es posible multiplicar y secuenciar (casi) ADN bacteriano puro, en donde la cantidad de ADN humano apenas supera el fondo ambiental habitual.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una solución de lisis para lisar selectivamente células animales en una muestra que comprende células animales y células microbianas y/o vegetales que contienen menos de 2 M de sustancias caotrópicas, que comprende al menos una saponina en una cantidad total del 5 % al 15 % (p/v), una sal soluble en agua seleccionada de acetatos, sulfatos, glutamatos y mezcla de estos en una cantidad de 50 mM a 850 mM, seleccionándose un agente modificador de la viscosidad entre sacarosa y glucosa o una mezcla de estos en una cantidad de 300 mM a 1000 mM y opcionalmente un sulfonato polianiónico.

2. La solución de lisis según la reivindicación 1, en donde al menos una saponina está presente, en base a la solución de lisis entera, en una cantidad del 5 % al 14 %, más preferiblemente en una cantidad del 5 % al 13 %, incluso más preferiblemente del 5 % a aproximadamente el 12 %, incluso más preferiblemente del 5 % al 10 % y lo más preferiblemente del 5 % al 8 %.

3. La solución de lisis según la reivindicación 1 o 2, en donde la sal soluble en agua está presente en una cantidad de 100 mM a 500 mM y lo más preferiblemente de 160 mM a 250 mM, en base a la solución de lisis entera.

4. La solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente modificador de la viscosidad está presente en una cantidad de 300 mM a 900 mM, más preferiblemente de 300 mM a 700 mM y lo más preferiblemente de 400 mM a 500 mM, en base a la solución de lisis entera.

5. La solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sulfonato polianiónico, si está presente, está presente en una concentración de 0,001 mM a 50 mM, preferiblemente de 0,01 mM a 10 mM, más preferiblemente de 0,1 mM a 5 mM, incluso más preferiblemente de 0,5 mM a 3 mM y lo más preferiblemente de 1,0 mM a 2,0 mM, basado en la solución de lisis entera.

6. La solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende menos de 1 M; más preferiblemente menos de 0,1 M; incluso más preferiblemente menos de 0,01 M; aún más preferiblemente menos de 0,001 M y lo más preferiblemente ninguna sustancia caotrópica.

7. La solución de lisis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene un pH en el intervalo de 4,0 a 9,0.

8. Un kit para eliminar selectivamente ácidos nucleicos animales de una muestra que comprende células animales y células microbianas y/o vegetales, comprendiendo dicho kit:

una solución de lisis para lisar células animales como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores y además al menos uno de los compuestos:

(i) una endonucleasa capaz de degradar tanto el ARN como el ADN, o una mezcla de al menos una ADNasa y al menos una ARNasa, y/o

(ii) un filtro que comprende una membrana de sílice que tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0,1 pm a 1,5 pm; preferiblemente de 0,2 pm a 1,0 pm; más preferiblemente de 0,3 pm a 0,8 pm; lo más preferiblemente de 0,5 pm a 0,7 pm.

9. Un kit según la reivindicación 8, que comprende además al menos uno de los siguientes componentes: instrucciones para usar el kit, medios cromatográficos para purificar, concentrar y/o aislar células microbianas y/o vegetales o ácidos nucleicos, agentes o tampones para lisar células microbianas y/o vegetales, mediadores de unión o tampones de unión, tampones de lavado, tampones de elución, otros medios para filtrar y/o centrifugar la muestra o una combinación de estos.