CN115521875A - 一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法及其应用。所述方法包括：裂解人源细胞：采集待测样本，采用Molzym试剂盒去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；裂解病原体细胞壁：对裂解人源细胞后的产物进行珠磨破碎，采用物理破碎的方式裂解病原体细胞壁，所述珠磨破碎处理的程序包括振荡速度5.5‑6.5m/s，振荡时间28‑32s，静置4.5‑5.5min，重复振荡和静置的步骤2‑3次；核酸提取：对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。本发明的去宿主方法与皂素法和Molzym试剂盒相比操作时间最短，对细菌和真菌的病原体检出率最高；采用全自动提取仪减少人力及样本间交叉污染，保证数据质量。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法及其应用。
背景技术
宏基因组学在临床应用上也有极好的前景，受到临床、科研和检验等各个领域的重视。病原体宏基因组学高通量测序技术(mNGS)可以对疑似感染标本采集提取后直接进行高通量测序，规避了绝大部分微生物不能培养、痕量菌无法检测的缺点，通过病原微生物专用数据库比对和智能化算法分析，获得疑似致病微生物的种属信息，并提供全面深入的报告，为疑难危重感染提供快速精准诊断依据，促进抗生素类药物合理使用。
然而即便有再强大的测序技术，也必须先从临床样本中提取出微量病原的核酸。临床样本形式种类繁多，病原微生物种类繁多，而样本中由于可能存在大量宿主细胞或宿主的游离核酸，病原微生物核酸在提取出的核酸样本中的丰度通常极低。因此，宿主核酸成为干扰mNGS的一大因素，在核酸提取环节，怎么样做到有效去除宿主核酸，富集病原体核酸，进而提高mNGS的灵敏度也是难点之一。
目前，常用的去除人源宿主的方法有：过滤法、甲基化抗体捕获法和选择性裂解法。其中过滤法是基于病原体和宿主细胞体积差异进行去除，但由于真核细胞、寄生虫等病原体和人类细胞体积大小近似，过滤法并不太常用。甲基化抗体捕获通过人基因组核酸中广泛存在的甲基化修饰对人的核酸进行去除，但是真菌、寄生虫等真核病原体的核酸同样具有甲基化，会在这一步骤中被去除，因此使用范围受到较大限制。相比之下，选择性裂解的原理是通过人细胞和病原体不同的理化性质，通过温和的变性剂处理优先裂解人细胞(没有细胞壁，较容易破裂)，再通过离心富集病原体。选择性裂解法具有方便快捷、微生物损失小等优点，目前被广泛采用。
但是选择性裂解法耗时长，以Molyzym去宿主试剂为例，去宿主流程时间约为100分钟，mNGS检测多为ICU重症病人，对TAT要求高，目前市场上去宿主试剂盒操作步骤多，耗时长。目前选择性裂解法在裂解宿主核酸中存在一定弊端，裂解不足影响去宿主效果，裂解过度则容易降低病原体检出率。选择性裂解法找到平衡点，在保证去宿主效果同时提高病原体检出率。
由于mNGS标本类型的多样性，目前市场上缺乏自动去宿主的设备，大部分去宿舍试剂盒均采用手工去宿主和手工提取核酸结合的方法，如Molzym、Zymo等。手工提取核酸步骤繁琐，耗费人力，容易导致样本间交叉污染，不利于mNGS的结果判读。因此，开发一种快速的病原微生物核酸提取方法，在病原体宏基因组学高通量测序领域具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法及其应用。本发明创新地使用Molzym化学选择性裂解法结合物理破碎(记为Quick B&F法)，成功地达到较佳的去宿主效果并缩短实际操作时间，去宿主操作流程时间仅需27-38分钟，远远低于市场上Zymo、Molzym、NEB等成品试剂盒所需时间，为重症医学mNGS的检测争取宝贵时间。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，所述方法包括如下步骤：
(1)裂解人源细胞：采集待测样本，采用Molzym试剂盒去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；
(2)裂解病原体细胞壁：对裂解人源细胞后的产物进行珠磨破碎，采用物理破碎的方式裂解病原体细胞壁，所述珠磨破碎处理的程序包括：振荡速度5.5-6.5m/s，振荡时间28-32s，静置4.5-5.5min，重复振荡和静置的步骤2-3次；
(3)核酸提取：对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。
本发明中，所述珠磨破碎处理的程序包括：振荡速度5.5-6.5m/s(例如可以是5.5m/s、6m/s或6.5m/s等)，振荡时间28-32s(例如可以是28s、29s、30s、31s或32s等)，静置4.5-5.5min(例如可以是4.5min、5min或5.5min等)，重复振荡和静置的步骤2-3次(例如可以2次或3次)。
在珠磨过程中，重复最后一次振荡后不用在静置4.5-5.5min。
本发明建立了Molzym试剂盒去宿主、珠磨和核酸全自动提取结合的核酸提取方案，与皂素法和Molzym试剂盒相比，操作时间最短，对细菌和真菌的病原体检出率最高；采用全自动提取仪代替手工提取核酸的方法，减少人力及样本间交叉污染的机会，且保证较好的数据质量。
优选地，步骤(1)中，所述Molzym试剂盒去宿主方法包括如下步骤：
(a)将待测样本与CM buffer振荡混合，进行静置；
(b)将DB1 buffer和MolDNase B与步骤(a)中静置后的溶液振荡混合，进行静置，离心，收集沉淀；
(c)将RS buffer与步骤(b)中的沉淀振荡混合，离心，收集沉淀，用PBS重悬沉淀。
优选地，步骤(a)中，所述待测样本与CM buffer的体积比为700:(200-300)，例如可以是700:200、700:220、700:240、700:250、700:260、700:280或700:300等。
优选地，步骤(a)中，所述振荡混合的时间为5-8s，例如可以是5s、6s、7s或8s等，所述振荡混合的转速为2500-2800rpm，例如可以是2500rpm、2600rpm、2700rpm或2800rpm等。
优选地，步骤(a)中，所述静置的时间为2-3min，例如可以是2min、2.5min或3min等。
优选地，步骤(b)中，所述DB1 buffer和MolDNase B与步骤(a)中静置后的溶液的体积比为(200-250):1:(900-1000)，例如可以是200:1:900、220:1:920、230:1:9500、240:1:980或250:1:1000等。
优选地，步骤(b)中，所述振荡混合的时间为5-8s，例如可以是5s、6s、7s或8s等，所述振荡混合的转速为2500-2800rpm，例如可以是2500rpm、2600rpm、2700rpm或2800rpm等。
优选地，步骤(b)中，所述静置的时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min或12min等。
优选地，步骤(b)中，所述离心的离心力为15000-17000g，例如可以是15000、16000或17000等，所述离心的时间为4-6min，例如可以是4min、5min或6min等。
优选地，步骤(c)中，采用0.8-1.2mL(例如可以是0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL或1.2mL等)的RS buffer与步骤(b)中的沉淀振荡混合。
优选地，步骤(c)中，所述振荡混合的时间为5-8s，例如可以是5s、6s、7s或8s等，所述振荡混合的转速为2500-2800rpm，例如可以是2500rpm、2600rpm、2700rpm或2800rpm等。
优选地，步骤(c)中，所述离心的离心力为15000-17000g，例如可以是15000g、15500g、16000g、16500g或17000g等，所述离心的时间为2-4min，例如可以是2min、3min或4min等。
优选地，步骤(c)中，采用700-750μL的PBS重悬沉淀，例如可以是700μL、710μL、720μL、730μL、740μL或750μL等。
优选地，步骤(2)中，所述珠磨的步骤包括：将重悬后的沉淀加入到破壁珠磨管中，进行珠磨破碎处理，取出破壁珠磨管，将破碎后的产物进行离心处理，收集上清。
优选地，所述离心处理的离心力为1800-2200g，例如可以是1800g、1900g、2000g、2100g或2200g等，所述离心的时间为2-4min，例如可以是2min、2.5min、3min、3.5min或4min等。
本发明通过减少MolYsisTMBasic 5(Molzym试剂盒)中的化学裂解病原体细胞壁的处理步骤，并与珠磨物理裂解的方法结合，使细菌和真菌等病原体细胞壁充分破碎，实现细菌和真菌mNGS较好的检测效果，显著优于专家共识里的皂素法和市场上Molzym试剂盒法。且标本去宿主操作时间仅需约35分钟，在国内外已有方法中时间较短，能为重症医学mNGS的检测争取宝贵时间，具有重要的应用价值。
优选地，步骤(3)中，所述核酸提取的方式包括采用自动提取仪完成核酸提取。
在本发明中，核酸提取后检测核酸浓度与质量。
本发明中所述Quick B&F法在细菌和真菌的检测中病原体检出效果最佳，人源占比最少，同时保持较好的数据质量。采用手工去宿主和核酸自动提取仪结合的方法，减少前处理全程手工带来的人力耗费，以及减少样本间交叉污染的机会。
第二方面，本发明提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主的装置，所述装置包括：
裂解人源细胞模块：用于对待测样本中的人源细胞进行裂解，采用选择性去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；
裂解原体细胞壁模块：用于对待测样本中的病原体进行裂解，采用珠磨破碎进行，通过物理破碎的方式裂解病原体细胞壁；
核酸提取模块：用于提取病原体的核酸，采用核酸自动提取仪对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。
第三方面，本发明提供第一方面所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法和/或第二方面所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主的装置在病原体宏基因组学高通量测序中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明建立了Molzym试剂盒与珠磨结合的去宿主Quick B&F法，实验结果表明，本发明建立的Quick B&F法实验时间35分钟左右，与目前宏基因专家共识里推荐的皂素法(40分钟)和Molzym试剂盒(110分钟)方法相比，操作时间最短。此外，Quick B&F法通过结合物理珠磨方法，有利于充分破碎细菌和真菌的细胞壁，因此，Quick B&F法与专家共识里的皂素法、Molzym试剂盒等相比，Quick B&F法对检出细菌的标准化序列数平均提高2个数量级，对检出真菌的标准化序列数平均提高0.5个数量级，且人源序列占比最低，具有统计学差异。综上所述，本发明建立的Quick B&F法实验时间最短，且对细菌和真菌的检出效果最好。
(2)本发明建立的核酸提取方案采用核酸全自动提取仪代替市场上去宿主试剂盒手工提取核酸的方法，减少人力及样本间交叉污染的机会，且保证较好的数据质量。
附图说明
图1是Quick B&F法的流程示意图；
图2A是Quick B&F法与皂素法检出病原体检出效果的结果统计图；
图2B是Quick B&F法与Molzym试剂盒检出病原体检出效果的结果统计图；
图2C是Quick B&F法与皂素、Molzym试剂盒标准化后病原体检出结果图；
图3A是Quick B&F法与皂素法检出病原体的种类统计图；
图3B是Quick B&F法与Molzym试剂盒检出病原体的种类统计图；
图4A是肺泡灌洗液标本病原体检出序列数的对比结果图(Quick B&F法与皂素法)；
图4B是石蜡切片标本病原体检出序列数的对比结果图(Quick B&F法与皂素法)；
图4C是肺泡灌洗液标本病原体检出序列数的对比结果图(Molzym法与Quick B&F)；
图5A是Quick B&F法与皂素法的人源序列占比统计图；
图5B是Quick B&F法与Molzym试剂盒的人源序列占比统计图；
图5C是Quick B&F法与皂素法、Molzym试剂盒法总体宿主占比图；
图6A是Quick B&F法与皂素法、Molzym试剂盒法Q30、Q20质量图；
图6B是Quick B&F法与皂素法、Molzym试剂盒法GC比例图；
图6C是Quick B&F法与皂素法序列有效率图；
图6D是Quick B&F法与Molzym试剂盒序列有效率图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法先采用MolYsisTMBasic 5试剂盒去除人源细胞，再结合珠磨物理裂解的方法进行病原体核酸提取。Quick B&F法的流程示意图如图1所示。本实施例的待测样本种类包括四例阳性的肺泡灌洗液，分别用于检测细菌1(肺炎克雷伯菌)；细菌2(嗜肺军团菌)；真菌1(白念珠菌)；真菌2(烟曲霉)。
(1)裂解人源细胞：采集待测样本，采用Molzym试剂盒去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；
(a)取700μL样本至1.5mL Ep管中，加入250μL Molysis Basic 5试剂盒(厂家：Molzym，货号：S12hKD301.050)的CM buffer，涡旋振荡器2800rpm剧烈振荡5秒，室温静置2min。
(b)向步骤(a)中静置后的溶液中加入250μL Molysis Basic 5试剂盒中的DB1buffer和10μL MolDNase B，涡旋振荡器2800rpm剧烈振荡5秒，室温静置10min；16000g离心5min，弃上清；
(c)加入1000μL Molysis Basic 5试剂盒中RS buffer，用枪头轻轻混匀沉淀4-6次，2800rpm剧烈振荡5秒；15000g离心3min，弃上清，收集沉淀；加入720μL PBS，用枪头轻轻混匀沉淀4-6次。
(2)裂解病原体细胞壁：对裂解人源细胞后的产物进行珠磨破碎，采用物理破碎的方式裂解病原体细胞壁；
将重悬后的沉淀转移至MP Biomedicals Lysing Matrix E破壁珠磨管(厂家：MPBiomedicals，批号：LME001421)中。将破壁珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度6m/s，30s，静置5min，再次启动，振荡速度6m/s，30s，取出破壁珠磨管。2000g离心3min，取520μL上清至新的EP收集管中。
(3)核酸提取：对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。
EP收集管放入QIAGEN核酸自动提取仪，启动配套的QIAsymphony DSP Virus/pathogen Mini Kit试剂盒(厂家：QIAGEN，批号：172017612)程序，完成核酸提取，下机后检测核酸浓度与质量。
QIAGEN核酸自动提取仪：其提取试剂盒含有PK蛋白酶，因而去宿主过程中可省略PK蛋白酶裂解的步骤。
实施例2
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法先采用MolYsisTMBasic 5试剂盒去除人源细胞，再结合珠磨物理裂解的方法进行病原体核酸提取。本实施例的待测样本种类包括四例阳性的肺泡灌洗液，分别用于检测细菌1(肺炎克雷伯菌)；细菌2(嗜肺军团菌)；真菌1(白念珠菌)；真菌2(烟曲霉)。
(1)裂解人源细胞：采集待测样本，采用Molzym试剂盒去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；
(a)取800μL样本至1.5mL Ep管中，加入200μL Molysis Basic 5试剂盒(厂家：Molzym，货号：S12hKD301.050)的CM buffer，涡旋振荡器2500rpm剧烈振荡8秒，室温静置3min。
(b)向步骤(a)中静置后的溶液中加入200μL Molysis Basic 5试剂盒中的DB1buffer和10μL MolDNase B，涡旋振荡器2500rpm剧烈振荡8秒，室温静置8min；15000g离心6min，弃上清；
(c)加入1200μL Molysis Basic 5试剂盒中RS buffer，用枪头轻轻混匀沉淀4-6次，2500rpm剧烈振荡8秒；17000g离心2min，弃上清，收集沉淀；加入700μL PBS，用枪头轻轻混匀沉淀4-6次。
(2)裂解病原体细胞壁：对裂解人源细胞后的产物进行珠磨破碎，采用物理破碎的方式裂解病原体细胞壁；
将重悬后的沉淀转移至MP Biomedicals Lysing Matrix E破壁珠磨管(厂家：MPBiomedicals，批号：LME001421)中。将破壁珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度5.5m/s，32s，静置5.5min，再次启动，振荡速度5.5m/s，32s，取出破壁珠磨管。1800g离心4min，取520μL上清至新的EP收集管中。
(3)核酸提取：对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。
EP收集管放入QIAGEN核酸自动提取仪，启动配套的QIAsymphony DSP Virus/pathogen Mini Kit试剂盒(厂家：QIAGEN，批号：172017612)程序，完成核酸提取，下机后检测核酸浓度与质量。
实施例3
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法先采用MolYsisTMBasic 5试剂盒去除人源细胞，再结合珠磨物理裂解的方法进行病原体核酸提取。本实施例的待测样本种类包括四例阳性的肺泡灌洗液，分别用于检测细菌1(肺炎克雷伯菌)；细菌2(嗜肺军团菌)；真菌1(白念珠菌)；真菌2(烟曲霉)。
(1)裂解人源细胞：采集待测样本，采用Molzym试剂盒去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；
(a)取700μL样本至1.5mL Ep管中，加入200μL Molysis Basic 5试剂盒(厂家：Molzym，货号：S12hKD301.050)的CM buffer，涡旋振荡器2700rpm剧烈振荡7秒，室温静置2.5min。
(b)加入220μL Molysis Basic 5试剂盒中的DB1 buffer和10μL MolDNase B，涡旋振荡器2700rpm剧烈振荡7秒，室温静置12min；17000g离心4min，弃上清；
(c)加入800μL Molysis Basic 5试剂盒中RS buffer，用枪头轻轻混匀沉淀4-6次，2700rpm剧烈振荡7秒；16000g离心4min，弃上清，收集沉淀；加入750μL PBS，用枪头轻轻混匀沉淀4-6次。
(2)裂解病原体细胞壁：对裂解人源细胞后的产物进行珠磨破碎，采用物理破碎的方式裂解病原体细胞壁；
将重悬后的沉淀转移至MP Biomedicals Lysing Matrix E破壁珠磨管(厂家：MPBiomedicals，批号：LME001421)中。将破壁珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度6.5m/s，28s，静置4.5min，再次启动，振荡速度6.5m/s，28s，取出破壁珠磨管。2200g离心2min，取520μL上清至新的EP收集管中。
(3)核酸提取：对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。
EP收集管放入QIAGEN核酸自动提取仪，启动配套的QIAsymphony DSP Virus/pathogen Mini Kit试剂盒(厂家：QIAGEN，批号：172017612)程序，完成核酸提取，下机后检测核酸浓度与质量。
实施例4
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中。将破壁珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度4m/s，40s，其余参数同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中。将破壁珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度7m/s，20s，其余参数同实施例1。
实施例6
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，珠磨之后离心的离心力为1600g，时间为7min。其余参数同实施例1。
实施例7
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，珠磨之后离心的离心力为2400g，时间为1min。其余参数同实施例1。
实施例8
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，将破壁珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度6.5m/s，28s，静置4.5min(即只进行一次振荡和静置)。其余参数同实施例1。
实施例9
本实施例提供一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法(后称Quick B&F法)，所述方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，将破壁珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度6.5m/s，28s，静置4.5min，重复振荡和静止的步骤5次。其余参数同实施例1。
实施例1-9中的去宿主方法对待测样本的病原体检出效果的结果统计如表1所示：
表1
实施例1-3中的方法中检测到的标准化病原序列数配对t检验P值＜0.05，实施例1-3中方法无统计学差异，均达到较好的检出效果，具有重要的应用价值。
通过实施例1和实施例4和5的对比可知，在珠磨破碎中降低振荡速度延长振荡时间，或升高振荡速度减少振荡时间，标准化病原序列数均降低，病原体检出效果下降。振荡速度过低，可能使病原体细胞壁破碎不充分，核酸提取质量下降，导致病原体检出序列数下降；振荡速度过高，过度研磨震荡，则可能导致核酸裂解，病原体核酸提取量减少，同样导致病原体检出序列数下降。
通过实施例1和实施例6和7的对比可知，珠磨破碎后，离心的转速影响去宿主效果，降低离心力延长离心时间，或升高离心力减少离心时间，标准化病原序列数均降低，病原体检出效果下降。离心力过低，珠磨粉末无法与病原体溶液分层，核酸提取过程吸取较多的珠磨粉末，可能影响病原体核酸提取质量，导致病原体检出序列数下降；减少离心时间，同样珠磨粉末无法与病原体溶液分层，导致病原体检出序列数下降。
通过实施例1和实施例8和9的对比可知，珠磨破碎的步骤改变影响病原体检出效果，减少或增加震荡次数可使表转化病原序列数下降。减少震荡次数时，珠磨不充分，病原体细胞壁无法充分破碎，特别是对于细胞壁难破碎的细菌和真菌，病原体核酸无法析出，导致病原体检出序列数下降；增加震荡次数时，过度珠磨，导致核酸裂解，提取病原体核酸数量减少，同样导致病原体检出序列数下降。
实施例10
本实施例分别用Quick B&F法和专家共识里的皂素法与Molzym试剂盒、Zymo试剂盒对比去宿主效果。本实施例的待测样本种类包括肺泡灌洗液、痰液、新鲜组织、组织蜡块、痰液、血液，样本来源于病人。
皂素法去宿主的步骤为照组中的皂素法具体流程为：
(1)取500μL样本至1.5mL EP管中，加入10μL 5％皂素溶液，剧烈振荡15s，室温静置5min。
(2)加入2μL Invitrogen公司TURBOTM DNase试剂盒中的DNase，振荡15s混匀，孵育器900rpm，37℃孵育30min。
(3)加入30μL TURBOTM DNase试剂盒中的stop buffer，振荡15s混匀，室温放置5min，期间每隔一分钟振荡15s。
(4)加入210μL PBS，转移至MP Biomedicals Lysing Matrix E破壁珠磨管中。
(5)珠磨管放入MP Biomedicals快速破碎仪，启动程序为：振荡速度6m/s，30s，静置5min，再次启动振荡速度6m/s，30s，取出珠磨管。
(6)2000g离心3min，取520μL上清至新的EP收集管中。
(7)EP收集管放入QIAGEN核酸自动提取仪，启动配套的QIAsymphony DSP Virus/pathogen Mini Kit试剂盒程序，完成核酸提取，下机后检测核酸浓度与质量。
采用Molzym试剂盒(厂家：Molzym，货号：S12hKD301.050)去宿主的步骤参照Molzym试剂盒的说明书进行。
检测结果如图2A、图2B和图2C所示，其中，图2A为Quick B&F法与皂素法检出病原体检出效果的结果统计图，图2B为Quick B&F法与Molzym试剂盒检出病原体检出效果的结果统计图，图2C为Quick B&F法与皂素、Molzym试剂盒标准化后病原体检出结果图。
从图2A、图2B和图2C的结果可知：标准化病原序列为病原体原始reads/总reads，其中Quick B&F法与皂素法标准化病原序列数具有显著性差异(p＜0.05)，(Quick B&F法标准化病原序列数-皂素法标准化病原序列数)/皂素法标准化病原序列数，均值为85.21，中位数为8.35，可见Quick B&F法病原体检出效果大大优于皂素法。
另一方面，Quick B&F法与Molzym试剂盒标准化病原序列数具有显著性差异(p＜0.05)，(Quick B&F标准化病原序列数-Molzym标准化病原序列数)/Molzym标准化病原序列数，均值为79.33，中位数为2.01，可见Quick B&F病原体检出效果也优于Molzym试剂盒。综上所述，在三种去宿主方案中，Quick B&F病原体检出效果最佳。
Quick B&F法总体病原体检出率效果最佳，对于不同类型的病原体，Quick B&F检出效果也有所偏颇。
图3A为Quick B&F法与皂素法检出病原体的种类统计图，从图3A可知：Quick B&F法与皂素法相比，细菌标准化病原体检出序列数约提高2个数量级，真菌提高0.5个数量级，而病毒则减少。
图3B为Quick B&F法与Molzym试剂盒检出病原体的种类统计图，从图3B可知：Quick B&F法与Molzym试剂盒检出病原体相比，细菌标准化病原体检出序列数约提高2个数量级，真菌提高1个数量级，而病毒则减少。可见，Quick B&F法对于细菌与真菌的检出具有较好的性能，而病毒检出率较低。
实施例11
为明确不同标本类型，Quick B&F法、Molzym试剂盒和皂素法去宿主效果是否具有差异，本实施例分别采用Quick B&F法、Molzym试剂盒和皂素法对肺泡灌洗液与石蜡切片标本进行去宿主处理，所述Quick B&F法处理的步骤参照实施例1，所述皂素法处理的步骤参照实施例10。分别统计了肺泡灌洗液与石蜡切片标本的病原序列数。
图4A为肺泡灌洗液标本病原体检出序列数的对比结果图(Quick B&F法与皂素法)；图4C为肺泡灌洗液标本病原体检出序列数的对比结果图(Molzym与Quick B&F法)。
从图4A和图4C可知：对于肺泡灌洗液标本，Quick B&F法的标准化病原序列数分别与皂素法和Molzym试剂盒的标准化病原序列数具有显著性差异(p＜0.05)。
图4B为石蜡切片标本病原体检出序列数的对比结果图(Quick B&F法与皂素法)；从图4B可知：对于石蜡切片标本，Quick B&F法与皂素法的标准化病原序列数无显著性差异(p＞0.05)，原因为Quick B&F法与皂素法均属于利用人体细胞膜与病原体细胞壁的差异，温和地裂解人体细胞膜的同时不破坏病原体细胞壁，由于石蜡切片制作过程中，标本已经过通透固定的处理，无法实现差异性裂解病原体与人体细胞壁。
实施例12
为进一步探究Quick B&F法检出病原体序列数高于皂素法与Molzym试剂盒的原因，本实施例采用Quick B&F法、皂素法与Molzym试剂盒对样本进行了检测，并统计了QuickB&F法、皂素法与Molzym试剂盒三种方法的宿主序列占比。结果如图5A、图5B和图5C所示。
图5A为Quick B&F法与皂素法的人源序列占比统计图，图5B为Quick B&F法与Molzym试剂盒的人源序列占比统计图，图5C为Quick B&F法与皂素法、Molzym试剂盒法总体宿主占比图，从图5A、图5B和图5C的结果表明，Quick B&F法的宿主序列占比与其余两种去宿主方法具有显著性差异(p＜0.05)，皂素法均值为98.74，中位数为99.28，Molzym试剂盒法均值为77.17，中位数为90.28，Quick B&F法均值为71.94，中位数为86.26。可见Quick B&F法总体的宿主序列宿主占比最低，即病原体序列占比最高。
实施例13
为进一步探究Quick B&F法的数据质量，本实施例对三种去宿主方法的Q30、Q20、GC占比以及序列有效率进行比较。不同去宿主方法序列质量的比较结果如图6A、图6B、图6C和图6D所示。图6A为Quick B&F法与皂素法、Molzym试剂盒法Q30、Q20质量图，图6B为QuickB&F法与皂素法、Molzym试剂盒法GC比例图，图6C为Quick B&F法与皂素法序列有效率图，图6D为Quick B&F法与Molzym试剂盒序列有效率图。
其中，三种方法的Q30和Q20数值无显著性差异(p＜0.05)，GC比例无显著性差异(p＜0.05)，Quick B&F法与皂素法序列有效率无显著性差异(p＜0.05)，而Quick B&F的序列有效率高于Molzym试剂盒，具有显著性差异(p＜0.05)。综上，Quick B&F去宿主法序列质量不低于皂素法与Molzym试剂盒。
综上，本发明提供的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法操作时间最短，对细菌和真菌的病原体检出率最高，采用全自动提取仪代替手工提取核酸的方法，减少人力及样本间交叉污染的机会，且保证较好的数据质量。本发明创新地使用Molzym化学选择性裂解法结合物理破碎，成功地达到较佳的去宿主效果并缩短实际操作时间，去宿主操作流程时间仅需35分钟，远远低于市场上Zymo、Molzym、NEB等成品试剂盒所需时间，为重症医学mNGS的检测争取宝贵时间，在病原体宏基因组学高通量测序领域具有重要的应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)裂解人源细胞：采集待测样本，采用Molzym试剂盒去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；
(2)裂解病原体细胞壁：对裂解人源细胞后的产物进行珠磨破碎，采用物理破碎的方式裂解病原体细胞壁，所述珠磨破碎处理的程序包括：振荡速度5.5-6.5m/s，振荡时间28-32s，静置4.5-5.5min，重复振荡和静置的步骤2-3次；
(3)核酸提取：对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。
2.根据权利要求1所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，步骤(1)中，所述Molzym试剂盒去宿主方法包括如下步骤：
(a)将待测样本与CM buffer振荡混合，进行静置；
(b)将DB1 buffer和MolDNase B与步骤(a)中静置后的溶液振荡混合，进行静置，离心，收集沉淀；
(c)将RS buffer与步骤(b)中的沉淀振荡混合，离心，收集沉淀，用PBS重悬沉淀。
3.根据权利要求2所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，步骤(a)中，所述待测样本与CM buffer的体积比为(700-800):(200-300)；
优选地，步骤(a)中，所述振荡混合的时间为5-8s，所述振荡混合的转速为2500-2800rpm；
优选地，步骤(a)中，所述静置的时间为2-3min。
4.根据权利要求2或3所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，步骤(b)中，所述DB1 buffer和MolDNase B与步骤(a)中静置后的溶液的体积比为(200-250):10:(900-1000)；
优选地，步骤(b)中，所述振荡混合的时间为5-8s，所述振荡混合的转速为2500-2800rpm；
优选地，步骤(b)中，所述静置的时间为8-12min；
优选地，步骤(b)中，所述离心的离心力为15000-17000g，所述离心的时间为4-6min。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，步骤(c)中，采用0.8-1.2mL的RS buffer与步骤(b)中的沉淀振荡混合；
优选地，步骤(c)中，所述振荡混合的时间为5-8s，所述振荡混合的转速为2500-2800rpm；
优选地，步骤(c)中，所述离心的离心力为15000-17000g，所述离心的时间为2-4min；
优选地，步骤(c)中，采用700-750μL的PBS重悬沉淀。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，步骤(2)中，所述珠磨的步骤包括：将重悬后的沉淀加入到破壁珠磨管中，进行珠磨破碎处理，取出破壁珠磨管，将破碎后的产物进行离心处理，收集上清。
7.根据权利要求6所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，所述离心处理的离心力为1800-2200g，所述离心的时间为2-4min。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法，其特征在于，步骤(3)中，所述核酸提取的方式包括采用核酸自动提取仪完成核酸提取。
9.一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主的装置，其特征在于，所述装置包括：
裂解人源细胞模块：用于对待测样本中的人源细胞进行裂解，采用选择性去宿主方法对待测样本中的人源细胞进行裂解处理；
裂解原体细胞壁模块：用于对待测样本中的病原体进行裂解，采用珠磨破碎进行，通过物理破碎的方式裂解病原体细胞壁；
核酸提取模块：用于提取病原体的核酸，采用核酸自动提取仪对珠磨破碎后的产物进行核酸提取。
10.权利要求1-8中任一项所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法和/或权利要求9所述的提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主的装置在病原体宏基因组学高通量测序中的应用。
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